Test di imaging basato su placche per quantificare le risposte fotoperiodiche in Neurospora crassa utilizzando lo sviluppo di protoperiteci

Sommario

Il Saggio dei Protoperiteci quantifica le risposte fotoperiodiche in Neurospora crassa misurando la formazione dei protoperiteci sotto cicli chiaro-oscuro definiti. Questo metodo basato su placche offre un approccio semplice e scalabile per confrontare risposte di sviluppo dipendenti dal fotoperiodo tra condizioni sperimentali.

Abstract

Neurospora crassa è un organismo modello ben consolidato per lo studio del tempismo biologico e dello sviluppo regolato dalla luce. Il Saggio dei Protoperiteci (PPA) è un metodo di imaging basato su placche per quantificare le risposte fotoperiodiche misurando la formazione dei protoperiteci come risultato dello sviluppo. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro riproducibile e scalabile per valutare come i cicli chiaro-oscuro definiti influenzino lo sviluppo sessuale fungino. In questo saggio, le colture fungine vengono coltivate su un mezzo sintetico di incrocio in condizioni di fotoperiodo controllate, seguite dalla rimozione standardizzata dei conidi superficiali per migliorare la visualizzazione. I protoperiteci sono quantificati tramite conteggio manuale basato su immagini e i conteggi medi per lastra vengono utilizzati per confronti statistici tra condizioni di fotoperiodo. A differenza degli approcci precedenti, la PPA integra condizioni di coltura standardizzate, esposizione controllata al fotoperiodo e imaging basato su quadranti per consentire confronti quantitativi riproducibili tra ceppi. Questo flusso di lavoro va oltre un protocollo di base stabilendo un quadro coerente e scalabile per misurare l'output di sviluppo dipendente dal fotoperiodo in condizioni sperimentali definite. Il metodo richiede circa una settimana dall'inoculazione all'analisi e può essere applicato su più ceppi in condizioni ambientali definite. Il PPA fornisce una piattaforma semplice e accessibile per l'analisi comparativa dello sviluppo dipendente dal fotoperiodo nei funghi in condizioni di laboratorio controllate.

Introduzione

Il saggio sui protoperiteci (PPA) quantifica le risposte fotoperiodiche nel fungo Neurospora crassa. Molti organismi misurano la durata del giorno e della notte per coordinare processi biologici in un fenomeno noto come^{fotoperiodismo} 1,2,3,4,5,6,7,8. In questo saggio, lo sviluppo della struttura sessuale femminile, il protoperitecio, funge da proxy misurabile e dipendente dalla luce per la risposta fotoperiodica. Sebbene il fotoperiodismo sia ben caratterizzato nelle piante attraverso esperimenti di^{night-break 3}, esistono meno approcci standardizzati per quantificare le risposte fotoperiodiche in eucarioti non fotosintetici come i funghi. N. crassa fornisce un sistema modello trattabile a questo scopo grazie alla sua genetica ben definita e ai percorsi di sviluppo reattivi alla luce. La regolazione dipendente dal fotoperiodo del tempo riproduttivo è stata osservata negli^organismi 1,2,3,4,5,6,7,8, a sostegno della rilevanza delle risposte fisiologiche guidate dalla luce; tuttavia, gli studi meccanicistici sui funghi rimangono limitati dalla mancanza di saghi riproducibili.

I protoperiteci sono strutture sessuali femminili premature in N. crassa. Derivano dall'ascogonia, che sviluppa trichogini avvolti che si fondono con ife o conidi di tipo di accoppiamento^{opposto 9}. Dopo la fusione, i nuclei del partner "maschio" entrano nel protoperitezio. Il numero di protoperiteci prodotti è regolato stagionalmente e fortemente indotto dalla^{luce 10}. La regolazione fotoperiodica è centrale per l'ecologia, la cronobiologia e la fisiologia fungina perché molti processi controllati da orologio dipendono dalla luce. La luce influenza numerose vie genetiche, inclusi fotorecettori, chinasi e meccanismi di trasduzione della luce collegati allo sviluppo^{sessuale 11}. I protoperiteci sono molto adatti a misurare l'output fotoperiodico perché sono facilmente visualizzabili al microscopio e rispondono con sensibilità alla luce.

Nonostante l'importanza del fotoperiodismo nei funghi, sono disponibili pochi saggi standardizzati e riproducibili per quantificare la produzione di protoperiteci sotto cicli luminosi controllati. Un saggio a media capacità basato su placche è prezioso perché i funghi sono organismi modello economici e facilmente mantenibili, permettendo un'analisi sistematica dello sviluppo sessuale indotto dalla luce e della funzione genica. La maggior parte delle ricerche sul fotoperiodismo si è concentrata sulle piante, mentre i quadri quantitativi equivalenti per i sistemi fungini rimangono limitati. In altri organismi, inclusi gli insetti, fenomeni dipendenti dalla luce come la diapausa sono ben^{caratterizzati,} ma mancano approcci comparabili nei funghi. Questo gap limita il confronto riproducibile delle risposte fotoperiodiche tra ceppi e condizioni sperimentali.

La PPA si basa su uno studio del 2004 che ha misurato la produzione di protoperiteci su durate crescenti del giorno, dall'oscurità costante alla luce costante, nel mutante a banda (bd) (ras-1^bd), utilizzato in studi^{circadiani 4,12}. In questo contesto sono stati osservati cambiamenti dipendenti dal fotoperiodo nella produzione di protoperiteci. L'attuale flusso di lavoro adatta ed estende questo approccio utilizzando il ceppo di riferimento FGSC 2489, associato al sequenziamento dell'intero genoma e alle risorse^{knockout 13,14}. Il saggio quantifica il numero medio di protoperiteci prodotti sotto fotoperiodi definiti nell'arco di una settimana come proxy della risposta fotoperiodica. Questo approccio standardizza le condizioni di coltura, l'imaging e la quantificazione, consentendo confronti riproducibili tra condizioni sperimentali e ceppi. I principali progressi metodologici includono condizioni standardizzate di coltura basate su lastre, parametri definiti di esposizione al fotoperiodo, imaging basato su quadranti e un flusso di lavoro di quantificazione riproducibile.

Questo protocollo quantifica le risposte fotoperiodiche in N. crassa misurando la formazione dei protoperiteci dopo l'esposizione a cicli chiaro-oscuro definiti. Per ogni condizione fotoperiodica vengono utilizzati quattro repliche biologiche, ciascuna costituita da una lastra incrociata sintetica (SC) inoculata indipendentemente. Quattro immagini vengono raccolte per ogni lastra e mediate per generare un unico valore per ogni replica biologica per l'analisi statistica. Le piastre vengono incubate per sette giorni sotto fotoperiodi calibrati (ad esempio, cicli chiaro-oscuro di 12 ore di 12 ore o 8 ore di 16 ore di luce e oscurità).

All'interno della camera di crescita viene posizionato un data logger per registrare continuamente l'intensità luminosa, la temperatura e l'umidità, verificando così condizioni ambientali stabili. L'intensità luminosa è mantenuta sopra i 1.000 lux, poiché livelli più bassi riducono la produzione di protoperiteci. Si evita un'illuminazione eccessiva per evitare aumenti della temperatura della camera e effetti termici confondenti. Dopo l'incubazione, i macroconidi vengono delicatamente rimossi con un tovagliolo di carta umido saturo al 70% di etanolo. Quattro quadranti equidistanti al perimetro di ciascuna lastra sono fotografiati con un ingrandimento del 40× utilizzando un microscopio stereo sotto illuminazione a campo chiaro. I protoperiteci vengono conteggiati manualmente tramite un pacchetto di elaborazione delle immagini, e i conteggi medi per lastra vengono utilizzati per confronti statistici tra fotoperiodi.

Protocollo

I reagenti, il software e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di materiali e materiali

(Tempo stimato: 1–1,5 ore attive; raffreddamento notturno opzionale)

1. Prepara un mezzo di incrocio sintetico (SC)
   1. Prepara il mezzo SC: 0,2% saccarosio, 5 μg/L di biotina, 1,5% agar e sali di Westergaard (pH 6,5 con 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoclave, il mezzo. Lascia raffreddare a 50–55 °C finché non raggiunge lo stato versabile.
      ATTENZIONE: Usa guanti resistenti al calore quando rimuovi le fiaschette dall'autoclave.
2. Versa i piatti
   1. Pipetta 10 mL di mezzo fuso in piastre di Petri da 60 mm usando una pipetta usa e getta.
   2. Lascia solidificare i piatti a temperatura ambiente per 30–45 minuti.
   3. Conserva i piatti capovolti a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
      NOTA: Mantieni l'idratazione dei piatti. Non conservare i piatti per più di 4 settimane a 4 °C.
3. Prepara ceppi fungini
   1. Coltivare ogni ceppo in piccoli tubetti di vetro contenenti un mezzo completo o minimo preparato secondo le istruzioni del manuale^{di laboratorio 15}.
   2. Incubare i tubi in costante oscurità (DD) a 30 °C finché non si forma una copertura miceliale visibile lungo la superficie del tubo (tipicamente 2–3 giorni).
      ATTENZIONE: Maneggiare colture fungine utilizzando pratiche microbiologiche standard e lavorare all'interno di un armadietto di biosicurezza per minimizzare la contaminazione.

2. Inoculazione delle placche

(Tempo stimato: 15–30 minuti per ogni set di piatti)

1. Trasferimento dei conidi fungini
   1. Inoculare ogni piastra SC utilizzando una tecnica sterile e un anello di inoculazione.
   2. Posizionare i conidi al centro della lastra per garantire una crescita uniforme (Figura 1A). I conidi appaiono come spore polverose e di colore chiaro che ricoprono la superficie della colonia.
   3. Applicare circa 1–2 μL di sospensione conidiale concentrata (o un loop equivalente) per standardizzare l'inoculazione tra le placche.
2. Prepara le piastre per l'incubazione
   1. Chiudi le piastre in modo sicuro per prevenire contaminazioni e permettere allo scambio di gas.
   2. Etichetta ogni targa con nome della ceppa, data e condizione del fotoperiodo.

3. Impostazione del trattamento fotoperiodico

(Tempo stimato: 10 minuti di preparazione + incubazione di 7 giorni)

1. Calibra la camera di crescita
   1. Imposta la temperatura della camera a 25 °C.
   2. Imposta l'umidità al 50% (intervallo accettabile: 40%–60%) per evitare l'asciugatura del piatto.
   3. Cicli di fotoperiodo programmato: EQ (equinozio): 12 h luce / 12 h scuro e SDP (giorno corto): 8 h luce / 16 h buio
   4. Imposta l'intensità luminosa a >1.000 lux a livello di piastra usando un misuratore calibrato. Evitare intensità che aumentano la temperatura della camera oltre i 25 °C.
      NOTA: Assicurati che le luci della camera non surriscaldano l'interno.
      ATTENZIONE: Non usare Parafilm o sacchetti di plastica per mantenere l'umidità, poiché limitano lo scambio di gas e ostacolano la crescita fungina. Se il controllo dell'umidità non è disponibile, posizionare un serbatoio d'acqua all'interno della camera.
2. Posiziona le piastre nella camera
   1. Disponi i piatti in modo uniforme sugli scaffali per garantire un'esposizione uniforme alla luce.
   2. Posiziona un data logger all'interno della camera per monitorare continuamente temperatura e umidità e verificare condizioni ambientali stabili.
3. Inizia il test
   1. Incubare le placche sotto il fotoperiodo programmato per 7 giorni senza disturbi.

4. Monitoraggio e preparazione delle lastre per l'imaging

(Tempo stimato: 15–20 min per piatto)

1. Rimuovere le piastre dalla camera
   1. Rimuovi le piastre dopo 7 giorni di incubazione.
   2. Ispezionare le placche per la crescita dei conidi e la formazione di protoperiteci.
2. Pulire le piastre per la visibilità
   1. Rimuovere i conidi superficiali dal coperchio del piatto e dalla superficie dell'agar usando asciugamani di carta strappati (Figura 1B).
   2. Inumidire un tovagliolo di carta con 1–2 mL di etanolo al 70%. Tampona delicatamente la superficie della piastra 3–5 volte per rimuovere i conidi. Lascia asciugare le piastre all'aria per 1–3 minuti prima dell'imaging (Figura 1C).
      ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile; Stai lontano dalle fonti di calore.
      NOTA: Evita di applicare una pressione eccessiva. Non trascinare l'asciugamano sulla superficie dell'agar, poiché ciò potrebbe danneggiare il mezzo o disturbare i protoperiteci.

5. Imaging dei protoperiteci

(Tempo stimato: 5 min per piatto)

1. Prepararsi per l'imaging
   1. Installa un microscopio con illuminazione e ingrandimento costanti (tipicamente 40×).
   2. Assicurati che la superficie della piastra sia asciutta e priva di detriti.
2. Cattura immagini
   1. Immagini quattro quadranti equidistanti al perimetro della placca usando un ingrandimento costante.
   2. Etichetta ogni immagine con deformazione, condizione del fotoperiodo, numero di targa e posizione del quadrante.
   3. Salva le immagini in un formato coerente (ad esempio, TIFF) per l'analisi.

6. Quantificazione e analisi dei dati

(Tempo stimato: 10–20 minuti per piastra per il conteggio; 15–25 minuti per l'analisi)

1. Conte protoperiteci
   1. Apri ogni immagine in un pacchetto di elaborazione immagini.
   2. Usa il plugin Cell Counter per contare manualmente i protoperiteci. Escludere bolle, artefatti di bordo e strutture ambigue. Contare i protoperiteci raggruppati come unità individuali e distinguibili.
   3. Registra i conteggi per ogni quadrante e calcola la media per tavola.
2. Analizza i dati
   1. Importare dati quantificati in un software di analisi statistica.
   2. Eseguire un'analisi statistica utilizzando il test t di Welch per i confronti mostrati nella Figura 2.
   3. Genera grafici che confrontano trattamenti fotoperiodici, ceppi o repliche.

Risultati

Dopo l'inoculazione con il ceppo di tipo selvatico, i conidi hanno coperto la superficie della cellula selvagia entro 36–48 ore. Dopo 7 giorni di esposizione al fotoperiodo, si è formato uno strato conico denso che veniva rimosso con un tovagliolo di carta inumidito saturo al 70% di etanolo (Figura 1). Questo passaggio ha esposto i protoperiteci sottostanti senza disturbarne la struttura. In microscopia, i protoperiteci apparivano come strutture scure e circolari distribuite sulla superficie...

Discussione

L'obiettivo della PPA è utilizzare lo sviluppo sessuale nei funghi come proxy per determinare se un organismo percepisce un fotoperiodo specifico. Quantificando il numero medio di protoperiteci prodotti sotto diversi cicli luminosi, le risposte fotoperiodiche possono essere valutate e confrontate tra le condizioni. In linea con le osservazioni^{precedenti 4,16}, N. crassa mostra una maggiore produzione di protoperiteci sott...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	BD	90000-786	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Alcohol burner flame	Wards	470346-104	Per sterilizing inoculazione loop
Ammonium iron sulfate hexahydrate	Supelco	FX0245-1	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Ammonium nitrate (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Per Minimal Media
Autoclave	VWR International	76683-456	Per sterilizing vetreria e media
Biological Safety Cabinet	ThermoFischer Scientific	1323TS	Per ridurre la contaminazione delle piastre e del laboratorio.
Biotin	VWR	97061-444	Per Syntetico Crossing Media
Boric acid (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Calcium chloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Per Syntetico Crossing Media
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Per Minimal Media
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Usato per rimuovere conidi dalla superficie della piastra e sterilizzare l'inoculazione loop
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Per analizzare immagini/conteggio
Gloves	SW Safety Solutions	76382-944	Per sicurezza
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Per eseguire test statistici e creare figure
Growth Chamber	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Programmabile per cicli di fotoperiodo
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Per registrazione di intensità luminosa e temperatura
Inoculation loop	VWR International	10806-354	Per trasferire materiale fungino in piastre petri
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Per imaging
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Ceppa fungino
Paper Towels	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	Per versare media
Permanent Marker	Sharpie	30072	Per etichettare le piastre
Petri Dishes	VWR International	25384-164	Per piastra Syntetico Crossing Media
Pipettes	VWR International	75816-090	Per versare media
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Potassium nitrate (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Per Syntetico Crossing Media
Small Disposable Glass Test Tubes	VWR International	470211-698	Per la crescita iniziale del ceppo fungino
Sodium chloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Per Syntetico Crossing Media
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Per Minimal Media
Sodium hydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Per Syntetico Crossing Media
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Per Syntetico Crossing Media/Minimal Media