Costruzione di organoidi per il cancro al seno umano e quantificazione basata su test cometa del danno al DNA indotto dalla doxorubicina

Sommario

Questo protocollo stabilisce un modello di organoidi per il cancro al seno umano (BCO) e valuta quantitativamente i danni al DNA indotti dalla doxorubicina utilizzando il test cometa. Viene dimostrata la fattibilità di applicare il test cometa ai BCO e viene fornito un flusso di lavoro riproducibile, scalabile e operativo per rilevare danni al DNA indotti da DOX nei BCO.

Abstract

Il cancro al seno è la neoplasia più comune tra le donne nel mondo e presenta un'eterogeneità significativa. La doxorubicina (DOX) è ampiamente utilizzata nel trattamento del cancro al seno e il suo principale meccanismo d'azione consiste nell'induzione di rotture a doppio filamento del DNA e nel trigger della morte cellulare. In questo protocollo, è stato stabilito un modello umano di BCO per valutare quantitativamente il danno al DNA indotto da DOX. Le cellule primarie del cancro al seno sono state isolate da tessuti tumorali derivati dal paziente tramite dissociazione meccanica ed enzimatica e successivamente coltivate in una matrice tridimensionale per generare BCO. Gli organoidi sono stati poi trattati con 8 μM DOX per 2 ore. Il danno al DNA è stato valutato dopo 2 ore di trattamento. Dopo il trattamento, gli organoidi venivano dissociati in singole cellule, immersi in agarosio a basso punto di fusione ed elettroforizzati in condizioni alcaline. Dopo l'elettroforesi, i modelli di migrazione del DNA sono stati visualizzati come strutture di comete sotto microscopia a fluorescenza e analizzati quantitativamente con il software OpenComet per determinare la percentuale di DNA caudal (% DNA caudale). Il test della cometa ha rilevato con successo danni al DNA nei BCO. Rispetto al gruppo di controllo, i BCO esposti a 8 μM DOX per 2 ore hanno mostrato code di cometa allungate dopo dissociazione organoide ed elettroforesi. L'analisi quantitativa ha rivelato che la percentuale di DNA della coda era significativamente più alta nel gruppo trattato, indicando l'induzione di danni al DNA. Questo metodo altamente sensibile supporta studi tossicologici e farmacodinamici di DOX e fornisce una solida piattaforma tecnica per valutare i danni al DNA nei sistemi BCO derivati dai pazienti.

Introduzione

Il cancro al seno è un tumore maligno che nasce dai tessuti epiteliali del seno a causa di alterazioni genetiche, disregolazione ormonale e altri fattori patogeni. È la malignità più comune tra le donne in tutto il mondo e presenta modelli epidemiologici unici e una notevole eterogeneità^{intratumorale 1,2}. DOX, un agente chemioterapeutico di prima linea, si intercala nel DNA, inibisce l'attività della topoisomerasi II e induce la rottura del filamento del DNA, scatenando infine l'apoptosi nelle cellule^{tumorali 3}. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale sono limitati nella loro capacità di riprodurre la complessa organizzazione cellulare e l'eterogeneità dei tumori al seno. Al contrario, i BCO sono strutture tridimensionali derivate dai tessuti tumorali del paziente che mantengono le caratteristiche chiave del tumore originale, inclusa la composizione cellulare, l'architettura tissutale e i fenotipi molecolari. In particolare, i modelli BCO dimostrano un'alta concordanza con le risposte cliniche ai farmaci; per un dato agente terapeutico, la concordanza della risposta negativa raggiunge il 100%, e la concordanza della risposta positiva raggiunge il 98% tra BCO e il paziente^{corrispondente 4}.

I BCO rappresentano un modello in vitro avanzato che riproduce caratteristiche strutturali e funzionali chiave dei tumori primari e sono stati ampiamente applicati per studiare la tumorigenesi, la progressione della malattia e la resistenza^{terapeutica 5}. L'inizio del tumore nel cancro al seno si basa tipicamente sull'inattivazione cooperativa di molteplici geni soppressori tumorali, come TP53, PTEN, RB1 e NF1, poiché le alterazioni di un singolo gene non sono sufficienti a guidare la trasformazione maligna dell'epitelio mammario normale. Questo processo è accompagnato da perdita di polarità cellulare, disorganizzazione architettonica e proliferazione incontrollata ^6,7,8.

Il saggio della cometa (noto anche come elettroforesi su gel a cellula singola, SCGE) è un metodo classico per valutare i danni al DNA a livello di singola cellula. La tecnica fu introdotta per la prima volta da Rydberg e Johanson nel 1978, e successivamente perfezionata da Ostling e Johanson, che stabilirono il test a cometa neutra per rilevare le rotture a doppio filamento del DNA. Nel 1988, Singh e colleghi incorporarono condizioni di elettroforesi alcalina, permettendo il rilevamento di rotture a singolo filamento del DNA, siti abasici e lesioni alcalin-labili, ampliando notevolmente l'applicabilità del^{saggio 9}. Il principio fondamentale del test cometa è che la mobilità elettroforetica del DNA dipende dall'integrità del DNA. Dopo l'inserimento dell'agarosio e la lisi per rimuovere membrane e proteine cellulari, frammenti di DNA danneggiati migrano verso l'anodo durante l'elettroforesi formando una "coda di cometa", mentre il DNA intatto rimane vicino al sito di carico, formando la "testa della cometa^"10. Parametri come la lunghezza della coda, la percentuale di DNA della coda (% DNA della coda) e il momento della coda oliva permettono una valutazione semi-quantitativa o quantitativa del danno al DNA, e i disegni sperimentali lungo il tempo possono essere utilizzati per valutare la capacità di riparazione del DNA. A causa della sua elevata sensibilità, dei bassi requisiti di input del campione e della relativa semplicità procedurale, il test cometa è stato ampiamente utilizzato in tossicologia genetica, biologia oncologica e studi di risposta farmacologica, in particolare per valutare i danni al DNA indotti da agenti chemioterapici e radioterapia, nonché i meccanismi di resistenza delle cellule tumorali. Il saggio è altamente sensibile alle condizioni sperimentali e alla variabilità procedurale, e la riproducibilità e la comparabilità inter-laboratorio dipendono da flussi di lavoro standardizzati e dall'analisi automatica delle immagini¹¹. Negli ultimi anni, l'integrazione di software di imaging ad alto rendimento, modelli organoidi e sistemi di editing genetico ha ulteriormente aumentato l'utilità del saggio cometa nell'indagare i danni e i meccanismi di riparazione del DNA e nella valutazione delle risposte al trattamento tumorale.

Rispetto ai tradizionali saggi di danno al DNA come la colorazione immunofluorescenza γ-H2AX o la citometria a flusso, il saggio cometa fornisce un mezzo diretto per quantificare le rotture fisiche del filamento del DNA a livello di singola cellula. Poiché questa metodologia opera indipendentemente dall'espressione proteica specifica o dalla specificità degli anticorpi, elimina efficacemente i risultati falsi negativi derivanti da variazioni negli stati del ciclo cellulare o da aberrazioni nelle vie di risposta al danno^{del DNA 12}. Inoltre, a differenza delle colture monostrato bidimensionali convenzionali, il modello organoide tridimensionale utilizzato in questo studio riproduce più fedelmente la complessa architettura spaziale, le interazioni con la matrice extracellulare e i gradienti di permeazione dei farmaci dei tumori in vivo. Mentre i modelli tradizionali di linee cellulari spesso sovrastimano la genotossicità dovuta all'esposizione artificiale a farmaci, la piattaforma organoide valuta il danno al DNA indotto da DOX in un microambiente che rispecchia da vicino le condizioni fisiologiche cliniche, migliorando così sostanzialmente l'affidabilità e il valore traslazionale di questo paradigma di screening¹³.

Nonostante i notevoli vantaggi del test integrato con cometa organoide stabilito in questo studio per la valutazione dei danni al DNA, la sua implementazione pratica richiede un'attenta considerazione di diverse limitazioni tecniche e parametri di applicabilità relativi all'input del campione. Il protocollo richiede una dissociazione enzimatica accurata ma delicata degli organoidi per ottenere una sospensione unicellulare altamente vitale. Una densità di semina di 15.000–20.000 cellule primarie di cancro al seno per 100 μL della matrice della membrana basale (~200 cellule/1 μL) sostiene la segnalazione paracrina intercellulare necessaria per la formazione robusta della sfera, prevenendo al contempo la necrosi centrale indotta dall'iperdensità e dalla rapida deplezione dei nutrienti. Per quanto riguarda la finestra terapeutica, questo test richiede un'attenta calibrazione della concentrazione DOX e della durata dell'esposizione per prevenire una morte cellulare eccessiva (>20–30%). L'esposizione supraletale a droghe genera un'abbondanza di comete "riccio", che oscurano i veri segnali di danno al DNA e confondono l'interpretazione dei dati. Per quanto riguarda le limitazioni del saggio, la bassa capacità intrinseca del test standard della cometa alcalina lo rende inadeguato per lo screening di farmaci ad alta produttività. Inoltre, questa tecnica richiede una rigorosa standardizzazione delle procedure sperimentali—inclusa la stabilità dell'adesione del gel, la durata dello swinding alcalino e l'uniformità elettroforetica—poiché anche piccole deviazioni operative possono introdurre errori sistemici sostanziali.

In conclusione, questo protocollo stabilisce i BCO umani e dimostra la fattibilità di applicare il test della cometa per quantificare i danni al DNA indotti dalla DOX. Dopo un trattamento DOX a 8 μM di BCO completamente affermati, il danno al DNA è stato valutato utilizzando il test cometa. Questo approccio consente una valutazione stabile e diretta del danno al DNA indotto dalla DOX.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare Wuzhong di Suzhou (Approvazione n. 20251w03) ed è stato condotto in conformità con gli standard etici medici. Tutti i soggetti coinvolti in questa ricerca hanno fornito un consenso scritto e informato.

1. Costruzione di BCO umani

1. Trasporto e stoccaggio del tessuto per il cancro al seno
   1. Inserire immediatamente il tessuto umano appena resezionato per il tumore al seno in una soluzione di conservazione del tessuto pre-raffreddata (4 °C).
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto rimanga completamente sommerso durante il trasporto.
2. Dissociazione meccanica del tessuto del tumore al seno
   1. Esegui tutte le procedure in un armadietto di biosicurezza. Posizionare il tessuto per il tumore al seno in una tavoletta di coltura da 6 cm e rimuovere il tessuto adiposo visibile usando bisturi sterili e pinze.
   2. Aggiungi 3 mL di PBS al piatto da 6 cm per la coltura e lava il fazzoletto tre volte.
   3. Aspirare e scartare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   4. Ripeti i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 altre due volte.
   5. Trasferire il tessuto del cancro al seno in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL usando forbici chirurgiche sterili e tagliare il tessuto in piccoli frammenti di circa 2 x 5 mm.
3. Digestione enzimatica del tessuto tumorale al seno
   1. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione organoide al tubo microcentrifuga da 1,5 mL e trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungere ulteriori 8 mL di soluzione di dissociazione organoide al tubo centrifuga da 15 mL.
   3. Incubare il tubo centrifugo da 15 mL a 37 °C per 40 minuti.
   4. Agita il tubo su uno shaker per 1 minuto ogni 10 minuti durante la digestione.
   5. Dopo 40 minuti, aggiungi 6 mL di PBS al tubo centrifugo da 15 mL per interrompere la digestione.
      NOTA: Aggiungere PBS direttamente alla miscela digeritiva per fermare l'attività enzimatica.
4. Isolamento delle cellule tumorali primarie al seno e incorporamento organoide
   1. Posizionare un filtro a celle da 100 μm su un tubo centrifuga da 50 mL.
   2. Aggiungi 1 mL di mezzo di coltura cellulare completo sul colino cellulare.
      NOTA: Prepara il mezzo completo di coltura cellulare utilizzando 500 mL di mezzo basale, 50 mL di siero bovino fetale e 5 mL di penicillina-estreptomicina.
   3. Aspirare 1 mL della sospensione tissutale digerita dal tubo centrifugo da 15 mL e applicarla sul colino cellulare.
   4. Ripeti il passaggio 1.4.3 finché l'intera sospensione non passa attraverso il passabraccio.
   5. Risciacquare il colino cellulare con un ulteriore 1 mL di mezzo di coltura cellulare completa.
   6. Centrifuga il tubo centrifugo da 50 mL a 350 × g per 3 minuti a 4 °C.
   7. Aspira e scarta il soprantantante.
   8. Risospendere la pellet cellulare in 1 mL di mezzo completo di coltura cellulare e trasferirla in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
   9. Centrifuga la sospensione a 370 × g per 5 minuti a 4 °C.
   10. Aspira e scarta il soprantantante.
   11. Aggiungi 100 μL della matrice della membrana basale al tubo della microcentrifuga da 1,5 mL e mescola accuratamente.
       NOTA: Mantenere una densità di semina di 15.000–20.000 cellule primarie di cancro al seno per 100 μL della matrice della membrana basale (200 cellule/1 μL). Questo sostiene la segnalazione paracrina intercellulare per la formazione robusta di sfere e previene la necrosi centrale.
   12. Dispensare 25 μL della miscela membrana-cella basale in ciascun pozzo di una piastra a 24 pozzi.
   13. Inverti la piastra a 24 pozzi e incubala a 37 °C per 10 minuti per permettere la polimerizzazione della matrice della membrana basale.
   14. Aggiungere 500 μL di substrato di coltura BCO a ciascun pozzo della piastra a 24 pozzi.
       NOTA: Coltura dei BCO utilizzando un mezzo commerciale pronto all'uso con una formulazione proprietaria.
   15. Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37°C con il 5% di CO₂.
       NOTA: Dopo la semina nella matrice extracellulare, i BCO sono stati coltivati per 7–10 giorni per consentire un corretto sviluppo strutturale 3D. Gli organoidi erano considerati completamente consolidati e pronti per il trattamento farmacologico quando mostravano morfologie 3D dense e sferiche e raggiungevano un diametro medio di circa 50–100 μm, senza segni di necrosi centrale. Una volta soddisfatti questi criteri di endpoint, i BCO sono stati successivamente trattati con DOX.

2. Rilevamento del danno al DNA indotto da DOX nei BCO tramite il test della cometa

Il protocollo sperimentale è stato adattato dalle linee guida stabilite e ulteriormente ottimizzato per adattarsi a specifiche condizioni di laboratorio¹⁴.

ATTENZIONE: Esegui tutte le procedure di gestione DOX — inclusa la pesatura della polvere secca, la preparazione della soluzione stock e la diluizione seriale delle soluzioni di lavoro — esclusivamente all'interno di un armadietto di sicurezza biologica certificato Classe II o di una cappa chimica. Evita rigorosamente qualsiasi manipolazione su banchi di laboratorio aperti. Indossa guanti in nitrile a doppio strato e proteggi il farmaco dalla luce durante tutte le procedure. Infine, segregare tutti i consumabili contaminati da DOX (ad esempio, punte di pipetta e tubi microcentrifughe) strettamente come 'rifiuti citotossici' per uno smaltimento specializzato; Non mescolare mai questi oggetti con rifiuti biologici pericolosi di routine.

1. Trattamento DOX dei BCO
   1. Aspira e scarta il mezzo di coltura esaurito.
   2. Aggiungere 500 μL di substrato colturale fresco per BCO in ciascun pozzo
   3. Rimuovere e scartare 4 μL del mezzo da ogni pozzo
   4. Aggiungi 4 μL di soluzione DOX stock da 1 mM a ciascun pozzo.
      NOTA: Per stabilire una concentrazione di lavoro finale di 8 μM, determinare il volume di stock richiesto utilizzando l'equazione standard di diluizione: C₁V₁ = C₂V_2. Dove C₁ rappresenta la concentrazione iniziale di stock DOX (1 mM), C₂ è la concentrazione target (8 μM) e V₂ è il volume finale del pozzo (500 μL). Risolvendo per V₁ si ottiene 4 μL. Di conseguenza, il protocollo richiede l'aggiunta di 4 μL dello stock DOX da 1 mM ai restanti 496 μL di mezzo di coltura per pozzo, quindi di mescolare accuratamente per garantire una distribuzione omogenea.
   5. Incubare la piastra in un incubatore a 37°C con il 5% di CO₂ per 2 ore.
2. Dissociazione delle BCO
   1. Aspirare e scartare il mezzo di coltura BCO dalla piastra a 24 pozzi.
   2. Aggiungere 500 μL di soluzione di dissociazione organoide a ciascun pozzo.
   3. Pipetta su e giù ripetutamente per disturbare completamente la matrice della membrana basale e le strutture organoide.
   4. Incubare il piatto a 37 °C con il 5% di CO₂ per 10 minuti.
   5. Trasferire 500 μL della sospensione risultante da ciascun pozzo in un tubo centrifuga da 15 mL.
   6. Centrifuga la sospensione a 350 × g per 3 minuti a 4 °C.
   7. Aspira e scarta il soprantantante.
   8. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura completo al tubo centrifuga da 15 mL per risospendere il pellet della cella e successivamente trasferire la sospensione risultante in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
   9. Centrifuga la sospensione a 350 × g per 3 minuti a 4 °C.
   10. Aspira e scarta il soprantantante.
       NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet organoide rimane nel tubo della centrifuga.
3. Risospensione delle celle e incorporamento dell'agarosio
   1. Preriscalda il blocco riscaldante metallico a 95 °C.
   2. Inserisci 1 mL di agarosio a basso punto di fusione (LMP) in un blocco metallico riscaldante e incuba per 10 minuti per garantire la fusione completa.
   3. Pipettare 100 μL di agarosio fuso allo 0,5% a basso punto di fusione in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente BCO.
   4. Trasferisci immediatamente i campioni in un bagno d'acqua a 37 °C e lasciali in equilibrio per 10 minuti.
   5. Mescola accuratamente e immediatamente pipetta 50 μL della sospensione di agarosio a cellula su un vetrino al microscopio.
4. Lisi cellulare e rielaborazione del DNA
   1. Immergi i vetri in soluzione fredda per la lisi e incuba a 4 °C al buio per 12 ore.
   2. Rimuovi i vetri dalla soluzione di lisi e immergile immediatamente in una soluzione alcalina di srotolamento.
      NOTA: Per preparare la soluzione alcalina di srotolamento, sciogliere 0,6 g di NaOH in 4,975 mL di acqua ultrapura, poi aggiungere 250 μL di 200 mM EDTA. Per preparare il tampone di elettroforesi alcalina, sciogliere 12 g di NaOH in 995 mL di acqua ultrapura, poi aggiungere 5 mL di 200 mM EDTA.
      ATTENZIONE: Il NaOH nel tampone per il test cometa è una base altamente corrosiva e forte, capace di causare gravi ustioni cutanee e oculari. Durante la preparazione della soluzione, aggiungere i pellet solidi di NaOH all'acqua lentamente, in modo incrementale e sotto una mescolata magnetica continua. Non versare mai acqua direttamente sui pellet secchi, poiché la reazione esotermica violenta può far bollire e schizzare il liquido caustico. Inoltre, eseguire tutta la polvere secca pesante esclusivamente all'interno di una cappa chimica per evitare l'inalazione di polvere corrosiva.
   3. Immergi i vetrini nella soluzione di lisi e incuba a 4 °C al buio per 1 ora.
5. Elettroforesi
   1. Trasferire i vetri dalla soluzione alcalina di srotolamento alla camera di elettroforesi.
   2. Aggiungere 1 L di tampone per elettroforesi alcalina nel serbatoio per elettroforesi per garantire l'immersione completa delle vetrine.
   3. Esegui l'elettroforesi a 25 V e 300 mA per 30 minuti.
6. Lavaggio e fissazione delle slitte
   1. Immergi i vetri in 5 mL di etanolo al 70% e incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: L'etanolo rappresenta un grave rischio di infiammabilità. Quando si effettuano preparazioni di grande volume o disidratazione tissutale, mantenere una ventilazione robusta nell'ambiente sperimentale. Isolare rigorosamente l'area operativa da tutte le sorgenti di accensione, incluse fiamme aperte (come i bruciatori di alcol) e scintille elettrostatiche. Dopo l'uso, sigilla immediatamente i contenitori dei reagenti e mettili in sicurezza in un armadietto di stoccaggio infiammabile a prova di esplosione dedicato.
   2. Metti le vetrine in un incubatore a 37 °C e lasciale asciugare per 15 minuti.
7. Colorazione e imaging del DNA
   1. Aggiungi 1 μL di colorazione fluorescente per acidi nucleici a 10 mL di acqua ultrapura.
      ATTENZIONE: Trattare questi agenti intercalanti degli acidi nucleici come potenziali mutageni e maneggiarli con precauzioni rigorose. Per prevenire la contaminazione incrociata negli spazi di lavoro di routine, stabilire una 'zona di colorazione degli acidi nucleici' dedicata, dotata di pipette dedicate. Se integri l'agarosio fuso con coloranti, lascia raffreddare il gel a circa 60 °C prima di aggiungerlo per evitare l'inalazione di vapori pericolosi e carichi di coloranti. Infine, getta tutte le soluzioni di colorazione esaurite e i gel di scarto rigorosamente in contenitori designati per gli acidi nucleici.
   2. Immergi i vetrini nella soluzione di colorazione preparata nel Passo 2.7.1 e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
   3. Esegui un singolo lavaggio di 5 minuti con 5 mL di acqua ultrapura.
   4. Asciugare le vetrine all'aria per 15 minuti in un incubatore a 37 °C.
   5. Visualizza le strutture delle comete usando un microscopio a fluorescenza con filtro di eccitazione verde e rileva la fluorescenza rossa.

3. Elaborazione dei dati

1. Eseguire un'analisi quantitativa automatizzata delle immagini dei test comete utilizzando il plugin OpenComet in Fiji (distribuzione ufficiale) per ottenere parametri correlati al danno del DNA.
   NOTA: Per quanto riguarda l'analisi statistica, questo lavoro ha incluso rigorosamente solo comete ad alta risoluzione, chiaramente fotografate, che mostrano morfologia intatta e nessuna sovrapposizione. Al contrario, il protocollo di screening escludeva comete 'ricci' o 'fantasma' (che mostrano una testa ridotta e una coda estesa, indicando una grave apoptosi o necrosi), così come immagini con bordi sfocati, raggruppamento cellulare o artefatti di fondo.
   1. Apri il software delle Fiji (Figura supplementare 1A).
   2. Clicca su Plugin nella barra del menu (Figura supplementare 1A).
   3. Seleziona OpenComet (Figura supplementare 1B).
   4. Clicca su Sfoglia sotto File di input e seleziona le immagini del test cometa per l'analisi (Figura supplementare 1C).
   5. Clicca su Sfoglia sotto Cartella di Output e definisci la cartella di destinazione per i file di output (Figura Supplementare 1C).
   6. Clicca su Esegui per avviare l'analisi automatica (Figura Supplementare 1C). Questo passaggio conclude il flusso di lavoro di elaborazione e analisi dei dati.
      NOTA: Per ogni gruppo sperimentale, questo studio ha quantificato la percentuale di DNA della coda (% DNA della coda) da una selezione casuale di almeno 50 cellule. L'analisi statistica successiva ha utilizzato un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per confrontare le medie dei gruppi, con p < 0,05 considerata statisticamente significativa.

Risultati

Istituzione delle BCO

Questo studio ha riconosciuto con successo gli organoidi del tumore al seno a partire da campioni primari di tessuto tumorale. Nella fase iniziale della coltura, un gran numero di singole cellule o piccoli gruppi cellulari era chiaramente osservato, con cellule distribuite in modo relativamente disperso e prive di un'evidente organizzazione sferica tridimensionale. Alcune cellule presentavano morfologie rotonde o quasi ro...

Discussione

Il saggio sulla cometa rappresenta un significativo progresso nei metodi di valutazione della genotossicità. Grazie alla sua risoluzione a singola cellula e alla visualizzazione diretta dei modelli di danno del DNA basati sulla migrazione elettroforetica, questa tecnica offre chiari vantaggi rispetto ai saggi convenzionali^{di genotossicità 15}.

Diversi passaggi critici durante la procedura sperimentale influenzano la riproducibilità e l'i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit Plus	Mogenel Biotechnology	MA-0807T011LP	BCO culture medium
Comet Slide	R&D SYSTEMS	4250-050-03
Dry-bulb thermostat	Hangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.	DH100-2	Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	gibco	C11995500BT	Complete cell culture medium
EDTA	TREVIGEN	4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water Bath	Shanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.	MSY-24	Water bath
Electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645052
Fetal bovine serum	EallBio	03.U16001DC
Fluorescence microscope	WEIDA	IM-300LD4
Forceps	Beyotime	FS019
GelRed	Beyotime	D0140
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical analysis software
ImageJ	National Institutes of Health, NIH	1.54p	Image processing software / image
LMA garose	R&D SYSTEMS	4250-050-02	Low-melting-point agarose
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40	Centrifuge
Lysis Solution	TREVIGEN	4250-050-01	Lysis solution
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	The basement membrane matrix
NaOH	DAMAO	1588
OpenComet software	Open-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singapore	v1.3.1
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L
Penicillin – Streptomycin	Beyotime	CO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032	PBS
Pipettes	Rainin	Pipet-Lite XLS
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S	Organoid dissociation solution