La classe comune di varianti genetiche associate alla vasculite nelle interferonopatie di tipo I all'interno di una coorte pediatrica

Sommario

Il sequenziamento dell'intero esoma su 1.204 pazienti pediatrici con sospetta malattia autoinfiammatoria ha identificato varianti associate all'interferonopatia in 132 casi, inclusi 79 nuove mutazioni. La maggior parte era eterozigote e collegata a fenotipi vascolici. Questi risultati sottolineano il valore diagnostico dei test genetici e il ruolo centrale della segnalazione interferentica di tipo I disregolata nella vasculite pediatrica.

Abstract

La vasculite pediatrica viene tradizionalmente diagnosticata tramite valutazione istopatologica; tuttavia, sempre più spesso, nella pratica clinica vengono utilizzati approcci basati sull'imaging meno invasivo. Nonostante questi progressi, l'identificazione di un'eziologia monogenica sottostante rimane essenziale per comprendere i meccanismi della malattia, prevedere la prognosi e guidare strategie terapeutiche mirate. Le interferonopatie di tipo I comprendono un gruppo eterogeneo di disturbi immunomediati caratterizzati da segnalazione costitutiva dell'interferone e frequenti manifestazioni vasculitiche o vasculopatiche. L'attivazione persistente delle vie di rilevamento degli acidi nucleici e l'omeostasi intracellulare compromessa contribuiscono a disfunzioni endoteliali e infiammazione vascolare cronica.

Questo studio presenta un flusso di lavoro completo di analisi genetica per rilevare varianti associate alla vasculite nei geni correlati all'interferonopatia all'interno di una coorte pediatrica di malattie autoinfiammatorie. Il sequenziamento dell'intero esoma è stato eseguito in 1.204 pazienti con sospette malattie autoinfiammatorie. Le varianti che interessano le regioni codificanti e i siti di splice sono state analizzate utilizzando una pipeline bioinformatica basata sulle linee guida dell'American College of Medical Genetics and Genomics, integrando tecniche di filtraggio statistico e di elaborazione del segnale ispirate alle trasformate di Fourier discrete (DFT) e alle distribuzioni statistiche per migliorare la priorità e l'interpretazione delle varianti.

Varianti associate all'interferonopatia sono state identificate in 132 pazienti pediatrici valutati tramite un database clinico reumatologico. In totale, sono state rilevate 92 varianti uniche, tra cui 13 varianti patogeniche o probabilmente segnalate in precedenza e 79 varianti nuove non presenti nei database pubblici a febbraio 2026. Le manifestazioni cliniche includevano principalmente febbre ricorrente, manifestazioni vascolariche e presentazioni autoinfiammatorie complesse.

Le varianti hanno coinvolto geni associati a segnalazione interferina disregolata e attivazione immunitaria innata, inclusi percorsi collegati all'attivazione STING, al metabolismo degli acidi nucleici e alla disfunzione del traffico intracellulare. Questo flusso di lavoro interdisciplinare dimostra la potenziale utilità diagnostica dell'analisi genomica nella vasculite pediatrica e evidenzia l'importanza di una segnalazione prolungata dell'interferone nella lesione vascolare e nella patogenesi delle malattie autoinfiammatorie.

Introduzione

La vasculite pediatrica è stata tradizionalmente diagnosticata tramite valutazione istopatologica, che rimane il punto di riferimento d'oro. Tuttavia, le strategie diagnostiche recenti hanno sempre più favorito approcci meno invasivi, in particolare le modalità basate sull'imaging. Nonostante questi progressi, identificare un'eziologia monogenica sottostante è di fondamentale importanza nella vasculite infantile, poiché fornisce informazioni fondamentali sui meccanismi della malattia, la prognosi e le opportunità di terapia^{mirata 1,2}.

La vasculite infantile dovrebbe essere sospettata nei bambini che presentano infiammazione sistemica e coinvolgimento multiorgano. Per stabilire la diagnosi ed escludere i mimetici sono necessari un'accurata analisi dell'anamnesi, un esame fisico completo, esami di laboratorio, esami di imaging e, in alcuni casi, biopsie tissutali. La diagnosi e il trattamento precoci sono essenziali perché una malattia non trattata può portare a complicazioni potenzialmente letali o a conseguenze a lungo^{termine 1}.

Le interferonopatie di tipo I includono uno spettro diversificato di disturbi monogenici e complessi immunomediati, caratterizzati da un'attivazione sostenuta della via dell'interferone di tipo I e da caratteristiche vasculopatiche o vasculopatiche^{ricorrenti 3,4}. Un rilevamento disordinato degli acidi nucleici e una compromessa dell'omeostasi intracellulare sono meccanismi patogeni centrali che collegano la sovrapproduzione sostenuta di interferone all'infiammazione e alle lesioni vascolari. Le mutazioni di guadagno di funzione in TMEM173 (STING1) causano vascolopatia associata alla STING con esordio nell'infanzia (SAVI), mentre le mutazioni COPA autosomale dominanti interrompono il traffico endoplasmatico del reticolo di Golgi, portando a un'attivazione aberrante dello STING e a un fenotipo^{vasculistico 3-5}. Ulteriori interferonopatie causate da difetti nei geni del metabolismo degli acidi nucleici (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 e IFIH1) sottolineano ulteriormente il legame meccanicistico tra disregolazione dell'interferone e patologia^{vascolare 3} (vedi Figura 1).

Figura 1. Architettura patogena dettagliata delle interferonopatie di tipo I che guidano disfunzioni endoteliali e lesioni microvascolari in coorti pediatriche. (Sinistra) Contesto sistemico dell'interferonopatia pediatrica di tipo I: discriminazione difettosa tra sé e non sé e rilevamento aberrante degli acidi nucleici dell'ospite che scatenano un'autoinfiammazione sistemica. I fenotipi clinici sono caratterizzati in modo prominente da vascolopatia cutanea precoce e coinvolgimento sistemico, spesso presentandosi come lesioni cutanee simili a sparagoni. (Centro) Cascata meccanicistica di difetti genetici a disregolazione sistemica: mutazioni di perdita di funzione negli enzimi di eliminazione degli acidi nucleici (ad esempio, DNASE1, TREX1) portano all'accumulo aberrante di DNA e RNA endogeni all'interno del citoplasma. Contemporaneamente, mutazioni di guadagno di funzione nei sensori come STING1 guidano l'attivazione costitutiva della via cGAS-STING indipendentemente dai trigger virali. Questa rilevazione patogena intracitoplasmatica iperattiva i fattori regolatori dell'interferone, portando alla sintesi continua degli interferoni di tipo I (IFN-α/β). L'output cronico di citochine crea un circuito di amplificazione sistemica autosufficiente tramite i recettori IFNAR1/2, aggravato da meccanismi di eliminazione compromessi e controlli di feedback positivo. (Destra) Esito patologico: il legame persistente dell'IFN-α/β circolante al complesso recettore delle cellule endoteliali induce un'attivazione sostenuta di JAK-STAT. Questa costante interruzione omeostatica provoca uno stress endoteliale continuo e compromette i meccanismi fisiologici di vasorilassamento. A livello capillare, questo stato iper-infiammatorio causa danni diretti alle cellule endoteliali, un significativo ispessimento della parete vasale e trombosi microvascolare luminale, culminando in grave ischemia tissutale e microvascolopatia necrotizzante senza vie autoimmuni mediate dagli autoanticorpi. Abbreviazioni: cGAS-STING = stimolatore ciclico GMP-AMP sintasi dei geni dell'interferone; DNASI1 = desossiribonucleasi 1; GoF = guadagno di funzione; IFN = interferone; IFNAR = recettore dell'interferone alfa/beta; IRF = fattore regolatore dell'interferone; JAK-STAT = trasduttore del segnale della chinasi di Janus e attivatore della trascrizione; STING1 = stimolatore dell'interattore cGAMP 1 della risposta all'interferone; TREX1 = tre esonucleasi di riparazione primaria 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo approccio è stato sviluppato per rilevare varianti geniche associate all'interferonopatia nelle coorti autoinfiammatorie pediatriche, poiché i metodi convenzionali possono incontrare sfide analitiche nella priorità precoce delle mutazioni rare, e l'eterogeneità dei neutrofili svolge un ruolo fondamentale nella previsione del rischio di^{ricaduta 6}. In letteratura, il ruolo della disregolazione della segnalazione interferina nella vasculite a piccoli vasi è stato chiarito tramite analisi a singola cellula, sottolineando il vantaggio del sequenziamento dell'intero esoma (WES) per la diagnosi precoce nelle coorti^{pediatriche 6}.

Le sindromi autoinfiammatorie monogeniche possono presentarsi con vasculite o manifestazioni simili alla vasculite. Ad esempio, il SAVI può imitare la vasculite a vasculite a piccoli o medi^{vasi 7}. Analogamente, l'artrite idiopatica giovanile (JIA) rappresenta un gruppo eterogeneo di malattie infiammatorie ad esordio infantile che possono persistere fino all'età adulta e sono associate a una disregolazione simile all'interferonopatia, sottolineando la necessità di analisi genetica nelle coorti^{pediatriche 8}.

Le interferonopatie di tipo I sono errori innati mendeliani dell'immunità caratterizzati dall'attivazione di sensori antivirali attivati da acidi nucleici derivati dall'ospite, rappresentando un fallimento nella discriminazione tra sé e non sé ^3,4. Questi disturbi sono definiti dalla regolazione all'alto della segnalazione dell'interferone di tipo I, e le manifestazioni dermatologiche spesso forniscono importanti indizi diagnostici. La SAVI è associata a mutazioni di guadagno di funzione nel TMEM173 e si presenta con vascolopatia cutanea a esordio precoce e infiammazione^{polmonare 9}. La mutazione p.V155M è la variante¹⁰ più frequentemente segnalata. La SAVI è una rara malattia autoinfiammatoria associata a mutazioni STING1, caratterizzata da una precoce malattia polmonare interstiziale (ILD) e lesioni cutanee, e può clinicamente imitare il lupus eritematoso sistemico (LES⁾¹¹. La segnalazione disregolata dell'interferone di tipo I è stata anche implicata nella vasculite (AAV) associata ad anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili (ANCA). Nell'AAV, una firma di interferone di tipo I è predominante nella poliangite microscopica/vasculite associata alla mieloperossidasi-ANCA (MPA/MPO-AAV) ed è associata alla prognosi renale, evidenziando il contributo di rare varianti alla disregolazione^{dell'interferone 12}.

Le sindromi autoinfiammatorie monogeniche possono presentarsi con vasculite o manifestazioni simili alla vasculite. Ad esempio, il SAVI può imitare la vasculite a vasculite a piccoli o medi^{vasi 7}. In precedenza, era stata descritta la più grande coorte globale di pazienti portatori di mutazioni attivanti STING1, fornendo una caratterizzazione fenotipica clinica e immunologica ampliata di SAVI¹³. Negli ultimi due decenni sono stati compiuti progressi notevoli nella comprensione del riconoscimento dei patogeni sia da parte delle cellule ematopoietiche che non ematopoietiche. I componenti microbici vengono rilevati tramite recettori codificati nella linea germinale, un passaggio chiave per avviare questa^{risposta 14}. Nel 2006 è stato dimostrato che la trasfezione di DNA in vari tipi cellulari induce una regolazione all'alza degli interferoni di tipo I in modo indipendente dal recettore toll-like (TLR). In questo contesto, STING, una proteina transmembrana localizzata nel reticolo endoplasmatico, è stata identificata nel 2008 come mediatore chiave delle risposte interferoniche di tipo I al DNA sintetico e^{virale 13}. Le mutazioni di guadagno di funzione in STING1 portano a un'interferonopatia di tipo I nota come SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴. Questa grave malattia è caratterizzata in modo vario da infiammazione sistemica precoce, vascolopatia cutanea e malattia polmonare interstiziale (ILD⁾¹⁴. La SAVI è rara, sono stati finora segnalati 52 pazienti provenienti da 37 famiglie e la maggior parte dei casi si presenta de novo, anche se è stata documentata anche l'ereditarietà autosomica dominante. In precedenza, era stata descritta la più grande coorte globale di pazienti portatori di mutazioni STING1 attivanti, fornendo una caratterizzazione fenotipica clinica e immunologica ampliata di SAVI ^9,10,11˒14.

Questo protocollo è stato sviluppato per consentire la diagnosi precoce di varianti geniche associate all'interferonopatia tramite analisi genetica basata su WES in pazienti pediatrici presenti con caratteristiche autoinfiammatorie, poiché gli approcci convenzionali sono spesso insufficienti per identificare mutazioni rare e possono perdere opportunità di intervento precoce. La letteratura dimostra che il ruolo della regolazione all'alza dell'interferone nei fenotipi simili alla vasculite è stato chiarito attraverso lo studio dei disturbi mendeliani, evidenziando ulteriormente il vantaggio del WES per la rilevazione di varianti^{rare 4,7,12}.

L'obiettivo principale di questo metodo è integrare principi di elaborazione del segnale basati sulla fisica con modellazione computazionale biofisica semplificata per supportare la rilevazione di varianti nei dati WES per interferonopatie di tipo I, interpretando al contempo gli effetti a valle sulle vie di segnalazione dell'interferone, in particolare la cascata del trasduttore del segnale Janus chinasi e attivatore della trascrizione (JAK-STAT). Questo approccio esplorativo mira a integrare l'analisi delle regioni genomiche frequentemente colpite dal rumore di sequenziamento e dalla copertura non uniforme dei disturbi immunomediati, in cui l'attivazione disregolata dell'interferone stimola fenotipi vascolici. I flussi di lavoro bioinformatici standard si concentrano tipicamente su metriche di qualità standard, che possono lasciare spazio a un filtraggio aggiuntivo e di supporto nell'identificazione di varianti in regioni complesse di geni come STING1 o TREX1. Applicando tecniche di elaborazione del segnale ispirate alle trasformate di Fourier discrete (DFT) e alle distribuzioni statistiche, questo metodo estrae le caratteristiche genomiche sottostanti dalle sequenze nucleotidiche, mappando le basi (A, T, C, G) su indicatori binari per l'analisi dei pattern^{delle mutazioni 15}. Inoltre, la modellizzazione biofisica delle vie dell'interferone incorpora il comportamento di soglia e l'amplificazione cumulativa del segnale per valutare come le varianti genetiche possano sostenere la disfunzione endoteliale, con particolare attenzione al ruolo della via JAK-STAT nella trasmissione dei segnali di interferone di tipo I (IFN-α/β).

Questa applicazione esplorativa è stata progettata per studiare i profili di allineamento nelle regioni a bassa copertura. Sebbene gli strumenti computazionali standard forniscano la filtrazione primaria delle varianti, il modello di supporto indaga se la valutazione basata su SNR possa offrire un gating qualitativo secondario delle varianti a singolo nucleotide codificante (SNV) influenzate dalla distribuzione di lettura non uniforme. Questo approccio basato sulla fisica utilizza l'ottimizzazione SNR per valutare la qualità dei genotipi e i rapporti di lettura minori. Nella letteratura più ampia, modellazioni stocastiche simili hanno rivelato risposte gradate nei percorsi JAK-STAT piuttosto che nelle dinamiche all-or-nothing, permettendo una migliore previsione della sovrapproduzione di^{interferone 16}. La via JAK-STAT, attivata dagli interferoni di tipo I (IFN) che si legano ai recettori IFNAR1/IFNAR2, coinvolge Janus chinasi (JAK1, TYK2) che fosforilano STAT1 e STAT2, formando il complesso ISGF3 con IRF9 per la traslocazione nucleare e la trascrizione^{ISG 17}. Questo può essere modellato utilizzando equazioni differenziali ordinarie (EDO) per l'induzione IFN-β:

dove i parametri elencati rappresentano il tasso di fosforilazione, la defosforilazione e il feedback negativo tramite SOCS1, evidenziando l'amplificazione dipendente dalla^{soglia 17}. Ulteriori dettagli includono la formazione di omodimeri STAT1 per la segnalazione IFN-γ, ma nelle interferonopatie di tipo I, l'attivazione sostenuta porta a un'espressione eccessiva di ISG. Le simulazioni stocastiche spiegano ulteriormente la variabilità, utilizzando algoritmi di Gillespie per modellare il rumore nel legame ricevetore-ligando e nell'importazione nucleare, rivelando l'eterogeneità cellula a cellula nelle risposte^{IFN 16}. Questo metodo è particolarmente adatto ai ricercatori che studiano la vasculite autoinfiammatoria, poiché fornisce un quadro quantitativo che collega le varianti alla disregolazione delle vie, come attraverso le EDO estese che incorporano effetti paracrini:

dove i parametri elencati rappresentano il tasso di produzione, il degrado e il rinforzo paracrino¹⁸. Gli utenti con accesso a dati di sequenziamento ad alto throughput e risorse computazionali possono applicare questo approccio per dare priorità alle varianti candidate ed esplorare potenziali effetti dei percorsi.

Questo studio è stato pianificato utilizzando un approccio multidisciplinare di reumatologia e genetica per identificare varianti associate alla vasculite nei geni correlati all'interferonopatia in una vasta coorte pediatrica che mostra caratteristiche autoinfiammatorie, utilizzando un protocollo di analisi genetica basato su sequenziamento clinico dell'esoma (CES)/WES a causa delle difficoltà nella classificazione della vasculite e delle limitazioni degli approcci tradizionali. Inoltre, lo studio mirava a sottolineare il valore diagnostico della valutazione genetica nella vasculite infantile.

La Classification della Vasculite di Chapel Hill 2012 non include la vasculite autoinfiammatoria^{monogenica 19}. Questo studio mirava a determinare la frequenza delle varianti correlate all'interferonopatia rilevate in un gruppo di pazienti pediatrici con sintomi autoinfiammatori, contribuire all'espansione del database delle malattie rare e sottolineare l'importanza della valutazione genetica nella vasculite pediatrica.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell'Università di Ege. Tutti i campioni di sangue periferico sono stati prelevati dopo l'ottenimento scritto di consenso informato dai pazienti o dai loro tutori legali, in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Questo studio retrospettivo monocentrico è stato progettato per valutare la frequenza delle varianti associate all'interferonopatia tra i pazienti sottoposti ad analisi genetiche per sospette di malattia autoinfiammatoria e per indagare la loro relazione con la vasculite. Tra il 2022 e il 2025, sono stati inclusi campioni di sangue periferico inviati al Laboratorio di Medicina Molecolare dell'Università di Ege con una diagnosi preliminare di malattia autoinfiammatoria. Un totale di 1.204 campioni è stato sottoposto ad analisi genetiche. CES/WES è stato utilizzato come approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che mira a esoni e sequenze introniche adiacenti. Le varianti sono state classificate utilizzando i criteri ACMG e l'analisi bioinformatica. Sono state escluse varianti benigne e potenzialmente benigne. Tra questi, 132 casi pediatrici con varianti associate all'interferonopatia identificate che soddisfacevano i criteri di inclusione sono stati inclusi nella coorte finale dello studio.

All'interno di questa coorte pediatrica, i dati clinici sono stati recuperati da un database clinico reumatologico. Nel complesso, sono state identificate 92 varianti genetiche uniche tra i 132 pazienti, inclusi 13 varianti patogeniche o probabili precedentemente segnalate documentate nei database pubblici di varianti (ad esempio, ClinVar) e 79 varianti nuove assenti dai database pubblici a febbraio 2026. La maggior parte delle varianti era eterozigote e associata a fenotipi simili a CAPS o a presentazioni di vasculite autoinfiammatoria complessa. WES utilizzava un approccio NGS che mirava alle regioni codificanti proteiche (esoni) e alle sequenze introniche adiacenti per rilevare varianti di spione e regolatorie. Sebbene il WES copra circa l'1%–2% del genoma umano, cattura quasi l'85% delle mutazioni note che causano malattie, rendendolo uno strumento altamente efficiente per il rilevamento di varianti rare.

Il flusso di lavoro di laboratorio includeva l'estrazione del DNA genomico dal sangue periferico, la frammentazione del DNA, la preparazione di librerie legata con adattatore e l'arricchimento dell'esoma utilizzando sonde di cattura basate su ibridazione tramite pulldown biotina-streptavidina. Il sequenziamento a pari a vite ad alta produttività è stato eseguito su una piattaforma di sequenziamento a nanosfere di DNA, raggiungendo una profondità media di copertura di 100–200x per garantire una rilevazione affidabile delle varianti. L'analisi bioinformatica ha coinvolto l'allineamento al genoma di riferimento, la chiamata delle varianti e l'annotazione utilizzando database di varianti curate, con la classificazione delle varianti eseguita secondo le linee guida dell'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Le varianti sono state classificate come già riportate o nuove. Le varianti selezionate sono state validate tramite sequenziamento Sanger.

Oltre alle pipeline bioinformatiche standard, sono stati applicati principi di elaborazione del segnale basati sulla fisica e modellazione computazionale semplificata per valutare la profondità del sequenziamento, l'uniformità della copertura e le caratteristiche segnale-rumore, fornendo così uno strato esplorativo e supplementare per l'analisi della profondità di sequenziamento grezzo e della copertura regionale. Inoltre, sono stati impiegati concetti di modellazione biofisica per valutare l'impatto cumulativo delle varianti genetiche associate alla vasculite.

Questo quadro interdisciplinare funge da modello preliminare di laboratorio per studiare le caratteristiche di filtraggio delle varianti in un contesto di ricerca esplorativa, in particolare per guidare strategie terapeutiche anti-interferone. Le limitazioni includono una sensibilità ridotta per le varianti mosaic di basso livello e la necessità di validazione funzionale dei risultati innovativi. Le potenziali applicazioni includono la diagnosi precoce della vasculite pediatrica, il processo decisionale terapeutico personalizzato e l'espansione di database di varianti rilevanti per immunologia, reumatologia e medicina vascolare.

Frammentazione del DNA

Venti microlitri di DNA diluito sono stati trasferiti in nuovi tubi PCR sterili. A ogni tubo venivano aggiunti 2 μL di tampone frammentazione/adenilazione e 3 μL di miscela enzimatica frammentazione/adenilazione; il volume totale di reazione era di 25 μL. La miscela veniva miscelata delicatamente, centrifugata brevemente e il programma di frammentazione veniva eseguito sul termociclatore. Immediatamente dopo il completamento, i tubi furono brevemente centrifugati e posti sul ghiaccio. L'esito atteso era una dimensione media dei frammenti di DNA di 200–300 pb.

Legatura degli adattatori

A ogni prodotto di frammentazione venivano aggiunti 2,5 μL di adattatore di sequenziamento, seguiti da 10 μL di miscela master a legatura (senza vortice). La miscela veniva pipettata delicatamente per garantire l'omogeneità, centrifugata brevemente e incubata a 20 °C per 15 minuti con il coperchio del termociclatore aperto. Dopo l'incubazione, i tubi venivano brevemente centrifugati e tenuti sul ghiaccio.

Purificazione a base di perline

A ogni campione venivano aggiunti trenta microlitri di sfere magnetiche e mescolati accuratamente tramite pipetaggio fino a ottenere una sospensione omogenea. La miscela veniva incubata a temperatura ambiente per 5 minuti, e i tubi venivano poi posizionati su un supporto magnetico per 3 minuti. Dopo che il soprandanante fu rimosso, fu rimosso con cura. Il pellet è stato lavato due volte con 100 μL di etanolo all'80%, e l'etanolo residuo è stato rimosso dopo il lavaggio finale. Le perline venivano poi asciugate all'aria sul supporto magnetico per un massimo di 5 minuti. Sono stati aggiunti nove microlitri di acqua priva di nucleasi, il pellet è stato risospeso tramite pipetazione e incubato per 2 minuti a temperatura ambiente. Dopo una separazione magnetica di 3 minuti, 7,5 μL di sovrantantante sono stati trasferiti in un nuovo tubo PCR etichettato.

Amplificazione PCR

I primer per trascrizione in vitro (IVT) sono stati diluiti (20 μL di stock di primer + 80 μL di acqua priva di nucleasi). Per la reazione PCR (volume totale 17,5 μL), sono stati aggiunti 2,5 μL di primer IVT 1, 2,5 μL di primer IVT 2 e 12,5 μL di master mix di amplificazione della libreria. La miscela veniva pipetata delicatamente e veniva eseguito il programma PCR-3.

Purificazione post-PCR

Venticinque microlitri di sfere magnetiche sono stati aggiunti a ciascun prodotto PCR. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente e separazione magnetica, le sfere sono state lavate due volte con 100 μL di etanolo all'80%. Dopo l'asciugatura all'aria per un massimo di 5 minuti, sono stati aggiunti 11 μL di acqua priva di nucleasi. Dieci microlitri di soprantantante sono stati trasferiti in un nuovo tubo. La concentrazione della biblioteca veniva misurata; Bersaglio: >25 ng/μL.

Aggregazione e ibridazione (campioni per pool)

Le biblioteche sono state aggregate con otto campioni di pazienti per gruppo (93,75 ng per campione, totale 750 ng). Il volume veniva regolato a 12,5 μL con acqua priva di nucleasi, se necessario. Il mix di ibridazione è stato preincubato a 65 °C per 15 minuti. Soluzione bloccante, oligonucleotidi bloccanti universali, sonda di cattura dell'esoma, acqua priva di nucleasi e potenziatore di ibridazione sono stati aggiunti in modo sequenziale. È stato avviato il programma di ibridazione di 16 ore (18:00–10:00).

Cattura di bersagli ibridi su perle di streptavidina

Le perle di streptavidina sono state lavate tre volte con il tampone di legaggio. Dopo l'ibridazione di 16 ore, la miscela è stata aggiunta alle sfere e incubata a 25 °C per 30 minuti, con miscela delicata ogni 5 minuti. Il lavaggio è stato eseguito con il tampone di lavaggio di cattura 1 a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi con tampone di lavaggio di cattura 2 preriscaldato (48 °C), inclusa l'incubazione a 48 °C. Dopo il lavaggio finale, la pellet è stata risospesa in 23 μL di acqua priva di nucleasi.

Preparazione del DNA a singolo filamento (ssDNA)

Ventiquattro microlitri di tampone TE sono stati aggiunti e la miscela è stata denaturata a 95 °C per 3 minuti, per poi essere immediatamente messa sul ghiaccio. È stato aggiunto un master mix contenente buffer di legatura a stecca e una rapida legasi di DNA, e il programma SS-2 (37 °C, 30 min) è stato eseguito per circolarizzare il DNA monofilato. È stato aggiunto il buffer di digestione e la miscela di enzimi digestionali, e è stato eseguito il programma SS-3 (37 °C, 30 min). Successivamente, sono stati aggiunti 3,75 μL di buffer di arresto di digestione. Sono stati aggiunti ottantacinque microlitri di perle magnetiche, seguiti dalla purificazione standard delle perline. Quindici microlitri di surnatante furono trasferiti in un nuovo tubo; la concentrazione attesa era di 0,8–2 ng/μL.

Preparazione della nanosfera del DNA (DNB)

I prodotti ssDNA venivano utilizzati per la formazione del DNB. Sono stati aggiunti buffer di formazione DNB, tampone TE a basso contenuto EDTA e miscele enzimatiche DNB 1 e 2. I programmi DNB-1 e DNB-2 venivano eseguiti in sequenza. Dopo il completamento, sono stati aggiunti 20 μL di buffer DNB reaction stop e miscelati delicatamente (5–8 volte) usando punte di pipetta a largo diametro; La concentrazione prevista era di 8–40 ng. I DNB preparati venivano caricati sulla piattaforma di sequenziamento delle nanosfere per il DNA per un sequenziamento ad alta velocità.

Sequenziamento, elaborazione dei dati e analisi del segnale

Le letture di sequenziamento raw erano controllate in qualità usando FastQC (v0.11.9) e fastp (v0.23.1). La soglia rapporto segnale-rumore (SNR) di 20 dB è stata ottimizzata utilizzando l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) rispetto a un dataset di riferimento di varianti autoinfiammatorie note, bilanciando un tasso di false scoperte (FDR) dell'<1% con una sensibilità target del >95% per varianti a bassa frequenza; le letture inferiori a questa soglia di 20 dB sono state scartate. L'allineamento al genoma di riferimento del Genome Reference Consortium Human Build 38 (GRCh38) e alla chiamata iniziale delle varianti è stato effettuato utilizzando BWA-MEM (v0.7.17) e il Genome Analysis Toolkit (GATK, v4.2.6).

Per i passaggi di elaborazione del segnale basati sulla fisica, le sequenze di nucleotidi sono state convertite in segnali numerici binari (0 che rappresenta le purine; 1 che rappresenta le pirimidine). Per calcolare la DFT, il segnale binario è stato elaborato con una finestra scorrevole di N = 512 coppie di basi e una sovrapposizione del 50% (passo di 256 bp) per mantenere una risoluzione genomica localizzata. La DFT era definita come:

Per filtrare artefatti di sequenziamento ad alta frequenza senza livellare eccessivamente le vere varianti a nucleotide singolo (SNV), che si manifestano come transizioni locali acute ad alta frequenza, è stato calibrato programmaticamente un filtro digitale passa-basso. La frequenza di taglio (fc) normalizzata ottimale è stata determinata iterativamente scansionando l'intervallo di 0,05–0,25 cicli/base. L'algoritmo di ottimizzazione ha selezionato fc = 0,15 cicli/base, definito come il punto di flessione in cui lo spettro di potenza del segnale ha trattenuto l'≥85% della varianza totale delle varianti note di controllo true-positive, eliminando al contempo il rumore tecnico di fondo. Il filtraggio basato su DFT veniva applicato utilizzando script personalizzati scritti in Python (v3.9), utilizzando specificamente le librerie NumPy (v1.23.0) e SciPy (v1.9.1), per ridurre il rumore ad alta frequenza preservando le caratteristiche spettrali associate alle mutazioni. I parametri di filtraggio venivano calibrati iterativamente in modo programmativo per evitare un eccessivo smoothing di segnali varianti rari. Il flusso di lavoro integrato per l'elaborazione del segnale e la modellazione biofisica è riassunto nella Figura 2.

Modellazione biofisica e stocastica della segnalazione dell'interferone

Per indagare le conseguenze funzionali delle varianti identificate, la dinamica delle vie JAK–STAT è stata modellata utilizzando equazioni differenziali ordinarie (ODE) definite come:

Simulazioni deterministiche di ODE venivano eseguite utilizzando COPASI (Complex Pathway Simulator, v4.36) e corroborate con script Python personalizzati utilizzando il modulo scipy.integrate.solve_ivp. Sono state stabilite condizioni iniziali biologicamente realistiche e sono state effettuate analisi di sensibilità su costanti di velocità di amplificazione utilizzando SALib (Sensitivity Analysis Library in Python, v1.4.5). La cinetica di segnalazione IFN-α mediata da TYK2 è stata incorporata per simulare l'amplificazione STAT2 guidata dal guadagno di funzione.

Gli effetti stocastici sono stati introdotti utilizzando una formulazione di Langevin:

dX = f(X) dt + g(X)dW

Inoltre, sono state condotte simulazioni stocastiche di Gillespie utilizzando la libreria Python GillesPy2 (v1.7.0) per modellare il bursting trascrizionale e l'attivazione eterogenea del gene stimolato da interferone (ISG) indotta da IFN-β. Le funzioni di ritardo distribuite rappresentate da formulazioni gamma-kernel sono state implementate in Python utilizzando l'integrazione numerica per simulare meccanismi di retroazione trascrizionale ritardata. Tutte le pipeline computazionali, inclusi il filtraggio del segnale e la modellazione matematica, venivano eseguite su un ambiente di calcolo ad alte prestazioni (HPC) basato su Linux.

Figura 2. Framework integrato per l'elaborazione del segnale e la modellazione biofisica della segnalazione JAK-STAT. 1: Fase di elaborazione del segnale: mappatura binaria delle sequenze nucleotidiche (purine = 0, pirimidine = 1) seguita da filtraggio basato su DFT. Si noti la soglia critica SNR a 20 dB per una chiamata variante accurata. 2: Modellazione biofisica: Simulazione basata su ODE dei tassi di amplificazione in cui piccole perturbazioni nelle condizioni iniziali portano a spostamenti di soglia nella segnalazione sostenuta. 3: Fenotipo biologico: modellazione delle varianti di guadagno di funzione di TYK2 nella via IFN-α, che porta a un'attivazione amplificata di STAT2 e a fenotipi di interferonopatia conseguenti. Abbreviazioni: DFT = trasformata di Fourier discreta; IFN-α = interferone alfa; JAK-STAT = trasduttore del segnale della chinasi di Janus e attivatore della trascrizione; ODE = equazione differenziale ordinaria; SNR = rapporto segnale-rumore; STAT2 = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 2; TYK2 = tirosina chinasi 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Figura 2 riassume l'integrazione dell'elaborazione del segnale basata su DFT con componenti di modellazione ODE e stocastica utilizzati nel flusso di lavoro computazionale esplorativo. Questo protocollo completo integra genetica molecolare avanzata, tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, algoritmi di elaborazione del segnale e modellazione biofisica per supportare la rilevazione e l'interpretazione funzionale delle varianti associate all'interferonopatia nella vasculite autoinfiammatoria pediatrica.

Quadro statistico e distribuzione di probabilità di mappatura dei segnali

Per formalizzare la mappatura digitale delle sequenze genomiche prima del filtraggio del segnale, è stato stabilito un quadro di conversione binaria basato sulla biochimica dei nucleotidi. Per una data finestra genomica strutturale di lunghezza N, le purine {A, G} sono mappate a un valore digitale di 0, mentre le pirimidine {C, T} sono mappate a 1. Secondo l'ipotesi nulla (H0) di una distribuzione genomica di fondo uniforme e non bilanciata, questa conversione binaria segue un quadro di sperimentazione di Bernoulli. La funzione di massa di probabilità (PMF) del segnale mappato X è definita come segue

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x per x ∈ {0,1}

dove p = 0,5 rappresenta la probabilità di incontrare un residuo di pirimidina su una traccia di fondo non selezionata. Quando si scala questa conversione su basi sequenziali per il calcolo della densità spettrale di potenza (PSD) tramite la DFT, la distribuzione cumulativa del rumore di fondo si comporta come una camminata casuale, convergendo in una distribuzione di rumore bianco gaussiano secondo il Teorema Centrale del Limite. Di conseguenza, lo spettro di potenza normalizzato di questa distribuzione nulla segue una distribuzione chi-quadrato (χ²) con 2 gradi di libertà. Per mantenere una soglia di significatività statistica rigorosa (α = 0,05), la soglia di intensità di potenza critica per definire un vero picco di segnale variante patogeno è stata calcolata analiticamente utilizzando la seguente integrazione di densità di probabilità:

Soglia = - In(a) x a²

dove σ² rappresenta la varianza operativa del rumore genomico locale di fondo. Qualsiasi picco spettrale superiore a questa soglia (p < 0,05, equivalente a un SNR > 20 dB) era prioritizzato per porte di filtrazione in silico a valle, assicurando che la chiamata variante fosse guidata dai dati e meno influenzata dal rumore di sequenziamento stocastico.

Efficienza operativa e analisi dei costi (Figura 3)

Dal punto di vista traslazionale e dell'implementazione clinica, l'efficienza operativa, il tempo di risposta clinica (TAT) e la sostenibilità economica di questo protocollo integrato sono stati confrontati con le vie diagnostiche tradizionali, come il sequenziamento sequenziale di Sanger o i panel genici mirati a restrizioni. Mentre le odisee diagnostiche convenzionali per la vasculite pediatrica o le sospette interferonopatie di tipo I spesso durano 8–12 settimane a causa di test iterativi su un singolo gene, il flusso di lavoro semplificato — che comprende WES ad alto throughput, ibridazione ottimizzata a 16 ore e filtraggio parallelo del segnale DFT su un cluster di calcolo ad alte prestazioni (HPC) — raggiunge un TAT clinico totale riportato di 10–14 giorni dalla ricezione iniziale del campione fino al rapporto molecolare finale. Inoltre, grazie all'efficiente multiplexing dei campioni (aggregazione di otto campioni di pazienti per blocco di ibridazione), il costo del reagente principale e del sequenziamento è stato segnalato tra circa 250 e 300 dollari per paziente, rispetto ai tradizionali panel completi che spesso superano i 1.200–1.800 dollari. Questa compressione sia dei quadri temporali diagnostici che dei costi suggerisce che il flusso di lavoro bioinformatico ispirato alla fisica proposto possa essere fattibile e scalabile per laboratori clinici di genetica di routine.

Risultati

In questa coorte di 132 pazienti con varianti associate all'interferonopatia identificate, è stato individuato un ampio spettro di varianti genetiche (Tabella 1). Dei pazienti, 53 (40,2%) erano donne e 79 (59,8%) uomini. L'età media era di 10,2 anni (intervallo: 0–18 anni). I dati a livello di paziente corrispondenti alla coorte finale sono forniti nella Tabella Supplementare S1.

Tabella 1: Distribuzione e classificazione delle varianti genetiche associate all'interferonopatia di tipo I identificate all'interno della coorte autoinfiammatoria pediatrica (n = 132). Clicca qui per scaricare questa tabella

I geni più frequentemente colpiti sono stati ADAR (25 pazienti, 18,94%) e DNASE1 (24 pazienti, 18,18%). Le varianti di DNASE1 erano esclusivamente di classe 3 (100% all'interno del gene; 18,18% della coorte totale). Analogamente, la maggior parte delle varianti ADAR era di classe 3 (24 pazienti, 96,00%; 18,18% della coorte), con una sola variante di classe 2 (4,00% all'interno del gene; 0,76% della coorte) (Tabella 2).

Tabella 2: Varianti identificate nel pannello NGS per malattie rare. Clicca qui per scaricare questa tabella

Anche varianti in STING1 (20 pazienti, 15,15%) e RNASEH2B (14 pazienti, 10,61%) erano comuni. Tutte le varianti STING1 erano di classe 3 (100%). Per RNASEH2B, 10 pazienti (71,43%) avevano varianti di classe 3 (7,58% della coorte), mentre 4 pazienti (28,57%) avevano varianti di classe 2 (3,03% della coorte).

RNASEH2A mutazioni sono state identificate in 13 pazienti (9,85%), tutti portatori di varianti di classe 3 (100%). Le mutazioni TREX1 erano presenti in 10 pazienti (7,58%), inclusi 8 varianti di classe 3 (80,00%; 6,06% della coorte) e 2 varianti di classe 2 (20,00%; 1,52% della coorte).

Le varianti SAMHD1 sono state rilevate in 9 pazienti (6,82%), con 7 pazienti portatori di varianti di classe 3 (77,78%; 5,30% della coorte), 1 paziente portatore di una variante di classe 1 (11,11%; 0,76%) e 1 paziente portatore di una variante di classe 2 (11,11%; 0,76%).

RNASEH2C mutazioni sono state riscontrate in 8 pazienti (6,06%), tutti di classe 3. DNASE1L3 mutazioni sono state identificate in 6 pazienti (4,55%), inclusi 5 varianti di classe 3 (83,33%; 3,79% della coorte) e 1 variante di classe 2 (16,67%; 0,76%). Sono state rilevate mutazioni di PSMB8 e COPA ciascuna in 5 pazienti (3,79%), con tutte le varianti di classe 3 (100%). Le mutazioni DNASE2 e STAT4 erano presenti ciascuna in 3 pazienti (2,27%), con tutte le varianti classificate come classe 3.

Nel complesso, le varianti di classe 3 costituivano la classe predominante in quasi tutti i geni della coorte. I siti specifici delle varianti, incluse le sostituzioni dettagliate dei nucleotidi e le corrispondenti alterazioni degli amminoacidi tra i geni target, sono catalogati nella Tabella 3.

Analisi esplorativa delle prestazioni di elaborazione del segnale

Per esplorare la robustezza e la sensibilità della pipeline di elaborazione del segnale basata su DFT, è stato condotto un benchmark comparativo rispetto al flusso di lavoro standard di chiamata di varianti solo GATK, concentrandosi specificamente sulle regioni genomiche a bassa copertura (profondità < 30x). Nel benchmarking preliminare, la disposizione integrata del filtraggio DFT ha mostrato una potenziale tendenza a una migliore priorità in alcune regioni a bassa copertura, suggerendo una stima esplorativa del recupero fino al 96,8% in queste specifiche condizioni di controllo di laboratorio. È importante sottolineare che questi parametri e metriche numeriche di efficienza rappresentano risultati preliminari ed esplorativi calibrati all'interno del contesto istituzionale specifico della coorte, piuttosto che una pipeline clinica universalmente validata. Il gasdotto recuperò anche varianti true-positive precedentemente scartate nelle regioni ad alto rumore. Inoltre, il FDR è stato ridotto dal 6,4% all'1,2%, evidenziando la potenziale robustezza del filtro passa-basso nell'eliminare artefatti di sequenziamento ad alta frequenza. Tra le varianti nuove identificate nella coorte, 14 varianti (rappresentanti il 17,7% dei risultati nuovi), prevalentemente situate in regioni di copertura non uniforme in STING1 e TREX1, sono state inizialmente classificate come artefatti di bassa qualità secondo soglie algoritmiche standard ma sono state recuperate e validate con successo dal sequenziamento Sanger seguendo il protocollo di potenziamento del segnale a rumore. Questa osservazione analitica suggerisce che valutare le caratteristiche fisiche del segnale possa essere uno strumento utile nei flussi di lavoro di ricerca esplorativa.

Benchmarking comparativo con flussi di lavoro standard

Per valutare le prestazioni comparative di questo framework integrato, è stata effettuata un'analisi di benchmarking affiancata su due pipeline standard di chiamata di varianti: il workflow GATK Best Practices (BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6) e DeepVariant (v1.5). Le metriche di performance sono state calcolate utilizzando un sottoinsieme di validazione ad alta fiducia della coorte, valutato tra regioni genomiche a bassa copertura (profondità < 30x) e ad alto rumore. L'architettura comparata è riassunta nella Tabella 4.

Parametrizzazione quantitativa e validazione dei modelli computazionali

Per fondare i quadri biofisici e stocastici in termini quantitativi, le EDO e le simulazioni di Gillespie sono state parametrizzate utilizzando valori cinetici empirici calibrati secondo condizioni di controllo sperimentali. Le simulazioni continue di ODE tracciano la concentrazione assoluta di STAT2 fosforilato ([STAT2p]) su un percorso di 720 minuti dopo l'esposizione simulata all'interferone di tipo I. Nel modello computazionale wild-type (WT), la cascata di segnalazione ha mostrato un'attenuazione omeostatica rapida, caratterizzata da un picco di attivazione a t = 45 min seguito da una rapida liberazione guidata da feedback negativo programmato (k3 = 0,45 min-1) tramite espressione simulata di SOCS1. Al contrario, la modellazione delle variazioni di guadagno di funzione (GoF) nelle vie STING1 e TYK2 ha rivelato gravi spostamenti di soglia, con conseguente uno stato iperinfiammatorio persistente e non attenuante. L'emivita del segnale (t1/2) e le variazioni di piegamento a stato stazionario sono riassunte nella Tabella 5.

Dichiarazione di Disponibilità Dati

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level dati clinici corrispondenti alla coorte finale sono forniti nella Tabella Supplementare S1. Le soglie discrete di elaborazione digitale del segnale, le formulazioni matematiche, le configurazioni dell'ambiente software e i parametri computazionali necessari per replicare il filtraggio DFT e le simulazioni delle vie biofisiche (ODE e modellazione stocastica) sono state rese pubbliche. Per garantire un accesso permanente e senza ostacoli ai lettori, questo framework di replica è stato depositato su GitHub e archiviato permanentemente in Zenodo tramite DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. Le librerie software open source standard e le piattaforme di calcolo numerico utilizzate in questo flusso di lavoro, come NumPy, SciPy e COPASI, sono accessibili al pubblico.

Figura 3. Architettura di storyboard operativo e pipeline basata sui dati per l'identificazione e la modellazione biofisica di varianti associate all'interferonopatia di tipo I. Lo schema delinea un flusso di lavoro cronologico e sperimentale a quattro livelli, che integra l'analisi clinica delle coorti con l'elaborazione biologica del segnale. (A) Stratificazione delle coorti e pipeline NGS: flusso di lavoro per la coorte autoinfiammatoria pediatrica (n = 132) sottoposta a WES. L'inserimento mostra tracce rappresentative di punteggio FastQ con controllo qualità FastQ, passando alla chiamata di varianti GATK/DeepVariant e alla generazione finale di matrice VCF. (B) Elaborazione del segnale basata su DFT: traduzione algoritmica del testo genomico in segnali genomici numerici per la riduzione del rumore. Il grafico basato sui dati incorporati traccia una distribuzione dello spettro di potenza, identificando frequenze varianti patogeniche (picchi di segnale) contro il rumore di fondo genomico con una soglia SNR di >20 dB. (C) Gate di curazione in silico : funnel di priorità multilivello che integra linee guida ACMG a 5 livelli di patogenicità, HGMD e controlli incrociati di Infevers per dare priorità alle 79 varianti nuove e 13 riportate. (D) Validazione della modellazione biofisica funzionale: livello di validazione biologica. Il framework deterministico ODE e le curve di simulazione stocastiche di Gillespie sono integrati come componenti grafiche, tracciando il recupero del percorso temporale di 720 minuti e la segnalazione sostenuta della cinetica cellulare di tipo selvatico rispetto a quella simulata mutante. Abbreviazioni: ACMG = American College of Medical Genetics and Genomics; DFT = trasformata di Fourier discreta; GATK = Toolkit per l'Analisi del Genoma; HGMD = Human Gene Mutation Database; NGS = sequenziamento di nuova generazione; ODE = equazione differenziale ordinaria; SNR = rapporto segnale-rumore; VCF = formato di chiamata variante; WES = sequenziamento dell'intero esoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 3: Controllo completo di annotazioni e locus database delle varianti genetiche associate all'interferonopatia di tipo I identificate all'interno della coorte pediatrica (n = 132). Criteri ACMG (dalle linee guida ACMG/AMP del 2015): i codici di evidenza ACMG/AMP sono stati raggruppati per forza di evidenza. Evidenze molto forti includevano PVS1, che si riferisce a varianti previste di perdita di funzione in geni in cui la perdita di funzione è un meccanismo patologico affermato. Forti evidenze includevano PS1–PS4, che coprivano le variazioni degli amminoacidi già stabilite, la conferma dell'occorrenza de novo, le evidenze funzionali di supporto e l'aumento della frequenza delle varianti negli individui colpiti. Le evidenze moderate includevano PM1–PM6, inclusa la localizzazione in un dominio critico o in un punto caldo mutazionale, assenza o frequenza molto bassa nei database di popolazioni, occorrenza trans nei disturbi recessivi, variazioni della lunghezza delle proteine, nuovi cambiamenti missense nei residui con noti variazioni patogene e presunto occorso de novo. Le prove a supporto includevano PP1–PP5, tra cui cosegregazione, vincolo di missense specifico per geni, prove in silico , specificità fenotipica e precedenti segnalazioni affidabili di patogenicità quando non erano disponibili prove indipendenti. Clicca qui per scaricare questa tabella

Tabella 4: Confronto delle prestazioni affiancato delle pipeline di chiamata di varianti in regioni genomiche ad alto rumore. Una valutazione di benchmark è stata condotta in aree a bassa copertura (<30x) per valutare le prestazioni del filtro passa-basso DFT basato sulla fisica nell'eliminare il rumore di sequenziamento e proteggere i segnali veramente positivi rispetto alle configurazioni algoritmiche standard. Abbreviazioni: DFT = trasformata di Fourier discreta. Clicca qui per scaricare questa tabella

Tabella 5: Parametri cinetici quantitativi e variazioni in stato stazionario della segnalazione JAK-STAT a valle. Riepilogo dei confini di simulazione di ODE e stocastica di Gillespie su un percorso di 720 minuti, evidenziando il fallimento dell'attenuazione omeostatica cellulare nei modelli che portano variazioni patogeniche di STING1 e TYK2. Abbreviazioni: JAK-STAT = trasduttore del segnale della chinasi Janus e attivatore della trascrizione; ODE = equazione differenziale ordinaria; STING1 = stimolatore dell'interattore cGAMP 1 della risposta all'interferone; TYK2 = tirosina chinasi 2. Clicca qui per scaricare questa tabella

Tabella supplementare S1. Dataset a livello di paziente per la coorte pediatrica con varianti associate all'interferonopatia. La tabella fornisce i dati a livello di paziente corrispondenti alla coorte finale di 132 pazienti analizzata nel manoscritto. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

I passaggi critici del protocollo includono frammentazione del DNA, ligatura degli adattatori, amplificazione PCR e circolarizzazione del DNA a singolo filamento (ssDNA). Durante queste fasi, è essenziale un'esecuzione meticolosa per minimizzare il rischio di contaminazione. Sono obbligatori lavaggi precisi con etanolo e tempi di incubazione magnetici adeguati durante la purificazione a base di perle, poiché le deviazioni possono causare una riduzione della resa del prodotto o la mancata rilevazione di varianti. Durante la preparazione della biblioteca in pool, è necessario un calcolo accurato di 93,75 ng per paziente e un'accurata regolazione del volume.

Per l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi dei protocolli, le misurazioni di quantificazione fluorometrica basse, in particolare le concentrazioni di ssDNA al di sotto della soglia di 0,8–2 ng/μL, possono richiedere un aumento della profondità di sequenziamento o un accorciamento dei tempi di asciugatura delle perne per migliorare la sensibilità alla chiamata della variante. Nei casi di sospette varianti mosaici, l'integrazione di tecnologie di sequenziamento a lunga lettura può migliorare la precisione della rilevazione. Inoltre, il trasferimento rapido dei campioni sul ghiaccio dopo la digestione enzimatica è fondamentale per mantenere la stabilità del prodotto^12,13. Durante la preparazione del DNB, la pipettura lenta e delicata, insieme all'aggiunta attenta del buffer di stop, preserva l'integrità della nanosfera. Questo è particolarmente importante per stabilire le correlazioni genotipo-fenotipo nelle interferonopatie a esordio precoce come^{SAVI 6,11}.

Questa analisi genetica basata sul WES fornisce un quadro per valutare varianti associate all'interferonopatia nei pazienti pediatrici con caratteristiche autoinfiammatorie e vasculite. Identificando varianti in geni chiave come DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 e COPA, lo studio evidenzia l'eterogeneità genetica alla base dei fenotipi vasculici guidati dall'interferone. La frequenza di varianti nel metabolismo degli acidi nucleici e nei geni di rilevamento, in particolare DNASE1 e ADAR, in questa coorte è coerente con il ruolo centrale della segnalazione interferonica di tipo I disregolata nella patogenesi della vasculite pediatrica e delle malattie autoinfiammatorie. Questi risultati sono coerenti con rapporti precedenti che collegavano questi geni a interferonopatie e manifestazioni^{vasculitiche 4,5,7}.

Elucidando le presentazioni simili alla vasculite delle sindromi autoinfiammatorie monogeniche, come il coinvolgimento polmonare cutaneo e interstiziale osservato nella SAVI, questo approccio può facilitare una diagnosi precoce e aiutare a guidare terapie anti-interferone ^4,5,7. Le interferonopatie monogeniche possono replicare clinicamente la vasculite associata all'ANCA e altri vasculitidi infantili, sottolineando l'importanza del test genetico nei casi atipici o resistenti^{al trattamento 9,10,11}. Una diagnosi genetica precoce può anche consentire l'avvio tempestivo di trattamenti mirati come gli inibitori JAK, che hanno mostrato benefici clinici nei pazienti con mutazioni STING1 e altre correlate^{all'interferone 7,13,14}.

Questo studio rafforza anche che una proporzione significativa di pazienti pediatrici presenti con vasculite autoinfiammatoria complessa ospita varianti rare o nuove nei geni correlati all'interferonopatia. L'identificazione di 79 nuove varianti in questa ampia coorte amplia lo spettro genetico noto e potrebbe contribuire a migliori correlazioni genotipo-fenotipo nella vasculite infantile.

Una considerazione operativa in questo flusso di lavoro esplorativo riguarda la valutazione dei limiti di soglia, poiché deviazioni nei parametri SNR esplorativi possono alterare l'output del filtraggio. Ad esempio, il filtraggio basato su DFT delle distribuzioni dei nucleotidi aiuta a ridurre il rumore nelle letture ma richiede una calibrazione per evitare un eccesso di livellamento dei segnali di mutazione; La risoluzione dei problemi include l'aggiustamento iterativo dei parametri binari di mappatura (0 per le purine, 1 per le pirimidine) per ottimizzare l'estrazione delle caratteristiche¹⁵. Nella modellazione biofisica, definire le condizioni iniziali per le EDO è essenziale, poiché piccole perturbazioni nei tassi di amplificazione possono modificare i comportamenti di soglia, potenzialmente sottostimando la segnalazione sostenuta dell'interferone. I dettagli potenziati di JAK-STAT includono la modellizzazione del ruolo di TYK2 nella segnalazione IFN-α, dove le varianti di guadagno di funzione amplificano l'attivazione di STAT2, portando a fenotipi di^{interferonopatia 20}.

Le modifiche al metodo possono includere l'integrazione di elementi stocastici per ambienti cellulari rumorosi, come l'aggiunta di termini di rumore di Langevin agli EDO:

dX = f(X)dt + g(X)dW

dove dW, il termine elencato, rappresenta il rumore del processo di Wiener, migliorando il realismo nella simulazione della variabilità^{JAK-STAT 21}. Le simulazioni stocastiche delle vie dell'interferone, utilizzando algoritmi di Gillespie, catturano l'eterogeneità nell'espressione di IFN-β dovuta a loop di retroazione negativa, dove differenze cellula a cellula nei livelli di fattori di trascrizione portano a distribuzioni bimodali di attivazione^{ISG 22,23}. La risoluzione dei modelli di percorso prevede la validazione con dati sperimentali IFN-β; Se l'amplificazione diverge, controlli negativi come i tassi di attivazione della fosfatasi possono essere ricalibrati, oppure possono essere incorporati ritardi distribuiti per la trascrizione:

con kernel gamma per processi ritardati.

Rispetto al sequenziamento del genoma completo (WGS), questo approccio focalizzato sul WES può essere conveniente ma meno completo per le regioni non esoniche^24,25. L'ambito di questo quadro preliminare è limitato a fornire un modello di simulazione biochimica di supporto per valutare come le variazioni matematiche si corrispondano al comportamento stimato della segnalazione dell'interferone, come si osserva nei modelli di soglia in cui gli effetti cumulativi superano valori critici che portano a lesioni vascolari. Le limitazioni del metodo includono la possibilità di trascurare varianti mosaic a basso livello e la necessità di validazione funzionale di nuovi^{risultati 6}.

Questa tecnica ha potenziali applicazioni in immunologia e medicina vascolare, inclusa la guida delle terapie anti-interferone simulando gli impatti delle varianti sulle vie e l'arricchimento di database per la diagnostica delle malattie^{rare 19}. Le estensioni stocastiche possono ulteriormente permettere la previsione di risposte eterogenee nelle interferonopatie, facilitando la medicina personalizzata.

In questo studio, la valutazione genetica nella vasculite pediatrica viene enfatizzata insieme a strumenti diagnostici convenzionali come l'istopatologia e le modalità di imaging. Nel complesso, questo studio evidenzia l'importanza della valutazione genetica nella vasculite pediatrica, sottolineando al contempo la frequenza delle varianti associate all'interferonopatia identificate tra i pazienti sottoposti ad analisi genetica per sospette malattie autoinfiammatorie. Valutando l'impatto di queste varianti sulle vie di segnalazione dell'interferone e sottolineando l'importanza di una diagnosi precoce nella vasculite pediatrica, questo lavoro contribuisce all'arricchimento delle banche dati di malattie rare relative a disturbi vascolitici e autoinfiammatori e fornisce spunti per futuri studi che indagano la patogenicità delle varianti e i polimorfismi specifici della popolazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipette regolabili (P2, P10, P20, P200, P1000)	Qualsiasi fornitore		Per una gestione accurata dei liquidi
Centrifughe da banco	Qualsiasi fornitore		Per brevi centrifugazioni di tubi PCR
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (o equivalente)	Mix master di amplificazione PCR
Etanolo (grado di biologia molecolare)	Qualsiasi fornitore		Usato per preparare la soluzione di lavaggio 80% etanolo
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Incluso nel kit o separato	Primers per l'amplificazione della libreria
Tubi PCR a basso legame (0,2 mL)	Qualsiasi fornitore		Tubi PCR sterili
Supporto magnetico / Supporto magnetico	Qualsiasi fornitore		Per la separazione delle perle magnetiche
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Sequenziatore di prossima generazione da banco che utilizza la tecnologia DNBSEQ (DNA Nanoball Sequencing); supporta diverse lunghezze di lettura (ad es. SE50 a PE300); output ad alto rendimento fino a 1440 Gb per corsa; ideale per applicazioni WES, WGS e sequenziamento mirato.
Kit di circolarizzazione MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) o 1000005260 (V2.0)	Kit di circolarizzazione per la generazione di DNA circolare monocatenario (ssCirDNA); la versione con doppio barcode riduce l'indice hopping; passaggio essenziale post-preparazione della libreria per la formazione di DNB nel flusso di lavoro di sequenziamento MGI.
Perle di pulizia MGIEasy DNA	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Perle magnetiche per la purificazione del DNA
Kit di preparazione DNB MGIEasy/ Kit di preparazione DNB	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (integrato con circolarizzazione a doppio barcode) o DNB Make correlato (ad es. 940-000036-00 Onestep DNB)	Modulo di preparazione DNA Nanoball (DNB); include circolarizzazione e generazione di nanosfere per il caricamento della flow cell; ultima fase nell'elaborazione della libreria per i sequenziatori DNBSEQ (spesso combinato con il Kit di circolarizzazione).
Kit accessori per cattura esomica MGIEasy	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (o equivalente)	Contiene soluzione bloccante, bloccanti universali MGI, Enhancer, tampone di legame, tampone di lavaggio 1 & 2 e perle di streptavidina
Sonde per cattura esomica MGIEasy V4 (o sonde Twist CES, compatibili con MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (per MGIEasy) o Twist Bioscience (per Twist)	1000007745 (set sonde V4, 16 RXN) o 1000007740 (sonde); Twist: Personalizzato / specifico per il pannello (basato sull'ordine, nessun numero standard)	Sonde di cattura esomica basate sull'ibridazione; si rivolgono a ~59 Mb di regioni codificanti (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); progettate per un arricchimento ad alta efficienza nei flussi di lavoro WES su piattaforme DNBSEQ; utilizzate con il Kit accessori MGIEasy per l'ibridazione (pre-incubazione a 65°C, 16 ore a 65°C), aggiunta del bloccante, cattura con perle di streptavidina (tampone di legame, tampone di lavaggio 1/2 a 48°C), eluizione e amplificazione PCR post-cattura (compatibile con il mix Equinox).
Kit MGIEasy per ibridazione e lavaggio rapidi	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Reagenti per l'ibridazione e il lavaggio
Kit MGIEasy per la preparazione della libreria FS DNA	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (set 16 RXN) o 1000005256 (kit core 96 RXN)	Kit per la preparazione della libreria del DNA basato sulla frammentazione rapida; frammentazione enzimatica con input di gDNA da 5–400 ng; compatibile con le piattaforme DNBSEQ per una costruzione efficiente della libreria WGS/WES.
Acqua priva di nucleasi	Qualsiasi fornitore		Grado di biologia molecolare
Kit Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Per la quantificazione della libreria
Kit Qubit ssDNA Assay (opzionale)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Per la quantificazione di ssDNA dopo la circolarizzazione
Perle magnetiche di streptavidina	MGI Tech	Incluse nel kit accessori	Per l'ibrido cattura
Buffer TE (pH 8,0)	Qualsiasi fornitore		Per la fase di denaturazione
Termociclatore	Vari (Bio-Rad, Thermo, ecc.)		Usato per frammentazione, legatura, PCR e programmi DNB
Vortice	Qualsiasi fornitore		Per il mix dei campioni
Puntalette per pipette a canale largo	Qualsiasi fornitore		Richiesto per la preparazione DNB