Valutazione in tempo reale e non invasiva della funzione mitocondriale tramite spettroscopia Raman a risonanza

Sommario

Presentiamo un metodo non invasivo e in tempo reale per monitorare la salute mitocondriale utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). Abbiamo utilizzato RRS per quantificare gli stati redox mitocondriali e sviluppato una metrica per la salute mitocondriale, il rapporto ridotto mitocondriale Resonance Raman (3RMR), che mostra una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione rispetto agli analiti ematici ematici e gasses.

Abstract

Sebbene i mitocondri siano centrali per la patogenesi e la progressione della malattia, la comprensione meccanicistica delle dinamiche della salute mitocondriale rimane costosa e inaccessibile. Per colmare questa lacuna, questo studio utilizza la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS) per valutare la funzione mitocondriale, utilizzando un sistema portatile che fornisce misurazioni in tempo reale, non invasive e quantitative degli stati redox del citocromo mitocondriale nel fegato di ratto. In questo protocollo dimostriamo l'uso di questa tecnologia, inclusi l'installazione, l'acquisizione dati e l'elaborazione dei dati. Questo studio presenta un esperimento proof-of-concept che evidenzia la capacità della RRS di misurare cambiamenti in tempo reale nello stato redox mitocondriale e, di conseguenza, nella funzione mitocondriale. Per un breve periodo, il dispositivo RRS era collegato a una pompa laser e a un computer di acquisizione dati e posizionato a 1 cm dal fegato del ratto.  I parametri di acquisizione sono stati selezionati in conformità con il protocollo del fegato del ratto; Gli stati redox sono stati misurati in condizioni ossigenate e ischemiche utilizzando un test di stress ossigeno. Le variazioni negli stati redox mitocondriali sono state monitorate durante il test di stress da ossigeno.

Introduzione

Le mitocondri svolgono un ruolo cruciale nella funzione cellulare e nell'omeostasi. I mitocondri sono i principali motori del metabolismo cellulare, regolando la generazione di ATP tramite fosforilazione ossidativa. Servono anche come organelli di segnalazione che dettano il destino cellulare regolando le vie apoptotiche, così come ROS e segnalazione Ca^{+2 1}. Pertanto, la disfunzione mitocondriale può portare a varie malattie neurodegenerative, muscolari e^{cardiovascolari 2,3}. Nonostante il ruolo cruciale che i mitocondri svolgono nella progressione della malattia, valutare la funzione mitocondriale può essere invasivo, costoso e limitato.

Indicatori chiave della funzione mitocondriale, come il tasso di consumo di ossigeno, la fosforilazione ossidativa e l'attività di vari complessi all'interno della catena di trasporto elettronico (ETC), sono misurati tramite respirometria. L'ETC è composto da quattro complessi (I–IV) incorporati nella membrana mitocondriale interna (IMM). Questi complessi, con l'aiuto di altri coenzimi, trasferiscono elettroni da substrati ridotti, come NADH e FADH2, all'accettore finale di elettroni,_O2, che viene poi ridotto ad acqua. La maggior parte degli saggi di respirometria contemporanei, come il Seahorse e l'Orobros O2k, richiede l'elaborazione dei tessuti, limitandone così l'applicazione nella ricerca^{traslazionale 4,5}. La misurazione del potenziale della membrana mitocondriale (MMP) è un altro metodo per valutare la disfunzione mitocondriale, che utilizza fluorofori lipofili cationici, come il JC-1, insieme all'imaging microscopico, dove i mitocondri accoppiati (sani) e non accoppiati (danneggiati) fluoresiscono con lunghezze d'onda^{diverse 6}. Tuttavia, questi saghi possono avere una bassa^{sensibilità 5}. Il colorante stesso può anche avere un'alta citotossicità a concentrazioni^{elevate 5}. Infine, analogamente alle misurazioni della respirometria, questa tecnica richiede anche l'elaborazione dei tessuti. Tecniche basate sulla spettroscopia sono state recentemente utilizzate come metodi non invasivi per valutare la salute mitocondriale. Ad esempio, la Spettroscopia di Risonanza Magnetica del Fosforo (P-MRS), un metodo che valuta il metabolismo cellulare misurando le concentrazioni di metaboliti contenenti fosforo, è stata utilizzata per caratterizzare tessuti adipogenici ingegnerizzati in fase di^{differenziazione 7}. Tuttavia, questa tecnica richiede anche attrezzature e formazione specializzate.

Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato una tecnica in tempo reale, non invasiva e altamente specifica per misurare lo stato redox mitocondriale come indicatore della vitalità dell'organo utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). La RRS utilizza lo scattering inelastico dei fotoni per la quantificazione degli stati redox dei citocromi mitocondriali. Gli anelli porfirinici in parti eme di molecole come citocromi mitocondriali, emoglobina e mioglobina producono uno spettro Raman caratteristico a seconda del loro stato di ossidazione quando eccitate con un laser⁸ a lunghezza d'onda da 441 nm. Sebbene il sistema RRS utilizzi una lunghezza d'onda di 441 nm, possono essere utilizzati anche laser con lunghezze d'onda da 420 nm e 405 nm, ognuno dei quali migliora preferenzialmente un diverso complesso di citocromi. Lo spettro ottenuto da un campione sconosciuto di interesse viene incrociato con librerie preregistrate di mitocondri completamente ossidati o ridotti intatti, fornendo il rapporto tra mitocondri ridotti e totali o lo stato redox medio dei citocromi ETC in situ . Questo rapporto è definito come il rapporto mitocondriale ridotto di risonanza Raman (3RMR).

Esistono 3 calcoli/tipi distinti di 3RMR: 3RMR mitocondriale (mito-3RMR), complesso III 3RMR (cIII-3RMR) e complesso IV 3RMR (cIV-3RMR). Ciascuno di questi indici viene calcolato attraverso la frazione di ridotta al numero totale di una determinata componente. Ad esempio, il 3RMR di cIII sarebbe il rapporto tra cIII ridotto e il numero totale di cIII nel tessuto (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Lo stesso schema vale per il cIV. Quindi, 3RMR-cIII si riferirebbe al rapporto tra cIII ridotto e la quantità totale di cIII, e 3RMR-cIV si riferirebbe al rapporto tra cIV ridotto e la quantità totale di cIV. Attraverso l'analisi di regressione, vengono calcolati gli stati redox mitocondriali (mito-3RMR) utilizzando librerie spettrali di mitocondri intatti, oppure vengono calcolati singoli stati redox complessi (cIII-3RMR e cIV-3RMR) utilizzando librerie spettrali cIII e cIV. Una recente pubblicazione⁹ ha dimostrato che il mito-3RMR è rappresentativo della media ponderata degli stati redox di cIII e cIV (o cIII-3RMR e cIV-3RMR). È importante notare che cI e cII non sono attivi da Raman né amplificati risonantemente attraverso la lunghezza d'onda di 441 nm. Di conseguenza, non vengono calcolati durante il calcolo del mito-3RMR.

Sfruttando questi tipi di 3RMR, abbiamo definito l'intervallo ottimale del 3RMR. Negli organi "sani", i mitocondri sono intatti e hanno un apporto sufficiente di ossigeno. Al contrario, gli organi danneggiati possono avere una fornitura o un utilizzo insufficiente di ossigeno, causando così l'accumulo di elettroni da parte dei complessi ETC. L'accumulo di elettroni causa uno "stress riduttivo", spostando i mitocondri dallo stato ossidato a quello ridotto e aumentando i valori di 3RMR. Diversi studi ^8,9,10,11,12, che riguardano cuori e fegati in modelli di roditori e suini, hanno iniziato a fare luce sull'intervallo ottimale "sano" per il 3RMR, che si propone sia compreso tra 10 e 30. Ad esempio, Perry et al. hanno sottoposto cuori di mammiferi all'ipossia, dove un 3RMR del 30% ha dimostrato fornire l'equilibrio ottimale tra sensibilità e specificità per rilevare tessuto^{ipossico 8}. Questa tendenza è stata ulteriormente confermata in ulteriori studi con tessuto^{cardiaco 11,12} e innesti^{epatici 10}. Inoltre, Nyugen et ^al.9 hanno dimostrato che i valori di 3RMR scendono a valori molto bassi (ossidati) per i tessuti in cui il metabolismo si è fermato, con livelli di 3RMR (7,667 ±± 4,926) di fegati ischemici caldi non trapiantabili dopo 3 ore di perfusione di macchine normothermiche, rispetto a valori di 3RMR superiori a 10 (~12–15) per fegati ischemici caldi freschi e^{trapiantabili 9}.

Oltre a queste dimostrazioni di come il 3RMR possa misurare la vitalità tissutale, la sensibilità, specificità e facilità d'uso del RRS lo rendono altamente applicabile a molti altri tipi di ricerca in cui il metabolismo cellulare e la funzione mitocondriale sono influenzati. In studi precedenti, il RRS è stato utilizzato per rilevare la degenerazione maculare e il glaucoma nei topi attraverso la valutazione dell'attività metabolica degli assoni non mielinizzati delle cellule gangliari retiniche situate nella testa del nervo^{ottico 13}. Inoltre, è stato utilizzato per rilevare la coartazione dell'aorta (CoA) in un modello ratto di cardiopatia congenita, una diagnosi spesso trascurata negli screening cardiaci^{neonatali 12}. Questa tecnologia è stata utilizzata per comprendere la funzione e la vitalità degli organi in varie condizioni sperimentali rilevanti nel campo del trapianto d'organo, inclusi studi che valutano la vitalità degli organi su perfusione di macchine^{ex vivo 10,11}, la riossigenazione post-static cold^{storage 14}, o la mitigazione del danno da reperfusione di fegati caldo-ischemici⁹.

Questo articolo mira a stabilire il RRS come uno strumento sensibile e in tempo reale per la valutazione della salute mitocondriale. Fegati interi di un modello ratto sono stati sottoposti a diversi livelli di ischemia e reperfusione di ossigeno come test di sforzo per valutare la risposta mitocondriale. In questo test da stress da ossigeno, i fegati freschi sono sottoposti a 5 minuti di flusso iniziale di perfusione, 5 minuti di ischemia e 5 minuti di reperfusione. Durante il test di sforzo sono state effettuate misurazioni di lattato, K+ e pressione parziale di ossigeno (pO2). Una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione è stata osservata con la 3RMR rispetto agli analiti ematici tradizionali. Con questi esperimenti, l'uso del RRS viene evidenziato non solo per studi meccanicistici, ma anche come metodo diagnostico e come banco di prova terapeutico. Pertanto, il protocollo condiviso potrebbe essere utile a una varietà di ricercatori che lavorano con i mitocondri. Nel complesso, il RRS, con la sua natura non invasiva, in tempo reale e altamente specifica, potrebbe avere un impatto sostanziale sul metabolismo cellulare.

Protocollo

Tutti gli animali per gli esperimenti sono stati mantenuti in conformità con le linee guida del National Research Council e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Configurazione e utilizzo dei RRS

1. Descrizione del dispositivo:
   NOTA: Il sistema RRS portatile (Pendar Technologies; il prodotto è solo per scopi di ricerca) utilizza un laser a 441 nm grazie a un potenziamento risonante dello spettro Raman dei citocromi mitocondriali con questa lunghezza d'onda. Il laser funziona tra 4 mW e 8 mW.
   1. Collega una sorgente di eccitazione laser a una sonda costruita su misura tramite un cavo in fibra ottica. La sonda illumina il tessuto con un punto laser di diametro di 2 mm e raccoglie lo spettro emesso. Lo spettro passa poi attraverso un filtro passa-banda ed è raccolto da un array di dispositivi accoppiati di carica (CCD). Lo spettro viene raccolto ogni secondo su un arco temporale di 180 gradi e mediato per creare uno spettro grezzo, ridotto dal rumore, per l'analisi.
   2. Il software confronta questo spettro ottenuto con librerie spettrali pre-misurate tramite un'analisi di regressione.
2. Procedura per le librerie di pre-registrazione
   NOTA: Per gli esperimenti presentati in questo articolo sono state create e utilizzate le forme ridotte e ossidate di biblioteche di mitocondri, complessi III e complessi IV, emoglobina e mioglobina. I segnali RRS di tutte le librerie venivano assorbiti in una scatola nera a temperatura ambiente (21 °C). Questi file della libreria sono forniti separatamente con il software di analisi. Tuttavia, a seconda del tessuto di interesse e della presenza di altre molecole attive Raman, si potrebbero creare anche altre librerie adattando adeguatamente il seguente protocollo. Gli spettri RRS grezzi delle librerie di emoglobina, mioglobina e complessi III/IV ossidati/ridotti sono forniti in Figura supplementare 1.
   1. Librerie di emoglobina (Figura supplementare 1C):
      1. Raccogli sangue fresco di roditori tramite dissanguinazione animale. Ossigenare il sangue raccolto usando ossigeno al 100%, oppure disossigenarlo usando azoto al 100%, in una cuvetta di vetro, aggiungendo ditionato di sodio.
      2. Misura il RRS di ogni stato attraverso la parete della cuvetta di vetro per 10 minuti, con la sonda RRS posizionata a 9 mm dalla cuvetta di vetro.
      3. Utilizzare i picchi spettrali a 1356 ^cm-1 per verificare lo stato deossigenato, e usare i picchi a 1376 ^cm-1 per confermare lo stato ossigenato.
   2. Librerie mitocondriali ridotte/ossidate (Figura 1)
      1. Isolare i mitocondri da cuori di roditori omogeneizzati e purificati in una cuvetta di vetro. Posiziona la sonda Raman a 9 mm dalla cuvetta di vetro e misura gli spettri di questi mitocondri attraverso la parete di vetro.
      2. Creare condizioni completamente ossidate fornendo un flusso di ossigeno al 100% ai mitocondri. Verifica lo stato ossidato in assenza del picco RR ridotto a 1357 ^cm-1.
      3. Creare condizioni completamente ridotte esponendo i mitocondri al 100% di azoto con piccole quantità di solfuro di idrogeno. Verifica le condizioni ridotte in assenza del picco ossidato del marcatore RR a 1371 ^cm-1.
   3. Complesso ossidato/ridotto III/IV (Figura supplementare 1A,B):
      1. Isolare i Complessi III e IV come descritto^{altrove 9,15,16,17}. In breve, utilizzare un campione stock di mitocondri isolati (corrispondenti a 200 nanomoli di citocromo a) come materiale di partenza.
      2. Diluire i mitocondri a 10 nmol citocromo A/mL in un tampone gelato C (50 mM Tris, 1 mM_{MgSO 4,} pH 8,45). Poi, aggiungi il 10% di goccia di n-β-D-dodecil maltoside (DM) goccia per goccia fino a una concentrazione finale dell'1%, mescolando delicatamente sul ghiaccio.
      3. Centrifugare l'estratto a 40.000 × g per 40 minuti a 4 °C. Applicare il sovrantantante su una colonna di vetro di 2,5 cm × 20 cm che è stata precedentemente riempita con una resina di scambio bilanciata con 5 volumi di colonna di tamponamento C (contenenti 0,02% w/v DM).
      4. Dopo il lavaggio con 2 volumi colonne di tampone C, eludi i complessi mitocondriali applicando un gradiente lineare di NaCl da 0–400 mM nello stesso tampone e raccogli l'eluto in frazioni di 4 mL.
      5. Le frazioni verdi contenenti il Complesso IV eluiscono vicino al centro del gradiente (~180 mL NaCl), prima delle frazioni rossastre contenenti il Complesso III. Concentrare le frazioni aggregate contenenti ogni complesso a 20–30 nmole di citocromo a/mL.
      6. Una volta isolati i singoli complessi, si espone ciascuno a condizioni di ossidazione e ridutzione. Ridurre un campione di 11 mM del Complesso III nel tampone Tris utilizzando 2 mL di ascorbato (1 M) per ridurre il citocromo c1 e 2 mL di HS (idrosolfito) per ridurre completamente i citocromi b_L e_{b H}.
      7. Ridurre un campione di 18,67 mM di Complesso IV in Tampone Tris in più fasi, poiché il Complesso IV subisce un processo di ossidazione catalitica a più fasi. Per ridurre completamente il Complesso IV, aggiungere due 2 mL di H₂O₂ (10 mM), seguiti da 2 mL di HS.
      8. Raccogli gli spettri della libreria dopo ogni aggiunta per catturare ogni fase del ciclo. Aggiungere spettri completamente ossidati e ridotti alla libreria di riferimento finale per rappresentare gli stati stazionari del complesso IV.
      9. Prepara tutti i campioni in una fiala di vetro da 1 mL e teneli in posizione fissa a 9 mm dalla lente della sonda, chiudendoli in una scatola nera per evitare contaminazioni da luce. Raccogli gli spettri RRS per 600 secondi per ogni complesso e stato di ossidazione.
      10. Validare la purezza di cIII e cIV isolati come descritto in^{precedenza 17}, e validare l'adeguatezza delle librerie spettrali isolate di cIII e cIV nell'spiegare gli spettri mitocondriali completi come descritto in un recente^{articolo 9}.
   4. Librerie di mioglobina (Figura supplementare 1D):
      1. Utilizzando flussi simili di ossigeno e azoto (con ditionite di sodio disciolto), varia la saturazione di ossimioglobina dell'estratto miocardico tra lo 0% e il 100%. Verifica gli spettri Raman tramite picchi di marcatore a 1355 ^cm-1 e 1376 ^cm-1.

NOTA: La maggior parte dei componenti spettrali descritti sopra, come l'emoglobina o i mitocondri ossidati/ridotti, sono molecole contenenti eme e sono eccitate dalla stessa lunghezza d'onda. Questo sistema RRS evita la sovrapposizione del segnale creando una libreria di regressione per ogni molecola basata sul suo segnale spettrale unico. Gli spettri diffusi ottenuti vengono eseguiti tramite un algoritmo di regressione contro le librerie selezionate. L'algoritmo di regressione fornisce un fattore per ogni spettro di libreria che rappresenta la stima più adatta del suo contributo relativo nello spettro registrato, e quindi della sua concentrazione relativa nel tessuto. Poiché l'algoritmo utilizza il miglior adattamento su un intervallo di numeri d'onda, piccole differenze nella posizione o intensità dei picchi spettrali dei vari componenti della libreria permettono alla regressione di distinguere anche cromofori strettamente correlati. Attraverso l'algoritmo di regressione e le librerie spettrali, il sistema RRS può scomporre il segnale totale e diffuso in varie componenti a seconda dei loro picchi spettrali unici, evitando la sovrapposizione del segnale da parte delle molecole contenenti eme. Per mostrare la relazione tra emoglobina e mitocondri, è inclusa la Figura Supplementare 2 , che fornisce immagini di spettri prelevati da una perfusione epatica, suddivisi nel segnale misurato, nella linea di miglior adattamento e nel residuo inspiegabile che deriva dalle differenze nei singoli picchi spettrali. Nel pannello A vengono selezionate librerie di regressione mitocondriale ridotte e ossidate di emoglobina e ossidata. La linea di miglior adattamento curata tra le librerie e l'analisi di regressione si sovrappone ordinatamente al segnale misurato, e c'è poco residuo inspiegabile. Nel pannello B vengono selezionate solo librerie di mitocondri ossidate e ridotte. Poiché esiste una grande struttura residua inspiegabile, il picco spettrale mitocondriale si sposta di diversi numeri d'onda rispetto a quello dell'emoglobina, che non era stata inclusa nell'analisi di regressione. Inoltre, nelle figure supplementari di Nguyen et ^al.9, gli autori spiegano la relazione tra mitocondri e i complessi individuali (cIII e cIV), così come la relazione tra i complessi^{individuali 16}, in cui il complesso III mostra picchi più netti e a frequenza più bassa, mentre il complesso IV mostra bande più ampie e spostate verso l'alto. Inoltre, gli autori mostrano che le librerie ridotte del Complesso III e del Complesso IV spiegano pienamente lo spettro misurato dei mitocondri interi ridotti, risultando in un residuo inspiegabile minimo.

Figura 1: Librerie spettrali di mitocondri completamente ossidati e ridotti. Gli spettri della libreria RRS sono stati ottenuti dopo che i mitocondri isolati sono stati forniti con (A) ossigeno al 100%, o azoto (B) al 100%, raggiungendo rispettivamente gli stati ossidato e ridotti. Questi stati sono stati confermati con la presenza di picchi ossigenati RR (C) e di marcatori ridotti (D). Lo spostamento di questi picchi corrisponde a variazioni nei modi vibrazionali molecolari in presenza di ossigeno. L'intensità di ogni picco è normalizzata a 1 unità di intensità arbitraria (UA), poiché il potenziamento dello stato ridotto è maggiore utilizzando questa lunghezza d'onda di eccitazione di 441 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta dati tramite RRS

1. Configurazione del dispositivo:
   1. Collega l'unità dello spettrometro (alloggiata all'interno di una scatola compatta) all'alimentatore a corrente continua (DC) e all'adattatore di alimentazione utilizzando i cavi forniti. L'unità dello spettrometro ha un tappo rotondo con rientranze di allineamento.
   2. Allinea le rientranze della spina rotonda con quelle del cavo collegato all'alimentatore. Non è necessaria alcuna pulizia prima di collegare le porte (Figura 2).
   3. Collega il computer che esegue l'analisi allo stesso adattatore di alimentazione che collega lo spettrometro e l'alimentatore usando i cavi forniti.
   4. Metti la sonda laser nel portasonde. Regola la posizione di questa sonda all'inizio dell'esperimento.
   5. Apri il software di controllo dello spettrometro (Software di Energetica Cellulare).
2. Configurazione software:
   NOTA: File di impostazioni e librerie di regressione per diversi tipi di tessuto sono forniti con il sistema. Questi file includono informazioni su quali librerie il sistema RRS dovrebbe includere nella regressione, quanti spettri sono inclusi nella finestra di regressione e altri parametri come la potenza laser. Le impostazioni predefinite possono essere modificate e un nuovo file di impostazioni salvato per l'uso in esperimenti futuri. Gli screenshot del software descritti di seguito sono presentati nella Figura Supplementare 3.
   1. All'apertura del software di controllo dello spettrometro, apparirà un grafico che mostra la percentuale di 3RMR, la saturazione di ossigeno (_{StO 2}) e la saturazione della mioglobina. Questa schermata è dove queste metriche verranno visualizzate, se selezionate, in tempo reale durante tutte le misurazioni. Clicca sulla scheda Impostazioni in basso a sinistra della pagina.
   2. Nella scheda Informazioni , inserisci le informazioni della sessione sotto Nome della sessione e eventuali dettagli necessari nella scheda Descrizione della sessione .
   3. Ci sono due modalità di raccolta dati. Usa la modalità Spot Check per accumulare spettri finché non vengono soddisfatte le metriche di qualità specificate (ad esempio, sigma target o finestra/numero di spettri di regressione), poi interrompi la registrazione. Usa la Modalità Continua per registrare gli spettri fino a quando non si preme il pulsante di stop. In entrambe le modalità, tutti i dati, sia i risultati 3RMR che gli spettri individuali, vengono memorizzati automaticamente. Questo esperimento utilizza la Modalità Continua.
   4. Una volta inserite tutte le informazioni sulla sessione, clicca sulla scheda Sistema .
   5. Sotto Impostazioni, seleziona il protocollo appropriato per il progetto (per perfusioni acellulari di fegato di ratto, scegli il protocollo Acellulare del Fegato di Ratto). Questo regolarà automaticamente il tipo di misurazione, la durata media della misurazione (finestra di regressione), così come il sigma target.
      1. Per creare un nuovo file di impostazioni, regola uno qualsiasi dei componenti elencati sopra, poi clicca sul pulsante Salva . Questo dovrebbe salvare questi parametri come file di impostazioni separato che poi può essere importato nel sistema.
      2. Per importare un nuovo file di impostazioni, clicca sul menu a tendina accanto a Default (Mod) e seleziona Importa file Nuove impostazioni. Clicca sul nuovo file Impostazioni per importarlo.
   6. Nella sezione Librerie di regressione, seleziona e conferma la combinazione di librerie da utilizzare per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Le librerie per mitocondri ridotti e ossidati [Solo Mito] sono state selezionate per questo esperimento. Altri utenti possono scegliere di utilizzare librerie che includono anche emoglobina, mioglobina o altri complessi presenti sotto la Biblioteca Avanzata.
   7. Seleziona e conferma la modalità di larghezza finestra preferita.
      1. Modalità di larghezza adattiva: Utilizzare la modalità di larghezza adattiva per aggiungere singoli spettri allo spettro mediato fino a raggiungere il massimo target sigma. Se il target sigma non viene raggiunto, la registrazione si interromperà quando raggiunge il limite superiore della finestra di regressione impostata (cioè il numero massimo di spettri che era stato indicato di registrare). I risultati della misurazione verranno visualizzati sullo schermo dopo aver raggiunto il target sigma minimo.
      2. Modalità a larghezza fissa: Utilizzare la modalità a larghezza fissa per aggiungere singoli spettri allo spettro medio fino a quando non viene incluso il numero target di spettri (impostato sotto la lunghezza media).
   8. Una volta completate le impostazioni di sistema, clicca sulla scheda Trama .
   9. Sotto Serie Principale, seleziona i componenti da tracciare e mostrare sullo schermo durante le misurazioni.
   10. Confermare che tutti i componenti di misura selezionati siano in linea con il protocollo di interesse.
3. Acquisizione dati:
   NOTA: Le misurazioni Raman dovrebbero essere effettuate in uno spazio buio. Prima di iniziare l'acquisizione dati, assicurati che lo spazio di lavoro sia il più schermato possibile dalla luce. Se la stanza non può essere completamente schermata dalla luce, il sistema RRS è dotato di una copertura nera con un'apertura rettangolare al centro (mostrata in Figura 2), attraverso il quale può essere posizionata la sonda laser. La scatola può coprire il campione/la sezione dell'organo da cui vengono prelevate le misurazioni RRS. Quando si lavora con il laser RRS, evita l'esposizione oculare diretta o prolungata. Non puntare un laser direttamente nell'occhio o sulle superfici riflettenti. Attiva il laser solo quando posizionato direttamente sul tessuto di interesse. Il laser RRS è un laser di Classe 3R quando usato a 4 mW, e di Classe 3B quando usato a 10 mW. Il laser è sicuro per il contatto con i tessuti.
   1. Seleziona le impostazioni pre-salvate, i parametri di registrazione e i file della libreria appropriati.
   2. Posiziona la sonda laser direttamente sopra il tessuto/organo di interesse. Posiziona la sonda il più perpendicolare possibile e a 1 cm dal tessuto. Usa un righello per misurare con precisione 1 cm dalla superficie dell'organo. Regolare la sonda per posizionarla più vicino a meno di 1 cm se il segnale non è chiaro. Tuttavia, assicurati che la sonda non tocchi mai il tessuto.
      NOTA: La sonda può essere portata, ma si consiglia di utilizzare un supporto/supporto per sonda che possa essere regolato e rimanga stabile. Posiziona la sonda il più perpendicolare possibile e a 1 cm dal tessuto. Un righello poteva essere usato per misurare con precisione 1 cm dalla superficie dell'organo. La sonda poteva essere regolata per essere posizionata più vicino a meno di 1 cm se il segnale non fosse chiaro. Tuttavia, la sonda non dovrebbe mai toccare il tessuto.
   3. Conferma che il punto laser sia sul lobo laterale sinistro, il più vicino possibile alla vena porta.
   4. Conferma che tutte le librerie selezionate, le impostazioni di regressione, il sigma target, la finestra di regressione e le modalità di acquisizione siano corretti e come desiderato.
      1. Assicurati che la stanza sia il più buia possibile. Verifica che la sonda non abbia alcuna contaminazione, specialmente sangue, sul finestrino. In caso di contaminazione, utilizzare una salvietta senza pelucchi e non abrasiva con alcol isopropilico al 70% per pulire la finestra di quarzo, seguita da un'asciugatura accurata con una salvietta a secco prima di procedere.
      2. In caso di forte contaminazione, pulire la sonda il più accuratamente possibile, come descritto sopra. Poi, calibra il dispositivo posizionando il laser in un involucro buio fodetratto con nastro nero e premendo il pulsante Take Dark . La calibrazione richiede circa 5–10 minuti. Indipendentemente dalla contaminazione, calibra il dispositivo una volta al mese e invierà messaggi di promemoria automatici.
         NOTA: Le spiegazioni di ogni metrica di controllo qualità, esempi di tali metriche QC e il segnale spettrale grezzo ottenuto da registrazioni ottimali e subottimali (File Supplementare 1, Figura 3, Figura Supplementare 3). Questi criteri di controllo qualità sono stati ottimizzati per fegati interi dal modello del ratto. Qualsiasi protocollo di nuova evoluzione che utilizza un organo/modello animale diverso dovrebbe affinare e adattare di conseguenza queste metriche.
   5. Nella pagina principale, clicca sul pulsante Start per iniziare ad acquisire dati. A seconda delle impostazioni scelte, il software prenderà registrazioni fino a raggiungere il valore di errore target (sigma) o 180 s. L'acquisizione dei dati è ora completata.
      1. Deducere la qualità del segnale RRS da questi grafici e valori per consentire l'aggiustamento della posizione della sonda o delle condizioni di misurazione (Figura 3). Se il segnale RRS ottenuto non soddisfa questi criteri di controllo qualità, si regola la sonda per renderla il più perpendicolare possibile e di circa 9 mm dalla superficie alla finestra della sonda.
   6. Una volta completato il protocollo di acquisizione dati/sperimenti, scartare tutto il fegato/tessuto in un contenitore per i rischi biologici. Pulire qualsiasi sistema o superficie che sia stata a contatto con l'organo/tessuto con il 70% di etanolo.
      1. Se si utilizza un sistema di perfusione, si fa passare acqua DI miscelata con detergente enzimatico (7,8 mL diluiti in 1 L di acqua deionizzata [DI]), seguita da acqua DI pulita.
         NOTA: Ogni registrazione verrà salvata come file di analisi separato sotto un nuovo file di sessione. I risultati per 3RMR e la forza del segnale mitocondriale (r3RMR) sono rappresentati nella finestra principale. Lo spettro grezzo può essere visualizzato anche. Altre metriche di controllo qualità, come la potenza residua del segnale e la potenza totale del segnale, saranno visualizzate nella scheda Spectrum .
4. Analisi dei dati:
   1. Una volta terminata l'acquisizione dati, clicca sulla cartella Revisioni in basso dello schermo per aprire il file sperimentale e vedere i risultati.
   2. In alternativa, apri un file di testo contenente i risultati. Seleziona il file della sessione di interesse. Si aprirà un file di analisi contenente tutte le misurazioni ottenute. Ogni parametro e il suo valore sigma avranno la propria colonna. Ad esempio, i valori di 3RMR ottenuti ogni secondo saranno elencati nella colonna "3RMR" e il loro valore sigma sarà elencato sotto "sigma_3RMR".
   3. L'ultima riga di ogni colonna conterrà i valori finali per ogni parametro di quel file di sessione. Usa questo valore per tracciare.
   4. Ripeti i passaggi per ogni file di sessione/ogni registrazione. Traccia i valori ottenuti come desiderato.

Figura 2: Configurazione del dispositivo RRS. Uno schema della configurazione del sistema RRS. La sonda è collegata tramite un cavo in fibra ottica al sistema RRS, che contiene la sorgente di eccitazione laser e lo spettrometro. Questa configurazione si collega poi a qualsiasi laptop che contiene l'app di controllo dello spettrometro per la raccolta e l'analisi dei dati. Sia il computer che l'unità spettrometrica sono collegati a una presa di corrente. Le misurazioni RRS dovrebbero essere effettuate al buio. Se la stanza non può essere completamente schermata dalla luce, il sistema RRS è dotato di una copertura nera con un'apertura rettangolare al centro, dove può essere posizionata la sonda laser. La scatola copre il campione/la sezione dell'organo da cui vengono prese le misurazioni RRS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di tracce e metriche di controllo qualità di tracce di qualità subottimale e qualità ottimale. Il segnale residuo (rumore) è segnato con una parentesi arancione, mentre il segnale mitocondriale con una parentesi verde. (A) Tracciamento di esempio da un segnale Raman subottimale. Il segnale residuo è troppo grande per essere differenziato dal segnale mitocondriale. I picchi spettrali sono indistinguibili lungo tutto il segnale misurato. (B) Traccia di esempio dal segnale Raman ottimale. Il segnale mitocondriale è visibilmente più ampio e distinto dal segnale residuo. I picchi spettrali derivanti dalla misura ottenuta sono distinguibili. (C) Metriche QC ottenute da ciascun segnale. Nel complesso, il segnale totale ottenuto nella lettura subottimale è inferiore a quella ottimale. Un maggiore segnale mitocondriale viene misurato nella registrazione ottimale rispetto a quella subottimale, con il segnale mitocondriale che rappresenta rispettivamente il 17% e il 14% del segnale totale. Il segnale è stato misurato con un errore del 4,3% nella lettura ottimale, in contrasto con un errore del 18,5% nella lettura subottimale. Analogamente, il segnale residuo inspiegabile rappresenta l'11% del segnale totale nella registrazione subottimale, mentre rappresenta il 3,6% nell'ottimale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione della salute mitocondriale tramite RRS

NOTA: La tecnologia di Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS) è stata impiegata per sviluppare una metrica di vitalità mitocondriale (3RMR) che indica la vitalità degli organi trapiantati. Questo studio mira a dimostrare come i cambiamenti nell'ossigenazione – e, di conseguenza, nella respirazione cellulare – si riflettano nelle tendenze del 3RMR rispetto ai biomarcatori tradizionali del danno, come il lattato e il K⁺. Qui viene utilizzato un test di stress ossigeno, in cui, dopo 5 minuti di perfusione continua, il flusso di perfusione ossigenata viene sospeso per 5 minuti, poi ripreso per 5 minuti. Durante il test di stress vengono prelevate misurazioni RRS, così come campioni di perfusione in ingresso e uscita.

1. Procuramento epatico:
   1. Sedate gli animali in una camera di induzione usando isoflurano al 3%–5%. Filtra il vapore in eccesso con carbone attivo.
   2. Eseguire un'epatectomia completa su maschi di ratti Lewis (150 g). Legare i rami della vena porta. Inietta 50 U di eparina sodica attraverso la VCI. Durante l'intervento, cannula la vena porta con un catetere da 16 G e risciacqua il fegato con 50 mL di soluzione salina.
   3. Mettere i fegati acquisiti sul ghiaccio in una piastra di Petri contenente 30 mL di soluzione dell'Università del Wisconsin (UW).
2. Configurazione della perfusione di macchine subnormotermiche (SNMP) e misurazioni Raman per risonanza:
   1. Configura il dispositivo RRS come descritto prima. Imposta il Protocollo Acellulare del Fegato di Ratto sul software di controllo dello spettrometro, che imposta automaticamente la modalità larghezza su larghezza adattiva, la lunghezza media a 180 e il sigma target a 1,5. Seleziona inoltre 3RMR e Fluorescenza come parametri di misura, oltre a Mito solo come libreria di regressione. Imposta la modalità acquisizione su modalità continua.
   2. Ha istituito il sistema SNMP come descritto^{altrove 18}.
      1. In breve, assicurati che l'impianto di perfusione includa una camera di perfusione, una pompa peristaltica, un ossigenatore a membrana e una trappola per bolle.
      2. Fornire ossigeno con una miscela atmosferica (95%_O2 e 5%_CO2); Mantieni_{pO 2} tra 400 e 500 mmHg. Monitorare la pressione intraepatica con un sensore di pressione e mantenerla tra 3 e 5 mmHg. Raccogli i campioni tramite porte di campionamento.
   3. Una volta configurato il software e il sistema di perfusione, collega la cannula che penetra nel PV al tubo di ingresso della macchina per la perfusione. Mantieni l'organo, la perfusione e la perfusione a temperatura ambiente (21 °C), senza l'aiuto di un bagno d'acqua.
   4. Somministrare il perfuso all'organo attraverso la cannula nella PV utilizzando una pompa peristaltica.
      1. Per preparare il perfusato, mescola 500 mL di Williams' Medium senza fenolo rosso con 5 g di albumina sierica bovina (BSA), 12 mg di desametasone solubile in acqua, 5 mL di penicillina-estreptomicina, 5 mL di L-glutammina, 2,5 μL di insulina e 1000 U di eparina.
      2. Mescola tutti i componenti su una piastra di mescolamento per circa 20 minuti, o finché tutti i componenti non si sono dissolti. Aumentare i flussi di perfusione a pressioni di snervamento di 3–5 mmHg.
   5. Poi, posizionare la sorgente laser RRS nel supporto sonda e posizionarla a 1 cm sopra il lobo più grande del fegato, il più vicino possibile alla PV. Mettere in pausa il flusso di perfusione a 5 minuti (T₅) e riprenderlo a 10 minuti (T₁₀). Esegui il test di sforzo a 15 minuti (T₁₅).
   6. Effettua misurazioni RRS durante tutto il test di stress; prendere misurazioni di afflusso e uscita ogni 5 minuti, a partire da T₀ (Figura 4). Traccia i valori di 3RMR, così come i livelli di K⁺ in uscita e di lattato per T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (n = 3) (Figura 5).
   7. Calcola il tasso di consumo di ossigeno (OCR) a T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ moltiplicando la pressione parziale di afflusso e uscita di ossigeno (_{pO 2}) con il coefficiente di solubilità dell'ossigeno nel plasma (0,00314). Traccia l'OCR per T₀, T₅, T₁₀, T₁₅ (Figura 5).
      NOTA: Sono mostrate tracce spettrali Raman di risonanza esemplare negli stati perfusi (T₅), ischemici (T₁₀) e reperfusi (T₁₅) da un fegato (Figura 6)

Figura 4: Diagramma che rappresenta il flusso sperimentale. Fu eseguita un'epatectomia completa su femmine di ratti Lewis. Il fegato estratto è stato sottoposto a perfusione subnormotermica con macchine e somministrato con perfuso ossigenato per i primi 5 minuti. La perfusione fluisce nel fegato attraverso la vena porta e circola attraverso la pompa peristaltica (flusso di perfusione raffigurato con frecce blu). La perfusione ossigenata è stata sospesa per i successivi 5 minuti a T5 e ripresa per altri 5 minuti a T10. Misurazioni 3RMR effettuate durante il test di stress (rappresentate come il laser). Sono stati prelevati campioni di perfuso a T0, T5, T10 e T15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

I fegati nuovi sono stati sottoposti a periodi di ischemia e reperfusione tramite un test di sforzo per ossigeno. Successivamente, le variazioni in tempo reale della 3RMR sono state confrontate durante il test di sforzo con il tasso di consumo di ossigeno, il lattato in uscita e il potassio ottenuti dall'analisi del perfusato a T₀,_{T 5}, T₁₀, T₁₅. In condizioni di salute, i valori di 3RMR sono previsti tra il 10% e il 30% (Figura 5A). Come previsto, i valori di 3RMR a T₀ e T₅ rientrano in questo intervallo, poiché il fegato è stato continuamente fornito di perfuso ossigenato tra questi punti temporali (Figura 5A). Tuttavia, il valore di 3RMR alla fine del periodo ischemico (T₁₀) è fuori dal range ottimale (Figura 5A). Questo aumento è indicativo dello spostamento dei mitocondri verso uno stato ridotto, poiché gli elettroni si accumulano lungo tutta la catena di trasporto a causa della deossigenazione. A T_10, il flusso ossigenato riprende; Inizia il periodo di reperfusione. Al termine del periodo di reperfusione (T₁₅), i valori di 3RMR tornano a livelli ottimali (Figura 5A) man mano che l'attività dell'ETC viene ripristinata con la reintroduzione dell'ossigeno come accettore finale di elettroni. Questi cambiamenti nel flusso di ossigeno sono visibili anche negli spettri grezzi. Gli spettri RRS grezzi a T₀ e_{T 15} presentano caratteristiche spettrali simili a quelle dei mitocondri ossidati (Figura 6A,C), come un picco di marcatore spettrale a 1371 ^cm-1 (Figura 6D,F). Analogamente, gli spettri Raman grezzi a T₁₀ (Figura 6B) mostrano marcatori RR ridotti, come un picco spettrale di marcatore a 1357 ^cm-1 (Figura 6E). In conclusione, la RRS identifica i cambiamenti negli stati redox mitocondriali in tempo reale, dimostrati sia nel segnale spettrale grezzo, sia come metrica della salute mitocondriale (3RMR).

Il RRS può anche calcolare valori di 3RMR basandosi sugli stati redox di cIII e cIV. Un modello simile è stato osservato nei valori di cIII e cIV 3RMR (Figura 5B). A T₀, sono stati osservati valori completamente ossidati di 3RMR per cIV e valori di 3RMR entro l'intervallo ottimale per cIII. Questo equilibrio redox tra i complessi è fisiologico, poiché gli elettroni fluiscono dal cIII al cIV per essere rapidamente ossidati. All'inizio dell'ischemia, è stato osservato un aumento dei livelli di 3RMR per ogni complesso. Durante il periodo ischemico, un accumulo di elettroni attraverso l'ETC aumenta lo stress riduttivo su cIII e cIV, il che di conseguenza incrementa cIII-3RMR e cIV-3RMR. Tuttavia, alla reintroduzione dell'ossigeno, i valori 3RMR di entrambi i complessi diminuiscono fino a livelli ottimali: cIV completamente ossidato e cIII fisiologicamente ridotto (Figura 5B). Le tendenze della 3RMR in entrambi i complessi mostrano che la cessazione dell'ossigeno colpisce l'intera ETC, e nessun complesso individuale è particolarmente vulnerabile all'ischemia no-flow.

D'altra parte, i cambiamenti nella dinamica dell'ossigenazione non si sono riflessi nei biomarcatori di danno e negli analiti gassesio-ematici ottenuti dall'analisi del perfusato. All'insorgenza dell'ischemia, si prevede che il lattato e il K⁺ aumentino, poiché la cellula inizia a dipendere dalla respirazione aerobica e si degrada lentamente rilasciando K⁺ intercellulare. Ci aspettiamo anche che la OCR diminuisca, poiché le cellule non producono abbastanza energia per continuare la respirazione cellulare. Anche dopo un periodo di ischemia senza flusso, i tassi di consumo di ossigeno non mostravano segni di danno. I livelli di lattato in uscita e K⁺ rimangono relativamente costanti durante tutto il test di sforzo, nonostante le variazioni di ossigenazione (Figura 5D–E).

Figura 5: Cambiamenti nel 3RMR e danno dei biomarcatori durante il test di stress ossigeno. L'inizio dell'ischemia e i periodi di reperfusione sono rappresentati tramite linee tratteggiate rispettivamente al minuto 5 e al minuto 10. Inoltre, i periodi di flusso ossigenato sono rappresentati con linee blu, e i periodi di ischemia sono rappresentati con linee rosse. (A) Valori di 3RMR durante tutto il test mitocondriale. I valori di 3RMR aumentano quando il flusso ossigenato viene sospeso e riducono a livelli ottimali quando il flusso viene riavviato. (B) 3RMR valori del complesso III e complesso IV. La cessazione del flusso porta a una riduzione di entrambi i complessi. (C^{) Valori medi} di K+ di uscita durante tutto il test di stress. I valori di K⁺ rimangono costanti durante tutto il test di sforzo, nonostante i cambiamenti nella dinamica dell'ossigenazione. (D) Livelli medi di lattato in uscita durante il test di sforzo. L'output di lattato rimane costante durante il test di sforzo. (E) Tassi di consumo di ossigeno a T₀, T₁₀, T₁₅. Poiché i valori di_{pO 2} sono misurazioni basate su flusso, OUR non poteva essere calcolato per un periodo di ischemia senza flusso. Non sono state osservate modifiche significative (p-valore: 0,2500) (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Tracce spettrali esemplari grezze di un fegato fresco di ratto durante il test di sforzo. Profili spettrali completi di un fegato in (A) stato ossidato, (B) ischemico e (C) reperfuo. Lo spostamento dal marcatore RR ossigenato a quello RR ridotto è visibile quando si zooma sul picco spettrale dei mitocondri, segnato da una casella rossa in ciascun profilo spettrale. (D–F) I picchi ossidati dei marcatori RR (1371 ^cm-1) sono presenti negli stati (D) ossidato e (F) reperfuso e sono segnati con una linea tratteggiata rossa. Il picco ridotto del marcatore RR (1357 ^cm-1) è presente nello stato ischemico (E) ed è segnato da una linea tratteggiata blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Tracce spettrali di complesso III ridotto e ossidato, complesso IV, emoglobina e mioglobina. (A) Complex III, (B) complesso IV, (C) emoglobina e (D) mioglobina. L'analisi di regressione esegue gli spettri raccolti rispetto a queste librerie spettrali (se selezionata), ottenendo un fattore per ogni spettro di libreria che rappresenta la stima migliore del suo contributo relativo nello spettro registrato e quindi della sua concentrazione relativa nel tessuto. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Esempio di utilizzo di librerie di regressione per scomporre molecole che contengono eme sovrapposte (emoglobina e mitocondri ossidati/ridotti). (A) Sono state selezionate tracce spettrali grezze dal tessuto epatico perfuso con perfuso cellulare, con tutte le necessarie librerie di regressione, come emoglobina, emoglobina ossidata, mitocondri ridotti e mitocondri ossidati. È chiaro che la linea di miglior adattamento, derivata dalle librerie e dall'analisi di regressione, si sovrappone perfettamente al segnale misurato, con pochi residui inspiegabili. (B) Tracce spettrali grezze dallo stesso tessuto, ma selezionate solo librerie mitocondrie ossidate e ridotte. Poiché esiste una grande struttura residua inspiegata, è chiaro che il picco spettrale mitocondriale è spostato di diversi numeri d'onda rispetto a quello dell'emoglobina, che non era stato incluso nell'analisi di regressione. Questa figura mostra che lo spettrometro ad alta risoluzione e l'analisi di regressione sull'intero spettro sono in grado di distinguere spettri strettamente correlati. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Screenshot del software. (A) Finestra principale che mostra i valori di misurazione nel tempo. 3RMR, StO2 e qualsiasi altra serie selezionata saranno esposti qui durante la misurazione. Inoltre, la potenza del segnale di ogni serie sarà visualizzata come una linea tratteggiata sul grafico e un valore sottostante sul lato destro dello schermo. Ad esempio, la linea solida catturata qui rappresenta il 3RMR di un tessuto, mentre la linea tratteggiata rappresenta il r3RMR (intensità del segnale di 3RMR). Se si voleva vedere la qualità degli spettri registrati, si poteva cliccare sulla scheda Mostra spettro (cerchiata in viola). (B) Schermo che mostra gli spettri grezzi del tessuto. Questa è la scheda in cui si può valutare la qualità del segnale attraverso la potenza degli spettri misurati rispetto al rumore residuo. (C) Scheda che mostra le tendenze nelle serie all'interno dell'esperimento. Se si prendono ad esempio più misurazioni 3RMR durante un esperimento, ogni misurazione sarà visualizzata nel tempo in questa scheda. Anche le tendenze di altre serie, se selezionate, saranno mostrate qui. Questa scheda poteva essere accessibile cliccando sul pulsante Trends nella schermata principale (cerchiato verde su A). (D) Scheda informativa, dove si possono inserire informazioni sperimentali, come nome e descrizione della sessione. (E) scheda di sistema, dove si possono caricare protocolli pre-caricati. Ad esempio, se si seleziona il protocollo LiverContAcell, questo protocollo imposterà la libreria di regressione, la finestra di regressione target e sigma secondo il protocollo di perfusione acellulare per fegati di ratto. Per importare un protocollo, si può cliccare su Importa Impostazioni dal File e importare il protocollo di interesse. Se si vuole creare un proprio protocollo, si possono selezionare le librerie necessarie dal menu a tendina della Libreria di Regressione (F), regolare sigma target e finestra di regressione, così come gli allarmi, e cliccare su Salva (rappresentato da un disco) in basso a sinistra. (F) Scheda grafica, dove si può selezionare quale serie visualizzare nella finestra principale. Se si rianalizza uno spettro e si vuole aggiungere altre serie alle misure precedenti, si può selezionare la serie di interesse sotto la sezione Recal. Durante la ricalibrazione (Recal), il software rianalizzerà gli spettri grezzi misurati e mostrerà i risultati delle serie appena selezionate. È anche possibile selezionare di mostrare la potenza del segnale delle serie selezionate da questa scheda. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Spiegazioni di ogni metrica di controllo qualità.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo studio evidenzia un metodo non invasivo, in tempo reale e altamente sensibile per quantificare la salute mitocondriale utilizzando un sistema portatile di spettroscopia Raman a risonanza, composto da un laser in una sonda compatta, collegato con un cavo in fibra ottica a una pompa laser. Questo metodo utilizzava un laser da 441 nm per eccitare i mitocondri, che producono segnali spettrali unici a seconda del loro stato di ossidazione. Pertanto, RRS è in grado di quantificare ogni stato dei mitocondri attraverso le loro firme spettrali e confrontare gli spettri emessi con librerie spettrali pre-misurate utilizzando l'analisi di regressione. È stata quindi creata una metrica di salute mitocondriale basata sul rapporto tra mitocondri ridotti e totali: il Rapporto Mitocondriale Raman a Risonanza Ridotta (3RMR).

Questo articolo si concentra sulla dimostrazione dei cambiamenti in tempo reale nel 3RMR in funzione dell'ossigenazione con tessuto nativo senza la necessità di elaborazione del campione. Questo è stato ottenuto tramite un test di stress ossigeno: dopo 5 minuti di perfusione ossigenata continua, il flusso di perfusione viene sospeso per 5 minuti e riavviato per altri 5 minuti. Durante il test di sforzo vengono effettuate misurazioni 3RMR. Un modello di test di stress, in cui passiamo da periodi ischemici a periodi ossigenati, ci permette di monitorare i cambiamenti continui negli stati redox mitocondriali e, per estensione, nella funzione mitocondriale. In altre parole, il test di stress ossigeno ci permette di monitorare le tendenze della 3RMR in funzione dell'ossigenazione. Il nostro gruppo ha attribuito l'aumento dei valori di 3RMR a condizioni ischemiche, interrompendo il flusso di perfusione, causando l'accumulo di elettroni che attraversano l'ETC, poiché l'O2 non è disponibile come accettore finale di elettroni. Questo accumulo di elettroni provoca uno stato ridotto, che si traduce in un aumento dei valori di 3RMR. Tuttavia, con la reintroduzione di O₂, si prevede che i mitocondri sani riprendano l'attività ETC e si ripristinino agli stati fisiologici redox, poiché i loro elementi strutturali e funzionali sono intatti.

Come previsto, nel presente articolo è stato osservato un aumento continuo e in tempo reale della 3RMR durante tutto il periodo ischemico (Figura 5A). Analogamente, la 3RMR ritorna gradualmente a livelli ottimali durante il periodo di reperfusione (Figura 5A). Questo cambiamento in tempo reale negli stati redox mitocondriali è visibile anche nel grafico spettrale, poiché il picco mitocondriale si sposta da stati ossidati (1371 ^cm-1) a stati ridotti (1357 ^cm-1) durante il periodo ischemico, e ritorna a ossidarsi alla fine della reperfusione (Figura 6). Altri picchi ridotti dei marcatori RR compaiono anche durante il periodo ischemico. A differenza dei tradizionali saghi di salute mitocondriale, il Raman a risonanza è sufficientemente sensibile da quantificare gli stati redox del complesso III e del complesso IV, il che potrebbe e ha fornito una comprensione meccanicistica sull'impatto specifico delle lesioni ischemiche-reperfusione sull'ETC. Nei mitocondri sani, gli elettroni passano attraverso vari complessi nell'ETC, a partire dal complesso I, fino a raggiungere_O2 come ultimo accettore di elettroni. Una pausa nel flusso di ossigeno può spostare ogni complesso in uno stato ridotto, poiché gli elettroni si accumulano lungo l'ETC. Come previsto, è stato osservato un aumento in tempo reale dei valori di 3RMR di cIII e cIV all'insorgenza dell'ischemia. Ciò indica che la mancanza di O₂ impatta l'intera ETC, piuttosto che un complesso specifico (Figura 5B). Come discuteremo di seguito, la sensibilità della RRS facilita studi meccanicistici dettagliati e informa lo sviluppo di terapie mirate per l'IRI.

Tradizionalmente, ci aspettiamo anche di osservare livelli elevati di lattato negli organi ischemici, poiché si basano sul metabolismo anaerobico in assenza di ossigeno per produrre ATP. Analogamente, si prevedeva un aumento dei livelli di K⁺ negli organi danneggiati, poiché l'integrità della membrana delle cellule viene compromessa, permettendo un efflusso di K⁺ intercellulare. Infine, le cellule gravemente danneggiate possono avere un metabolismo più basso, poiché le loro vie metaboliche sono influenzate da rifiuti metabolici e ROS indotti da ischemia, portando a un consumo ridotto di ossigeno. Tuttavia, non si osservano cambiamenti nel consumo di lattato, K⁺ o ossigeno durante o dopo il periodo ischemico. Infatti, i valori non indicano alcuna interruzione del flusso di ossigeno, poiché rimangono relativamente costanti durante il test di sforzo (Figura 5B–D). In sostanza, utilizzando un test di stress ossigeno, questo studio mostra che i valori 3RMR riflettono i cambiamenti negli stati redox mitocondriali durante la riperfusione ischemia-reperfusione più rapidamente, in tempo reale e con maggiore sensibilità rispetto ai biomarcatori tradizionali del danno (Figura 5). Riconosciamo che questo studio ha confrontato la dinamica della 3RMR con indicatori indiretti della salute mitocondriale, come lattato e OCR, piuttosto che con confrontatori più diretti a valle, come NAD+/NADH e ATP. Sebbene questo studio non corrisponda esplicitamente le variazioni di 3RMR alle concentrazioni di ATP/NADH, lavori^{precedenti 9,14} hanno dimostrato che la 3RMR è predittiva dei cambiamenti in questi biomarcatori a valle. Ad esempio, Nguyen et ^al.9 hanno dimostrato che fegato a 3 ore con valori di 3RMR bassi (<10%) presentano concentrazioni e rapporti NAD/NADH significativamente inferiori rispetto a fegati WI da 1 ora (valori 3RMR di ~15%). Inoltre, Jain et ^al.14 non hanno riscontrato differenze significative nel rapporto NAD+/NADH o nell'EC nei gruppi che non presentavano differenze significative nel loro 3RMR. Hanno inoltre osservato che i rapporti NAD+/NADH e la CE sono significativamente diversi nel fegato freddo-ischemico (CI) a 24 ore durante la perfusione acellulare rispetto alla perfusione cellulare, che ha mostrato anch'essi valori statisticamente significativi di 3RMR. Questi risultati insieme, dimostrano valori di 3RMR che riflettono cambiamenti nelle misure più dirette della funzione mitocondriale e ETC.

Anche se questo articolo utilizza RRS durante una perfusione di 15 minuti per dimostrare le prestazioni del sistema, altri studi pubblicati hanno dimostrato l'utilità di RRS in studi longitudinali. Più specificamente, in un lavoro precedente, abbiamo dimostrato che la RRS integra i biomarcatori tradizionali durante perfusioni d'organo più lunghe, poiché fornisce informazioni sulla salute e la funzione mitocondriale che differiscono significativamente dai metodi tradizionali. Ad esempio, lo studio ha utilizzato RRS per valutare la vitalità di fegati di ratto freddo-ischemico trapiantabile (24 ore SCS) e non trapiantabile (72 ore SCS) durante la perfusione^{subnormotermica 10}. Sebbene la risposta iniziale all'ossigenazione in entrambi i gruppi fosse simile, la 3RMR dei fegati non trapiantabili aumentava con la perfusione, mentre la 3RMR del fegato trapiantabile rimaneva costante tramite SNMP. Analogamente, i livelli di potassio e l'aumento di peso complessivo per il fegato con IC a 72 ore erano più alti in tutto il SNMP rispetto al fegato con IC a 24 ore. Lo studio ha dimostrato l'utilità del RRS nel completare i biomarcatori tradizionali durante lunghe perfusioni. In un altro studio, abbiamo utilizzato il RRS per comprendere la dinamica della reossigenazione e il recupero metabolico del fegato di ratto freddo-ischemico^{(CI) 14}. Abbiamo perfuso fegato ischemico minimo (15 minuti di ischemia fredda) e fegato ischemico freddo a 24 ore con una perfusa acellulare o una perfusa impapolta in globuli rossi (pRBC). Quando fegato con CI a 24 ore è stato perfuso con perfuso acellulare, abbiamo osservato una diminuzione latente della 3RMR rispetto a quando si perfusa con pRBC. Lo studio attribuì questo aumento ritardato del 3RMR all'accumulo di elettroni nei citocromi mitocondriali durante l'ischemia fredda, che possono essere rapidamente trasferiti alle abbondanti molecole di ossigeno nel caso della perfusa a base di pRBC. Tuttavia, in combinazione con altri marcatori di lesione, osserviamo un danno epatico maggiore nel fegato con CI a 24 ore perfuso con pRBC. Lo studio ha concluso che misurare l'ossigenazione mitocondriale in tempo reale tramite RRS può fornire informazioni sul recupero mitocondriale, il che potrebbe essere utile per ottimizzare strategie di perfusione lunga. In sostanza, i risultati indicano che integrare biomarcatori tradizionali (ad esempio, lattato, OCR, ATP) con le intuizioni guidate dal RRS sugli stati redox mitocondriali e sulla dinamica dell'ossigenazione fornisce una valutazione più completa del recupero mitocondriale.

Altri studi hanno utilizzato RRS come banco di prova per terapie che potrebbero mitigare la lesione ischemia-reperfusione dell'ETC⁹. In periodi prolungati di ischemia, gli elettroni si accumulano all'interno dell'ETC, con la capacità degli elettroni di fuggire attraverso i vari complessi, specialmente durante la reperfusione. Comprendere lo stato redox dei complessi individuali in funzione della ischemia-reperfusione può offrire una comprensione più profonda della localizzazione della lesione con la possibilità di interventi più mirati. Ad esempio, il nostro gruppo ha utilizzato RRS per sviluppare interventi terapeutici per la disfunzione complessa-III nei fegati suini a ischemica calda. In uno studio condotto da Nguyen et al. (2026)⁹, fegati WI di 1 ora e 3 ore sono stati inseriti su SNMP per 3 ore. Come già accennato, i fegati con WI a tre ore sono noti per subire danni all'ETC, che portano a sovrassossidazione e riduzione del metabolismo. Sebbene i valori di 3RMR per fegati freschi e con WI di 1 ora fossero nell'intervallo ottimale durante la perfusione, abbiamo osservato valori di 3RMR per fegato con WI a 3 ore che scendevano continuamente, raggiungendo il limite al di sotto del limite ottimale (10%) a 3 ore. Inoltre, non abbiamo osservato differenze nei valori 3RMR del cIV tra nessuno dei due gruppi, con il cIV completamente ossidato in ciascun gruppo. L'iperossidazione di cIII, combinata con uno stato redox sano osservato in cIV, indica una sovraossidazione indotta dalla reperfusione al complesso III. Con queste conoscenze, Nyugen et al. (2026)⁹sono riusciti a selezionare un trattamento terapeutico in grado di superare la disfunzione del cIII: il blu di metilene (MB), che agisce come uno shuttle elettronico tra cI e citocromo c, bypassando cIII e trasferendo elettroni direttamente al cIV. I risultati della 3RMR hanno riflettuto l'effetto terapeutico della MB sui mitocondri, poiché i valori di 3RMR durante il SNMP del fegato WI a 3 ore aumentavano per riflettere gli elettroni trasportati direttamente al cIV e il riavvio del metabolismo epatico. L'effetto mitigante del MB è stato inoltre validato riducendo il lattato in uscita e migliorando i tassi di consumo di ossigeno. In sostanza, la specificità della RRS ha permesso lo sviluppo di un percorso terapeutico su misura per le esigenze mitocondriali successive a un'ischemia calda.

In tutto questo articolo, presentiamo la Spettroscopia Raman a Risonanza come un metodo non invasivo, in tempo reale e altamente specifico per misurare la salute mitocondriale. Lo studio dimostra come la RRS possa misurare sottili spostamenti negli stati redox senza disturbare il tessuto prima che tali cambiamenti fisiologici abbiano effetti a valle. Tuttavia, è importante notare le diverse limitazioni del sistema Raman di Risonanza. Innanzitutto, la RRS richiede che tutte le molecole potenziate in risonanza in un tessuto vengano identificate e tenute in considerazione nella regressione, con ogni molecola che ha diversi fattori di potenziamento per tenere conto della potenza relativa del segnale. Sebbene abbiamo creato librerie spettrali per tutti questi componenti a una data lunghezza d'onda e tessuto, l'utente potrebbe dover creare e validare nuove librerie per ogni tessuto e lunghezza d'onda di interesse. Inoltre, alcuni tessuti possono avere elementi spettrali complessi, il che può rendere difficile misurare i citocromi mitocondriali presenti a concentrazioni più basse. Ad esempio, il fegato di maiale o umano contiene beta-carotene, e il sangue contiene emoglobina, entrambi con forti segnali spettrali che aumentano il numero di firme spettrali che RRS deve tenere conto nella regressione. Infine, il laser da 441 nm utilizzato per queste misurazioni ha un diametro del fascio di 2 mm e una profondità di penetrazione inferiore a 1 mm. Tali misurazioni localizzate e superficiali possono favorire l'errore di campionamento, poiché le differenze nello stato redox in altre parti dell'organo possono essere trascurate. Per superare tali sfide, si potrebbero effettuare misurazioni da biopsie prelevate dal nucleo dell'organo, oppure un sistema multi-laser potrebbe consentire misurazioni su una superficie più ampia per fornire una comprensione più completa della salute dell'organo completo.

In conclusione, mostriamo che la spettroscopia Raman per risonanza è sensibile a sottili cambiamenti nella dinamica mitocondriale rispetto agli analiti gassesanguo. Qui è fornita una spiegazione dettagliata su come configurare e gestire il sistema. Evidenziiamo la natura non invasiva, altamente specifica e di valutazione in tempo reale della RRS, e spieghiamo come potrebbe essere utilizzata come approccio diagnostico e meccanicistico. Sottolineiamo inoltre il suo utilizzo nello sviluppo di specifiche vie terapeutiche per la disfunzione mitocondriale. Studi futuri potrebbero concentrarsi sull'adattamento del sistema RRS per valutare la salute mitocondriale da biopsie, fette di tessuto a taglio di precisione o altri prodotti derivati dal tessuto, incluso tessuto umano per la ricerca traslazionale. L'adozione del RRS offre un approccio potente nella ricerca metabolica, migliorando la nostra comprensione dei processi bioenergetici cellulari con maggiore facilità rispetto ai metodi tradizionali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Usato per cannulare la vena porta
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Usato per filtrare il vapore in eccesso durante l'anestesia
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Composizione del perfusato
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Composizione del perfusato
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Composizione del perfusato
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Usato per far fluire il perfusato attraverso il fegato
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Usato per far fluire il perfusato attraverso il fegato
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Usato per ossigenare il perfusato.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Composizione del perfusato
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Per l'analisi del gas nel sangue
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Contattare Pendar Technologies per informazioni su questo prodotto