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Articolo metodologico

Valutazione in tempo reale e non invasiva della funzione mitocondriale tramite spettroscopia Raman a risonanza

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DOI:

10.3791/71290

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7 agosto 2026

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un metodo non invasivo e in tempo reale per monitorare la salute mitocondriale utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). Abbiamo utilizzato RRS per quantificare gli stati redox mitocondriali e sviluppato una metrica per la salute mitocondriale, il rapporto ridotto mitocondriale Resonance Raman (3RMR), che mostra una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione rispetto agli analiti ematici ematici e gasses.

Abstract

Sebbene i mitocondri siano centrali per la patogenesi e la progressione della malattia, la comprensione meccanicistica delle dinamiche della salute mitocondriale rimane costosa e inaccessibile. Per colmare questa lacuna, questo studio utilizza la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS) per valutare la funzione mitocondriale, utilizzando un sistema portatile che fornisce misurazioni in tempo reale, non invasive e quantitative degli stati redox del citocromo mitocondriale nel fegato di ratto. In questo protocollo dimostriamo l'uso di questa tecnologia, inclusi l'installazione, l'acquisizione dati e l'elaborazione dei dati. Questo studio presenta un esperimento proof-of-concept che evidenzia la capacità della RRS di misurare cambiamenti in tempo reale nello stato redox mitocondriale e, di conseguenza, nella funzione mitocondriale. Per un breve periodo, il dispositivo RRS era collegato a una pompa laser e a un computer di acquisizione dati e posizionato a 1 cm dal fegato del ratto.  I parametri di acquisizione sono stati selezionati in conformità con il protocollo del fegato del ratto; Gli stati redox sono stati misurati in condizioni ossigenate e ischemiche utilizzando un test di stress ossigeno. Le variazioni negli stati redox mitocondriali sono state monitorate durante il test di stress da ossigeno.

Introduzione

Le mitocondri svolgono un ruolo cruciale nella funzione cellulare e nell'omeostasi. I mitocondri sono i principali motori del metabolismo cellulare, regolando la generazione di ATP tramite fosforilazione ossidativa. Servono anche come organelli di segnalazione che dettano il destino cellulare regolando le vie apoptotiche, così come ROS e segnalazione Ca+2 1. Pertanto, la disfunzione mitocondriale può portare a varie malattie neurodegenerative, muscolari ecardiovascolari 2,3. Nonostante il ruolo cruciale che i mitocondri svolgono nella progressione della malattia, valutare la funzione mitocondriale può essere invasivo, costoso e limitato.

Indicatori chiave della funzione mitocondriale, come il tasso di consumo di ossigeno, la fosforilazione ossidativa e l'attività di vari complessi all'interno della catena di trasporto elettronico (ETC), sono misurati tramite respirometria. L'ETC è composto da quattro complessi (I–IV) incorporati nella membrana mitocondriale interna (IMM). Questi complessi, con l'aiuto di altri coenzimi, trasferiscono elettroni da substrati ridotti, come NADH e FADH2, all'accettore finale di elettroni,O2, che viene poi ridotto ad acqua. La maggior parte degli saggi di respirometria contemporanei, come il Seahorse e l'Orobros O2k, richiede l'elaborazione dei tessuti, limitandone così l'applicazione nella ricercatraslazionale 4,5. La misurazione del potenziale della membrana mitocondriale (MMP) è un altro metodo per valutare la disfunzione mitocondriale, che utilizza fluorofori lipofili cationici, come il JC-1, insieme all'imaging microscopico, dove i mitocondri accoppiati (sani) e non accoppiati (danneggiati) fluoresiscono con lunghezze d'ondadiverse 6. Tuttavia, questi saghi possono avere una bassasensibilità 5. Il colorante stesso può anche avere un'alta citotossicità a concentrazionielevate 5. Infine, analogamente alle misurazioni della respirometria, questa tecnica richiede anche l'elaborazione dei tessuti. Tecniche basate sulla spettroscopia sono state recentemente utilizzate come metodi non invasivi per valutare la salute mitocondriale. Ad esempio, la Spettroscopia di Risonanza Magnetica del Fosforo (P-MRS), un metodo che valuta il metabolismo cellulare misurando le concentrazioni di metaboliti contenenti fosforo, è stata utilizzata per caratterizzare tessuti adipogenici ingegnerizzati in fase didifferenziazione 7. Tuttavia, questa tecnica richiede anche attrezzature e formazione specializzate.

Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato una tecnica in tempo reale, non invasiva e altamente specifica per misurare lo stato redox mitocondriale come indicatore della vitalità dell'organo utilizzando la Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS). La RRS utilizza lo scattering inelastico dei fotoni per la quantificazione degli stati redox dei citocromi mitocondriali. Gli anelli porfirinici in parti eme di molecole come citocromi mitocondriali, emoglobina e mioglobina producono uno spettro Raman caratteristico a seconda del loro stato di ossidazione quando eccitate con un laser8 a lunghezza d'onda da 441 nm. Sebbene il sistema RRS utilizzi una lunghezza d'onda di 441 nm, possono essere utilizzati anche laser con lunghezze d'onda da 420 nm e 405 nm, ognuno dei quali migliora preferenzialmente un diverso complesso di citocromi. Lo spettro ottenuto da un campione sconosciuto di interesse viene incrociato con librerie preregistrate di mitocondri completamente ossidati o ridotti intatti, fornendo il rapporto tra mitocondri ridotti e totali o lo stato redox medio dei citocromi ETC in situ . Questo rapporto è definito come il rapporto mitocondriale ridotto di risonanza Raman (3RMR).

Esistono 3 calcoli/tipi distinti di 3RMR: 3RMR mitocondriale (mito-3RMR), complesso III 3RMR (cIII-3RMR) e complesso IV 3RMR (cIV-3RMR). Ciascuno di questi indici viene calcolato attraverso la frazione di ridotta al numero totale di una determinata componente. Ad esempio, il 3RMR di cIII sarebbe il rapporto tra cIII ridotto e il numero totale di cIII nel tessuto (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Lo stesso schema vale per il cIV. Quindi, 3RMR-cIII si riferirebbe al rapporto tra cIII ridotto e la quantità totale di cIII, e 3RMR-cIV si riferirebbe al rapporto tra cIV ridotto e la quantità totale di cIV. Attraverso l'analisi di regressione, vengono calcolati gli stati redox mitocondriali (mito-3RMR) utilizzando librerie spettrali di mitocondri intatti, oppure vengono calcolati singoli stati redox complessi (cIII-3RMR e cIV-3RMR) utilizzando librerie spettrali cIII e cIV. Una recente pubblicazione9 ha dimostrato che il mito-3RMR è rappresentativo della media ponderata degli stati redox di cIII e cIV (o cIII-3RMR e cIV-3RMR). È importante notare che cI e cII non sono attivi da Raman né amplificati risonantemente attraverso la lunghezza d'onda di 441 nm. Di conseguenza, non vengono calcolati durante il calcolo del mito-3RMR.

Sfruttando questi tipi di 3RMR, abbiamo definito l'intervallo ottimale del 3RMR. Negli organi "sani", i mitocondri sono intatti e hanno un apporto sufficiente di ossigeno. Al contrario, gli organi danneggiati possono avere una fornitura o un utilizzo insufficiente di ossigeno, causando così l'accumulo di elettroni da parte dei complessi ETC. L'accumulo di elettroni causa uno "stress riduttivo", spostando i mitocondri dallo stato ossidato a quello ridotto e aumentando i valori di 3RMR. Diversi studi 8,9,10,11,12, che riguardano cuori e fegati in modelli di roditori e suini, hanno iniziato a fare luce sull'intervallo ottimale "sano" per il 3RMR, che si propone sia compreso tra 10 e 30. Ad esempio, Perry et al. hanno sottoposto cuori di mammiferi all'ipossia, dove un 3RMR del 30% ha dimostrato fornire l'equilibrio ottimale tra sensibilità e specificità per rilevare tessutoipossico 8. Questa tendenza è stata ulteriormente confermata in ulteriori studi con tessutocardiaco 11,12 e innestiepatici 10. Inoltre, Nyugen et al.9 hanno dimostrato che i valori di 3RMR scendono a valori molto bassi (ossidati) per i tessuti in cui il metabolismo si è fermato, con livelli di 3RMR (7,667 ±± 4,926) di fegati ischemici caldi non trapiantabili dopo 3 ore di perfusione di macchine normothermiche, rispetto a valori di 3RMR superiori a 10 (~12–15) per fegati ischemici caldi freschi etrapiantabili 9.

Oltre a queste dimostrazioni di come il 3RMR possa misurare la vitalità tissutale, la sensibilità, specificità e facilità d'uso del RRS lo rendono altamente applicabile a molti altri tipi di ricerca in cui il metabolismo cellulare e la funzione mitocondriale sono influenzati. In studi precedenti, il RRS è stato utilizzato per rilevare la degenerazione maculare e il glaucoma nei topi attraverso la valutazione dell'attività metabolica degli assoni non mielinizzati delle cellule gangliari retiniche situate nella testa del nervoottico 13. Inoltre, è stato utilizzato per rilevare la coartazione dell'aorta (CoA) in un modello ratto di cardiopatia congenita, una diagnosi spesso trascurata negli screening cardiacineonatali 12. Questa tecnologia è stata utilizzata per comprendere la funzione e la vitalità degli organi in varie condizioni sperimentali rilevanti nel campo del trapianto d'organo, inclusi studi che valutano la vitalità degli organi su perfusione di macchineex vivo 10,11, la riossigenazione post-static coldstorage 14, o la mitigazione del danno da reperfusione di fegati caldo-ischemici9.

Questo articolo mira a stabilire il RRS come uno strumento sensibile e in tempo reale per la valutazione della salute mitocondriale. Fegati interi di un modello ratto sono stati sottoposti a diversi livelli di ischemia e reperfusione di ossigeno come test di sforzo per valutare la risposta mitocondriale. In questo test da stress da ossigeno, i fegati freschi sono sottoposti a 5 minuti di flusso iniziale di perfusione, 5 minuti di ischemia e 5 minuti di reperfusione. Durante il test di sforzo sono state effettuate misurazioni di lattato, K+ e pressione parziale di ossigeno (pO2). Una risposta più rapida ai cambiamenti di ossigenazione è stata osservata con la 3RMR rispetto agli analiti ematici tradizionali. Con questi esperimenti, l'uso del RRS viene evidenziato non solo per studi meccanicistici, ma anche come metodo diagnostico e come banco di prova terapeutico. Pertanto, il protocollo condiviso potrebbe essere utile a una varietà di ricercatori che lavorano con i mitocondri. Nel complesso, il RRS, con la sua natura non invasiva, in tempo reale e altamente specifica, potrebbe avere un impatto sostanziale sul metabolismo cellulare.

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Protocollo

Tutti gli animali per gli esperimenti sono stati mantenuti in conformità con le linee guida del National Research Council e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Configurazione e utilizzo dei RRS

  1. Descrizione del dispositivo:
    NOTA: Il sistema RRS portatile (Pendar Technologies; il prodotto è solo per scopi di ricerca) utilizza un laser a 441 nm grazie a un potenziamento risonante dello spettro Raman dei citocromi mitocondriali con questa lunghezza d'onda. Il laser funziona tra 4 mW e 8 mW.
    1. Collega una sorgente di eccitazione laser a una sonda costruita su misura tramite un cavo in fibra ottica. La sonda illumina il tessuto con un punto laser di diametro di 2 mm e raccoglie lo spettro emesso. Lo spettro passa poi attraverso un filtro passa-banda ed è raccolto da un array di dispositivi accoppiati di carica (CCD). Lo spettro viene raccolto ogni secondo su un arco temporale di 180 gradi e mediato per creare uno spettro grezzo, ridotto dal rumore, per l'analisi.
    2. Il software confronta questo spettro ottenuto con librerie spettrali pre-misurate tramite un'analisi di regressione.
  2. Procedura per le librerie di pre-registrazione
    NOTA: Per gli esperimenti presentati in questo articolo sono state create e utilizzate le forme ridotte e ossidate di biblioteche di mitocondri, complessi III e complessi IV, emoglobina e mioglobina. I segnali RRS di tutte le librerie venivano assorbiti in una scatola nera a temperatura ambiente (21 °C). Questi file della libreria sono forniti separatamente con il software di analisi. Tuttavia, a seconda del tessuto di interesse e della presenza di altre molecole attive Raman, si potrebbero creare anche altre librerie adattando adeguatamente il seguente protocollo. Gli spettri RRS grezzi delle librerie di emoglobina, mioglobina e complessi III/IV ossidati/ridotti sono forniti in Figura supplementare 1.
    1. Librerie di emoglobina (Figura supplementare 1C):
      1. Raccogli sangue fresco di roditori tramite dissanguinazione animale. Ossigenare il sangue raccolto usando ossigeno al 100%, oppure disossigenarlo usando azoto al 100%, in una cuvetta di vetro, aggiungendo ditionato di sodio.
      2. Misura il RRS di ogni stato attraverso la parete della cuvetta di vetro per 10 minuti, con la sonda RRS posizionata a 9 mm dalla cuvetta di vetro.
      3. Utilizzare i picchi spettrali a 1356 cm-1 per verificare lo stato deossigenato, e usare i picchi a 1376 cm-1 per confermare lo stato ossigenato.
    2. Librerie mitocondriali ridotte/ossidate (Figura 1)
      1. Isolare i mitocondri da cuori di roditori omogeneizzati e purificati in una cuvetta di vetro. Posiziona la sonda Raman a 9 mm dalla cuvetta di vetro e misura gli spettri di questi mitocondri attraverso la parete di vetro.
      2. Creare condizioni completamente ossidate fornendo un flusso di ossigeno al 100% ai mitocondri. Verifica lo stato ossidato in assenza del picco RR ridotto a 1357 cm-1.
      3. Creare condizioni completamente ridotte esponendo i mitocondri al 100% di azoto con piccole quantità di solfuro di idrogeno. Verifica le condizioni ridotte in assenza del picco ossidato del marcatore RR a 1371 cm-1.
    3. Complesso ossidato/ridotto III/IV (Figura supplementare 1A,B):
      1. Isolare i Complessi III e IV come descrittoaltrove 9,15,16,17. In breve, utilizzare un campione stock di mitocondri isolati (corrispondenti a 200 nanomoli di citocromo a) come materiale di partenza.
      2. Diluire i mitocondri a 10 nmol citocromo A/mL in un tampone gelato C (50 mM Tris, 1 mMMgSO 4, pH 8,45). Poi, aggiungi il 10% di goccia di n-β-D-dodecil maltoside (DM) goccia per goccia fino a una concentrazione finale dell'1%, mescolando delicatamente sul ghiaccio.
      3. Centrifugare l'estratto a 40.000 × g per 40 minuti a 4 °C. Applicare il sovrantantante su una colonna di vetro di 2,5 cm × 20 cm che è stata precedentemente riempita con una resina di scambio bilanciata con 5 volumi di colonna di tamponamento C (contenenti 0,02% w/v DM).
      4. Dopo il lavaggio con 2 volumi colonne di tampone C, eludi i complessi mitocondriali applicando un gradiente lineare di NaCl da 0–400 mM nello stesso tampone e raccogli l'eluto in frazioni di 4 mL.
      5. Le frazioni verdi contenenti il Complesso IV eluiscono vicino al centro del gradiente (~180 mL NaCl), prima delle frazioni rossastre contenenti il Complesso III. Concentrare le frazioni aggregate contenenti ogni complesso a 20–30 nmole di citocromo a/mL.
      6. Una volta isolati i singoli complessi, si espone ciascuno a condizioni di ossidazione e ridutzione. Ridurre un campione di 11 mM del Complesso III nel tampone Tris utilizzando 2 mL di ascorbato (1 M) per ridurre il citocromo c1 e 2 mL di HS (idrosolfito) per ridurre completamente i citocromi bL eb H.
      7. Ridurre un campione di 18,67 mM di Complesso IV in Tampone Tris in più fasi, poiché il Complesso IV subisce un processo di ossidazione catalitica a più fasi. Per ridurre completamente il Complesso IV, aggiungere due 2 mL di H2O2 (10 mM), seguiti da 2 mL di HS.
      8. Raccogli gli spettri della libreria dopo ogni aggiunta per catturare ogni fase del ciclo. Aggiungere spettri completamente ossidati e ridotti alla libreria di riferimento finale per rappresentare gli stati stazionari del complesso IV.
      9. Prepara tutti i campioni in una fiala di vetro da 1 mL e teneli in posizione fissa a 9 mm dalla lente della sonda, chiudendoli in una scatola nera per evitare contaminazioni da luce. Raccogli gli spettri RRS per 600 secondi per ogni complesso e stato di ossidazione.
      10. Validare la purezza di cIII e cIV isolati come descritto inprecedenza 17, e validare l'adeguatezza delle librerie spettrali isolate di cIII e cIV nell'spiegare gli spettri mitocondriali completi come descritto in un recentearticolo 9.
    4. Librerie di mioglobina (Figura supplementare 1D):
      1. Utilizzando flussi simili di ossigeno e azoto (con ditionite di sodio disciolto), varia la saturazione di ossimioglobina dell'estratto miocardico tra lo 0% e il 100%. Verifica gli spettri Raman tramite picchi di marcatore a 1355 cm-1 e 1376 cm-1.

NOTA: La maggior parte dei componenti spettrali descritti sopra, come l'emoglobina o i mitocondri ossidati/ridotti, sono molecole contenenti eme e sono eccitate dalla stessa lunghezza d'onda. Questo sistema RRS evita la sovrapposizione del segnale creando una libreria di regressione per ogni molecola basata sul suo segnale spettrale unico. Gli spettri diffusi ottenuti vengono eseguiti tramite un algoritmo di regressione contro le librerie selezionate. L'algoritmo di regressione fornisce un fattore per ogni spettro di libreria che rappresenta la stima più adatta del suo contributo relativo nello spettro registrato, e quindi della sua concentrazione relativa nel tessuto. Poiché l'algoritmo utilizza il miglior adattamento su un intervallo di numeri d'onda, piccole differenze nella posizione o intensità dei picchi spettrali dei vari componenti della libreria permettono alla regressione di distinguere anche cromofori strettamente correlati. Attraverso l'algoritmo di regressione e le librerie spettrali, il sistema RRS può scomporre il segnale totale e diffuso in varie componenti a seconda dei loro picchi spettrali unici, evitando la sovrapposizione del segnale da parte delle molecole contenenti eme. Per mostrare la relazione tra emoglobina e mitocondri, è inclusa la Figura Supplementare 2 , che fornisce immagini di spettri prelevati da una perfusione epatica, suddivisi nel segnale misurato, nella linea di miglior adattamento e nel residuo inspiegabile che deriva dalle differenze nei singoli picchi spettrali. Nel pannello A vengono selezionate librerie di regressione mitocondriale ridotte e ossidate di emoglobina e ossidata. La linea di miglior adattamento curata tra le librerie e l'analisi di regressione si sovrappone ordinatamente al segnale misurato, e c'è poco residuo inspiegabile. Nel pannello B vengono selezionate solo librerie di mitocondri ossidate e ridotte. Poiché esiste una grande struttura residua inspiegabile, il picco spettrale mitocondriale si sposta di diversi numeri d'onda rispetto a quello dell'emoglobina, che non era stata inclusa nell'analisi di regressione. Inoltre, nelle figure supplementari di Nguyen et al.9, gli autori spiegano la relazione tra mitocondri e i complessi individuali (cIII e cIV), così come la relazione tra i complessiindividuali 16, in cui il complesso III mostra picchi più netti e a frequenza più bassa, mentre il complesso IV mostra bande più ampie e spostate verso l'alto. Inoltre, gli autori mostrano che le librerie ridotte del Complesso III e del Complesso IV spiegano pienamente lo spettro misurato dei mitocondri interi ridotti, risultando in un residuo inspiegabile minimo.

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Figura 1: Librerie spettrali di mitocondri completamente ossidati e ridotti. Gli spettri della libreria RRS sono stati ottenuti dopo che i mitocondri isolati sono stati forniti con (A) ossigeno al 100%, o azoto (B) al 100%, raggiungendo rispettivamente gli stati ossidato e ridotti. Questi stati sono stati confermati con la presenza di picchi ossigenati RR (C) e di marcatori ridotti (D). Lo spostamento di questi picchi corrisponde a variazioni nei modi vibrazionali molecolari in presenza di ossigeno. L'intensità di ogni picco è normalizzata a 1 unità di intensità arbitraria (UA), poiché il potenziamento dello stato ridotto è maggiore utilizzando questa lunghezza d'onda di eccitazione di 441 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta dati tramite RRS

  1. Configurazione del dispositivo:
    1. Collega l'unità dello spettrometro (alloggiata all'interno di una scatola compatta) all'alimentatore a corrente continua (DC) e all'adattatore di alimentazione utilizzando i cavi forniti. L'unità dello spettrometro ha un tappo rotondo con rientranze di allineamento.
    2. Allinea le rientranze della spina rotonda con quelle del cavo collegato all'alimentatore. Non è necessaria alcuna pulizia prima di collegare le porte (Figura 2).
    3. Collega il computer che esegue l'analisi allo stesso adattatore di alimentazione che collega lo spettrometro e l'alimentatore usando i cavi forniti.
    4. Metti la sonda laser nel portasonde. Regola la posizione di questa sonda all'inizio dell'esperimento.
    5. Apri il software di controllo dello spettrometro (Software di Energetica Cellulare).
  2. Configurazione software:
    NOTA: File di impostazioni e librerie di regressione per diversi tipi di tessuto sono forniti con il sistema. Questi file includono informazioni su quali librerie il sistema RRS dovrebbe includere nella regressione, quanti spettri sono inclusi nella finestra di regressione e altri parametri come la potenza laser. Le impostazioni predefinite possono essere modificate e un nuovo file di impostazioni salvato per l'uso in esperimenti futuri. Gli screenshot del software descritti di seguito sono presentati nella Figura Supplementare 3.
    1. All'apertura del software di controllo dello spettrometro, apparirà un grafico che mostra la percentuale di 3RMR, la saturazione di ossigeno (StO 2) e la saturazione della mioglobina. Questa schermata è dove queste metriche verranno visualizzate, se selezionate, in tempo reale durante tutte le misurazioni. Clicca sulla scheda Impostazioni in basso a sinistra della pagina.
    2. Nella scheda Informazioni , inserisci le informazioni della sessione sotto Nome della sessione e eventuali dettagli necessari nella scheda Descrizione della sessione .
    3. Ci sono due modalità di raccolta dati. Usa la modalità Spot Check per accumulare spettri finché non vengono soddisfatte le metriche di qualità specificate (ad esempio, sigma target o finestra/numero di spettri di regressione), poi interrompi la registrazione. Usa la Modalità Continua per registrare gli spettri fino a quando non si preme il pulsante di stop. In entrambe le modalità, tutti i dati, sia i risultati 3RMR che gli spettri individuali, vengono memorizzati automaticamente. Questo esperimento utilizza la Modalità Continua.
    4. Una volta inserite tutte le informazioni sulla sessione, clicca sulla scheda Sistema .
    5. Sotto Impostazioni, seleziona il protocollo appropriato per il progetto (per perfusioni acellulari di fegato di ratto, scegli il protocollo Acellulare del Fegato di Ratto). Questo regolarà automaticamente il tipo di misurazione, la durata media della misurazione (finestra di regressione), così come il sigma target.
      1. Per creare un nuovo file di impostazioni, regola uno qualsiasi dei componenti elencati sopra, poi clicca sul pulsante Salva . Questo dovrebbe salvare questi parametri come file di impostazioni separato che poi può essere importato nel sistema.
      2. Per importare un nuovo file di impostazioni, clicca sul menu a tendina accanto a Default (Mod) e seleziona Importa file Nuove impostazioni. Clicca sul nuovo file Impostazioni per importarlo.
    6. Nella sezione Librerie di regressione, seleziona e conferma la combinazione di librerie da utilizzare per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Le librerie per mitocondri ridotti e ossidati [Solo Mito] sono state selezionate per questo esperimento. Altri utenti possono scegliere di utilizzare librerie che includono anche emoglobina, mioglobina o altri complessi presenti sotto la Biblioteca Avanzata.
    7. Seleziona e conferma la modalità di larghezza finestra preferita.
      1. Modalità di larghezza adattiva: Utilizzare la modalità di larghezza adattiva per aggiungere singoli spettri allo spettro mediato fino a raggiungere il massimo target sigma. Se il target sigma non viene raggiunto, la registrazione si interromperà quando raggiunge il limite superiore della finestra di regressione impostata (cioè il numero massimo di spettri che era stato indicato di registrare). I risultati della misurazione verranno visualizzati sullo schermo dopo aver raggiunto il target sigma minimo.
      2. Modalità a larghezza fissa: Utilizzare la modalità a larghezza fissa per aggiungere singoli spettri allo spettro medio fino a quando non viene incluso il numero target di spettri (impostato sotto la lunghezza media).
    8. Una volta completate le impostazioni di sistema, clicca sulla scheda Trama .
    9. Sotto Serie Principale, seleziona i componenti da tracciare e mostrare sullo schermo durante le misurazioni.
    10. Confermare che tutti i componenti di misura selezionati siano in linea con il protocollo di interesse.
  3. Acquisizione dati:
    NOTA: Le misurazioni Raman dovrebbero essere effettuate in uno spazio buio. Prima di iniziare l'acquisizione dati, assicurati che lo spazio di lavoro sia il più schermato possibile dalla luce. Se la stanza non può essere completamente schermata dalla luce, il sistema RRS è dotato di una copertura nera con un'apertura rettangolare al centro (mostrata in Figura 2), attraverso il quale può essere posizionata la sonda laser. La scatola può coprire il campione/la sezione dell'organo da cui vengono prelevate le misurazioni RRS. Quando si lavora con il laser RRS, evita l'esposizione oculare diretta o prolungata. Non puntare un laser direttamente nell'occhio o sulle superfici riflettenti. Attiva il laser solo quando posizionato direttamente sul tessuto di interesse. Il laser RRS è un laser di Classe 3R quando usato a 4 mW, e di Classe 3B quando usato a 10 mW. Il laser è sicuro per il contatto con i tessuti.
    1. Seleziona le impostazioni pre-salvate, i parametri di registrazione e i file della libreria appropriati.
    2. Posiziona la sonda laser direttamente sopra il tessuto/organo di interesse. Posiziona la sonda il più perpendicolare possibile e a 1 cm dal tessuto. Usa un righello per misurare con precisione 1 cm dalla superficie dell'organo. Regolare la sonda per posizionarla più vicino a meno di 1 cm se il segnale non è chiaro. Tuttavia, assicurati che la sonda non tocchi mai il tessuto.
      NOTA: La sonda può essere portata, ma si consiglia di utilizzare un supporto/supporto per sonda che possa essere regolato e rimanga stabile. Posiziona la sonda il più perpendicolare possibile e a 1 cm dal tessuto. Un righello poteva essere usato per misurare con precisione 1 cm dalla superficie dell'organo. La sonda poteva essere regolata per essere posizionata più vicino a meno di 1 cm se il segnale non fosse chiaro. Tuttavia, la sonda non dovrebbe mai toccare il tessuto.
    3. Conferma che il punto laser sia sul lobo laterale sinistro, il più vicino possibile alla vena porta.
    4. Conferma che tutte le librerie selezionate, le impostazioni di regressione, il sigma target, la finestra di regressione e le modalità di acquisizione siano corretti e come desiderato.
      1. Assicurati che la stanza sia il più buia possibile. Verifica che la sonda non abbia alcuna contaminazione, specialmente sangue, sul finestrino. In caso di contaminazione, utilizzare una salvietta senza pelucchi e non abrasiva con alcol isopropilico al 70% per pulire la finestra di quarzo, seguita da un'asciugatura accurata con una salvietta a secco prima di procedere.
      2. In caso di forte contaminazione, pulire la sonda il più accuratamente possibile, come descritto sopra. Poi, calibra il dispositivo posizionando il laser in un involucro buio fodetratto con nastro nero e premendo il pulsante Take Dark . La calibrazione richiede circa 5–10 minuti. Indipendentemente dalla contaminazione, calibra il dispositivo una volta al mese e invierà messaggi di promemoria automatici.
        NOTA: Le spiegazioni di ogni metrica di controllo qualità, esempi di tali metriche QC e il segnale spettrale grezzo ottenuto da registrazioni ottimali e subottimali (File Supplementare 1, Figura 3, Figura Supplementare 3). Questi criteri di controllo qualità sono stati ottimizzati per fegati interi dal modello del ratto. Qualsiasi protocollo di nuova evoluzione che utilizza un organo/modello animale diverso dovrebbe affinare e adattare di conseguenza queste metriche.
    5. Nella pagina principale, clicca sul pulsante Start per iniziare ad acquisire dati. A seconda delle impostazioni scelte, il software prenderà registrazioni fino a raggiungere il valore di errore target (sigma) o 180 s. L'acquisizione dei dati è ora completata.
      1. Deducere la qualità del segnale RRS da questi grafici e valori per consentire l'aggiustamento della posizione della sonda o delle condizioni di misurazione (Figura 3). Se il segnale RRS ottenuto non soddisfa questi criteri di controllo qualità, si regola la sonda per renderla il più perpendicolare possibile e di circa 9 mm dalla superficie alla finestra della sonda.
    6. Una volta completato il protocollo di acquisizione dati/sperimenti, scartare tutto il fegato/tessuto in un contenitore per i rischi biologici. Pulire qualsiasi sistema o superficie che sia stata a contatto con l'organo/tessuto con il 70% di etanolo.
      1. Se si utilizza un sistema di perfusione, si fa passare acqua DI miscelata con detergente enzimatico (7,8 mL diluiti in 1 L di acqua deionizzata [DI]), seguita da acqua DI pulita.
        NOTA: Ogni registrazione verrà salvata come file di analisi separato sotto un nuovo file di sessione. I risultati per 3RMR e la forza del segnale mitocondriale (r3RMR) sono rappresentati nella finestra principale. Lo spettro grezzo può essere visualizzato anche. Altre metriche di controllo qualità, come la potenza residua del segnale e la potenza totale del segnale, saranno visualizzate nella scheda Spectrum .
  4. Analisi dei dati:
    1. Una volta terminata l'acquisizione dati, clicca sulla cartella Revisioni in basso dello schermo per aprire il file sperimentale e vedere i risultati.
    2. In alternativa, apri un file di testo contenente i risultati. Seleziona il file della sessione di interesse. Si aprirà un file di analisi contenente tutte le misurazioni ottenute. Ogni parametro e il suo valore sigma avranno la propria colonna. Ad esempio, i valori di 3RMR ottenuti ogni secondo saranno elencati nella colonna "3RMR" e il loro valore sigma sarà elencato sotto "sigma_3RMR".
    3. L'ultima riga di ogni colonna conterrà i valori finali per ogni parametro di quel file di sessione. Usa questo valore per tracciare.
    4. Ripeti i passaggi per ogni file di sessione/ogni registrazione. Traccia i valori ottenuti come desiderato.

figure-protocol-2
Figura 2: Configurazione del dispositivo RRS. Uno schema della configurazione del sistema RRS. La sonda è collegata tramite un cavo in fibra ottica al sistema RRS, che contiene la sorgente di eccitazione laser e lo spettrometro. Questa configurazione si collega poi a qualsiasi laptop che contiene l'app di controllo dello spettrometro per la raccolta e l'analisi dei dati. Sia il computer che l'unità spettrometrica sono collegati a una presa di corrente. Le misurazioni RRS dovrebbero essere effettuate al buio. Se la stanza non può essere completamente schermata dalla luce, il sistema RRS è dotato di una copertura nera con un'apertura rettangolare al centro, dove può essere posizionata la sonda laser. La scatola copre il campione/la sezione dell'organo da cui vengono prese le misurazioni RRS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Esempi di tracce e metriche di controllo qualità di tracce di qualità subottimale e qualità ottimale. Il segnale residuo (rumore) è segnato con una parentesi arancione, mentre il segnale mitocondriale con una parentesi verde. (A) Tracciamento di esempio da un segnale Raman subottimale. Il segnale residuo è troppo grande per essere differenziato dal segnale mitocondriale. I picchi spettrali sono indistinguibili lungo tutto il segnale misurato. (B) Traccia di esempio dal segnale Raman ottimale. Il segnale mitocondriale è visibilmente più ampio e distinto dal segnale residuo. I picchi spettrali derivanti dalla misura ottenuta sono distinguibili. (C) Metriche QC ottenute da ciascun segnale. Nel complesso, il segnale totale ottenuto nella lettura subottimale è inferiore a quella ottimale. Un maggiore segnale mitocondriale viene misurato nella registrazione ottimale rispetto a quella subottimale, con il segnale mitocondriale che rappresenta rispettivamente il 17% e il 14% del segnale totale. Il segnale è stato misurato con un errore del 4,3% nella lettura ottimale, in contrasto con un errore del 18,5% nella lettura subottimale. Analogamente, il segnale residuo inspiegabile rappresenta l'11% del segnale totale nella registrazione subottimale, mentre rappresenta il 3,6% nell'ottimale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Valutazione della salute mitocondriale tramite RRS

NOTA: La tecnologia di Spettroscopia Raman a Risonanza (RRS) è stata impiegata per sviluppare una metrica di vitalità mitocondriale (3RMR) che indica la vitalità degli organi trapiantati. Questo studio mira a dimostrare come i cambiamenti nell'ossigenazione – e, di conseguenza, nella respirazione cellulare – si riflettano nelle tendenze del 3RMR rispetto ai biomarcatori tradizionali del danno, come il lattato e il K+. Qui viene utilizzato un test di stress ossigeno, in cui, dopo 5 minuti di perfusione continua, il flusso di perfusione ossigenata viene sospeso per 5 minuti, poi ripreso per 5 minuti. Durante il test di stress vengono prelevate misurazioni RRS, così come campioni di perfusione in ingresso e uscita.

  1. Procuramento epatico:
    1. Sedate gli animali in una camera di induzione usando isoflurano al 3%–5%. Filtra il vapore in eccesso con carbone attivo.
    2. Eseguire un'epatectomia completa su maschi di ratti Lewis (150 g). Legare i rami della vena porta. Inietta 50 U di eparina sodica attraverso la VCI. Durante l'intervento, cannula la vena porta con un catetere da 16 G e risciacqua il fegato con 50 mL di soluzione salina.
    3. Mettere i fegati acquisiti sul ghiaccio in una piastra di Petri contenente 30 mL di soluzione dell'Università del Wisconsin (UW).
  2. Configurazione della perfusione di macchine subnormotermiche (SNMP) e misurazioni Raman per risonanza:
    1. Configura il dispositivo RRS come descritto prima. Imposta il Protocollo Acellulare del Fegato di Ratto sul software di controllo dello spettrometro, che imposta automaticamente la modalità larghezza su larghezza adattiva, la lunghezza media a 180 e il sigma target a 1,5. Seleziona inoltre 3RMR e Fluorescenza come parametri di misura, oltre a Mito solo come libreria di regressione. Imposta la modalità acquisizione su modalità continua.
    2. Ha istituito il sistema SNMP come descrittoaltrove 18.
      1. In breve, assicurati che l'impianto di perfusione includa una camera di perfusione, una pompa peristaltica, un ossigenatore a membrana e una trappola per bolle.
      2. Fornire ossigeno con una miscela atmosferica (95%O2 e 5%CO2); MantienipO 2 tra 400 e 500 mmHg. Monitorare la pressione intraepatica con un sensore di pressione e mantenerla tra 3 e 5 mmHg. Raccogli i campioni tramite porte di campionamento.
    3. Una volta configurato il software e il sistema di perfusione, collega la cannula che penetra nel PV al tubo di ingresso della macchina per la perfusione. Mantieni l'organo, la perfusione e la perfusione a temperatura ambiente (21 °C), senza l'aiuto di un bagno d'acqua.
    4. Somministrare il perfuso all'organo attraverso la cannula nella PV utilizzando una pompa peristaltica.
      1. Per preparare il perfusato, mescola 500 mL di Williams' Medium senza fenolo rosso con 5 g di albumina sierica bovina (BSA), 12 mg di desametasone solubile in acqua, 5 mL di penicillina-estreptomicina, 5 mL di L-glutammina, 2,5 μL di insulina e 1000 U di eparina.
      2. Mescola tutti i componenti su una piastra di mescolamento per circa 20 minuti, o finché tutti i componenti non si sono dissolti. Aumentare i flussi di perfusione a pressioni di snervamento di 3–5 mmHg.
    5. Poi, posizionare la sorgente laser RRS nel supporto sonda e posizionarla a 1 cm sopra il lobo più grande del fegato, il più vicino possibile alla PV. Mettere in pausa il flusso di perfusione a 5 minuti (T5) e riprenderlo a 10 minuti (T10). Esegui il test di sforzo a 15 minuti (T15).
    6. Effettua misurazioni RRS durante tutto il test di stress; prendere misurazioni di afflusso e uscita ogni 5 minuti, a partire da T0 (Figura 4). Traccia i valori di 3RMR, così come i livelli di K+ in uscita e di lattato per T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Figura 5).
    7. Calcola il tasso di consumo di ossigeno (OCR) a T0, T5, T10, T15 moltiplicando la pressione parziale di afflusso e uscita di ossigeno (pO 2) con il coefficiente di solubilità dell'ossigeno nel plasma (0,00314). Traccia l'OCR per T0, T5, T10, T15 (Figura 5).
      NOTA: Sono mostrate tracce spettrali Raman di risonanza esemplare negli stati perfusi (T5), ischemici (T10) e reperfusi (T15) da un fegato (Figura 6)

figure-protocol-4
Figura 4: Diagramma che rappresenta il flusso sperimentale. Fu eseguita un'epatectomia completa su femmine di ratti Lewis. Il fegato estratto è stato sottoposto a perfusione subnormotermica con macchine e somministrato con perfuso ossigenato per i primi 5 minuti. La perfusione fluisce nel fegato attraverso la vena porta e circola attraverso la pompa peristaltica (flusso di perfusione raffigurato con frecce blu). La perfusione ossigenata è stata sospesa per i successivi 5 minuti a T5 e ripresa per altri 5 minuti a T10. Misurazioni 3RMR effettuate durante il test di stress (rappresentate come il laser). Sono stati prelevati campioni di perfuso a T0, T5, T10 e T15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

I fegati nuovi sono stati sottoposti a periodi di ischemia e reperfusione tramite un test di sforzo per ossigeno. Successivamente, le variazioni in tempo reale della 3RMR sono state confrontate durante il test di sforzo con il tasso di consumo di ossigeno, il lattato in uscita e il potassio ottenuti dall'analisi del perfusato a T0,T 5, T10, T15. In condizioni di salute, i valori di 3RMR sono previsti tra il 10% e il 30% (Fi...

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Discussione

Questo studio evidenzia un metodo non invasivo, in tempo reale e altamente sensibile per quantificare la salute mitocondriale utilizzando un sistema portatile di spettroscopia Raman a risonanza, composto da un laser in una sonda compatta, collegato con un cavo in fibra ottica a una pompa laser. Questo metodo utilizzava un laser da 441 nm per eccitare i mitocondri, che producono segnali spettrali unici a seconda del loro stato di ossidazione. Pertanto, RRS è in grado di quantificare ogni ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano interessi contrastanti. S.N.T e P.R. hanno domande di brevetto provvisorie rilevanti per questo studio. P.R. è un dipendente e azionista di Pendar Technologies. Le S.N.T. sono gestite da MGH e Partners HealthCare in conformità con le loro politiche di conflitto di interesse. Gli interessi in conflitto di J.N.K sono gestiti dalle politiche di conflitto di interessi di BCH. In questo studio sono state utilizzate le seguenti tecnologie brevettate: US2020/0281474A1 Monitoraggio in vivo dell'energetica cellulare con spettroscopia Raman (applicazione). Sono state presentate ulteriori domande di brevetto per l'uso in oftalmologia, vitalità tissutale e valutazione delle lesioni da ustioni tramite spettroscopia Raman a risonanza, con R.J. anche inventore.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da generosi finanziamenti al S.N.T. dai National Institutes of Health (R01DK134590). Riconosciamo inoltre con gratitudine i finanziamenti a S.N.T dal National Institute of Health degli Stati Uniti (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Fondazione Nazionale per la Scienza (EEC 1941543), Fondazione della Famiglia Polsky e Shriners Children's Boston (Grant #BOS-85115). Inoltre, riconosciamo i finanziamenti a R.J. tramite la Grant #LIFER23-263034 della American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Gli autori esprimono profonda gratitudine per il supporto esperto del Pathology Core della Harvard Medical School per gli studi di istologia. Desideriamo esprimere la nostra gratitudine al Dr. Robert Balaban e al Dr. Armel Femnou del NIH National Heart, Lung, and Blood Institute per la loro competenza nell'energetica mitocondriale e il loro importante supporto nello sviluppo della biblioteca RRS dei singoli complessi mitocondriali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Usato per cannulare la vena porta
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Usato per filtrare il vapore in eccesso durante l'anestesia
BSA Sigma-Aldrich A7906Composizione del perfusato
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Composizione del perfusato
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Composizione del perfusato
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Usato per far fluire il perfusato attraverso il fegato
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Usato per far fluire il perfusato attraverso il fegato
Membrane Oxygenator Radnoti130144Usato per ossigenare il perfusato. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Composizione del perfusato
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Per l'analisi del gas nel sangue
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Contattare Pendar Technologies per informazioni su questo prodotto

Riferimenti

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