Articolo di ricerca

Farmacologia di rete, apprendimento automatico e validazione in vivo della capsula Danzhi Jiangtang nella nefropatia diabetica

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DOI:

10.3791/71328

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28 luglio 2026

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1Anhui University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

La Capsula Danzhi Jiangtang (DJC) può attenuare la nefropatia diabetica (DN), come dimostrato dai cambiamenti nella segnalazione chemochina e nei marcatori della piroptosi, supportati dalla bioinformatica e dalla validazione in vivo .

Abstract

Sebbene la Capsula Danzhi Jiangtang (DJC) sia una preparazione tradizionale cinese a base di erbe utilizzata clinicamente per il diabete, non è stato ancora completamente chiarito come possa proteggere il rene durante la nefropatia diabetica (DN). Questa indagine è stata progettata per esplorare potenziali meccanismi attraverso cui il DJC influenza la DN, con particolare attenzione alla cascata di segnalazione correlata alla piroptosi di piroptosi nella famiglia NLR contenente dominio pirinico 3 (NLRP3)/Caspasi-1/Gasdermin D (GSDMD).

È stata impiegata una strategia integrata che combina farmacologia di rete e apprendimento automatico. Il Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) e lo strumento di analisi bioinformatica per il meccanismo molecolare della medicina tradizionale cinese (BATMAN-TCM) sono stati utilizzati per lo screening degli ingredienti bioattivi e dei rispettivi bersagli proteici del DJC. I geni associati alla DN sono stati recuperati da Gene Expression Omnibus (GEO), GeneCard e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). I target dei candidati chiave sono stati selezionati e classificati utilizzando più algoritmi di machine learning. L'affinità di legame tra gli ingredienti attivi del DJC e i bersagli principali è stata valutata tramite docking molecolare. Infine, l'efficacia terapeutica e i meccanismi previsti sono stati valutati nei topi diabetici con db/db.

L'analisi farmacologica di rete ha identificato 599 target DJC e 68 geni sovrapposti condivisi con DN. Utilizzando algoritmi di machine learning, il ligando chemoquina C-C motif 2 (CCL2) e CASP1 sono stati identificati come target candidati prioritari. Il docking molecolare ha previsto possibili forti affinità di legame tra gli ingredienti attivi del DJC e queste proteine centrali. Le analisi di arricchimento funzionale (GO/KEGG) hanno suggerito che la modulazione del DJC è associata a risposte infiammatorie e al percorso MAPK. La validazione in vivo ha mostrato che il trattamento con DJC attenuava i marcatori della lesione renale e della fibrosi. Questi risultati suggeriscono che il DJC possa attenuare la DN in parte attraverso i cambiamenti di segnalazione della pirotosi correlati al recettore della chemicina 2 (CCR2) del motivo CCL2/C-C.

Introduzione

Il peso globale del diabete mellito (DM) continua ad aumentare, rappresentando una sfida formidabile per la salute pubblica. Si stima che 5,2 milioni di decessi ogni anno derivino dalla DM e dalle sue complicazionicorrelate 1. La DN è considerata una grave complicazione microvascolare e un contributo importante allo sviluppo della malattia renale terminale (ESRD), che colpisce circa il 30-40% della popolazionediabetica 2,3. Molteplici fattori intrecciati contribuiscono alla progressione patologica della DN, tra cui disfunzioni metaboliche, rimodellamento emodinamico e risposte infiammatorie persistenti. Gli insulti patologici, tra cui glucosio elevato e iperlipidemia, attivano la via della piroptosi mediata da NLRP3/caspasi-1/GSDMD, inducendo la morte infiammatoria programmata nelle cellule epiteliali mesangiali renali e tubolari, seguita da lesioni tubulointerstizialiprogressive 4. La pirotosi è caratterizzata dalla rottura della membrana plasmatica, che favorisce il rilascio di IL-1β eIL-185. Tali fattori proinfiammatori aumentano la trascrizione del ligando chemoquina C-C motive 2 (CCL2), promuovono l'infiltrazione dei macrofagi e potenziano ulteriormente l'attivazione pirototica, aggravando così progressivamente la lesionerenale 6. Nella pratica clinica, questa condizione si manifesta con albuminuria progressiva e una riduzione graduale del tasso di filtrazione glomerulare, che può portare a danni renali irreversibili e a un marcato deterioramento della qualità della vita per gli individuicolpiti 7,8. Nonostante i progressi nell'assistenza medica, le attuali strategie terapeutiche, che si concentrano principalmente sul rigoroso controllo glicemico e della pressione sanguigna, spesso non riescono a fermare completamente la progressione della malattia. Sebbene le nuove farmacoterapie, tra cui agenti bloccanti SGLT2, agonisti GLP-1 e bloccanti dei recettori mineralocorticoidi, così come terapie con cellule staminali e interventi alimentari, abbiano attirato notevole attenzione e stiano diventando più diffuse nellapratica 9, il rischio residuo di DN rimane elevato. Pertanto, lo sviluppo di sostanze terapeutiche innovative rimane una priorità di ricerca urgente, in particolare quelle della medicina tradizionale che possono colpire contemporaneamente più vie patologiche.

La Capsula Danzhi Jiangtang (DJC), una formulazione esclusiva per l'ospedale sviluppato presso il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese dell'Anhui (Approvazione per la Preparazione dell'Istituto Medico Provinciale dell'Anhui n. Z20090006; Brevetto n. ZL200310112845.1; Lotto n. 20220427), è un promettente candidato terapeutico. Deve essere sigillata, conservata in un ambiente asciutto e ventilato, e protetta dalla luce. La formula è composta da sei erbe tradizionali cinesi: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra (Hirudo), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Paeonia suffruticosa (Cortex Moutan) e Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. Nella pratica clinica, il DJC ha dimostrato una significativa efficacia ipoglicemica e la capacità di ridurre i marcatori della lesione renale nei pazientidiabetici 11. Ricerche precedenti suggeriscono che il DJC possa esercitare effetti rinoprotettivi regolando i livelli di glucosio nel sangue e il metabolismolipidico 12,13,14. Studi precedenti sul DJC si sono concentrati principalmente sulla validazione a via singola con selezione non sistematica dei bersagli. Pertanto, abbiamo integrato farmacologia di rete e machine learning per selezionare i componenti attivi e identificare i geni core hub, seguiti da una validazione preliminare in vivo, per rafforzare l'analisi.

La farmacologia di rete offre una strategia efficace per analizzare prescrizioni erboristiche complesse. Questo quadro integra approcci bioinformatici e biologici sistematici, chimica computazionale e farmacologia per decifrare i meccanismi "multi-componenti, multi-bersaglio e multi-percorso" delle azioni dei farmaci 15,16,17. Questo approccio olistico facilita un esame strutturato delle intricate interazioni tra composti erboristici e reti specifiche per malattie, rivelando gli effetti sinergici insiti nellaMTC 18. Tuttavia, la farmacologia tradizionale delle reti può talvolta generare un rumore eccessivo nei dati. Per superare questo problema, l'integrazione di algoritmi di machine learning consente uno screening preciso dei geni caratteristici fondamentali da dataset su larga scala. Inoltre, il docking molecolare offre una prospettiva intuitiva e dinamica per prevedere potenziali affinità di legame farmaco-biomolecola19.

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Protocollo

Screening di composti bioattivi e potenziali bersagli del DJC

I composti bioattivi delle sei erbe presenti nel DJC, Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Corteccia di Moutan), Cuscuta chinensis (Cuscutae Semen), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) e Whitmania pigra (Hirudo) sono stati recuperati dal database TCMSP. Lo screening è stato effettuato in base a parametri farmacocinetici: biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18. Per Whitmania pigra, che manca di dati in TCMSP, i suoi composti attivi e bersagli sono stati ottenuti dal BATMAN-TCM, utilizzando un punteggio ≥ 20 e un valore P < 0,05 come criteri di selezione. UniProt è stato applicato per unificare tutti i bersagli raccolti in una nomenclatura genica standard.

Acquisizione di geni correlati alla DN

Geni correlati alla DN sono stati raccolti da tre fonti. Per prima cosa, GeneCard e OMIM sono stati cercati con "nefropatia diabetica" come termine di ricerca. Sono stati mantenuti i geni delle GeneCard con punteggio di rilevanza > 1. In secondo luogo, tre profili di microarray (GSE30529, GSE104948, GSE96804) sono stati ottenuti dal repository GEO. I campioni in GSE30529 sono stati derivati da tubuli renali, mentre quelli in GSE104948 e GSE96804 hanno avuto origine da glomeroli renali. Tutte le ricerche nel database sono state effettuate il 15 dicembre 2024. I geni differenzialmente espressi (DEG) tra pazienti con DN e controlli sani nel dataset GSE30529 sono stati identificati utilizzando il pacchetto limma nel software R. I criteri di screening sono stati fissati a un p-value aggiustato < 0,05 e |log2(Fold Change)| > 0,5. I grafici vulcanici e le heatmap mostravano geni espressi differenzialmente.

Identificazione dei presunti bersagli terapeutici del DJC per la DN

L'analisi del diagramma di Venn ha identificato loci condivisi tra il pool target DJC e i geni associati alla DN provenienti da GeneCards, OMIM e GSE30529 DEG. Questi loci condivisi fungevano da geni terapeutici candidati per tutte le procedure di ricerca a valle.

Istituzione e profilazione delle reti di interazione proteica (PPI)

I loci terapeutici presunti sono stati caricati su STRING per costruire una rete di interazione proteina-proteina, con un cutoff di interazione fissato sopra un valore di confidenza di 0,4. Cytoscape ha elaborato i dataset di rete per la presentazione visiva. Indici topologici come Degree venivano calcolati tramite il plugin CytoNCA per identificare i nodi core in tutta la rete.

Analisi dell'arricchimento

Per delimitare i ruoli biologici e le cascate di segnalazione collegate ai target candidati, l'arricchimento funzionale è stato analizzato in R con il pacchetto clusterProster, utilizzando org. Hs.eg.db per l'annotazione e ggplot2 per la visualizzazione. I termini di Ontologia Genica (GO) sono stati valutati tra le categorie di processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF). Le vie dell'Enciclopedia di Geni e Genomi di Kyoto (KEGG) sono state mantenute quando il valore p di arricchimento era < 0,05.

Applicazione dell'algoritmo CytoHubba

Il plugin CytoHubba in Cytoscape veniva utilizzato per calcolare quattro indici di centralità topologica per ogni nodo di rete. Il grado, il conteggio dei vicini direttamente connessi, riflette l'ampiezza delle interazioni di ciascuna proteina. La componente massima di vicinato, MNC, una metrica che quantifica la dimensione della componente connessa più grande nel sottografo di vicinato, misura l'influenza regolatoria locale. Il componente percolato di bordo (EPC) valuta l'importanza strutturale globale tramite la rimozione casuale simulata dei bordi e la quantificazione della dimensione media del componente connesso. I geni che si posizionavano tra i primi 20 per ciascun indice sono stati intersecati per ottenere i geni hub finali.

Screening genico base basato su machine learning

Tre approcci di machine learning sono stati applicati ai profili di espressione del dataset GSE30529 per identificare geni hub affidabili tra i target candidati.

(1) LASSO (Operatore di Minima Riduzione Assoluta e Selezione): Il parametro di regolarizzazione λ è stato regolato tramite validazione incrociata a cinque punti, con il valore ottimale determinato dalla performance media tra i fold. Le caratteristiche di espressione genica di input sono state automaticamente standardizzate per il punteggio Z per eliminare gli effetti della magnitudine dell'espressione. Con il parametro di penalità α fissato a 1 per la regolarizzazione pura LASSO, per lo screening veniva utilizzato un pannello predefinito di valori di 100 λ. La penalità L1 riduceva a zero i coefficienti delle caratteristiche a bassa rilevanza, consentendo la selezione simultanea delle caratteristiche e il controllo della complessità, mentre la forza di regolarizzazione con validazione incrociata mitigava il rischio di sovrafitting.

(2) SVM-RFE (Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination): È stato impiegato un framework di validazione incrociata a due livelli a 5 livelli per garantire uno screening robusto delle funzionalità. Cinque sottoinsiemi non sovrapposti sono stati generati dividendo stocasticamente l'intero dataset, di cui quattro utilizzati per l'addestramento e uno per i test su cinque iterazioni; La media pieghevole mitigava il bias dovuto alla divisione su singolo campione. L'eliminazione ricorsiva delle caratteristiche è stata applicata per ridurre la dimensionalità delle caratteristiche e limitare la complessità del modello, alleviando l'overfitting. Il tasso di errore di classificazione e l'accuratezza servivano come metriche di prestazione per determinare il numero ottimale di caratteristiche.

(3) Foresta Casuale (RF): È stata costruita una foresta casuale iniziale di 500 alberi, con il numero ottimale dell'albero determinato dal tasso minimo di errore di classificazione fuori dal sacco per riaddestrare il modello finale. Tutti i restanti iperparametri, inclusa la dimensione casuale del sottoinsieme delle caratteristiche a ogni divisione del nodo, venivano mantenuti nelle impostazioni predefinite del pacchetto. I punteggi di importanza genica del modello finale sono stati classificati in ordine decrescente per generare il set genico firmato della malattia. L'insieme finale di geni core è stato determinato intersecando i risultati di questi tre algoritmi.

Verifica indipendente basata su dataset dell'espressione genica hub

Due dataset esterni indipendenti, GSE104948 e GSE96804, sono stati utilizzati per convalidare i livelli di trascrizione dei geni hub. I dataset di espressione genica sono stati normalizzati; le differenze di espressione tra casi DN e soggetti sani sono state tracciate utilizzando i toolkit ggplot2 e ggsignif di R.

Aggancio molecolare

Le conformazioni 3D delle proteine hub target (CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00) sono stati ottenuti dalla Protein Data Bank. Le conformazioni 3D dei composti bioattivi sono state ottenute tramite PubChem. L'acido ursolico, l'acido 3β-idrossiur-12-en-28-oico e la quercetina sono stati selezionati per l'agganciamento perché la farmacologia della rete prevedeva le interazioni tra questi composti attivi e i bersagli principali CCL2 o CASP1. Le strutture proteiche sono state pretrattate rimuovendo liganti nativi e molecole d'acqua, introducendo idrogeni polari e successivamente sottoposte a docking molecolare tramite AutoDock Vina. L'affinità di legame, rappresentata dal punteggio di attracco (in kcal/mol), serviva a valutare la forza delle interazioni. È stata stabilita una soglia di energia di legame di −5,0 kcal/mol per definire interazioni intermolecolari stabili. Le conformazioni agganciate sono state visualizzate utilizzando PyMOL.

Animali e progettazione sperimentale

Il presente studio ha utilizzato 30 maschi di 8 settimane di db/db di grado specifico senza patogeno (SPF), insieme a 10 maschi di SPF db/ m di età compatibile. Tutti i topi sperimentali sono stati allevati in una struttura di grado SPF sotto un fotoperiodo chiaro-oscuro di 12 ore e mantenuti in condizioni stabili: 22 ± 2 °C, umidità relativa 50–70% e accesso illimitato a cibo e acqua potabile regolari. L'approvazione etica per tutti i protocolli sperimentali in vivo è stata concessa dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese dell'Anhui (Approvazione n. AHUCM-mouse-2023059).

I roditori hanno seguito una fase di adattamento di 7 giorni prima di un raggruppamento casuale (6 animali ciascuno) e 8 settimane di intervento giornaliero. La glicemia a digiuno è stata misurata in tutti gli animali sperimentali; gli animali sono stati assegnati utilizzando una tabella a numeri casuali, e istologia, IHC e quantificazione del western blot sono state eseguite sotto valutazione cieca.

Gruppo di controllo normale (CTL): topi db/m che ricevono soluzione salina tramite gavage orale.

Gruppo modello (M): topi db/db che ricevono soluzione salina tramite gavage orale.

Gruppo DJC-Dose Media (DJC-M): topi db/db che ricevono DJC a 0,78 g/kg (equivalente alla dose clinica giornaliera per adulti).

Gruppo DJC-High Dose (DJC-H): topi db/db che ricevono DJC a 1,56 g/kg (il doppio della dose clinica giornaliera per gli adulti).

Preparazione del dosaggio

La scala della dose da uomo a murino è stata derivata utilizzando l'approccio di normalizzazione della superficie corporea, come illustrato nella Metodologia degli Esperimenti Farmacologici, con un coefficiente di conversione di 9,1. La dose clinica giornaliera di DJC era di 6 g per un adulto di 70 kg (0,0857 g/kg), con dosi equivalenti per topini di 0,78 g/kg (dose clinica 1 volta) e 1,56 g/kg (dose clinica doppia). Tutti i topi hanno ricevuto somministrazione intragastrica a un volume costante di 10 mL/kg. La polvere di DJC è stata pesata con precisione e sospesa in una soluzione CMC-Na allo 0,5% per formare sospensioni uniformi a 78 mg/mL (dose media) e 156 mg/mL (dose alta).

Dopo 8 settimane di somministrazione giornaliera, l'anestesia è stata indotta in tutti i topi sperimentali utilizzando pentobarbital di sodio all'1%. I campioni di sangue sono stati raccolti tramite l'aorta addominale e centrifugati per isolare i soprannatanti in saggi biochimici basati su kit. Gabbie metaboliche venivano utilizzate per raccogliere campioni di urina murina. I tessuti renali parziali sono stati fissati nel 4% di paraformaldeide per la colorazione di ematossilina-eosina (HE) e Masson. Congelati rapidamente in azoto liquido, i tessuti renali residui sono stati conservati a −80 °C per i test analitici a valle.

Analisi istologica

Dopo la fissazione nel 4% di paraformaldeide, i tessuti renali hanno subito disidratazione graduale con etanolo, clearing, incorporazione con paraffina e sezionamento seriale a 4 μm per la successiva colorazione HE e trichrome di Masson. La colorazione con HE è stata eseguita seguendo procedure standard (deparaffinizzazione, reidratazione, colorazione nucleare dell'ematossilina, differenziazione e azzurramento dell'etanolo acidificato, contrasto con l'eosina, disidratazione, pulizia e montaggio del balsamo neutro) per osservare i cambiamenti istopatologici renali. Le sezioni sono state immerse nella colorazione dell'ematossilina per 3 minuti, seguite da una controcolorazione con eosina per 15 secondi. Per la colorazione tricroma di Masson, le sezioni sono state sottoposte a deparaffinizzazione, reidratazione, colorazione sequenziale, differenziazione e separazione del colore con acido acetico, seguite da disidratazione, pulizia e montaggio per valutare l'accumulo di collagene renale e i cambiamenti fibrotici. La microscopia a campo chiaro veniva impiegata per ispezionare e fotografare tutte le sezioni di tessuto colorato con un ingrandimento di 200×. Le sezioni colorate con HE sono state valutate utilizzando l'Indice di Sclerosi Glomerulare (GSI). Per la colorazione tricroma di Masson, è stato applicato il preset Tricromo di Masson per isolare il canale del collagene blu, e si è calcolato il rapporto tra l'area del collagene e l'area del tessuto colorato di rosso.

Immunoistochimica (IHC)

Dopo una fissazione a 24 ore con paraformaldeide al 4%, i campioni di tessuto sono stati disidratati tramite gradienti seriali di etanolo, poi incorporati nella paraffina e tagliati in sezioni sequenziali da 5 μm. Dopo la deparaffinizzazione, le sezioni sono state sottoposte al recupero di antigeni e al blocco della perossidasi endogena. Dopo il blocco, i vetrini tessuti venivano incubati con anticorpi primari diluiti a 4 °C durante la notte in una camera umida. Le vetrine ricevevano un'incubazione secondaria di anticorpi a temperatura ambiente dopo i lavaggi PBS, seguita da una reazione cromogenica DAB fino a raggiungere l'intensità ottimale della colorazione. Le sezioni sono poi state sottoposte a controcolorazione sequenziale dell'ematossilina, differenziazione, inbluzionamento, disidratazione, clearing, montaggio su copertura e imaging microscopico in campo chiaro. Il recupero dell'antigene è stato eseguito tramite autoclaving per 10 minuti, seguito da un raffreddamento naturale a temperatura ambiente. Dopo il blocco con siero di capra al 5% per 60 minuti a temperatura ambiente, le sezioni sono state incubate con anticorpo primario (diluizione 1:200) e poi con anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con HRP (diluizione 1:300) per 60 minuti ciascuna a temperatura ambiente. La reazione cromogenica DAB è stata condotta per 3–5 minuti a temperatura ambiente, monitorata microscopicamente e terminata con un risciacquo con acqua distillata. Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento ×200 e la percentuale di area positiva di colorazione è stata quantificata usando ImageJ.

Rilevamento ELISA

I passaggi di analisi rispettavano i protocolli ufficiali forniti dai fornitori di kit. Sono stati preparati in anticipo standard di lavaggio e standard a serie diluiti. I pozzi vuoti, standard e campioni venivano caricati con reagenti e incubati al buio. Le placche venivano lavate accuratamente dopo l'incubazione, poi incubate con l'enzima coniugato al buio. Dopo il lavaggio, veniva aggiunto un substrato cromogenico per una reazione colorata protetta dalla luce, che veniva terminata con un buffer di stop una volta che nei pozzi standard emergevano gradienti blu distinti. L'assorbanza (OD) di ciascun pozzo veniva misurata alla lunghezza d'onda target utilizzando un lettore di microplacche. Le concentrazioni sieriche di IL-1β e IL-18 sono state quantificate utilizzando curve di calibrazione generate a partire dai valori OD delle concentrazioni standard (campioni sierici non diluiti; assorbanza misurata a 450 nm; otto pozzi replicati tecnici per campione). La creatinina urinaria e la proteina urinaria a 24 ore sono state misurate in campioni di urina non diluita raccolti utilizzando gabbie metaboliche a 24 ore (assorbanza rilevata a 546 nm; otto repliche tecniche per campione).

PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

L'RNA totale è stato isolato dai tessuti renali, e la sua purezza e concentrazione sono state determinate tramite spettrofotometria. L'RNA purificato è stato trascritto inversamente per generare modelli di cDNA. La RT-qPCR è stata eseguita su uno strumento PCR in tempo reale con il seguente programma di ciclo termico: 5 minuti di pre-denaturazione (95 °C), seguiti da 40 round di amplificazione: 15 secondi a 95 °C, 1 minuto a 60 °C. La RT-qPCR è stata eseguita in una reazione da 10 μL contenente 5 μL di SYBR Green Master Mix, 0,2 μL di primer diretto, 0,2 μL di primer inverso, 1 μL di modello di cDNA e 3,6 μL di acqua priva di RNasi. La trascrizione inversa per la sintesi del cDNA è stata eseguita su un volume totale di reazione di 20 μL. L'analisi della curva di fusione è stata effettuata per confermare la specificità di amplificazione, e ogni campione è stato analizzato in tre repliche tecniche. I livelli dei trascritti sono stati valutati tramite normalizzazione 2⁻ΔΔCq a β-actina, con tutte le sequenze di primer elencate nella Tabella 1.

Analisi del western blot

Circa 40 mg di campioni di tessuto renale sono stati prelevati da ciascuna coorte di topi, tritati su ghiaccio e completamente omogeneizzati in tampone di lisi proteica. Dopo una rotazione di 15 minuti a 12.000 giri/min a 4 °C, il surnatante totale contenente proteine proveniente da omogeneati tissutali è stato raccolto, allicitato e criopreservato a −80 °C. Il soprandanante proteico veniva miscelato con il tampone di carico e denaturato bollendo in un bagno d'acqua. Circa 10 μL di campione proteico normalizzato sono stati caricati per corsia e separati su gel al 10% di SDS-poliacrilammide. Le proteine bersaglio venivano trasferite ai filtri di nitrocellulosa tramite elettroblotting umido. Il trasferimento è stato eseguito a una corrente fissa di 400 mA in un bagno di ghiaccio per 30–45 minuti. Dopo il trasferimento, i blot venivano incubati in latte scremo freddo per 2 ore, poi incubati durante la notte a 4 °C con 1:1.000 anticorpi primari. I blot lavati sono stati coperti con anticorpi secondari corrispondenti (1:10.000) a 4 °C per 2 ore, e i segnali della banda luminescente sono stati registrati e quantificati dalle foto delle tache utilizzando il software ImageJ. Per il GSDMD-N, la tubulina è stata utilizzata come controllo del carico perché il suo peso molecolare atteso (~35 kDa) si sovrappone a quello del GAPDH (~36 kDa). Tutti gli esperimenti western blot sono stati eseguiti con tre repliche biologiche indipendenti.

Analisi statistica

I dati quantitativi sono presentati come la media ± deviazione standard (SD). Le differenze tra i due gruppi sono state analizzate con un test t di Student non accoppiato, mentre i confronti tra più gruppi sono stati valutati tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguiti dal test post hoc di Tukey. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Identificazione dei componenti bioattivi e del bersagli del DJC

Sono stati identificati in totale 66 composti bioattivi che soddisfacevano i criteri di screening (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18) tra le sei erbe che compongono il DJC. Questi includevano 26 composti di Pseudostellaria heterophylla, 6 di Paeonia suffruticosa, 8 di Cuscuta chinensis, 6 di Alisma orientale, 10 di Rehmannia glutinosa e 10 di Wh...

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Discussione

La DN rimane una delle principali cause di ESRD, caratterizzata da una patogenesi complessa e multifattoriale che non è ancora pienamentecompresa 20,21. Sebbene il DJC abbia mostrato una promettente efficacia clinica nel migliorare la DN, i meccanismi molecolari sottostanti sono rimasti in gran partesfuggenti 22. In questo studio, abbiamo utilizzato uno schema analitico multi-omico che integra farmacologia...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dai Progetti di Ricerca Chiave delle Università Provinciali dell'Anhui (Grant n. 2024AH050968).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxylin Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
software nameversion
AutoDock Vina1.2.3
Cytoscape software3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
R software4.2.0

Riferimenti

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