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Articolo metodologico

Analisi metabolomica della risonanza magnetica nucleare dei mezzi di coltura embrionale umana esaurita: validazione del metodo e considerazioni tecniche

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DOI:

10.3791/71285

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31 luglio 2026

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per raccogliere, preparare e analizzare il mezzo di coltura embrionale umana esaurito utilizzando spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), consentendo la rilevazione riproducibile di metaboliti a basso peso molecolare da campioni su scala di microlitri in condizioni di coltura clinica di routine.

Abstract

I mezzi di coltura embrionale umana esauriti contengono metaboliti a basso peso molecolare che possono fornire una lettura non invasiva della fisiologia embrionale pre-impianto. Tuttavia, l'analisi metabolomica basata su risonanza magnetica nucleare (NMR) di questi campioni è tecnicamente complessa perché le condizioni di coltura embrionale di routine coinvolgono volumi di microlitri, integrazione proteica e sovrapposizioni di olio di paraffina che generano segnali di fondo e compromettono la qualità spettrale. Qui presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per metabolomica NMR per mezzi di coltura embrionale esauriti che incorporano la raccolta controllata di gocce per minimizzare la contaminazione da petrolio, rivestimenti di tubi di etilene propilene fluorurato (FEP) per isolare chimicamente il campione dal riferimento esterno (TMSP) accogliendo i volumi di microlitri, e l'acquisizione tramite una sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill per sopprimere i segnali di fondo macromolecolare. Il protocollo consente una rilevazione e quantificazione coerente di metaboliti a basso peso molecolare da embrioni umani colti singolarmente e supporta l'analisi riproducibile in condizioni di laboratorio di routine. A causa di numerose sfide tecniche, il metodo deve essere correttamente validato prima di poter essere utilizzato per scopi di ricerca o clinici.

Introduzione

Durante lo sviluppo pre-impianto in vitro, gli embrioni consumano continuamente e rilasciano metaboliti a basso peso molecolare nel mezzo circostante. La composizione del mezzo di coltura embrionale esaurito (SECM), quindi, riflette l'attività metabolica embrionale e fornisce una lettura funzionale non invasiva della fisiologia embrionale e della competenza dello sviluppo 1,2. L'analisi di questa impronta metabolica potrebbe integrare i metodi di valutazione convenzionali e migliorare le strategie di selezione degli embrioni nella tecnologia della riproduzioneassistita 3,4. In particolare, alterazioni nel ricambio degli amminoacidi e dei carboidrati sono state collegate al potenziale e alla vitalità dello sviluppo embrionale 5,6,7.

La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) è ampiamente utilizzata per la profilazione non mirata dei metaboliti di diversi campioni biologici, inclusi i mezzi di coltura embrionaleesauriti 8,9,10. Tuttavia, l'analisi di questi campioni rimane analiticamentecomplessa 11. Nella pratica clinica di routine, gli embrioni vengono coltivati in microambienti definiti progettati per imitare condizioni fisiologiche. I mezzi di coltura sono integrati con proteine, tipicamente albumina, per stabilizzare la pressione osmotica, legare composti tossici e fornire molecole portanti per lipidi e fattori di crescita che supportano lo svilupponormale 12. Per prevenire l'evaporazione e mantenere concentrazioni costanti di soluto, le gocce di coltura vengono sovrapposte con olio sterile diparaffina 13.

I lipidi provenienti da componenti sovrapposti di olio e proteine generano ampi segnali di fondo che oscurano le risonanze strette di metaboliti a basso peso molecolare come glucosio, piruvato e amminoacidi. Inoltre, l'analisi di volumi di campioni in microlitri in tubi NMR standard da 5 mm richiede una diluizione significativa per raggiungere il volume attivo della bobina RF. Questa riduzione della concentrazione di analiti riduce drasticamente il rapporto segnale-rumore (S/N), mascherando metaboliti a bassa abbondanza e ostacolando la quantificazione riproducibile. Sebbene numerosi studi abbiano applicato la metabolomica basata sulla NMR a mezzi di coltura embrionale umana esauriti, la mancanza di protocolli standardizzati e riproducibili di raccolta e preparazione ha limitato la riproducibilità e la comparabilità tra studi 8,9,11.

Qui presentiamo un flusso di lavoro metabolomico basato su NMR (Figura 1) progettato per superare le sfide tecniche associate al campionamento e all'analisi dei mezzi di coltura embrionale umana. L'approccio combina la raccolta controllata di gocce per ridurre il trasferimento di petrolio, l'acquisizione in volume di microlitri utilizzando liner di etilene propilene fluorurato (FEP) per evitare artefatti di diluizione e attenuazione macromolecolare del segnale tramite una sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).

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Protocollo

Questo studio è stato condotto tra gennaio e aprile 2023 presso il Dipartimento di Medicina Riproduttiva e Endocrinologia Ginaecologica del Centro Medico Universitario di Maribor, Slovenia. L'analisi NMR è stata effettuata presso l'Istituto Nazionale di Chimica di Lubiana, Slovenia. È stato ottenuto un consenso informato scritto da tutti i partecipanti. Ha ricevuto l'approvazione sia dal Comitato Etico Istituzionale (n.: UKC-MB-KME-21/1) sia dal Comitato Nazionale di Etica Medica (n.: 0120-37/2021/15).

1. Progettazione dello studio

NOTA: Lo studio ha analizzato i mezzi di coltura embrionale esauriti umani utilizzando metabolomiche basate sulla NMR.

  1. Raccogliere campioni dopo una coltura embrionale estesa a seguito dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). Raccogliere un numero uguale di campioni di controllo incubati non esauriti.

2. Raccolta di campioni

  1. Raccogliere campioni di substrati di coltura embrionale esauriti (SECM) dopo l'incubazione dell'embrione, come illustrato nella Figura 2.
  2. Dopo la rimozione dell'embrione dalla goccia di coltura, aspirare con cura l'olio sovrapposto in eccesso dalla superficie del piatto di coltura senza disturbare il mezzo (Figura 2, passo 1).
  3. Utilizzando una pipetta sterile, aspirare circa 35 μL di mezzo di coltura dalla goccia originale, lasciando circa 5 μL per evitare di assorbire residui di olio superficiale. Trasferire questo volume in una piastra di Petri sterile per formare una nuova goccia (Figura 2, passo 2).
  4. Sotto uno stereomicroscopio, ispezionare visivamente la goccia appena formata. Aspirare con attenzione circa 30 μL da questa goccia, lasciando ancora una volta circa 5 μL per minimizzare il trasferimento di olio. Trasferire questo volume in una seconda posizione sterile per formare una goccia più pulita (Figura 2, passo 3).
  5. Ispeziona visivamente la seconda goccia sotto ingrandimento. Identifica le regioni dove le gocce d'olio sono meno pronunciate. Inserire la punta della pipetta in questa regione e aspirare circa 25 μL di mezzo, lasciando ancora circa 5 μL per minimizzare il ritiro di olio (Figura 2, passo 4).
  6. Trasferire immediatamente i 25 μL raccolti in un tubo microcentrifuga sterile e privo di RNasi. Evitare di toccare le pareti interne del tubo durante la dispensazione del campione per evitare contaminazioni e perdite di campione. Congelare immediatamente tutti i campioni raccolti in azoto liquido e conservare a -80 °C fino all'analisi NMR (Figura 2, passo 5).
  7. Raccogliere gocce di controllo inutilizzate e non espulse abbinate (mezzo incubato senza embrioni) preparate, incubate e lavorate in condizioni di coltura identiche utilizzando gli stessi piatti di coltura, olio sovrapposto, durata di incubazione, ambiente dell'incubatrice e procedura di manipolazione sopra descritte per minimizzare la variabilità ambientale e il potenziale bias sistematico.
    NOTA: L'aderenza rigorosa al trasferimento sequenziale delle gocce e all'ispezione visiva riduce significativamente la contaminazione da petrolio. In questa fase, l'esperimento può essere sospeso e ripreso prima di ulteriori processi del campione per l'acquisizione della NMR.

3. Preparazione del campione per l'analisi NMR

  1. Scongelare i campioni a temperatura ambiente per ~10 minuti.
  2. Prepara la miscela NMR:
    1. Trasferire 25 μL di SECM in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 200 μL di D₂O. Vortizza per 10 secondi e poi centrifuga a 1000 × g per 10 secondi a temperatura ambiente.
  3. Inserimento del carico: trasferire 225 μL della miscela in un rivestimento FEP.
  4. Prepara il tubo di riferimento esterno.
    1. Riempire un tubo NMR da 5 mm con 150 μL di D₂O contenente 1 mM di sale di sodio acido 3-(trimetilsilil) 2,2,3,3-d4 acido (TMSP-d4).
  5. Assembla il campione: inserisci l'inserto FEP nel tubo NMR e sigilla con parafilm.

4. Acquisizione NMR e elaborazione spettrale

  1. Acquisire 1acquisizione H-CPMG utilizzando la sequenza di impulsi Bruker cpmgpr1d con: 64 scansioni; 65.536 punti dati; Ritardo di rilassamento: 8 s; Larghezza spettrale: 11,9 kHz; Tempo di eco: 400 μs × 80 anelli (filtro T₂ effettivo 32 ms); Tempo totale di acquisizione: ~15 min.
    NOTA: La durata efficace del filtro CPMG T₂ di 64 ms è stata selezionata sulla base dei protocolli metabolomici consolidati per campioni biologici contenenti proteine, dove questo valore consente una soppressione efficiente dei segnali macromolecolari preservando le risonanze metabolitiche a basso pesomolecolare 14.
  2. Eseguire l'elaborazione spettrale:
    1. Ottieni spettri di trasformata di Fourier.
    2. Applicare un allargamento esponenziale delle linee a 0,3 Hz.
    3. Esegui la correzione di fase e di base.
    4. Spettri di riferimento per TMSP-d4 a 0 ppm.
    5. Riferimento agli spostamenti chimici (δ) al segnale esternoTMSP-d 4 a 0 ppm.
      NOTA: Poiché la miscela del campione all'interno del liner FEP (225 μL) e la soluzione di riferimentoTMSP-d 4 esterna nel gap coassiale esterno (150 μL) occupano geometrie fisiche e volumi distinti all'interno della finestra attiva di rilevamento della bobina NMR, le loro intensità assolute del segnale non scalano 1:1. La quantificazione assoluta diretta usando il riferimento esterno richiede una curva di calibrazione geometrica specifica per sistema. Pertanto, dato il volume di campione strettamente costante e la precisione di pipettaggio altamente riproducibile di questo protocollo, gli integrali grezzi a secchio venivano utilizzati direttamente per tracciare le variazioni metaboliche relative tra campioni, escludendo la necessità di normalizzare il riferimento esterno o la somma totale dell'intensità.
  3. Esegui binning spettrale:
    1. Escludere la regione di risonanza dell'acqua (ad esempio, 4,65–5,00 ppm) e la regione di riferimento TMSP-d4 (ad esempio -0,05–+0,05 ppm) prima del binning.
    2. Dividere gli spettri in secchi di larghezza variabile per evitare la divisione dei picchi.
    3. Utilizzare integrali grezzi a secchio per l'analisi statistica invece di normalizzare al segnale esterno TMSP-d4, poiché il riferimento è fisicamente isolato nel volume esterno del bulbo. Questo approccio evita errori di quantificazione derivanti dai diversi volumi attivi dell'inserto rispetto al tubo esterno.
    4. Esportare integrali a secchio come matrice numerica di dati per analisi statistica.
      NOTA: Ogni "bucket" (o bin) rappresenta l'integrale numerico sommato di tutti i segnali NMR all'interno di un intervallo di ppm definito. Sebbene questi integrali riflettano la concentrazione relativa dei gruppi chimici presenti in quell'intervallo, un singolo secchio può contenere segnali provenienti da più metaboliti sovrapposti o solo una porzione del segnale totale di uno specifico metabolita.

5. Analisi statistica

  1. Importazione processata 1spettro H-CPMG in Python (v3.12) usando nmrglue15.
  2. Rimuovere l'acqua e le regioni spettrali TMSP-d4.
  3. Esporta integrali bucket per l'analisi.
  4. Esegui test statistici usando SciPy (v1.14.1):
    1. Valutare la normalità di ogni secchio spettrale utilizzando il test di Shapiro–Wilk.
    2. Applicare ANOVA unidirezionale (per dati normalmente distribuiti) o Kruskal-Wallis (per dati non parametrici) per identificare i bucket con differenze statisticamente significative tra il controllo incubato non esaurito e i mezzi esauriti.
    3. Per i secchi che mostrano differenze significative, eseguire l'assegnazione strutturale utilizzando una combinazione di esperimenti NMR 1D e 2D: 1 H-13CHSQC, 1 H-13C HMBC e 1 H-1H COSY.
    4. Confrontare le correlazioni 2D osservate con i database standard (ad esempio, HMDB) per verificare l'identità dei metaboliti che contribuiscono ai bucket discriminatori.

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Risultati

Il flusso di lavoro analitico per la profilazione metabolomica NMR non mirata del mezzo di coltura embrionale esaurito è riassunto nella Figura 1.

Rimozione della contaminazione da petrolio durante il campionamento
La Figura 2 illustra la procedura sequenziale di trasferimento delle gocce utilizzata per ridurre il trasferimento di olio sovrapposto. I campioni raccolti senza una pipettura attenta hanno mostrato ...

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Discussione

In questo studio, abbiamo affrontato le principali sfide analitiche associate all'identificazione e quantificazione dei metaboliti a basso peso molecolare nei mezzi di coltura embrionale esauriti utilizzando metabolomiche NMR non mirate. I nostri risultati mostrano che il flusso di lavoro ottimizzato consente l'acquisizione di spettri di alta qualità e ricchi di informazioni, adatti per la rilevazione affidabile di metaboliti a basso peso molecolare.

Un accura...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dall'Agenzia Slovena per la Ricerca e l'Innovazione (ARIS) [numero progetto P3-0327].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5 mm FEP tube linerSP Wilmad-LabGlass4682701Inserto interno per NMR coassiale
5 mm NMR tubeSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBTubo esterno
6-well culture plateOosafeOOPW-SW02Piatto per coltura embrioni
Cryogenic liquid nitrogenMesserContattare il produttoreCongelamento rapido del campione
Deuterium oxide (D2O)EurisotopD214LSolvente NMR
Micropipette (10–100 µL)Eppendorf4924000053Pipetta con volume regolabile
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL, RNase-freeEppendorfN216966NRaccolta e conservazione del campione
Mineral oilVitrolifeVTL-10029Strato di copertura per gocciolina di coltura
NMR spectrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlAcquisizione spettrale
Pasteur pipetteFalconFAL-357575Trasferimento gocciolina
Pipette, single-channel mechanicalSartorius728060Manipolazione campione
Pipette tips, sterileEppendorf22491148Compatibile con micropipetta
Pipette tips, sterile filterSartorius790201FBarriera contro gli aerosol
Sequential G-series culture mediaVitrolifeVTL-10143Medium di coltura embrioni
TMSP-d4 (sodium 3-trimethylsilylpropionate-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Riferimento spostamento chimico
Tubes, Safe-LockEppendorf0030121589Tubi di conservazione

Riferimenti

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