Imaging quantitativo delle cellule vive della forma nucleare e della dinamica della cromatina durante lo sviluppo e lo stress ambientale nella radice di Arabidopsis thaliana

Summary

Questo processo utilizza microscopia confocale in combinazione con un nucleo e una linea di marcatori di cromatina marcati fluorescentmente in Arabidopsis thaliana per registrare simultaneamente la dinamica del nucleo e della cromatina nelle radici di Arabidopsis e indagare i cambiamenti in queste dinamiche in risposta a segnali di sviluppo e ambientali.

Abstract

Il nucleo è l'organello caratteristico degli organismi eucarioti. A differenza della visione classica dei nuclei statici, la forma nucleare è dinamica nelle cellule vive. La forma nucleare alterata o deformata è un segno distintivo del cancro nelle cellule animali e dello stress ambientale nelle piante. Le proteine dell'involucro nucleare interagiscono con la cromatina per regolare l'espressione genica. Purtroppo, si sa poco sull'impatto dello stress abiotico sulla forma, sul movimento e sulla dinamica della cromatina nucleare. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una pipeline utilizzando software di microscopia confocale e tracciamento particelle per quantificare la dinamica nucleare e della cromatina nelle radici di Arabidopsis sotto controllo e in condizioni di stress abiotico. Questo metodo di imaging confocale utilizza una linea marcatrice doppia marcata con fluorescenza – proteina dell'involucro nucleare e cromatina – per eseguire l'imaging di cellule vive della radice nella pianta modello Arabidopsis thaliana sotto controllo e in condizioni di stress salato. Questi filmati vengono analizzati per quantificare la dinamica nucleare e della cromatina utilizzando il software open source di elaborazione immagini Fiji/ImageJ con l'aiuto del plugin TrackMate. Per convalidare questo metodo, abbiamo immaginato e quantificato il movimento della cromatina nelle radici di controllo e sotto stress salato, rivelando una diminuzione della velocità della cromatina in condizioni di stress salato. Questo metodo consente l'imaging quantitativo delle cellule vive della forma nucleare radicale e della dinamica della cromatina durante lo sviluppo delle piante e lo stress ambientale, consentendo così l'analisi dei cambiamenti nella dinamica nucleare e della cromatina causati da stressori abiotici.

Introduction

La forma nucleare varia tra diversi tipi cellulari e durante lo sviluppo^{nelle radici 1,2} di Arabidopsis thaliana. Ad esempio, la forma nucleare è sferica nelle regioni meristematiche attivamente divisive. A differenza della regione meristematica, i nuclei nella zona di transizione radicale ed elongazione sono meno sferici. Inoltre, i nuclei nelle cellule differenziate, come i peli radicali, passano attraverso la base dei peli radicali stretti e vengono attivamente trasformati in nuclei^{allungati 3,4,5}. I cambiamenti dinamici nella forma e nel movimento nucleare sono cruciali per il funzionamento della^{cellula 6,7}. I difetti nella forma nucleare portano a compromissione funzionale come la riduzione del movimento^{nucleare 1,3}. Nelle cellule di mammiferi, i cambiamenti nella forma cellulare e del nucleo sono direttamente correlati con cambiamenti nell'espressione genica e nella sintesi^{proteica 8}.

Durante l'interfase, il DNA di una cellula è organizzato come cromatina. Il DNA nella cromatina è raggruppato attorno alle istone, che possono stringere e allentare il DNA per alterarne l'espressione. Allo stesso modo, la posizione della cromatina rispetto all'involucro nucleare e la vicinanza alla periferia nucleare sono importanti per l'espressione^{genica 9}. Lo stress ambientale, come lo stress osmotico, altera la forma nucleare e di conseguenza modifica l'espressione di un insieme di geni sensibili al tatto nelle radici 10 di A. thaliana. In questo contesto, studiare la forma nucleare e la dinamica della cromatina attraverso l'imaging timelapse a cellule vive è importante. Un aspetto fondamentale della dinamica nucleare è la velocità con cui i nuclei si muovono, poiché il posizionamento nucleare all'interno della cellula guida l'espressione genica, e il riposizionamento nucleare richiede il movimento^{nucleare 11}. La velocità del movimento della cromatina all'interno del nucleo è altrettanto importante, poiché il posizionamento dei geni all'interno del nucleo è fondamentale per determinare l'espressione^{genica 12}.

In precedenza, la forma nucleare e la dinamica della cromatina venivano immaginate e quantificate separatamente; Di conseguenza, la relazione tra forma nucleare e dinamica della cromatina rimase inesplorata. Immaginando simultaneamente nuclei e cromatina, si possono osservare le loro posizioni relative l'uno all'altro, il che può rivelare movimenti come la rotazione nucleare e il movimento intra-nucleare della cromatina che altrimenti sarebbero difficili o impossibili da dimostrare. In questo metodo, presentiamo una tecnica di imaging a cellula viva per visualizzare e quantificare la forma nucleare tramite la proteina dell'involucro nucleare esterno WPP (WIP1)¹³ e la cromatina tramite dinamiche centromeriche dell'istone H3 (CENH3)¹⁴ simultaneamente sotto controllo e sotto stress salistico, con l'obiettivo di consentire l'analisi dei cambiamenti nella dinamica nucleare e della cromatina causati da stressori abiotici. Per abilitare questo metodo, abbiamo generato una linea WIP1-GFP/CENH3-mRFP di A. thaliana. Inoltre, abbiamo studiato la dinamica della cromatina in modo quantitativo utilizzando il plugin TrackMate del software open source ImageJ/Fiji. Abbiamo testato una doppia linea fluorescente e tecniche di dinamica della cromatina presentate qui in condizioni di stress salare e abbiamo scoperto un'alterazione nella morfologia e dinamica dei foci centromerici dovuta alle condizioni di stress. Questo metodo semplice e riproducibile è ideale per il tracciamento ad alta produttività della dinamica nucleare e della cromatina nelle radici di Arabidopsis sotto varie condizioni di stress abiotico.

Protocol

1. Crescita delle piantine di A. thaliana

1. Preparazione del materiale di crescita
   1. Metti 800 mL di acqua pura in un becher da 1 L su un piatto per mescolare. Aggiungi una barra di agitazione al becher.
   2. Accendi la piastra di mescolare a 600 giri/min.
   3. Aggiungi 10 g di saccarosio al becher.
   4. Aggiungi 2,16 g di mezzo di crescita Murashige e Skoog (MS) al becher.
   5. Aggiungi 5 mg di agar a ciascuna delle due bottiglie da 1 L.
   6. Etichetta una bottiglia come "1/2 MS" e etichetta l'altra come "100 mM NaCl".
   7. Etichetta entrambi i coperchi delle bottiglie con nastro autoclave.
   8. Aggiungi 5,84 g di NaCl alla bottiglia etichettata "100 mM NaCl".
   9. Riempi il becher con 1 litro di acqua pura.
   10. Rimetti il becher nella piastra di mescolamento e aspetta che il saccarosio e la MS si siano sciolti.
   11. Versa il contenuto del becher in un cilindro graduato da 1 L.
   12. Versare 500 mL del contenuto del cilindro graduato in ogni bottiglia.
   13. Substrato di crescita autoclave e 250 mL di acqua pura con un ciclo liquido di 60 minuti a 121 °C.
       NOTA: Quando si autoclavano i materiali e l'acqua, assicurarsi che i coperchi siano allentati per evitare potenziali esplosioni.
   14. Riavvita i coperchi del substrato di crescita.
   15. Inverti le bottiglie del materiale di crescita 7 volte per assicurarti che l'agar sia ben distribuito ovunque.
   16. Conserva il substrato di coltivazione in un frigorifero a 4 °C finché non serve e mettilo al microonde per liquefare.
2. Fissare piastre di crescita e semi
   1. In una cappa a flusso di scatole, usa una pistola a pipetta per pipettare 50 mL di mezzo di crescita in ciascuna delle dieci piastre (Figura 1A).
   2. Mentre il substrato si solidifica, pulire i semi WIP1-GFP x CENH3-mRFP allagandoli in un tubo microcentrifuga con 1 mL di etanolo al 70% per 10 minuti (Figura 1B).
      NOTA: Quando si maneggia etanolo, assicurarsi che non ci siano fiamme libere nelle vicinanze.
   3. Dopo 10 minuti, nella cappa di scorrimento, rimuovere l'etanolo e risciacquare i semi due volte con 1 mL di acqua autoclavata (Figura 1C).
   4. Una volta che il substrato si è fermato, si utilizza una pipetta da 1000 μL per posizionare i semi puliti su piastre di crescita in due file da 14 semi per piastra (Figura 1D).
   5. Etichetta le lastre con un pennarello permanente e sigillale con nastro microporoso prima di uscire dalla cappa di flusso (Figura 1E).
3. Piantine in germinazione
   1. Avvolgi le piastre di crescita in carta stagnola di alluminio e stratificale a freddo in un frigorifero a 4 °C per almeno 2 giorni (Figura 1F).
   2. Dopo la stratificazione a freddo, rimuovi i piatti dal frigorifero e lasciali verticalmente sotto luci di crescita (~80 μmol/^{m 2}/s) per un minimo di 4 giorni (Figura 1G).
   3. Trasferire metà delle piastre a un mezzo di crescita NaCl da 100 mM nella cappa a flusso, poi sigillare e etichettare le piastre (Figura 1H).
   4. Fai le piastre di crescita sotto luci di crescita per 2 giorni prima dell'imaging (Figura 1I).

2. Imaging cellulare vivente dei nuclei radicali di A. thaliana e della cromatina

1. Preparazione delle vetrine
   1. Pipetta 60 μL di acqua pura su un vetrino di vetro (Figura 2A).
   2. Depositare 3 radici di piantina di A. thaliana di 6 giorni nell'acqua (Figura 2B).
   3. Posizionare una copertura slide da 22 mm × 22 mm #1.5 sulle radici senza coprire le foglie (Figura 2C).
2. Impostazioni del microscopio confocale
   1. Imposta il tempo di esposizione laser a 1000 ms (1 s).
   2. Nel combinatore laser, imposta il laser da 488 nm al 50% per la proteina fluorescente verde (GFP) e il 561 nm al 50% per la proteina fluorescente rossa (RFP) (Figura 2D). Immagine con obiettivo al 20× senza zoom ottico. Se si registra per più di 10 minuti, abbassa l'intensità per ridurre il fotosbiancamento.
   3. Imposta la dimensione del passo della Z-slice a 0,3 μm.
   4. Imposta l'intervallo a 1 minuto e la durata totale a 10 minuti.
3. Imaging
   1. Individua le radici e seleziona fino a 20 z-slice e cattura immagini a 16 bit.
   2. Inizio timelapse.
   3. Risparmia timelapse come file TIFF usando la compressione lossless.
   4. Sposta i dati su un computer per l'analisi.

3. Tracciamento e analisi dei dati

NOTA: Sarà necessaria la versione Fiji del software open-source ImageJ (consigliata la v. 1.54), che include TrackMate preinstallato.

1. Inizializzazione
   1. Immagine aperta: J/Fiji.
   2. Clicca e trascina un file .vsi nella finestra principale dell'applicazione ImageJ/Fiji (Figura 3A).
   3. Apparirà un prompt intitolato Bio-Formati Import Options ; clicca su Ok in basso a destra (Figura 3B).
   4. Apparirà un prompt intitolato Bio-Format Series Options . Assicurati che la Serie 1 sia selezionata e clicca su Ok in basso a sinistra (Figura 3C).
      NOTA: Il file può impiegare un minuto per caricarsi, specialmente se ha molti strati Z o punti temporali.
   5. Una volta aperta l'immagine (Figura 3D), dividi i segnali navigando sulla finestra principale di ImageJ fino a Immagine > colore > canali divisi (Figura 3E). Questo creerà due finestre separate, una per i nuclei etichettati con GFP e una per la cromatina marcata con RFP (Figura 3F).
2. Preprocessing cromatina
   1. Determina quale delle due finestre corrisponde alla cromatina.
   2. Clicca sulla finestra della cromatina (Figura 3F) e applica l'operazione del progetto Z navigando sulla finestra principale di ImageJ per immagine > pile > progetto Z (Figura 4A).
   3. Cambia il tipo di proiezione su Massima Intensità e assicurati che Tutti i Frame di Tempo sia attivo, poi clicca su Ok (Figura 4B).
   4. Apri il menu di contrasto premendo Ctrl+Shift+C oppure navigando nella finestra principale di ImageJ per visualizzare > regolare > Luminosità/Contrasto (Figura 4C).
   5. Fai scorrere la seconda barra (etichettata come Maximum) verso sinistra finché la cromatina non è facilmente visibile (Figura 4D).
3. Tracciamento della cromatina
   1. Naviga verso i plugin (Figura 5A).
   2. Clicca sulla freccia verso il basso nel menu plugin per scorrere fino all'opzione di tracciamento (Figura 5A).
   3. Clicca su tracciamento, poi su TrackMate.
   4. Le impostazioni iniziali appariranno. Conferma che le impostazioni di calibrazione siano accurate, poi clicca su Seguente (Figura 5B).
   5. Seleziona Rilevatore di Soglia e clicca su Seguente (Figura 5C).
   6. Nella finestra dell'immagine, spostati all'ultimo fotogramma del timelapse (Figura 5D).
   7. Accanto alla soglia di intensità, clicca su Auto, poi su Anteprima.
   8. Regola la soglia di intensità e clicca su Anteprima. Regola e anteprima ripetutamente la soglia finché l'anteprima non include tutta la cromatina e il minimo rumore, poi clicca su Avanti (Figura 5D).
   9. Avverrà il rilevamento iniziale della soglia di soglia (thresholding); clicca su Avanti (Figura 5E).
   10. Imposta manualmente la soglia finché non risulta visibile solo la cromatina, poi clicca su Avanti (Figura 5F).
   11. Questa pagina permette di filtrare gli spot. Ignora questo e clicca su Avanti (Figura 6A).
   12. Seleziona Semplice tracciatore LAP e clicca su Avanti (Figura 6B). Il tracciatore LAP è applicabile quando gli oggetti tracciati non si uniscono o non si dividono.
   13. Imposta la distanza massima di collegamento a 5 micron, la distanza massima di chiusura a 15 micron e la distanza massima di chiusura a 1. Clicca su Avanti (Figura 6C).
   14. Il tracciamento avverrà in mente. Le tracce appariranno nella finestra originale dell'immagine. Clicca su Avanti (Figura 6D).
   15. Questa pagina consente il filtraggio delle tracce. Premi il pulsante verde + in basso a sinistra per creare un filtro, poi scegli il numero di punti in modalità pista e premi Auto (Figura 6E).
   16. Assicurati che la modalità sia impostata su Sopra. Questo eliminerà le macchie che appaiono e scompaiono rapidamente.
   17. Clicca su Avanti (Figura 6E).
   18. La pagina delle opzioni di visualizzazione consente di esportare dati come file csv. In fondo alla pagina, clicca sul pulsante Tracce, poi Esporta in CSV (Figura 7A).
   19. Questa pagina permette la graficazione integrata; ignoralo e clicca su Next.
   20. Nell'ultima pagina, salva il video usando l'overlay di cattura e premi esegui. Clicca, poi naviga su file > salva come > GIF (Figura 7B).
4. Analisi di base della velocità
   1. Apri il CSV delle tracce in un software di fogli di calcolo.
   2. Elimina tutte le colonne tranne TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME e RADIUS.
   3. Gli spazi in ogni traccia saranno fuori ordine. Per ordinarle, prima congela le prime quattro righe e poi crea una nuova colonna intitolata TRACK_FRAME e copia e incolla questa formula nella colonna: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Seleziona la colonna TRACK_FRAME , clicca con il tasto destro, poi clicca su Ordina foglio A–Z. Gli spazi all'interno di ogni traccia dovrebbero ora essere in ordine.
   5. Per confermare che non manchino punti al centro di nessuna traccia, crea una nuova colonna e usa questa formula: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Assicurati che il primo posto di ogni traccia restituisca "NA" e il resto 1.
   6. Crea una colonna per Velocità (micron/frame) e incolla la seguente formula: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Questo utilizzerà il teorema di Pitagora per calcolare la distanza tra due punti.
   7. Per tradurre questo in Velocità (micron/secondo), crea una nuova colonna e incolla la seguente formula: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Questo troverà i secondi/frame e tradurrà micron/frame di conseguenza.

Results

Imaging a cellula viva della dinamica dell'involucro nucleare e della cromatina
Abbiamo generato una linea di marcatori fluorescenti doppi, che include la proteina dell'involucro nucleare esterno WIP1-GFP e la cromatina centromerica CENH3-mRFP (Figura 8). Le piantine di 4 giorni venivano trasferite sulla piastra di controllo o su piastre contenenti NaCl da 100 mM per 2 giorni. Dopo 2 giorni di incubazione, si osserva una chiara inibizione...

Discussion

Il metodo presentato qui è ideale per monitorare la dinamica della cromatina. Rispetto ai precedenti metodi di imaging a cellule vive con imaging separato, l'imaging simultaneo di nuclei e cromatina permette di esplorare la relazione tra dinamica nucleare e cromatinica. Questo può rivelare movimenti come la rotazione nucleare e il movimento intra-nucleare della cromatina che altrimenti sarebbero difficili da dimostrare.

Come metodo di imaging a cellule vive, è...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Media Murashige e Skoog (MS)	bioWorld	30630058
Micropori 3M	Amazon	A-1530-0
Software di acquisizione	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Copertura	Genesee	29-116
Slide in vetro	Genesee	29-101
Immagine/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscopio	Olympus/Evident	IX83
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	BP358-212
Disco rotante	Yokogawa	CSU-W1
Piastre di Petri quadrate	Simport	26-275
Sucrosio	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987