Articolo metodologico

Consumo Intermittente Automatizzato di Alcol in topi ospitati socialmente tramite il Sistema di Test Intellicage

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DOI:

10.3791/71345

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5 giugno 2026

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1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta metodi per una valutazione automatizzata ad alto rendimento dei comportamenti di consumo di alcol nei topi socialmente ospitati, gestita tramite il sistema di test IntelliAge. È fornita una metodologia dettagliata per un paradigma operante e intermittente di alcol, insieme ai file sperimentali e al codice per analizzare i dati risultanti.

Abstract

Nonostante le note confondenze dell'isolamento sociale sul comportamento dei roditori, molti ricercatori si affidano al fatto di individuare singolarmente topi per valutare la preferenza per l'alcol nei modelli preclinici di disturbo da uso di alcol (AUD). Questo protocollo descrive un compito sociale di consumo di alcol che consente una valutazione automatizzata ad alto rendimento dei comportamenti di consumo di alcol nei topi senza gli effetti confusi dello stress indotto dall'isolamento sociale. Il sistema di test IntelliCage consente agli investigatori di valutare simultaneamente il comportamento di consumo di alcol operante in fino a 16 topi dello stesso sesso, ciascuno identificato in modo unico con un transponder di identificazione a radiofrequenza (RFID) impiantato sottocutaneo. L'accesso alle bottiglie a sorso è controllato tramite software e può essere regolato individualmente per ogni mouse. In questo paradigma cronico e intermittente di alcol, i topi si impegnano volontariamente in sepoke operanti per accedere a bottiglie a sorvetta contenenti il 20% di alcol per sei settimane consecutive. Le bottiglie di alcol sono disponibili solo a giorni alterni per 24 ore alla volta e possono essere opzionalmente adulterate con chinino per valutare il consumo di alcol insensibile alla punizione. Le visite a ogni angolo operante, nosepoke e dati di lick vengono registrate automaticamente per ogni mouse. Metodi sperimentali dettagliati e il codice open source per l'analisi dei dati registrati permetteranno agli investigatori di valutare i comportamenti di consumo di alcol rilevanti per l'AUD in modo sempre più efficiente ed etologico.

Introduzione

Gli studi nei modelli preclinici sono fondamentali per sviluppare una comprensione più profonda dei meccanismi neurobiologici alla base dei comportamenti simili al disturbo da uso di alcol (AUD). Tuttavia, molte misure tradizionali del consumo di alcol nei roditori, come i test a due bottiglie scelta 1,2 e il consumoal buio 3,4,5, richiedono una misurazione manuale dei volumi liquidi tra roditori singolarmente, un metodo a basso rendimento e soggetto a errori. La recente adozione di sistemi a lickometro open-source che utilizzano la tecnologiacapacitiva 6,7,8,9,10 o fotoelettrica 11,12 per automatizzare il conteggio dei lecci rappresenta un significativo progresso nella capacità di produzione, nell'accuratezza e nella sensibilità tecnica della metodologia del consumo di alcol. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di lickometro a gabbia domestica richiede ancora che i roditori siano abitati singolarmente, inducendo uno stress da isolamento13,14. Sebbene i risultati riportati varinoampiamente 15,16, i roditori generalmente hanno una preferenza maggiore per l'alcol quando sono alloggiatisingolarmente. 17,18,19,20. Tuttavia, gli effetti dell'isolamento sociale sul consumo di alcol variano in base all'età dell'animale, al sesso, all'ambiente abitativo e all'esposizione precedente allostress 20,21,22. L'isolamento sociale ha il potenziale di interagire in modo significativo con manipolazioni sperimentali per limitare la validità degli esiti comportamentali di tipo AUD valutati.

Nuovi sistemi di monitoraggio delle gabbie domestiche completamente automatizzati, come il sistema di test IntelliCage (TSE Systems 23,24,25) o alternative open source, LIQ PARTI20 e FARESHARE26, risolvono questo problema combinando la lickometria con il tracciamento per identificazione a radiofrequenza (RFID) di più animali alloggiati in gruppo. Questi sistemi di monitoraggio delle gabbia domestiche permettono una quantificazione più efficiente e riproducibile dei comportamenti di consumo di alcol, senza le confondenze dello stress causato dall'isolamento sociale. Pertanto, sono ideali per studi ad alto rendimento e confermatori di manipolazioni sperimentali che influenzano la vulnerabilità a comportamenti simili a quelli dell'AUD. Tra questi, il sistema di test IntelliCage è unico nell'incorporare angoli programmabili e operanti per l'accesso alle bottiglie a sorvetta, permettendo agli investigatori di valutare i comportamenti di ricerca in assenza di accesso ai farmaci, modulare i rapporti operanti per singoli animali e altro ancora.

Qui, gli autori presentano un paradigma operante di consumo intermittente di alcol gestito tramite il sistema di test IntelliCage tra topisocialmente ospitati 27,28. Questo paradigma consente la valutazione automatizzata e a lungo termine del consumo di alcol in fino a 16 topi dello stesso sesso, ciascuno identificato unicamente da transponder RFID impiantati sottocutaneo. Come descritto di seguito, i topi sono addestrati a fare il nosepoking operantemente con un rapporto fisso (FR)-3 per accedere alle bottiglie a sorso. Dopo un breve periodo di formazione, le bottiglie a sorseggiare in due dei quattro angoli operanti vengono sostituite con alcol al 20% (etanolo al 95% [190 proof] nell'acqua del rubinetto, v/v). I topi hanno accesso continuo all'acqua, ma a intermittenza con alcol a giorni alterni per periodi di 24 ore (dalle 12:30 alle 12:30). I leccati con alcol vengono quantificati nell'arco di sei settimane, con un test di adulterazione della chinina di due giorni (0,5 mM, 1,0 mM) a metà esperimento per valutare il consumo di alcol insensibile alla punizione. I dati visit, nosepoke e lick vengono registrati per ciascun mouse (Figura 1), estratti utilizzando il software proprietario di TSE e successivamente analizzati tramite la pipelineopen-source 29 per ottenere informazioni sui comportamenti simili a quelli di AUD.

Questo protocollo integra altri usi pubblicati del sistema di test IntelliCage per valutare comportamenti simili all'AUD 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, così come altri comportamenti simili ai disturbi da uso di sostanze 40,41,42. In linea con i rapporti che suggeriscono che i programmi di accesso intermittente aumentano il consumo volontario di alcolnei roditori 1,43,44,45,46,47, questo protocollo produce alti livelli di consumo volontario di alcol nella maggior parte dei topi. Tuttavia, come osservano gli autori durante tutto il protocollo, i parametri sperimentali possono essere facilmente modificati per affrontare domande sperimentali. In definitiva, questa metodologia offre una soluzione efficiente e flessibile per i ricercatori per studiare i meccanismi alla base dell'AUD.

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Figura 1: Tracciamento completamente automatizzato delle visite del topo, dei nosepoki e dei lick tramite identificazione RFID unica. (A) Diagramma cartoon dell'impianto di transponder RFID del topo. I transponder RFID vengono impiantati sottocutaneamente nella regione dorsocervicale per consentire il tracciamento individuale in un sistema automatizzato di monitoraggio homecage. (B) Schema delle fasi di raccolta dati durante il paradigma automatizzato e operante dell'alcol intermittente. L'identità dell'animale viene letta, e una visita all'angolo viene registrata tramite un'antenna ad anello doppia RFID e letture del sensore di temperatura, entrambi devono essere positivi per poter registrare la visita (a sinistra). Dopodiché, i topi vengono addestrati a fare il nosepoking secondo un programma FR-3 per accedere alle bottiglie a sorvetta (centrale). Un noepoking riuscito permette di accedere 5 secondi di bottiglia a sorso, a quel punto i lick del mouse vengono registrati tramite un lickometro basato sulla capacità (a destra). Cartoni animati realizzati a partire da modelli BioRender modificati da Lucy Anderson, con licenza CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal NIH Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono state conformi alle politiche del Servizio di Sanità Pubblica sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio.

1. Preparazione dell'apparecchio

NOTA: Ogni apparato del sistema di test IntelliCage consiste in una grande gabbia domestica in plastica (39 cm x 58 cm x 21 cm) all'interno della quale possono risiedere fino a 16 topi dello stesso sesso. Le precedenti coorti variavano in dimensioni da 8 a 16 topi per gabbia. L'apparecchio è dotato di quattro angoli operanti, tutti collegati a un microprocessore centrale sul coperchio superiore. Rodent chow è accessibile da una grande tramoggia metallica posta al centro del coperchio. All'interno della gabbia, i topi si muovono liberamente tra gli angoli operanti e uno spazio abitativo centrale, dotato di biancheria da letto e materiali per l'arricchimento. Ogni angolo operante ha un piccolo ingresso circolare che permette fisicamente l'ingresso di un solo topo alla volta. L'identità del mouse viene letta e registrata in base alle letture doppie dell'antenna ad anello RFID e del sensore di temperatura, entrambe devono essere positive per la registrazione della visita. All'interno di ogni angolo operante, ai topi vengono presentati due porti nasoke, ciascuno dei quali controlla l'accesso a una delle due porte motorizzate. Queste porte programmabili e motorizzate permettono di accedere a una delle due bottiglie a sorveglianza. Gli investigatori programmano manualmente le condizioni per l'accesso alle bottiglie a sorso, così come la sensibilità dei lickometri basati su capacità. I dati di visita, naso e lick vengono registrati individualmente per ciascun mouse e trasmessi tramite un microprocessore centrale a un computer su cui viene caricato il sistema software proprietario di TSE. Sebbene non sarà discusso in questo protocollo, ogni camera operante contiene anche una valvola programmabile per il raffreddamento avversivo.

  1. Equipaggiare la gabbia domestica in plastica con cinque cuscinetti in fibra di cotone compressa (15,24 x 25,4 cm), due piccoli quadrati di cotone (5,08 x 5,08 cm) e quattro strutture di scavo in plastica per la lettiera e l'arricchimento.
    NOTA: L'uso di cuscinetti in fibra di cotone compressa è raccomandato per due motivi: (1) per evitare che la polvere o le schegge dei materiali di letto comunemente usati interferiscano con la meccanica delle porte, e (2) per consentire una più facile identificazione dei combattimenti tra animali.
  2. Metti il coperchio superiore con gli angoli operanti nella gabbia di plastica per la casa.
  3. Se disconnesso, collegare tutti gli angoli operanti al microprocessore centrale usando i cavi forniti e poi collegare il microprocessore centrale a un computer precaricato con software TSE tramite cavi CAN.
    1. Se si utilizzano più apparecchi, collegare tutte le gabbie allo stesso computer in modo seriale.
  4. Collega il microprocessore alla fonte di alimentazione e assicurati che le luci LED in ogni angolo si accendano e che tutte e otto le porte motorizzate si muovano.
  5. Riempi otto bottiglie con ~250 mL ciascuna di acqua del rubinetto (o altro liquido), premi saldamente i tappi per garantire una buona tenuta e poi ruota delicatamente nelle aperture del lickometro, assicurando una connessione ben stretta al lickometro.
    NOTA: La sensibilità dei sensori di visita, nosepoke e leccata può essere ottimizzata opzionalmente tramite un esperimento pilota. Per regolare la sensibilità di ogni angolo, segui le istruzioni del produttore descritte nel file "Help" del programma "Controller". Tutti gli studi hanno utilizzato le seguenti impostazioni: visita- 816 ON/768 OFF; NOSEPOKE- 21 ON/26 OFF; Licchimetro - 69 ON/80 OFF/15 time-out.
  6. Riempi il cibo con cibo per roditori.
  7. Accendi il computer, apri l'applicazione "Controller" e carichi il file dell'esperimento desiderato.

2. Preparazione degli animali

NOTA: Gli animali dovrebbero essere impiantati con transponder RFID almeno una settimana prima dell'inizio dei test comportamentali per consentire un tempo di recupero sufficiente. Usa topi invecchiati almeno ~50 giorni, con peso corporeo superiore a 15 g. L'impianto di topi più piccoli aumenta il rischio di ferire il topo durante l'iniezione. A seconda della linea di topi, l'aggressività può diventare un problema nelle condizioni di alloggio in gruppo, specialmente tra i maschi. Mitiga questo rischio alloggiando tutti i topi insieme durante l'adolescenza. Gli autori non hanno osservato aggressività significativa in studi su topi adulti (~PND 80–150) di tipo selvatico C57BL/6, ma ciò non garantisce la generalizzazione di questo protocollo ad altri genotipi, età o disposizioni abitative.

  1. Impiantare sottocutaneamente topi con transponder RFID nella regione dorsocervicale per un'identificazione unica.
    1. Stampate una tabella dati con tutti gli animali sperimentali con uno spazio accanto a ciascun documento d'identità per posizionare un adesivo con codice a barre con il loro codice RFID.
    2. Raccogli tutti gli animali e le forniture necessarie: transponder RFID, iniettore di transponder RFID ricaricabile e impianto di induzione con isoflurano.
    3. Inserire il primo topo nella camera di induzione e anestetizzare tramite isoflurano vaporizzato (flussometro di ossigeno: 1,5 mL/min, isoflurano: 1,5–3,5%) finché il topo non prende grandi respiri singhiozzanti e non risponde a una pizzicotta del dito dei piedi.
      1. Mentre si aspetta che il topo venga anestetizzato, carica il transponder RFID sull'iniettore avvitando l'ago pre-caricato alla base dell'iniettore e poi espellendo lentamente la siringa finché non si vede il microchip muoversi.
      2. Applica il codice a barre che identifica il codice RFID sulla tabella dati stampata accanto all'identificazione animale appropriata.
    4. Rimuovere il topo dalla camera di induzione e impiantare sottocutaneamente il transponder RFID pre-caricato nella regione dorsocervicale.
      1. Dopo aver prima verificato che il topo non risponda a un pizzicolio del dito del piede, usa il pollice e l'indice della mano non dominante per pizzicare la pelle del topo direttamente sopra le scapole.
      2. Usando la mano dominante, inserire l'ago dell'iniettore sottocutaneamente nella parte posteriore della pelle del topo, assicurandosi di mantenere l'ago sollevato sopra e parallelo alla colonna vertebrale per evitare di ferire il topo.
      3. Con la punta della siringa all'interno della pelle del topo e saldamente stabile tra pollice e indice, muovi con attenzione la mano dominante in modo che la persona possa premere lo sturalavandini dell'iniettore.
      4. Espelle il transponder RFID, tenendo le dita della mano non dominante strette intorno alla pelle della testa in modo che si possa sentire una volta che il microchip è uscito dalla punta della siringa.
      5. Mentre tieni la pelle stretta, rimuovi lentamente l'iniettore. Rilascia la barba solo una volta che l'iniettore è stato completamente rimosso per evitare che il transponder cada.
        NOTA: Opzionalmente, si può aggiungere un singolo nodo di sutura per chiudere la pelle mentre il topo è sotto anestesia.
    5. Riporta il topo nella gabbia di casa e monitora il recupero dall'anestesia fino a quando non è completamente deambulato.
    6. Monitora il topo per eventuali segni di compromissione fisica, inclusa paralisi parziale, zoppia o giri intornali, che possano indicare un'iniezione fuori bersaglio. Se le disabilità persistono per più di 24 ore o hanno un impatto grave sul benessere animale, si sopporta l'eutanasia in modo umano.
      1. Puntare il lettore del transponder RFID sopra la regione dorsocervicale del topo e scansionare per confermare il posizionamento positivo.
    7. Opzionalmente, preleva un campione di tessuto per la genotipazione.
      1. Ripeti con tutti i topi sperimentali.
  2. Un giorno dopo l'impianto iniziale del transponder RFID, si utilizza il lettore di transponder RFID per verificare che nessun topo abbia perso il proprio transponder RFID. Se qualche topo ha perso i loro transponder, ripetere la procedura con un nuovo transponder e aggiornare i record di conseguenza.
    NOTA: Di solito, se un topo deve perdere il transponder RFID, ciò accade entro 24 ore dall'impianto. Questo può verificarsi a causa di una posizione imcorretta del transponder RFID e/o della toelettatura/graffi del mouse nel sito di iniezione. Evitare di reiniettare nelle ferite di iniezione precedenti ed escludere i topi dopo tre impiantamenti falliti di transponder RFID.
  3. Prima di rialloggiare i mouse nell'apparato IntelliCage, verifica che tutti i transponder RFID possano essere letti correttamente. Pesa e registra il peso corporeo di tutti i topi.

3. Preparazione dei file sperimentali

NOTA: Il sistema di test IntelliCage è controllato e gestito tramite interfacce grafiche utente fornite da TSE. Ci sono tre applicazioni utilizzate per eseguire esperimenti IntelliCage: "Designer", "Controller" e "Analyzer". Le diverse fasi dell'esperimento vengono eseguite tramite diversi file di esperimento, che vengono progettati nell'applicazione "Designer" e poi eseguiti nell'applicazione "Controller". Informazioni dettagliate su come progettare e adattare i file degli esperimenti sono state descritte inprecedenza 48,49. Sono stati forniti modelli dei quattro file di esperimenti utilizzati nello studio (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment) per facilitare la replicazione del protocollo. In questi file, i cambiamenti di fase avvengono alle 12:30. Gli autori hanno scelto questo orario perché gli animali erano ospitati in un ciclo di luce dalle 6:00 alle 18:00. Questo ha permesso una fase oscura ininterrotta per misurare i comportamenti di alcol. Tuttavia, gli investigatori potrebbero voler modificare questo tempismo per essere coerente con altre metodologie di consumo di alcol, come le procedure "drinking in the dark" 50.

  1. Configura i file degli esperimenti nell'applicazione "Designer".
    NOTA: Se si lavora con i file template, elimina i quattro animali di esempio prima di entrare nella coorte corrente. Inoltre, rinomina i nomi dei gruppi nel disegno sperimentale e aggiungi i gruppi se necessario. Assicurati che i nuovi gruppi partano tutti dallo stesso cluster di quelli del template.
    1. Apri il file Habituation.experiment nell'applicazione "Designer" e inserisci con attenzione l'ID animale, il codice del transponder RFID e il gruppo/genotipo sperimentale per ogni topo. Salva il file con un nuovo nome per mantenere il file template.
      NOTA: Se i codici transponder RFID vengono digitati erroneamente, i dati non verranno registrati. Assegnare gli animali ai gruppi sperimentali rilevanti aiuterà a monitorare il loro comportamento e, in ultima analisi, i dati.
    2. Esporta le informazioni sugli animali come file sugli animali.
    3. Per ogni fase dell'esperimento, apri il file corrispondente e carichi il file degli animali. Salva e rinomina in modo appropriato.
    4. Se progetti file su un computer separato, scarica i file degli esperimenti su una chiavetta USB portatile per il trasporto nella sala comportamenti.
  2. Scarica tutti i file dell'esperimento sul computer collegato all'apparato IntelliCage e apri il primo file nell'applicazione "Controller". Verifica che tutte le informazioni si carichino correttamente.
  3. Su carta o in formato elettronico, crea un registro sperimentale in cui si annota la data e l'ora in cui si possono iniziare/interrompere le diverse fasi dell'esperimento. Questo aiuterà notevolmente nell'analisi, poiché alcune condizioni legate alla droga (ad esempio, alcol adulterato con chinino) non sono registrate nei file d'archivio di IntelliCage.

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Figura 2: Linea temporale sperimentale per il paradigma operante e intermittente del consumo di alcol. (A) Schema dell'apparato IntelliCage con bottiglie contenenti alcol in due dei quattro angoli. (B) Cronologia sperimentale che rappresenta il calendario di tutte le fasi sperimentali, come utilizzato nella precedentepubblicazione 23. La coorte 1 ha condotto un test sull'alcol adulterato con chinina dopo aver concluso il consumo intermittente di alcol, mentre le coorti 2 e 3 sono tornate al consumo intermittente di alcol dopo adulterazione. (C) Calendario sperimentale dettagliato che mostra le modifiche software per tutte le fasi sperimentali: abituazione, addestramento con l'acqua, consumo intermittente di alcol, test dell'alcol adulterato con chinino e "open bar"/alcol ad accesso libero. I cambi di gabbia sono programmati almeno una volta a settimana dopo il completamento di un modulo "Accesso all'Alcol ON". Cartoni animati realizzati a partire da modelli BioRender modificati da Lucy Anderson, con licenza CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Conduzione dell'esperimento

NOTA: Il paradigma operante e intermittente del consumo di alcol consiste in cinque fasi: (1) abituazione, (2) addestramento all'acqua, (3) consumo intermittente di alcol, (4) test dell'alcol adulterato con chinina, e (5) "open bar"/alcol ad accesso libero. Ogni fase dell'esperimento viene eseguita su diversi file sperimentali, ad eccezione del consumo intermittente di alcol e del test di alcol adulterato con chinina, che utilizzano entrambi i parametri specificati nel file Intermittent Alcohol.experiment . Al di fuori dei cambi di gabbia, gli sperimentatori dovrebbero controllare i topi almeno tre volte a settimana per valutare il benessere degli animali e assicurarsi che il software funzioni correttamente. Qualsiasi topo trovato ferito o malato dovrebbe essere rimosso dall'esperimento. Per un esempio di programma sperimentale, vedi la Figura 2.

  1. Cambi di gabbia
    NOTA: Effettuate i cambi di gabbia almeno una volta a settimana. Durante il consumo di alcol, esegui questi cambiamenti solo dopo le 12:30 durante il periodo "Solo accesso all'acqua" per evitare di interrompere il consumo di alcol. Per facilitare ciò, i file Intermittent Alcohol.experiment e Open Bar.experiment inizieranno sempre con "Solo accesso all'acqua." A causa delle dimensioni delle gabbie, è difficile maneggiare le gabbie occupate da soli. Gli autori raccomandano di avere almeno un investigatore aggiuntivo per assistere nei cambi di gabbia. Controlla i topi 24 ore dopo ogni cambio di gabbia per assicurarti che il software funzioni correttamente e che non ci siano state aggressioni o litigi in risposta allo stress del cambio.
    1. Prima di iniziare il cambio di gabbia, prepara una nuova gabbia di plastica pulita con nuova biancheria da letto e materiali per il nido. Riempi ciascuna delle otto bottiglie/gabbia con ~250 mL di acqua del rubinetto o 20% di alcol (95% etanolo [190 proof] nell'acqua del rubinetto, v/v).
      NOTA: Opzionalmente, gli investigatori possono aggiungere una piccola quantità del vecchio materiale per la lettiera alla nuova gabbia pulita. Questo riduce al minimo il disturbo delle gerarchie di gruppo consolidate e può ridurre il rischio di conflitti.
    2. Ferma l'esperimento nell'applicazione "Controller". Dopo esserti assicurato che non ci siano topi negli angoli operanti, rimuovi la tramoggia metallica per il cibo. Fai sollevare a una persona l'apparecchio microprocessore metallico abbastanza in alto da permettere a una seconda persona di far scivolare fuori la gabbia di plastica da sotto. Verifica il numero corretto di topolini.
    3. Rimuovi i topi uno per uno dalla gabbia sporca, scansiona il transponder RFID e registra il peso corporeo. Esamina visivamente ogni topo per segni di lesioni o malattie.
      NOTA: Gli autori raccomandano di registrare il peso corporeo in un foglio elettronico (csv) in modo che possa essere facilmente letto nella pipeline di analisi.
    4. Metti temporaneamente i topi in un contenitore pulito dopo aver registrato il peso corporeo.
    5. Pulisci la parte superiore e gli angoli con un asciugamano bagnato imbevuto di disinfettante. Fai particolare attenzione a pulire la superficie e la cresta inferiore della piastra d'angolo, senza lasciare che alcun liquido perda sulle parti elettroniche.
    6. Solleva l'apparecchiatura microprocessore metallica abbastanza in alto da far scorrere la nuova gabbia di plastica pulita al suo posto.
    7. Ruota delicatamente nuove bottiglie per il biglietto nelle aperture del lickometro, assicurando una connessione salda al lickometro.
    8. Trasferire i topi in un nuovo apparecchio pulito.
    9. Sostituisci il cibo con uno nuovo e pulito e cibo fresco per roditori.
    10. Riavvia lo stesso esperimento nell'applicazione "Controller" oppure carica e avvia un nuovo file di esperimento.
    11. Assicurati che il programma funzioni correttamente e che tutti i topi abbiano visite registrate correttamente, con le rivisite, i colpi del naso e i colpi di calore.
      NOTA: Il programma "Controller" presenterà automaticamente avvisi quando un animale non ha registrazioni di lick entro un periodo di 12 ore.
    12. Pulire l'attrezzatura sporca. Gabbie in plastica, bottiglie a sorvettazione e strutture di scavo in plastica possono generalmente essere lavate attraverso i tipici sistemi di lavaggio della gabbia.
  2. Giorno 0: Abituazione
    NOTA: La fase di abituazione viene eseguita utilizzando il file Habituation.experiment . Durante questa fase, tutte le bottiglie a sorseggiatore contengono acqua del rubinetto. I topi hanno accesso libero a tutte le bottiglie senza naso operante. Le porte motorizzate si aprono quando i topi entrano in un angolo operante, rivelando l'accesso agli ugelli delle bottiglie per sorseggiare.
    1. Dopo aver verificato la presenza del transponder RFID e registrato il peso corporeo del topo, riempi tutte e otto le bottiglie con ~250 mL di acqua del rubinetto e ruota delicatamente nelle aperture del lickometro.
    2. Inserisci fino a 16 topi dello stesso sesso nell'apparecchiatura IntelliCage preparata.
    3. Carica il file Habituation.experiment nell'applicazione "Controller" e inizia la registrazione.
    4. Verifica che tutte le porte motorizzate si aprano correttamente quando un topo entra nell'angolo operante e che tutte le visite, i nosepoke e i lick siano registrati correttamente per ciascun topo. Se non sono state registrate visite, nasi o leccate per un topo entro un periodo di 6 ore, controlla il file .animal per errori.
  3. Giorno 1-3: Allenamento in acqua
    NOTA: La fase di addestramento in acqua viene svolta utilizzando il file Water Training.experiment . Tutte le bottiglie a sorseggiare dovrebbero continuare a contenere solo acqua del rubinetto. Questa fase addestrerà i topi a fare nosepoke su un FR-1 e successivamente su un programma FR-3 per accedere agli ugelli delle bottiglie a sorso. Dopo aver fatto il noepoking riuscito, le porte motorizzate si aprono per permettere l'accesso alla bottiglia per 5 secondi. Quando un singolo mouse raggiunge un tasso di successo del 60% o superiore, viene spostato a un programma FR-3 per il resto della durata del programma. Di solito, i topi passano al calendario FR-3 entro 24–72 ore. Monitora le prestazioni degli animali nel "Controller". Se un animale non raggiunge un calendario FR-3 entro 72 ore, escluderlo da ulteriori sperimentazioni.
    1. Se tutti i topi sembrano idratati e non feriti dopo 24 ore di abituazione, smetti di eseguire il file Habitatuation.experiment e inizia a eseguire il file Water Training.experiment .
    2. Verifica che visite, nosepoke e lick siano registrati correttamente dal software per ogni mouse e che tutte le porte motorizzate si aprano correttamente.
  4. Giorno 4+: Consumo intermittente di alcol
    NOTA: La fase intermittente di alcol viene eseguita utilizzando il file Intermittent Alcohol.experiment . In questa fase, le bottiglie a sorseggia in due dei quattro angoli operanti vengono sostituite con alcol al 20%. Gli angoli acqua vs alcol sono predefiniti tramite la funzione "Clusters" nel file dell'esperimento. Nel modello, l'acqua viene fornita negli angoli uno e tre (etichettati come "neutri") mentre l'alcol è negli angoli due e quattro (etichettati come "errato"). I topi hanno accesso continuo all'acqua, ma a intermittenza all'alcol per periodi di 24 ore (dalle 12:30 alle 12:30) a giorni alterni. L'accesso a 5 secondi di bottiglia a sorso è fornito su un FR-3 per tutti gli angoli. Durante questa fase dell'esperimento, effettua cambi di gabbia durante i periodi di "Solo accesso all'acqua" per evitare di interrompere il consumo di alcol. Gli investigatori dovrebbero assicurarsi che i gruppi sperimentali mostrino una preferenza approssimativamente uguale per tutti e quattro gli angoli durante l'addestramento in acqua prima di assegnare gli angoli alcolici per il consumo intermittente di alcol. In ciascuna delle coorti, i gruppi sperimentali hanno mostrato visite e colpi approssimativamente uguali su tutti e quattro gli angoli durante l'addestramento in acqua. Per questo motivo, gli autori hanno mantenuto gli assegni di angolo fissati tra le coorti. Gli sperimentatori possono facilmente vedere la proporzione di lick e visite negli angoli tramite il programma "Controller". Assicurati di monitorare regolarmente i dati durante l'esperimento per evitare problemi (ad esempio, malfunzionamenti dell'attrezzatura o "monopolizzano" certi angoli da parte dei topi).
    1. Dopo che tutti i topi hanno raggiunto con successo un programma FR-3 per accedere alle bottiglie a soppo, preparare alcol al 20% (etanolo al 95% [190 proof] nell'acqua del rubinetto, v/v; ~250 mL/bottiglia).
    2. Smetti di eseguire il file Water Training.experiment .
    3. Rimuovi le bottiglie a sorvettazione nell'angolo operante due e quattro (o negli angoli specificati nel file dell'esperimento, se diversi) e sostituisci ciascuna con ~250 mL di alcol al 20%.
    4. Ruota delicatamente le nuove bottiglie con alcol nelle aperture del lichimetro, assicurando una connessione ben stretta al lickometro.
    5. Carica il file Intermittent Alcohol.experiment e inizia a registrare.
    6. Verifica che visite, nosepoke e lick siano registrati correttamente dal software per ogni mouse e che tutte le porte motorizzate si aprano correttamente.
    7. Dopo le 12:30 del giorno seguente, verifica che il programma sia passato con successo dal modulo "Accesso all'Acqua SOLO" a quello "Accesso Alcol ACCESO" e che siano stati registrati dei leccati negli angoli operanti contenenti alcol.
  5. Giorno 16+: Test dell'alcol adulterato con chinino
    NOTA: La fase di test dell'alcol adulterato con chinino viene eseguita utilizzando il file Intermittent Alcohol.experiment. In questa fase, le bottiglie a sorso in due angoli operanti che prima contenevano il 20% di alcol vengono sostituite con 0,5 mM, e successivamente, 1 mM di alcol adulterato al 20% per valutare il consumo di alcol insensibile alla punizione. Queste concentrazioni di chinina, che si traducono rispettivamente nello 0,016% e nello 0,032% di chinina (v), sono state precedentemente trovate avverse nei test effettuati dal gruppo27,28 ealtri 31. I topi hanno accesso continuo all'acqua, ma intermittenti all'alcol adulterato con chinina per periodi di 24 ore a giorni alterni (ad esempio, un giorno di 0,5 mM di chinina, un giorno di accesso solo con acqua, un giorno di 1,0 mM di chinino). L'accesso è garantito secondo un orario FR-3 per tutti gli angoli. In questo studio, i topi hanno eseguito questa fase del compito dopo 16 o 24 giorni consecutivi di alcol intermittente e incontaminato. Non sono stati effettuati cambi di gabbia durante il giorno dell'acqua tra un test di adulterazione e l'altro per evitare effetti confondenti dello stress. Dopo questa fase dell'esperimento, i topi possono iniziare a bere alcolici "open bar"/accesso libero oppure tornare a bere intermittente per valutare il consumo di rimbalzo dopo l'adulterazione.
    1. Prepara 0,5 mM e 1 mM di alcol al 20% adulterato con chinina (95% etanolo [190 proof] in acqua del rubinetto, v/v; ~250 mL/bottiglia).
    2. Effettua un cambio della gabbia, rimuovendo tutte le bottiglie a sorso.
    3. Riempi ogni bottiglia con gli angoli dell'alcol con ~250 mL di soluzione alcolica adulterata con chinino al 20% da 0,5 mM.
    4. Ruota delicatamente le nuove bottiglie con alcol nelle aperture del lichimetro, assicurando una connessione ben stretta al lickometro.
    5. Carica il file Intermittent Alcohol.experiment e inizia a registrare.
    6. Verifica che visite, nosepoke e lick siano registrati correttamente dal software per ogni mouse e che tutte le porte motorizzate si aprano correttamente.
    7. Dopo le 12:30, verifica che il programma sia passato con successo dal modulo "Accesso all'Acqua SOLO" al modulo "Accesso Alcol ACCESO" e che siano stati registrati lecci negli angoli operanti contenenti alcol.
    8. Prima delle 12:30 del giorno successivo di alcol, sostituisci ogni bottiglia nell'angolo dell'alcol con ~250 mL di soluzione alcolica al 20% adulterata con chinino da 1 mM. Non c'è bisogno di fermare l'esperimento per il cambio di bottiglia.
    9. Prima delle 12:30 del giorno successivo di alcol, rimuovi le bottiglie con alcol adulterato e sostituisci con ~250 mL di alcol al 20% non adulterato.
  6. Giorno 20+: "Open Bar"/accesso gratuito al consumo di alcol
    NOTA: È opzionale che si possa gestire un giorno di "open bar"/alcol ad accesso libero per fungere da controllo non operante. Questa fase viene eseguita utilizzando il file Open Bar.experiment . In questa fase, le bottiglie a sorbo in due dei quattro angoli operanti contengono il 20% di alcol, a cui i topi hanno accesso per un periodo di 24 ore (dalle 12:30 alle 12:30). Una visita all'angolo aprirà le porte senza bisogno di naso. In questo studio, i topi hanno eseguito questa fase del compito dopo le fasi di test del consumo intermittente di alcol o quello di alcol adulterato con chinina.
    1. Se necessario, prepara alcol al 20% (etanolo al 95% [190 proof] in acqua del rubinetto, v/v; ~250 mL/bottiglia).
    2. Prima delle 12:30 del giorno successivo di alcol, smetti di eseguire il file dell'esperimento attuale.
    3. Se necessario, rimuovi le bottiglie con il sorvegliante negli angoli dell'alcol e sostituisci ciascuna con ~250 mL di alcol al 20%.
    4. Ruota delicatamente le nuove bottiglie con alcol nelle aperture del lichimetro, assicurando una connessione ben stretta al lickometro.
    5. Carica il file Open Bar.experiment e inizia a registrare.
    6. Verifica che visite, nasi e leccate siano registrate con successo dal software per ogni mouse e che tutte le porte motorizzate siano liberamente aperte.
    7. Dopo le 12:30, verifica che il programma sia passato con successo dal modulo "Accesso all'Acqua SOLO" al modulo "Accesso Alcol ACCESO" e che siano stati registrati lecci negli angoli operanti contenenti alcol.

5. Analisi dei dati

NOTA: I dati di ogni esperimento vengono memorizzati internamente fino a quando il programma non viene interrotto. In quel momento, viene creato e memorizzato un file archivio dati compresso sull'hard disk locale in C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. Il nome del file consiste nella data e nell'ora in cui il programma è stato avviato e termina in .zip.  I file archivio dei dati contengono tutte le informazioni rilevanti sull'esperimento, incluse visite agli angoli (ora di inizio, ora di fine, durata, sequenza delle visite), nosepoke (ora di inizio, ora di fine, durata), lick (ora di inizio, ora di fine, durata), orari di luce e buio, e dati sulla temperatura. Questo archivio dati può essere letto e analizzato con il programma "Analyzer". Tuttavia, esistono altri pacchetti open-source per l'analisi dei dati di IntelliCage (Ruffini et al., 2021; Gastaldi et al., 2025), gli autori hanno creato una pipeline di analisi dati in R utilizzando pacchetti pubblici dal tidyverse per analizzare i dati del paradigma del consumo intermittente di alcol. La pipeline include molteplici fasi di controllo qualità, tra cui l'analisi dell'occupazione degli angoli per mouse; frequenza media di visita, naso e leccata lungo il ritmo circadiano; Tasso di acquisizione FR-3 per mouse; e il conteggio giornaliero delle leccate per topo. Inoltre, gli autori forniscono analisi di base sui sistemi di consumo di alcol. La base è un file modello di notebook R che utilizza il linguaggio di markup Quarto che elabora i file dati e può essere adattato per variazioni specifiche per coorte animale. L'analisi viene effettuata utilizzando la versione gratuita di RStudio. Un file template di progetto per R si trova nel repository29 di GitHub.

  1. Compila tutti i dati, inclusi i file zip generati dall'applicazione "Controller" e il file CSV contenente i dati sul peso corporeo del mouse.
    NOTA: I pesi sono necessari per normalizzare l'assunzione in base al peso corporeo. In questo flusso di lavoro, aveva più senso raccogliere i dati sul peso in un file separato piuttosto che aggiungerli a ogni file di esperimento. La prima colonna deve corrispondere all'Animal ID dai file d'archivio.
  2. Scarica il modello del progetto R dal repository GitHub.
    1. Rinomina il progetto per adattarlo all'esperimento.
    2. Il modello include file di esempio per illustrare come funziona l'analisi, situati nella sottocartella dati/C1. Sostituisci i file di archivio con archivi dati personalizzati.
  3. Avvia RStudio e apri il progetto.
    1. Nella sezione file della finestra in basso a destra di RStudio, naviga nella cartella qmd e apri il file IC_template.qmd.
    2. Duplica il file template e rinomina per farlo corrispondere all'esperimento.
    3. Regola i metadati nella parte dell'intestazione YAML del file duplicato e nel blocco di codice iniziale.
    4. Regola i nomi dei gruppi nel file IC_Commons.R nella directory R per corrispondere ai gruppi sperimentali. (Il template utilizza due gruppi: Control e LBN.)
  4. Esegui il file del quaderno.
    NOTA: Istruzioni più dettagliate sono fornite con i file README.md nel repository GitHub.

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Figura 3: Accesso comparabile agli angoli operanti tra tutti i topi durante le fasi di addestramento e di consumo intermittente di alcol. Tra i topi della primacoorte, 23, la mappa termica mostrava il tempo totale trascorso in ogni angolo per giorno per topo durante (A) l'abituazione e l'addestramento all'acqua rispetto a (B) i primi quattro giorni di alcol intermittente (n = 15 F, 16 M). I colori rosso scuro indicano più tempo al giorno nell'angolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: I topi effettuano visite, leccate e leccate coerenti con il ritmo circadiano e ottengono con successo l'accesso alla bottiglia operante con un programma FR-3. Tra i topi della primacoorte, 23, la densità media di visite di angolo operante (A), (B) sepoke e (C) leccate durante la sessione durante i primi otto giorni di test. (D) Tempo fino a quando ogni topo non lecca con successo un rapporto FR-3 durante l'addestramento in acqua. (E) Tasso di successo delle visite (= % di visite che portano a leccare / visite totali) tra i topi durante l'abituazione e l'addestramento all'acqua (a sinistra) rispetto ai primi quattro giorni di alcol intermittente (a destra). I simboli circolari indicano le donne (n = 15); i simboli quadrati indicano i maschi (n = 16). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: I topi si impegnano in velocità di leccata giornaliere comparabili durante l'addestramento e le fasi di alcol intermittenti. Tra (A) femmine (n = 15) e (B) maschi (n = 16) coorte unotopi 23, numero totale di leccate giornaliere con acqua (blu) e alcol (rosso) durante l'abituazione e l'addestramento con l'acqua (giorno -4–0) rispetto al consumo intermittente di alcol (giorno 1–4). C indica alzamento controllato; La L indica allevamento LBN. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: I topi esposti alle avversità della prima età bevono più alcol rispetto ai controlli nel paradigma operante e intermittente del consumo di alcol. (A) Quantità medie di alcol al giorno normalizzate in base al peso corporeo (g; misurato settimanalmente) durante 8 giorni di accesso intermittente all'alcol tra topi di controllo (grigi; sinistra) e allevati con LBN (rosa; destra). (B) Quantità medie di alcol al giorno normalizzate in base al peso corporeo prima, durante e dopo l'adulterazione della chinina (0,5 mM, 1 mM). (C) Grafico di densità che mostra le leccate medie di alcol al giorno normalizzate in base al peso corporeo durante un singolo giorno di accesso all'alcol FR-0 "Open Bar". I simboli circolari indicano le donne (n = 15); i simboli quadrati indicano i maschi (n = 16). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Gli autori hanno utilizzato test automatici in gabbia domestica tramite IntelliCage per valutare come le avversità nella prima infanzia (ELA) alterino la vulnerabilità a comportamenti simili a quellidell'AUD 27. Per indurre avversità, hanno utilizzato il paradigma di limited bedding and nesting (LBN), un modello di scarsità di risorse che induce cure materne imprevedibili e frammentate 51,52,53,54,55,56. Lo studio è stato innovativo nella valutazione degli effetti dell'ELA sui comportamenti di consumo di alcol tra i topi socialmente alloggiati, senza gli effetti confondenti dello stress indotto dall'isolamento sociale. Questo era importante dato che l'isolamento sociale in età adulta è noto per avere un impatto differenziale sui topi espostiall'ELA 22,57. Per raggiungere il massimo throughput, gli autori hanno misurato simultaneamente i comportamenti di consumo di alcol in quattro apparecchi IntelliCage, due per ogni sesso.

Gli autori hanno avviato la pipeline di analisi conducendo un rigoroso controllo qualità dei dati grezzi. I grafici inclusi qui mostrano dati rappresentativi della coorte uno (n = 15 F, 16 M) dello studiopubblicato 23. Lo script per tutte le analisi e la grafica è incluso nel repositoryGitHub 29. Il giorno sperimentale 0 è stato escluso a causa di un cambio di gabbia, che ha interrotto la raccolta dei dati. Tra le considerazioni per l'esplorazione dei dati e il controllo qualità, gli autori hanno garantito che tutti i topi avessero accesso approssimativamente uguale a tutti gli angoli operanti sia durante la fase di addestramento (Figura 3A) che quella intermittente di alcol (Figura 3B). Questo esclude effetti significativi del fatto che i topi "monopolizzano" gli angoli operanti, impedendo ad altri topi di accedere alle bottiglie a sorso. Gli autori hanno poi convalidato che i topi hanno effettuato visite, leccate e leccate in un ritmo circadiano previsto durante i giorni sperimentali (Figura 4A–C) e che tutti i topi hanno effettuato con successo la prima leccata con un rapporto FR-3 entro sei ore dall'inizio del modulo (Figura 4D). Alla fine della fase di addestramento in acqua, tutti i topi hanno raggiunto un tasso di successo relativamente elevato nel leccare (= % delle visite che portavano a leccare / visite totali), confermando ulteriormente che l'addestramento era riuscito alla fine dell'addestramento in acqua (Figura 4E).

Durante l'abituazione, l'addestramento all'acqua e l'inizio del consumo intermittente di alcol, i topi mantenevano un numero approssimativamente comparabile di leccate giornaliere (Figura 5A–B). Sebbene alcuni topi abbiano mostrato un calo del totale delle leccate giornaliere all'inizio dell'addestramento operante in acqua al terzo giorno sperimentale (ad esempio, P241260-1), la maggior parte dei topi ha acquisito rapidamente un programma di leccate FR-1 e FR-3 abbastanza rapidamente da mantenere le velocità di leccata di base. Pertanto, è improbabile che i topi abbiano sperimentato una disidratazione eccessiva durante l'addestramento in acqua. Tutti i topi hanno imparato il programma FR-3 a un ritmo ragionevole. Una volta iniziato il consumo intermittente di alcol al primo giorno sperimentale, quasi tutti i topi hanno scelto di consumare alcol, sebbene a ritmi diversi. In generale, i topi non aumentavano significativamente il totale delle leccate giornaliere quando consumavano alcolici. Invece, i topi si sono impegnati a leccare meno acqua per gestire l'aumento del consumo di alcol.

In tutti i giorni di consumo intermittente di alcol, i topi della coorte uno variavano ampiamente nei lecci giornalieri di alcol rispetto al peso corporeo (Figura 6A). Gli autori hanno scoperto che i topi che hanno seguito il paradigma LBN avevano un peso corporeo significativamente inferiore rispetto ai controllicross-fostered 23. Così, esaminando le differenze tra gruppi nel consumo di alcol, hanno scelto di normalizzare i leccati giornalieri di alcol in base al peso corporeo, che gli autori valutavano settimanalmente durante i cambi di gabbia. I topi allevati con LBN generalmente bevevano più alcol per grammo di peso corporeo rispetto ai controlli sia durante il consumo intermittente (Figura 6A) sia durante l'adulterazione della chinina (Figura 6B). Questa tendenza è rimasta per un solo giorno di accesso aperto non operante (Figura 6C). Questi risultati della prima coorte sono coerenti con i risultati pubblicati, in cui gli autori riportano che i topi esposti all'ELA hanno costantemente bevuto più alcol per grammo di peso corporeo rispetto ai controlli cross-fostered durante l'accesso intermittente, un effetto particolarmente marcato neimaschi 23.

Resa possibile dall'efficienza dei sistemi automatizzati di monitoraggio delle gabbie domestiche, lo studio pubblicato ha confermato un aumento del consumo di alcol tra roditori esposti all'ELA alloggiati socialmente su campioni estremamente robusti, inclusi entrambi i sessi (n = 54 controllo, 43 LBN)23. Questi risultati rappresentano un passo avanti nella modellizzazione dei comportamenti simili all'AUD osservati nei pazienti con AUD con una storia di esperienze avverseinfantili 58,59,60,61,62, e aprono la porta a futuri studi meccanicistici che identificano la neurobiologia alla base dell'aumento della vulnerabilità all'AUD dopo l'ELA.

Discussione

Come dimostrato dall'uso da parte degli autori di IntelliCage per valutare in modo robusto i comportamenti simili all'AUD nei topi esposti aELA 27 , così come dai lavori precedenti sulle lineetransgeniche 28, i sistemi automatizzati di monitoraggio delle gabbie domestiche offrono una soluzione efficiente e flessibile per studiare i modelli preclinici di AUD. La valutazione simultanea di fino a 16 topi co-abitati aumenta significativamente la portata della metodologia del consumo di alcol, evitando gli effetti confusi dello stress indotto dall'isolamento sociale. Il paradigma operante e intermittente del consumo di alcol consente agli sperimentatori di indagare molteplici aspetti del comportamento simile all'AUD in un singolo periodo di ~5–6 settimane, inclusi il binge drinking, l'escalation nel tempo e il bere insensibile alla punizione. Sebbene il paradigma offra un metodo per valutare comportamenti simili a quelli di AUD, il design può essere facilmente adattato per misurare il consumo intermittente in modo più cronico, testare il consumo insensibile alla punizione in risposta a una boccata d'aria, o aggiungere un rapporto operante variabile, tra le altre possibilità. In definitiva, i sistemi automatizzati di monitoraggio delle gabbia domestiche aumentano notevolmente la capacità di produzione e la specificità con cui i ricercatori possono valutare comportamenti simili a quelli dell'AUD, favorendo l'identificazione di nuovi circuiti e trattamenti sottostanti.

Come per tutta la tecnologia, gli autori a volte sperimentano guasti meccanici e tecnici. Nonostante la tentazione di permettere al sistema di funzionare senza supervisione, è fondamentale che gli investigatori continuino a monitorare regolarmente l'apparato per garantirne il corretto funzionamento. Guasti meccanici occasionali delle porte magnetiche rendevano inaccessibili le bottiglie a sorveglianza ai topi. Questo avveniva raramente con una corretta pulizia e manutenzione e di solito risultava minimamente disturbante per la raccolta dei dati. Per identificare rapidamente gli errori, è importante monitorare le bottiglie a sorso per richiamare le riduzioni comparabili di liquido e controllare regolarmente l'applicazione "Controllore" per verificare che vengano registrate le leccate in tutti gli angoli per tutti gli animali. Per consigli più approfonditi, Masuda e colleghi presentano un'eccellente descrizione di come installare ed eseguire la manutenzione di IntelliCage48.

È inoltre fondamentale osservare regolarmente il comportamento degli animali per monitorare eventuali lotte o altri comportamenti di confusione. Sebbene gli autori non abbiano avuto problemi importanti di combattimento con questo paradigma con topi C57/BL6, la convivenza maschile di genotipi più aggressivi ha causato problemi significativi. Controlla regolarmente la presenza di sangue secco, animali zoppicanti o altri segni di risse, soprattutto dopo i cambi di gabbia. Se si notano questi segnali, si rimuove prontamente l'animale o gli animali responsabili ed escludi da ulteriori sperimentazioni. Usa la sezione "Prestazioni individuali dei topi" del codice fornito per valutare se, e per quanto tempo, l'aggressività ha influenzato il comportamento di bere dei singoli topi. Escludere tutti i giorni interessati dall'analisi. Come detto in precedenza, gli autori non possono garantire la generalizzazione del protocollo a diversi genotipi o disposizioni abitative.

In relazione a questo, gli autori occasionalmente hanno avuto problemi con topi che "monopolizzavano" gli angoli operanti, dormendo o occupando lo stesso angolo per ore. Questo comportamento impedisce agli altri topi di accedere alle bottiglie a sorbo in quell'angolo. Queste situazioni possono confondere i risultati del consumo di alcol se non vengono adeguatamente considerate nell'analisi. Utilizzare le sezioni "Occupazione degli angoli (durate delle visite)" e "Prestazioni individuali del topo" del codice fornito per decidere se l'"occupazione" abbia influenzato il comportamento del mouse in modo abbastanza significativo da escludere certi giorni sperimentali. In generale, l'impossibilità di registrare o quantificare i comportamenti sociali durante gli esperimenti è una delle principali limitazioni di questo sistema di monitoraggio automatizzato.

Infine, come accade sempre più spesso con i metodi neuroscientifici avanzati, i sistemi automatizzati di monitoraggio delle gabbia domestiche producono grandi quantità di dati. Attraverso codice open source come quello presentatoqui 29 e sviluppatoda altri 63,64, gli sperimentatori dispongono di molteplici strumenti per organizzare e analizzare i dati in uscita. Tuttavia, modifiche al protocollo qui presentate renderanno necessaria l'adattamento del codice. Inoltre, numerose analisi aggiuntive potrebbero essere condotte sul tesoro di dati in output non presentati qui.

Ad esempio, gli investigatori potrebbero essere interessati a quantificare il consumo di alcol (g di alcol per kg di peso del topo al giorno). Gli autori discutono brevemente questo e forniscono alcuni codici preliminari per eseguire questa analisi nel repository29 di GitHub. Lì, gli autori utilizzano un fattore di conversione lick-avolume di 1,94 μL/lick, coerente con i calcoli di Kasia Radwanska ecolleghi 30,37. Sebbene questo fattore di conversione lick sia stato utilizzato per stimare il consumo di alcol da altri nelcampo 30,37,38,39, è stato calcolato misurando il consumo d'acqua. Pertanto, potrebbe non essere una misura accurata del consumo del 20% di alcol a causa delle differenze nella tensione superficiale tra acqua e alcol. Altri nel campo hanno utilizzato un fattore di conversione lick di 3 μL/lick 31,34,36,38, evidenziando la necessità di risolvere questa misurazione. Non si può escludere la possibilità che i topi si impegnino in leccate di dimensioni diverse, complicando ulteriormente questo calcolo. Se i ricercatori sono interessati a ottenere una misura accurata del consumo di alcol (g/kg/giorno), gli autori raccomandano di calcolare un fattore di conversione lick-volume, coerente con il disegno sperimentale.

In conclusione, il progresso e l'aumento dell'accessibilità dei sistemi automatizzati di monitoraggio delle gabbia domestiche offrono ai ricercatori AUD strumenti nuovi e migliorati per valutare il consumo di alcol in modo preclinico. Paradigmi operanti di consumo intermittente di alcol come questo permettono agli sperimentatori di valutare simultaneamente molteplici aspetti del comportamento simile all'AUD a un rendimento molto più elevato e con maggiore rilevanza etologica rispetto alla metodologia tradizionale. Attraverso i sistemi di test IntelliCage e le alternative opensource 20,26, i ricercatori possono indagare in modo più efficiente e flessibile i comportamenti di consumo di alcol coerenti con l'AUD, accelerando l'identificazione di interventi efficaci.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Intramural Research Program dei National Institutes of Health al V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). Vorremmo ringraziare Miriam Bocarsly, Anoo Maskeri ed Erin Murray per il loro aiuto nello sviluppo di questo protocollo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo, 190 proofLaboratori di Decon2801G
Sistema di Test IntelliCageSistemi TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Include 1x 2000P Static Cage (Tecniplast, 2000P001),   4 case per topi (Tecniplast, ACRE011) e 8 bottiglie per sorso (Techniplast, ACBT0252) e tappi (Techniplast, ACCP3521)
Software IntelliCage ("Progettista", "Controllore", "Analizzatore")Sistemi TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Versione 3.6.9.0
Isopads, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Cuscinetti in fibra di cotone compressa (15,24 x 25,4 cm)
IsofluranoBaxter10019-360-40
Isoflurano VXP™ Vaporizzatore a pozzoMedVet91305535
Dieta di roditori da laboratorioLabDiet5001
Camera di induzione per topi/ratti a tenuta media Sure-Seal Strumenti di Precisione MondialeEZ-178
NidettiAncareNES 3600Piccoli quadrati di cotone (5,08 x 5,08 cm)
OHAUS Compass & Trade; Bilancia CX - 2.200 grammi x 1 grammoUlineH-8110Per le misurazioni del peso corporeo del topo
PC + DisplaySupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Venduto come parte del sistema di test IntelliCage
Transponder RFID (1,25 x 7 mm)Sistemi TSE290000-IC-60400
Iniettore a transponder RFIDAVIDAVID2028
Lettore di transponder RFIDSistemi TSE290000-IC-50800
RStudioIpotesihttps://posit.co/download/rstudio-desktopVersione 2026.01.1+403; con Tidyverse (2.0.0) e Quarto (1.9.37)
Becher usa e getta Tri PourConsolidated Plastics45317Per le misurazioni del peso corporeo del topo

Riferimenti

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