Fenotipizzazione comportamentale multimodale degli stati depressivi indotti dallo stress in Drosophila melanogaster

Sommario

Questo protocollo fornisce un quadro per valutare i cambiamenti comportamentali indotti dallo stress in Drosophila melanogaster. Combinare saggi complementari consente la quantificazione dell'attività, dell'esplorazione e del processo decisionale per singole mosche. L'approccio è flessibile e può essere adattato a una vasta gamma di studi che indagano la biologia dello stress, il metabolismo e la funzione neurocomportamentale.

Abstract

I disturbi metabolici, neurodegenerativi e legati allo stress sono spesso accompagnati da alterazioni della locomozione, decisioni compromesse e una riduzione della flessibilità comportamentale. Tuttavia, i quadri comportamentali multimodali accessibili per quantificare questi fenotipi in Drosophila melanogaster restano limitati. Qui viene presentato un protocollo che integra l'esposizione al nuoto forzato, il comportamento e la manovrabilità nel labirinto a Y, la fototaxi e la valutazione dell'attività nel sistema FlyVac, l'esplorazione in campo aperto e il monitoraggio locomotorio a lungo termine utilizzando il Drosophila Activity Monitor. Questi saggi complementari catturano molteplici dimensioni del comportamento, tra cui output motorio, motivazione, struttura decisionale e variabilità comportamentale, come letture funzionali degli stati neurali e metabolici. La pipeline è scalabile, riproducibile e adattabile a manipolazioni farmacologiche, genetiche e ambientali, fornendo un quadro versatile per rilevare fenotipi comportamentali legati allo stress, al metabolismo e alla neurodegenerazione in Drosophila.

Introduzione

Alterazioni comportamentali come cambiamenti nella locomozione, nel processo decisionale e nell'attività esplorativa sono ampiamente utilizzate come indicatori a livello organismo dello stato neurale e fisiologico. Attraverso i taxa, la disfunzione neurale si manifesta spesso come alterazione della struttura del movimento, riduzione della motivazione esplorativa, compromesso del comportamento decisionale guidato sensorialmente e cambiamenti nella prevedibilità comportamentale. Poiché questi outputs a livello di organismo integrano lo stato neurale, metabolico e fisiologico, forniscono letture scalabili per rilevare fenotipi rilevanti per la malattia. Tuttavia, nonostante l'ampio uso di Drosophila melanogaster nella genetica molecolare e nelle neuroscienze, i quadri comportamentali multimodali standardizzati che catturano contemporaneamente le prestazioni locomotorie, la struttura decisionale e la variabilità comportamentale rimangono limitati.

Gli organismi modello sono essenziali per studiare i meccanismi alla base dei fenotipi legati allo stress e neuropsichiatrici, poiché la manipolazione sperimentale controllata è spesso impossibile negli esseri umani. Le sindromi comportamentali legate allo stress si verificano in molti taxa, inclusi gli insetti, e coinvolgono sistemi neuromodulatori conservativi, come serotonina e dopamina, oltre a vie metaboliche di segnalazione. La mosca della frutta è quindi emersa come un potente sistema per collegare la disfunzione molecolare agli esiti comportamentali a livello organismo grazie al suo breve tempo di generazione, alla trattabilità genetica e alla conservazione delle vie rilevanti per^{la malattia 1,2}.

Allo stesso tempo, molti saggi comportamentali in Drosophila sono tipicamente applicati in isolamento, rendendo difficile distinguere tra effetti generali della malattia, deficit motorio, cambiamenti motivazionali e alterazioni comportamentali a livello decisionale. Inoltre, le misure comportamentali medie da sole possono oscurare fenotipi biologicamente significativi, poiché le perturbazioni neuromodulatrici e dello sviluppo spesso alterano la variabilità comportamentale piuttosto che la produzione comportamentale media. È quindi necessario un approccio comportamentale multimodale che combini saggi locomotori, esploratori, sensoriali e decisionali per generare firme fenotipiche a livello di^{organismo robuste 3}.

Qui, viene presentato un pipeline comportamentale multimodale che integra esposizione al nuoto^{forzato 4,5}, comportamento e manovrabilità del labirinto^{a Y} 6,7,8,9, fototaxi e valutazione dell'attività utilizzando il sistema FlyVac ^10,11, esplorazione in campo^{aperto 12} e monitoraggio locomotorio a lungo termine tramite il Drosophila Activity^{Monitor 5,13} (Figura 1). Ogni saggio in questo contesto cattura una dimensione comportamentale distinta rilevante per i fenotipi legati allo stress. Il test di nuoto forzato misura il comportamento passivo di coping, in cui una transizione precoce all'immobilità riflette una minore motivazione a sostenere risposte di fuga. I saggi a campo aperto e DAM quantificano l'attività locomotoria generale e la struttura circadiana, fornendo misure di base della produzione motoria e dell'attivazione. Il saggio Y-maze cattura la struttura decisionale attraverso sequenze di scelte sinistra–destra, permettendo di stimare sia il bias di rotazione (lateralizzazione) sia la variabilità comportamentale come misura della prevedibilità. Infine, il saggio FlyVac valuta il processo decisionale guidato sensorialmente e il comportamento di approccio-evitamento attraverso scelte fototattiche ripetute. Insieme, questi saghi forniscono letture complementari che distinguono i cambiamenti nell'attività, nella motivazione e nel comportamento a livello decisionale.

Questo protocollo cattura aspetti complementari di output motorio, motivazione, struttura decisionale e variabilità comportamentale, fornendo un quadro scalabile per rilevare fenotipi comportamentali legati allo stress, metabolici e neurodegenerazioni in D. melanogaster¹⁴. L'obiettivo principale di questo studio è stabilire un quadro multimodale di fenotipizzazione comportamentale che integri saghi complementari per catturare molteplici dimensioni del cambiamento comportamentale indotto dallo stress. Il paradigma delle tensioni viene utilizzato qui come perturbazione standardizzata per dimostrare la sensibilità e l'applicabilità del framework.

Protocollo

Il test di nuoto forzato è stato condotto secondo i principi dei 3R (Sostituzione, Riduzione e Affinamento). La sostituzione è stata ottenuta utilizzando Drosophila melanogaster come modello di invertebrati, evitando così paradigmi di nuoto forzato nei vertebrati che sono sempre più limitati per ragioni etiche. La riduzione è stata supportata dalla natura ad alto rendimento del saggio, che consente un'inferenza comportamentale robusta da coorti relativamente piccole minimizzando l'uso animale. Il perfezionamento è stato risolto limitando l'esposizione al nuoto a 2 minuti, una durata che previene l'esaurimento o l'annegamento e permette il pieno recupero del normale comportamento locomotore immediatamente dopo il test. Insieme, queste considerazioni garantiscono che il saggio fornisca dati comportamentali significativi minimizzando il potenziale disagio e massimizzando l'accettabilità etica, anche in ambito educativo.

1. Induzione di uno stato simile a una depressione in Drosophila (protocollo di stress da vibrazione)

1. Raccogliere il maschio D. melanogaster entro 24 ore dall'eclosione sotto leggera anestesia CO₂. Tutti i dettagli sono menzionati nella Tabella dei Materiali.
2. Posizionare le mosche in gruppi di 10 in fiale di polipropilene o acrilico (95 mm di lunghezza × 25 mm di diametro interno) sigillate con tappi di cotone.
3. Espone le mosche alle vibrazioni meccaniche (300 Hz) utilizzando una piattaforma vibrante.
4. Applicare cicli ripetuti composti da 45 minuti di vibrazione seguiti da 15 minuti di recupero in fiale contenenti cibo standard.
5. Continua i cicli di vibrazione per un totale di 6 ore al giorno.
6. Ripeti il protocollo per lo stress per 3 giorni consecutivi.
7. Mantenere il controllo delle mosche in condizioni di alloggiamento identiche senza esposizione alle vibrazioni.
   NOTA: Nel presente protocollo, sono stati utilizzati solo mosche maschi per ridurre la variabilità associata alle differenze fisiologiche e comportamentali specifiche per sesso, inclusi lo stato riproduttivo e le influenze ormonali. Questa standardizzazione facilita la rilevazione degli effetti comportamentali indotti dallo stress in un contesto controllato. Tuttavia, il protocollo è pienamente applicabile alle femmine di mosca, e le risposte specifiche per sesso rappresentano un'area importante per future indagini. Dato che la sensibilità ai fenotipi legati allo stress e a quelli simili alla depressione può variare in base al sesso e all'età tra i taxa, inclusa Drosophila, estendere questo quadro a diversi gruppi demografici può fornire ulteriori intuizioni biologiche. Questo paradigma è adattato da modelli consolidati di stress vibrazionale incontrollabile che inducono alterazioni motivazionali e di attività nelle mosche.

2. Test di nuoto forzato in Drosophila melanogaster

ATTENZIONE: Il dodecilsolfato di sodio (SDS) è un irritante. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (ad esempio, guanti e protezioni oculari) durante la preparazione e la gestione delle soluzioni SDS. Evita il contatto visivo con pelle e viso. Smaltire i rifiuti contenenti SDS in conformità con le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica.

1. Raccogli le mosche adulte entro 24 ore dall'eclosione e mantienile sotto luce costante e condizioni ambientali controllate.
2. Prepara vetri a camera multi-pozzo e riempi ogni pozzo con ~2 mL di soluzione SDS allo 0,08% a temperatura ambiente.
3. Trasferisci una singola mosca in ogni pozzo immediatamente prima della registrazione. Non è richiesta l'anestesia.
4. Registra il comportamento usando una telecamera dall'alto per 2 minuti per quantificare la latenza alla prima immobilità.
5. Quantifica la latenza alla prima immobilità.
6. Rimuovere le mosche dopo aver registrato e posizionarle su carta assorbente per confermare il recupero della locomozione normale.
   NOTA: L'immobilità è definita come la cessazione dei movimenti di fuga attivi mantenendo la posizione in superficie. Per registrare parametri aggiuntivi come la durata totale dell'immobilità e il numero di episodi di immobilità, sono necessarie durate di registrazione più lunghe (ad esempio, 3 minuti). Questo saggio riflette un comportamento passivo di coping; La ridotta latenza all'immobilità è interpretata come una diminuzione della motivazione a sostenere risposte di fuga. Variabilità della latenza all'immobilità / immobilità totale tra mosche. Questo saggio può indurre stress transitorio o affaticamento. Quando viene utilizzato in progetti longitudinali, eseguilo prima di altri saggi e consente un recupero sufficiente (ad esempio, ≥24 ore) prima dei test successivi.

3. Monitoraggio a lungo termine dell'attività locomotoria utilizzando il Drosophila Activity Monitor (DAM)

1. Anestetizzare brevemente le moscerini della frutta (5 s) usando CO₂ per lo smistamento.
2. Metti singole mosche in tubi DAM di vetro contenenti cibo e plug^{di cotone 17}.
3. Inserire i tubi nel sistema Drosophila Activity Monitor.
4. Registrare attività locomotoria in modo continuo (48 h) in condizioni di temperatura controllata e luce e buio.
5. Memorizzare i conteggi dei raggi usando software di acquisizione.
6. Compila i dati di attività in intervalli di tempo definiti (ad esempio, 1–10 minuti).
7. Escludere le mosche che muoiono o non mostrano attività dopo l'acclimatazione.
   NOTA: Un monitoraggio locomotorio continuo per un periodo di 48 ore è sufficiente per catturare i modelli di attività circadiana. DAM: variabilità nella distanza totale, velocità e struttura del prossimo tra individui.

4. Analisi motorica a campo aperto

1. Anestesiano brevemente (5 s) le moscerini della frutta usando CO₂.
2. Trasferire le singole mosche in arene rettangolari di 25 x 75 mm (una mosca per arena).
3. Permettere alle mosche di acclimatarsi (20 min) all'ambiente dell'arena prima di registrarsi sotto una luce bianca diffusa costante e di bassa intensità.
4. Registra il comportamento sotto illuminazione costante utilizzando un sistema automatizzato di tracciamento video.
5. Analizza le traiettorie utilizzando un software di tracciamento per estrarre:
   Distanza totale percorsa
   Velocità media del motore
   Accelerazione e metriche di virata
   NOTA: Questo saggio fornisce una base per interpretare i cambiamenti comportamentali legati allo stress. Il periodo di acclimatazione minimizza lo stress indotto dalla maneggevolezza e permette alle mosche di abituarsi all'arena, assicurando che l'attività locomotoria registrata rifletta il comportamento di base. L'illuminazione costante è stata utilizzata per ridurre la variabilità associata alle fluttuazioni circadiane e per garantire condizioni comportamentali coerenti tra le prove. Le traiettorie possono essere estratte utilizzando software di tracciamento automatizzato come EthoVision XT (Noldus Information Technology), oppure alternative open source come Ctrax, idTracker e TrackMate (ImageJ/Fiji), a seconda della disponibilità e delle preferenze dell'utente. Saggio in campo aperto: variabilità nella distanza totale, nella velocità e nella struttura del punto tra individui. Per ridurre gli effetti di ordine, standardizza le condizioni di acclimatazione e illuminazione tra le sessioni. Quando vengono condotti più test sugli stessi individui, mantenere costanti le durate dell'esposizione nell'arena.

5. Comportamento di rotazione a Y e saggio di variabilità comportamentale

1. Anestesiare brevemente (5 s) le moscerini della frutta usando CO₂.
2. Posiziona mosche singole nelle camere del labirinto^{a Y 8,9}. I labirinti venivano tagliati in acrilico nero spesso 1,6 mm usando un incisore laser. Abbiamo posizionato le mosche in una serie di 95 labirinti individuali, ciascuno composto da tre braccia simmetriche (lunghe 12 mm e larghe 3,3 mm).
3. Permette alle mosche di esplorare liberamente per lunghi periodi di registrazione (20 min).
4. Registrare le decisioni di rotazione (a sinistra o a destra) durante la locomozione esplorativa (1 ora).
5. Calcola il bias di virata individuale come proporzione di virate a destra. Calcolare metriche rilevanti come velocità, accelerazione, movimento senza movimento, variazioni temporali nell'attività ^12,15.
6. Quantificare la variabilità comportamentale tra mosche usando la deviazione assoluta mediana (MAD) del bias di virata.
   NOTA: Questo saggio misura la maneggiabilità locomotoria e la prevedibilità comportamentale indipendentemente dai livelli complessivi di attività. Le sequenze di rotazione catturano la struttura decisionale; Il bias di svolta riflette la lateralizzazione, mentre la variabilità tra individui riflette la prevedibilità comportamentale. bias = proporzione di virate a destra (per mosca); variabilità = dispersione (MADn) del bias tra le mosche. Per test ripetuti, si consideri di bilanciare l'ordine dei sami tra individui o coorti per controllare gli effetti della sequenza.

6. Scelte fototattiche: monitoraggio dell'attività nell'apparato FlyVac

1. Carica singole mosche nelle camere^{FlyVac 6, 11} senza usare anestesia al CO₂.
2. Consentire l'acclimatazione (10 minuti) prima di iniziare le prove.
3. Presenta scelte binarie ripetute di luce-oscurità a ciascuna mosca.
4. Registra le scelte su 40 trial utilizzando la rilevazione automatica.
5. Calcola la probabilità di scelta della luce per mosca e il tempo medio tra una scelta di luce e l'altra come misura dell'attività.
6. Quantificare la variabilità comportamentale tra gli individui che utilizzano MAD.
   NOTA: Il sistema FlyVac consente la valutazione simultanea del bias decisionale medio e della variabilità interindividuale. I saggi comportamentali descritti in questo protocollo sono modulari e possono essere condotti in sequenze diverse a seconda del disegno sperimentale. Tuttavia, per minimizzare i possibili effetti di riportazione, si raccomanda di eseguire il test del nuoto forzato prima di altri saggi. Per ridurre gli effetti di ordine, standardizza le condizioni di acclimatazione e illuminazione tra le sessioni.

7. Analisi dei dati

NOTA: Le analisi comportamentali sono state effettuate utilizzando mosche individuali come unità di inferenza, salvo diversa indicazione.

1. Test di nuoto forzato: Analizza manualmente le registrazioni video o utilizzando un software di valutazione comportamentale.
   NOTA: L'immobilità era definita come l'assenza di movimenti di fuga attivi mentre la mosca rimaneva a galla. I seguenti parametri sono stati estratti per mosca: latenza alla prima immobilità ( o prime).I confronti di gruppo sono stati effettuati utilizzando test statistici non parametrici a causa della distribuzione non normale delle misure comportamentali.
2. Attività locomotoria a lungo termine (DAM): conteggio record di rotture del fascio da parte del Drosophila Activity Monitor. Esporta e invia in intervalli di 10 minuti.
   NOTA: Per ogni mosca, sono stati calcolati i conteggi totali dell'attività e i modelli circadiani. Questi pattern possono essere calcolati in R, Python o Excel—a seconda di quale sia disponibile. Le mosche che mostrano inattività dovute alla mortalità o a artefatti tecnici sono state escluse prima dell'analisi. Il test è durato 48 ore.
3. Saggio per locomotori in campo aperto: Elaborare i dati di tracciamento video utilizzando software di tracciamento automatizzato. Importa i file video in EthoVision XT. Esegui il tracciamento utilizzando il rilevamento automatico con soglia basata sul contrasto.
   NOTA: Le traiettorie sono state smussate utilizzando l'algoritmo di filtraggio predefinito. I parametri locomotori per mosca (distanza, velocità, accelerazione) venivano esportati come file CSV per analisi a valle. I parametri per mosca della locomotore includevano: distanza totale percorsa (mm), accelerazioni (mm/^{s 2}). Le statistiche riassuntive sono state calcolate a livello individuale prima del confronto di gruppo. La durata di questo test è stata di 1 ora per ogni gruppo.
4. Comportamento di virata in Y-labirinto: Estrai le decisioni di virata dalle traiettorie registrate, classifica come sinistra o destra ed esporta come sequenze binarie (sinistra/destra) per ogni singolo.
   NOTA: Per ogni mosca, il bias di virata è stato calcolato come la proporzione di svolte a destra in tutte le decisioni registrate. La variabilità comportamentale tra mosche è stata quantificata utilizzando la deviazione assoluta mediana scalata (MAD_n = 1,4826 × MAD) del bias di virata. La durata di questo test è stata di 1 ora per ogni gruppo.
5. Scelte fototattiche FlyVac: Registra automaticamente le scelte binarie luce-buie. Per ogni mosca, si calcola la probabilità di scelta della luce (LCP) come proporzione di prove in cui è stato selezionato il braccio leggero. Esprimi il bias fototattico come media degli esiti binari delle prove (luce = +1, scuro = −1).
   NOTA: La variabilità tra mosche è stata quantificata utilizzando MAD_n degli indici fototaxi individuali.
6. Analisi statistica: Valutare le differenze tra gruppi nelle misure comportamentali utilizzando test basati su permutazioni con 10.000 randomizzazioni di etichette.
   NOTA: Per confrontare la variabilità, sono stati eseguiti test di permutazione sulle differenze assolute di_{MAD n} tra i gruppi. Gli intervalli di confidenza per le stime_{MAD n} sono stati ottenuti tramite il campionamento bootstrap. Un test t a due code non accoppiate è stato utilizzato per confrontare la distanza percorsa dalle mosche (mm) e l'accelerazione massima (mm/^{s 2}). Per la visualizzazione dei dati sono stati utilizzati grafici a violino (principalmente per mostrare densità, concentrazione e asimità), box plot e grafici a colonne. La significatività statistica è stata valutata a α = 0,05.

Risultati

L'applicazione del protocollo di stress da vibrazione ha prodotto alterazioni comportamentali misurabili attraverso molteplici saghi (Figura 1) progettate per catturare attività, comportamenti di coping e decisioni in D. melanogaster.

Induzione simile alla depressione

Le mosche esposte a vibrazioni meccaniche ripetute (Figura 1A) hanno mostrato una riduzione dell'attività esplorati...

Discussione

Il protocollo attuale dimostra un approccio multimodale per indurre e quantificare stati comportamentali simili alla depressione in D. melanogaster. Utilizzando un paradigma di stress basato sulle vibrazioni combinato con saghi comportamentali complementari, questo studio mostra che un'induzione simile alla depressione può essere rilevata attraverso misure di comportamento di coping, attività locomotoria, dinamiche esploratorie, decisioni e variabilità^comportam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura per l'anestesia: ad esempio, Benchtop Flowbuddy, Sistema Completo con Ultimate Flypad	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortex	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	Con tutte le piattaforme
Tappi in cotone per fiale strette	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Numero di catalogo: 51-101
Monitor di attività Drosophila (DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: non disponibile	32 tubi
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	Nome di catalogo: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	Versione 11.0.1
Webcam Logitech C920 HD Pro, lente HD 1080pNome di catalogo: HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland	RRID: non disponibile	La telecamera di registrazione soprastante utilizzata per FST
Fiala stretta per Drosophila, Polipropilene	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	Numero di catalogo: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, Paesi Bassi	RRID: SCR_000441	v. 15.0
Solfato di dodecil sodio (SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Germania	Nome di catalogo: Solfato di dodecil sodio (reagente ACS, ≥99% di purezza); RRID: non disponibile
ZEISS Stemi 508 Stereomicroscopio	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germania	15634448