Piezo1 promuove la rimodellazione della ECM sclerale tramite differenziazione meccanica indotta da deformazione dei fibroblasti

Sommario

Questo studio combina un modello di ipertensione oculare in ratto con esperimenti in vitro con sforzo meccanico, agonista/inibitore e siRNA in fibroblasti sclerali umani, mostrando che l'espressione di Piezo1 è elevata durante il rimodellamento della matrice extracellulare sclerale ed è funzionalmente coinvolta nella differenziazione dei miofibroblasti.

Abstract

La differenziazione dei miofibroblasti indotta da sforzo meccanico è un meccanismo fondamentale alla base del rimodellamento della matrice extracellulare sclerale (ECM) nel glaucoma. Tuttavia, la conversione della deformazione meccanica in segnali biochimici all'interno dei fibroblasti sclerali rimane inadeguatamente chiarata. Questo studio ha mirato a indagare il ruolo di Piezo1 nella proliferazione e differenziazione cellulare, nel contesto della differenziazione dei miofibroblasti indotta da sforzo meccanico durante il rimodellamento ECM sclerale. Il disegno dello studio combina osservazioni di espressione in vivo da un modello di ipertensione oculare di ratto di una settimana con saghi meccanicistici in vitro utilizzando stretching meccanico ciclico (10% a 0,5 Hz per un massimo di 24 ore) e modulazione farmacologica di Piezo1 (agonista Yoda1, inibitore GsMTx4 e knockdown siRNA) nei fibroblasti sclerali umani primari (cellule HSF). I nostri risultati dimostrano che Piezo1 è espresso nel tessuto sclerale e nelle cellule HSF. Nel braccio in vivo, è stato osservato un aumento significativo dei livelli di proteina Piezo1 nella sclera dei ratti ipertesi oculari dopo una settimana, che ha coinciso con un'elevata espressione di collagene di tipo I (COL1) e actina muscolare liscia α (α-SMA). Negli esperimenti in vitro, lo stiramento meccanico (8–24 ore) ha aumentato l'espressione di Piezo1 nelle cellule HSF. Inoltre, l'attivazione di Piezo1 con Yoda1 (24 h) ha facilitato la proliferazione delle cellule HSF e aumentato l'espressione di α-SMA e COL1. Al contrario, la riduzione o inibizione di Piezo1 soppresse l'espressione di COL1 e ostacolò la differenziazione dei miofibroblasti sotto sforzo meccanico. Inoltre, l'attivazione di Piezo1 ha portato a una regolazione all'alza dell'espressione della proteina Yes-associate (YAP), mentre l'espressione YAP indotta da sforzo meccanico veniva ridotta al knockdown o inibizione di Piezo1. In sintesi, i nostri risultati suggeriscono che Piezo1 svolge un ruolo nell'espressione indotta da sforzo meccanico di componenti chiave della ECM nella sclera nel contesto del glaucoma e potrebbe rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico che richiede ulteriore validazione in vivo.

Introduzione

Il glaucoma è una delle principali cause di cecità irreversibile caratterizzata da una progressiva degenerazione delle cellule ganglionari retiniche (RGC) e degli assoni del nervo ottico (ONH), che ha colpito 76 milioni di persone nel mondo nel 2020. L'elevata pressione intraoculare (IOP) è il fattore di rischio più grande per il^{glaucoma 3} e la riduzione della IOP è attualmente l'unica opzione disponibile per ritardare lo sviluppo e la progressione del^{glaucoma 4}. L'ONH, la struttura da cui gli assoni RGC escono dall'occhio, è il principale sito di danno nel glaucoma. L'elevazione della PIO induce deformazione e spostamento meccanico nell'ONH, causando la degenerazione degli assoni RGC all'interno della cribrosa laminare (LC), portando infine a neuropatia ottica^{glaucomatosa 5,6}.

La sclera peripapillare (PPS) è il tessuto principale portante dell'ONH, con le proprietà meccaniche della PPS che determinano la risposta dell'ONH alla deformazione meccanica indotta^{dall'IOP 7,8}. La modellazione agli elementi finiti e studi ex vivo hanno confermato che la deformazione biomeccanica della LC si basa sulla rigidità sclerale, e la maggiore rigidità della PPS contribuisce a ridurre la deformazione nella LC ^9,10. Successivamente, la variazione nella rigidità^11,12 e nello^{spessore 13} della PPS può alterare le proprietà biomeccaniche legate all'IOP dell'ONH, modificando ulteriormente la suscettibilità al danno del nervo ottico^{glaucomato 14,15}. Negli studi biomeccanici, la rigidità oculare della sclera glaucomatosa è stata superiore alla normale sclera negli occhi umani ^{post-mortem 16,17}, e l'irrigidimento della sclera peripapillare è stato osservato costantemente sia nel glaucoma umano che nei modelli animali^sperimentali 18,19,20. Questi dati suggeriscono che l'irrigidimento della sclera possa essere una risposta protettiva dovuta alla diminuzione della deformazione ONH indotta dalla IOP durante il glaucoma.

Le caratteristiche biomeccaniche del tessuto della sclera sono il risultato della composizione della matrice extracellulare sintetizzata dai^{fibroblasti 21}. Evidenze recenti suggeriscono che lo sforzo meccanico derivante dall'aumento della PIO sia in grado di attivare i fibroblasti sclerali presenti nella^{sclera 22}, promuovere la differenziazione dei miofibroblasti²³ e causare un rimodellamento^{ECM 24,25}. La trasformazione dei miofibroblasti indotta da sforzo meccanico è un processo chiave durante il rimodellamento della ECM sclerale nel glaucoma, ma non è chiaro come la tensione meccanica venga convertita in segnali biochimici e risposte cellulari nei fibroblasti sclerali.

Piezo1 è un membro di una nuova famiglia distinta di canali meccanosensibili cationici non selettivi coinvolti nella fibrosi di diversi organi, inclusi la pelle cardiaca e^{polmonare 26,27}. Lo sforzo meccanico può attivare i canali cellulari Piezo1 portando a un aumento dell'afflusso di Ca^{2+ 28}, segnalizzando così dipendente dal calcio per regolare una varietà di attività cellulari, inclusa la proliferazione, la motilità e la differenziazione dei^{fibroblasti 29,30}. Studi recenti hanno rivelato che, sotto sforzo meccanico, Piezo1 promuove processi fibrotici cutanei stimolando la proliferazione, la motilità e la differenziazione dei^{fibroblasti 31}. Questo studio include due componenti complementari: uno studio descrittivo in vivo sull'espressione di Piezo1 in un modello di ipertensione oculare di ratto, e uno studio meccanicistico in vitro utilizzando fibroblasti sclerali umani primari sotto deformazione meccanica ciclica. Abbiamo ipotizzato che lo strain meccanico attivi Piezo1, che favorisce la differenziazione dei miofibroblasti e l'espressione dei componenti ECM nei fibroblasti sclerali, potenzialmente tramite segnalazione YAP.

Protocollo

I maschi di ratti Sprague-Dawley (8 settimane di età) sono stati prelevati dal Fudan University Children's Hospital Experimental Animal Center. Tutti i ratti erano ad libitum e ospitati in condizioni SPF a 22±1 °C e con un ciclo giorno/notte di 12 ore. Tutti gli esperimenti sugli animali hanno aderito alla Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Vista ed è stata approvata dal Consiglio di Revisione Istituzionale e dal Comitato Etico dell'Ospedale Pediatrico dell'Università di Fudan (2022JS-EKYY-019). I tessuti sclerali umani utilizzati per derivare fibroblasti sclerali umani primari sono stati prelevati dalla sclera donatrice secondo le linee guida istituzionali, e tutte le procedure correlate sono state approvate dall'Institutional Review Board della Fudan University (2024-YS-187).

Progettazione sperimentale

Il presente studio ha utilizzato sia approcci in vivo che in vitro, connessi concettualmente da detensione meccanica, per esaminare il contributo di Piezo1 al rimodellamento ECM sclerale. In vivo, abbiamo utilizzato un modello di ipertensione oculare di ratto per esaminare l'espressione di Piezo1 sotto una PIO elevata. In vitro, abbiamo sottoposto fibroblasti sclerali umani primari a un allungamento meccanico ciclico per modellare lo sforzo meccanico subito dalla sclera nel glaucoma, e abbiamo manipolato l'attività di Piezo1 usando agonista farmacologico (Yoda1), inibitore (GsMTx4) e knockdown del siRNA.

Modello sperimentale di ipertensione oculare cronica (OHT)

Sono stati utilizzati in totale 18 maschi di ratti SD (SD). In ogni ratto, l'occhio destro riceveva iniezione di carbomeri per indurre l'ipertensione oculare (OHT), con l'occhio sinistro controlaterale che fungeva da gruppo di controllo (NT). Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti dell'intero esperimento, per un totale di 18 occhi per gruppo. L'unità sperimentale era l'occhio individuale. I ricercatori che eseguivano misurazioni IOP e analisi Western blot erano ciechi rispetto all'allocazione dei gruppi.

Un modello sperimentale cronico OHT è stato generato nei ratti come^{descritto in precedenza 25}. Per un breve periodo, i ratti sono stati anestetizzati con il 10% di cloral idrato e, dopo la dilatazione pupilare da tropicamide, è stata iniettata una soluzione di carbomero (0,3%, 20 μL) nella camera oculare anteriore. È stato applicato cloridriduro clortetraciclina per prevenire infezioni. Le misurazioni della PIO sono state effettuate con un tonometro a rimbalzo dopo 3 e 7 giorni. I tessuti della sclera sono stati raccolti una settimana dopo che il modello era stato considerato stabilito.

I tessuti sclerali sono stati isolati come descritto in precedenza nel^{dettaglio 25}. Dopo l'anestesia, i ratti sono stati perfusi transcardicamente con il 4% di formaldeide in PBS. Il tessuto orbitale estraneo veniva sezionato dal globo e le strutture dei segmenti anteriori (cornea, iride, cristallino) e il vetro erano stati accuratamente rimossi. La retina e la coroide sono state delicatamente raschiate dalla parete sclerale interna. I tessuti della sclera posteriore sono stati raccolti e identificati tramite colorazione patologica H&E.

Coltivazione cellulare

I fibroblasti sclerali umani primari (cellule HSF) erano una linea cellulare precedentemente stabilita dalla sclera³² del donatore umano. Per ogni esperimento venivano utilizzati tre repliche biologiche indipendenti (cellule di tre donatori diversi). Le cellule HSF sono state mantenute in DMEM integrate con 15% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO2, atmosfera umidificata). Le colture venivano suddivise ogni quattro giorni e per tutti gli esperimenti venivano impiegate cellule HSF tra i passaggi 5 e 9. Le cellule HSF sono state confermate tramite immunofluorescenza utilizzando marcatori cellulari di actina di tipo collagene I e muscolo α-liscio.

Applicazione della stimolazione meccanica

Il sistema di allungamento meccanico ciclico veniva utilizzato per produrre allungamento ciclico meccanico. Una densità di semina di 2×10⁵ cellule/mL è stata utilizzata per le cellule HSF placcate in piastre a sei pozzi con fondi flessibili rivestiti di collagene. Le cellule del gruppo di stretching sono state esposte allo stretching ciclico con ampiezza del 10% e 0,5 Hz come descritto nel nostro precedente^{studio 32}. Le cellule coltivate in placche di allungamento, ma lasciate statiche fungevano da controlli. Esperimento di knockdown del siRNA Piezo1: Le cellule hanno ricevuto una trasfezione di 48 ore di siRNA di Piezo1 o siRNA di controllo negativo prima dello stretching meccanico. Dopo la trasfezione, le cellule subivano un allungamento meccanico ciclico per 24 ore. Quattro gruppi erano inclusi: (A) cellule trasfectate con siRNA di controllo senza stretching; (B) controllare le cellule trasfettate da siRNA con stretching; (C) Cellule trasfettate da siRNA da Piezo1 senza allungamento; (D) Cellule trasfettate da siRNA Piezo1 con allungamento. Esperimento con inibitore piezo1 (GsMTx4): Le cellule sono state trattate con 5 μM GsMTx4 prima e durante lo stretching meccanico. Furono inclusi quattro gruppi: (A) cellule non trattate senza allungamento; (B) cellule non trattate con allungamento; (C) Cellule trattate con GsMTx4 senza allungamento; (D) Cellule trattate con GsMTx4 con stretch (con GsMTx4 presente ovunque). Esperimento agonista piezo1 (Yoda1): Le cellule sono state coltivate in presenza di Yoda1 a 5 μM per 24 ore. Erano inclusi due gruppi: (A) controllo non trattato (veicolo); (B) Cellule trattate con Yoda1.

Western blotting

I livelli proteici sono stati valutati tramite Western blotting seguendo procedure di routine. Per un breve periodo, abbiamo lisato campioni di fibroblasti sclerali o coltivati in un tampone RIPA. La proteina (20 μg) è stata risolta da SDS-PAGE e successivamente tamponata sulle membrane della nitrocellulosa. Le membrane sono state poi bloccate con il 5% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente, seguite da un'incubazione notturna a 4 °C con gli anticorpi primari appropriati. Gli anticorpi utilizzati includevano Piezo1, collagene tipo I, α-muscolo liscio actina, YAP e GAPDH. L'anticorpo Piezo1 è stato convalidato dal produttore per il Western blot e l'immunofluorescenza nei tessuti di ratto e umani, con dati di knockout/knockdown disponibili nella scheda prodotto. Dopo tre lavaggi con TBST, abbiamo incubato le membrane con anticorpi secondari coniugati con HRP appropriati (anti-rabbit o anti-mouse) per 1 ora a temperatura ambiente. Le intensità delle bande venivano quindi misurate utilizzando software di analisi delle immagini e il segnale di ogni banda bersaglio veniva normalizzato al segnale GAPDH della stessa corsia. I dati risultanti sono presentati come variazione di pieghe rispetto alla condizione di controllo.

Proliferazione cellulare

La proliferazione cellulare è stata valutata tramite un saggio di vitalità colorimetrica seguendo il protocollo fornito. Abbiamo aggiunto un composto di tetrazolio (10 μL/mL) a ciascun pozzo e incubato le lastre per 2 ore in condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO2). L'assorbenza veniva quindi rilevata a 450 nm.

Trasfezione di RNA interferente di piccole dimensioni

La trasfezione di siRNA con piezo1 è stata eseguita come^{descritto in precedenza 31}. Le sequenze erano le seguenti: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3' (senso) e 5'-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3' (antisenso), siRNA di controllo negativo (NC), 5'-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3' (senso) e 5'-AUGGUAUAUACGCUCACTT-3' (antisenso).

Immunofluorescenza

Per l'immunofluorescenza, le cellule coltivate sono state fissate con paraformaldeide al 4% (20 min, temperatura ambiente), permeabilizzate con 0,1% di Triton X-100 (40 min) e poi bloccate con BSA al 10%. Le sezioni tissutali sono state fissate durante la notte con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente, seguite da permeabilizzazione e blocco. I campioni sono stati incubati con anticorpi primari contro Piezo1 e α-SMA. Successivamente, abbiamo applicato anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti: anti-topo marcato con verde (per α-SMA) e anti-coniglio marcato con marchio rosso (per Piezo1), ciascuno con diluizione 1:500. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI e le immagini sono state catturate con un microscopio a fluorescenza.

Trattamento con agonisti e inibitori

Le cellule HSF sono state trattate con 5 μM GsMTx4 e 5 μM dell'agonista Piezo1 Yoda1 sulla base di studi^{precedenti 33}.

Analisi statistica

Ogni esperimento è stato condotto in triplice. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Per confronti tra due gruppi, abbiamo applicato un test t di Student a due code. Sono stati effettuati confronti multipli di gruppi con ANOVA unidirezionale seguiti dal test post-hoc di Tukey. La normalità dei dati è stata verificata con il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità delle varianze è stata valutata utilizzando il test di Levene. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05. Tutte le analisi statistiche sono state condotte con software statistico dedicato.

Risultati

Piezo1 è espresso nei tessuti della sclera del ratto e nelle cellule HSF

Per prima cosa, abbiamo esaminato l'espressione di Piezo1 sia nei tessuti sclerali del ratto (in vivo) sia in fibroblasti sclerali umani in coltura (in vitro). Per esaminare l'espressione specifica dei tessuti di Piezo1, è stato utilizzato il database di annotazione genica^{BioGPS 34}. L'analisi BioGPS ha rivelato che Piezo1 è fortemente espresso in v...

Discussione

La pressione intraoculare (IOP) elevata induce una tensione meccanica nella testa del nervo ottico e nella cribrosa laminare, contribuendo alla degenerazione delle cellule ganglionari^{retiniche 38,39}. La sclera peripapillare (PPS) è un tessuto portante importante che influenza la biomeccanica^{dell'ONH 40}. Studi precedenti hanno dimostrato che lo sforzo meccanico induce differenziazione da fibroblasti scleral...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer)	Solarbio, Shanghai, China	—	20 μL
10% chloral hydrate	Macklin, Shanghai, China	—	3 mL/kg
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	—
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	—
BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I)	Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA	—
Chlortetracycline hydrochloride	Zhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China	—
COL1 primary antibody	Novus Biologicals, CO, USA	—
DMEM	Gibco, Grand Island, NY, USA	—
FBS	Gibco Life Technologies, Australia	—
GAPDH primary antibody	Bioworld, MN, USA	—
GraphPad Prism version 8.4	Inc., San Diego, CA, USA	—
Nikon Eclipse E800 microscope	Nikon, Melville, NY, USA	—
Nitrocellulose membranes	Pierce, Rockford, IL, USA	—
Penicillin-streptomycin	Hyclone, South Logan, UT, USA	—
Piezo1 primary antibody	Novus Biologicals, CO, USA	—
Rebound tonometer (TonoLab)	Icare, Espoo, Finland	—
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China	—
The Flexcell FX-5000 Tension System	Flexcell International Corporation	—	Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells.
Tropicamide	Bausch Lomb Freda, Shandong, China	—
YAP primary antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, USA	—
α-SMA primary antibody	Abcam, Cambridge, UK	—