Bioinformatica e analisi quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi di SUCNR1 e GPR37L1 nella schizofrenia

Sommario

Questo studio valuta SUCNR1 e GPR37L1 come marcatori molecolari candidati associati alla schizofrenia attraverso l'analisi bioinformatica integrata del dataset GSE54913, la validazione quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) e l'analisi di correlazione con la memoria verbale in una coorte indipendente.

Abstract

La schizofrenia è un disturbo mentale grave, complesso e multifattoriale che coinvolge numerosi elementi di suscettibilità genetica, portando a una disabilità significativa, morbilità e mortalità. Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della sua fisiopatologia ed eziologia, i biomarcatori diagnostici specifici per la schizofrenia restano sfuggenti. Questo studio mirava a identificare i marcatori molecolari candidati associati alla schizofrenia. Un'analisi integrata di bioinformatica è stata effettuata sul dataset pubblico di microarray GSE54913. Le analisi delle vie della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) hanno rivelato che i termini GO più significativamente arricchiti erano correlati all'attività dei canali, inclusa l'attività passiva del trasportatore transmembrana, l'attività dei canali ionici, l'attività dei canali a gate e l'attività dei canali specifici del substrato. Le cinque principali vie di KEGG arricchite erano secrezione di insulina, via di segnalazione cAMP, riparazione dell'escissione di nucleotidi, via di segnalazione TNF e metabolismo del glutatione. La validazione è stata effettuata utilizzando reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) su un set di campioni indipendenti dell'Ospedale Rongjun Youfu di Wuhan. I risultati qRT-PCR sono stati in gran parte coerenti con l'analisi microarray (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). L'analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI) ha identificato due geni hub, SUCNR1 e GPR37L1, che erano significativamente associati al termine GO 'attività dei canali ionici' e arricchiti nella via KEGG 'secrezione di insulina'. Inoltre, l'espressione di SUCNR1 ha mostrato una correlazione negativa con i punteggi di memoria verbale (r = -0,54, P = 0,015), mentre GPR37L1 espressione ha mostrato una correlazione positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Questi risultati suggeriscono che l'alterazione dell'espressione di SUCNR1 e GPR37L1 potrebbe essere associata alla schizofrenia e rappresentare marcatori molecolari candidati per ulteriori indagini.

Introduzione

La schizofrenia è un disturbo mentale cronico e complesso di eziologia non identificata, caratterizzato da gravi disfunzioni cerebrali, compromissione cognitiva e deficit^{psicosociali.} Rappresenta un grave onere sanitario globale, che colpisce oltre 21 milioni di persone^{in tutto il mondo 2}. Sebbene gli approcci diagnostici e terapeutici si siano evoluti notevolmente negli ultimi cinquant'anni, la patogenesi centrale rimane poco chiara e gli esiti a lungo termine associati a disabilità sostanziali, morbilità e mortalità non sono migliorati in modo significativo³. Pertanto, è fondamentale identificare potenziali geni chiave e obiettivi regolatori.

La fisiopatologia della schizofrenia, pur non essendo completamente chiara, è ampiamente attribuita a polimorfismi genetici e variazioni di^espressione. Ad esempio, la variazione genetica nel gene alfa degli estrogeni può influenzare la suscettibilità alla schizofrenia attraverso una regolazione genica alternativa e l'elaborazione dei trascriverti⁵. Analogamente, una variante promotrice funzionale di NRG1 è stata collegata alla schizofrenia e correlata a una riduzione dell'espressione dell'isoforma^{NRG1 di tipo III 6}. Studi post-mortem hanno mostrato un'espressione significativamente ridotta delle isoforme di PDE4B nei cervelli schizofrenici, suggerendo il suo potenziale^{predittivo 7}. Altri candidati includono il trasportatore di dopamina (DAT), il trasportatore vesicolare di monoamine (VMAT2) e la monoaminossidasi (MAO), che regolano i livelli sinaptici di dopamina e possono fungere da^{biomarcatori 8}. Inoltre, TCP1 può contribuire a deficit del citoscheletro tramite un ripiegamento improprio dell'actin nella^{schizofrenia 9}. Pertanto, chiarire i profili di espressione genica nella patogenesi della schizofrenia potrebbe fornire informazioni sulla previsione del rischio, la comprensione meccanicistica e la valutazione terapeutica.

Approcci computazionali recenti hanno fatto avanzare l'identificazione dei geni associati a malattie attraverso l'analisi integrata delle reti e metodi di apprendimento^automatico 10,11,12. Nonostante numerosi studi genetici, non sono stati tradotti nella pratica clinica per la schizofrenia biomarcatori diagnostici basati sul sangue affidabili. Per colmare questa lacuna, il presente studio ha utilizzato un approccio bioinformatico integrato per rianalizzare il dataset GSE54913, che contiene dati trascritomici ematici provenienti da pazienti ben caratterizzati con schizofrenia e controlli sani. Il dataset è stato selezionato perché (1) i campioni di sangue periferico sono minimamente invasivi e clinicamente pratici, (2) include un campione relativamente ampio tra i dataset di microarray sulla schizofrenia disponibili pubblicamente, e (3) i dati grezzi erano disponibili per la rianalisi. Gli obiettivi di questo studio erano: (1) identificare geni differenzialmente espressi nei pazienti schizofrenici rispetto ai controlli sani utilizzando il dataset GSE54913; (2) eseguire analisi di arricchimento funzionale e reti PPI per identificare i geni hub; (3) convalidare l'espressione di geni candidati tramite qRT-PCR in una coorte indipendente; e (4) esplorare la correlazione tra l'espressione genica hub e la performance della memoria verbale. A conoscenza degli autori, questo è il primo studio a identificare SUCNR1 e GPR37L1 come marcatori molecolari ematici candidati per la schizofrenia.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Rongjun Youfu di Wuhan (codice di identificazione del progetto, YF-IRB202310215) e condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti erano residenti della comunità cinese e hanno fornito un consenso scritto e informato.

Soggetti dello studio e prelievo di sangue
Dieci adulti diagnosticati con schizofrenia e dieci volontari sani di controllo senza storia familiare di malattie mentali entro tre generazioni sono stati arruolati. Criteri di inclusione per i pazienti con schizofrenia: (1) diagnosi di schizofrenia secondo i criteri DSM-5 confermata da due psichiatri senior indipendenti; (2) età 18–65 anni; (3) nessun cambiamento del farmaco antipsicotico per almeno 4 settimane prima del prelievo di sangue; (4) disponibilità a fornire un consenso informato scritto. Criteri di esclusione: (1) malattie mediche gravi comorbide (ad esempio, diabete, malattie cardiovascolari, cancro); (2) abuso o dipendenza da sostanze negli ultimi 6 mesi; (3) disabilità intellettiva; (4) gravidanza o allattamento. Criteri di inclusione per i controlli sani: (1) nessuna storia personale o familiare (entro tre generazioni) di alcuna malattia mentale; (2) nessun uso attuale o passato di farmaci antipsicotici; (3) abbinata per età e sesso al gruppo schizofrenico; (4) nessuna grave malattia medica. La durata media della malattia per i pazienti schizofrenici è stata di 12,5 ± 6,8 anni; Tutti i pazienti assumevano antipsicotici stabili (6 con risperidone, 4 con olanzapina); il punteggio totale medio PANSS era 76,4 ± 12,3. I controlli sono stati abbinati per età (±5 anni) e sesso (5 maschi, 5 femmine per gruppo). La memoria verbale è stata valutata utilizzando il punteggio totale di richiamo nel Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Tutti i soggetti sono stati reclutati dall'Ospedale Wuhan Rongjun Youfu tra il 1° gennaio e il 31 luglio 2025. Le date demografiche di base sono riassunte nella Tabella 1.

La dimensione del campione è stata determinata utilizzando software di calcolo della dimensione del campione per un test t indipendente a due code con una dimensione d'effetto di 1,2, α = 0,05 e potenza (1-β) = 0,80, ottenendo almeno nove soggetti per gruppo.

Il sangue venoso veniva prelevato in tubi anticoagulati con EDTA e processato senza ritardo. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) sono state quindi separate dai campioni tramite centrifugazione a gradiente di densità utilizzando un mezzo a gradiente di densità. Per un breve periodo, il sangue veniva diluito 1:1 con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4), stratizzato sul mezzo a gradiente di densità e centrifugato a 400 × g per 30 minuti a 20 °C con il freno staccato. Dopo la centrifugazione, l'interfaccia contenente PBMC veniva accuratamente trasferita in un nuovo tubo. Le celle sono state risciacquate due volte con PBS, con ogni lavaggio seguito da centrifugazione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C, e l'ultimo pellet è stato sospeso nel PBS. La vitalità è stata valutata utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano e sono state utilizzate solo preparazioni con cellule vitali al ≥95%. I PBMC isolati sono stati aliquotati e conservati a −80 °C per un massimo di 3 mesi prima dell'estrazione dell'RNA.

Dati di microarray
Il flusso di lavoro dello studio è mostrato nella Figura 1. Il dataset di microarray GSE54913 è stato scaricato dal database GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Questo dataset è stato selezionato perché (1) contiene dati trascrittomici provenienti da campioni di sangue periferico, che sono minimamente invasivi e clinicamente pratici per la scoperta di biomarcatori; (2) include un campione relativamente ampio tra i dataset di microarray sulla schizofrenia disponibili pubblicamente (18 pazienti, 12 controlli); (3) i dati grezzi erano disponibili per la rianalisi. Secondo il registro GEO, i campioni sono stati estratti da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), non dal plasma. La descrizione originale 'campioni di plasma' nella versione precedente era un errore ed è stata corretta.

Preprocessing dei dati e screening genico differenzialmente espresso (DEG)
Dati grezzi (. file CEL) venivano preprocessati utilizzando software di pre-elaborazione di microarray. La correzione di background è stata eseguita utilizzando il metodo Robust Multichip Average (RMA), seguita dalla normalizzazione quantile e dalla trasformazione log2. I sonde senza alcuna annotazione genetica venivano filtrati. Le sonde con valori mancanti del >20% tra i campioni sono state escluse; I valori mancanti per le sonde rimanenti sono stati imputati utilizzando l'algoritmo k-vicini più prossimi (k = 10) implementato nel software di imputazione dei valori mancanti. Gli effetti batch non erano presenti poiché tutti i campioni venivano processati in un unico lotto secondo il registro GEO. Dopo la pre-elaborazione, sono stati ottenuti valori di espressione per 17.200 geni per l'analisi a valle. Le DEG tra pazienti schizofrenici e controlli sani sono state identificate tramite software di analisi differenziale dell'espressione. I geni con tasso di falsa scoperta (FDR) < 0,05, cambiamento assoluto di piega (FC) > 1,2 e P < 0,05 sono stati considerati espressi differenzialmente. È stata scelta una soglia di FC relativamente bassa (FC assoluta > 1,2) perché la schizofrenia è un disturbo psichiatrico complesso in cui le differenze nell'espressione genica individuale sono spesso sottili piuttosto che drammatiche.

Analisi GO e arricchimento dei percorsi
Analisi di arricchimento funzionale per i termini Gene Ontology (GO) e i percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state effettuate utilizzando software di analisi dell'arricchimento funzionale. Il set genico di fondo comprendeva tutti i geni che avevano superato la pre-elaborazione (17.200 geni). Sono stati riportati termini di arricchimento e percorsi con valori P grezzi < 0,05. Poiché i valori P grezzi sono stati utilizzati per i risultati di arricchimento GO e KEGG, questi risultati devono essere interpretati come esplorativi.

Analisi della rete PPI e identificazione dei geni hub
Un database di interazione proteina-proteina è stato utilizzato per costruire una rete PPI, con un punteggio combinato di interazione > 0,9 fissato come soglia. La rete veniva visualizzata utilizzando software di visualizzazione della rete. I geni hub sono stati identificati tramite un plugin di identificazione genica hub con l'algoritmo Degree. I primi 10 nodi con i punteggi di laurea più alti sono stati selezionati come geni hub. La sottorete dei geni chiave dell'hub è stata estratta utilizzando un plugin di estrazione di sottorete con parametri predefiniti (cutoff di grado = 2, cutoff del punteggio node = 0,2, K-core = 2, profondità massima = 100).

Isolamento totale dell'RNA e qRT-PCR
β-Actin veniva utilizzata come gene di riferimento interno (gestione domestica). La stabilità dell'espressione di β-actina tra i campioni è stata confermata dall'assenza di differenze significative nei valori di Ct tra i gruppi schizofrenia e di controllo (P > 0,05). La quantificazione relativa è stata eseguita utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt . Tutte le reazioni venivano eseguite in triplice e il valore medio di Ct veniva utilizzato per il calcolo (vedi sequenze di innesco nella Tabella 2). I dieci migliori DEG (cinque più significativamente al rialzo e cinque più significativamente al ribasso per variazione di pieghe) sono stati selezionati per la validazione iniziale qRT-PCR per confermare l'affidabilità complessiva dei dati del microarray. Successivamente, SUCNR1 e GPR37L1 sono stati selezionati per una validazione focalizzata basandosi su tre criteri: (1) sono stati identificati come geni hub nell'analisi della rete PPI (grado ≥ 7); (2) erano significativamente associate al termine GO arricchito di alto livello 'attività dei canali ionici' e alla via KEGG 'secrezione di insulina'; (3) entrambi codificano i GPCR, che sono noti bersagli farmacologici nella schizofrenia.

Analisi statistica
La normalità è stata valutata con il test di Shapiro–Wilk. Le variabili che mostravano una distribuzione approssimativamente normale (P > 0,05) sono state analizzate utilizzando metodi parametrici, incluso il test t di Student per confronti a due gruppi e ANOVA unidirezionale per confronti che coinvolgono più di due gruppi. Quando l'assunzione di normalità non veniva soddisfatta, venivano utilizzati test Mann–Whitney U o Kruskal–Wallis, secondo il caso. Tutti i test statistici erano a doppia coda. Per confronti multipli (ad esempio, nei test post-hoc ANOVA), è stato applicato il metodo del tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg (FDR), con una soglia FDR di 0,05. Per le analisi di correlazione, non è stata applicata alcuna correzione a confronto multiplo, poiché sono state eseguite solo due correlazioni; i valori grezzi P sono riportati con cautela.

Risultati

Identificazione dei DEG e clustering gerarchico
L'analisi del dataset GSE54913 ha identificato 473 geni differenzialmente espressi (DEG), inclusi 357 geni alzati e 116 sottoregolati, tra pazienti con schizofrenia e controlli (Figura 2A,B). Il raggruppamento gerarchico di questi DEG ha distinto i campioni di schizofrenia dai controlli (Figura 2C).

Analisi dell'arricchimento funzionale dei DEG
L'analisi di arricchimento GO ha identificato termini relativi all'attività del canale, tra cui attività passiva del trasportatore transmembrana, attività dei canali ionici, attività dei canali a porta e attività dei canali specifici del substrato (grezzo P < 0,05; Tabella 3). L'analisi delle vie KEGG ha identificato la secrezione di insulina, la via di segnalazione del cAMP, la riparazione da escissione di nucleotidi, la via di segnalazione del TNF e il metabolismo del glutatione come le vie più arricchite (P grezzo < 0,05; Figura 3C e Tabella 4).

Validazione dei DEG superiori tramite qRT-PCR
I cinque geni più sottoregolati (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 e BRIP1) e i cinque geni più alti (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS e C12orf68) sono stati convalidati tramite qRT-PCR. I geni convalidati e i corrispondenti valori logFC del microarray sono elencati nella Tabella 5, la validazione qRT-PCR è mostrata nella Figura 4, e i valori grezzi di Ct sono forniti nella Tabella Supplementare S1. I cambiamenti di piega qRT-PCR sono stati direzionalmente coerenti con i dati di microarray per tutti e dieci i geni (tutti P < 0,05 secondo il test U di Mann-Whitney). La correlazione di Pearson tra microarray logFC e qRT-PCR logFC era r = 0,89 (IC 95%: 0,66–0,97, P = 0,0004), indicando un forte accordo. Sono state confermate anche differenze di espressione tra SUCNR1 e GPR37L1 (Figura 5A,B).

Analisi della rete PPI
Una rete PPI è stata costruita da tutti i DEG (punteggio di interazione > 0,9; Figura 6A). Le prime dieci proteine hub basate sul grado di connettività erano RTP5 (grado = 14), CXCL1 (grado = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (grado = 7) e ATM (grado = 5) (Figura 6B e Tabella 6). Una sottorete di geni chiave dell'hub veniva estratta utilizzando un plugin di estrazione di sottorete con parametri predefiniti. L'algoritmo di estrazione della sottorete identificò un cluster densamente connesso contenente RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 e SUCNR1, con un punteggio di cluster di 6,2. ATM non era incluso nella sottorete perché aveva una connettività inferiore con il cluster core (Figura 6C).

Associazione tra memoria verbale e SUCNR1/GPR37L1
L'espressione di SUCNR1 era significativamente elevata, mentre GPR37L1 espressione era ridotta, nei pazienti con schizofrenia rispetto ai controlli sani (Figura 5A,B). L'espressione di SUCNR1 ha mostrato una correlazione negativa con i punteggi di memoria verbale (r = -0,54, IC 95%: -0,79 a -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Figura 5C), mentre GPR37L1 espressione mostrava una correlazione positiva con i punteggi della memoria verbale (r = 0,59, IC 95%: 0,20-0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Figura 5D). Sono state effettuate analisi di correlazione su tutti e 20 i soggetti, inclusi 10 pazienti con schizofrenia e 10 controlli sani. Con un campione di 20, lo studio aveva l'80% di potere nel rilevare un coefficiente di correlazione di |r| > 0,6 a α = 0,05. Data la modesta dimensione del campione, questi risultati correlazionali sono preliminari e richiedono validazione in coorti indipendenti più grandi.

Dichiarazione di Disponibilità Dati
Il dataset GSE54913 analizzato in questo studio è pubblicamente disponibile tramite il Gene Expression Omnibus. I valori grezzi di qRT-PCR Ct sono forniti nella Tabella Supplementare S1. Gli script di analisi, i file di output DEG, i risultati di arricchimento, i file di rete PPI e i file sorgente delle figure sono disponibili su https://sandbox.zenodo.org/records/514960 o 10.5072/zenodo.514960.

Figura 1: Diagramma di flusso: raccolta dati, pre-elaborazione, analisi e validazione. Analisi di microarray mRNA su PBMC ottenute da GSE54913. Sono state effettuate analisi di arricchimento funzionale e di percorso GO sui DEG. I primi 10 geni classificati per variazione di piega sono stati selezionati per la validazione dei dati microarray tramite qRT-PCR. L'analisi della rete PPI ha identificato due geni hub. Infine, è stata condotta un'analisi ex vivo dei due geni hub SUCNR1 e GPR37L1 . Abbreviazioni: DEGs = geni espressi differenzialmente; mRNA = RNA messaggero; PBMC = cellule mononucleari del sangue periferico; qRT-PCR = reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale; PPI = interazione proteina-proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Selezione dei DEG e analisi gerarchica del clustering. (A) Grafico del vulcano dei DEG. L'asse orizzontale rappresenta log₂ (cambiamento di piegatura), e l'asse verticale rappresenta –log₁₀(valore P). I punti verdi e rossi rappresentano geni espressi differenzialmente, mentre i punti neri rappresentano geni non espressi differenzialmente. (B) Numero di DEG al ribasso e al rialzo. (C) Mappa termica dei geni espressi differenzialmente. Il rosso indica la regolazione al rialzo e il verde indica la regolamentazione al ribasso. Abbreviazione: DEGs = geni espressi differenzialmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi di arricchimento GO e KEGG dei DEG. (A,B) l'arricchimento GO e (C) l'arricchimento KEGG sono mostrati in base ai valori grezzi P. Abbreviazioni: DEGs = geni espressi differenzialmente; GO = Ontologia Genica; KEGG = Enciclopedia di Kyoto dei Geni e dei Genomi; BP = processo biologico; CC = componente cellulare; MF = funzione molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Validazione dei dati dei microarray per i primi dieci geni disregolati utilizzando qRT-PCR. (A) Riduzione dei primi cinque DEG. (B) Regolare al rialzo i primi cinque DEG. I dati sono la media ± errore standard della media. I valori p sono mostrati nei pannelli corrispondenti. Abbreviazioni: DEGs = geni espressi differenzialmente; qRT-PCR = reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Espressione di SUCNR1 e GPR37L1 nei pazienti schizofrenici e nei controlli sani. (A) SUCNR1 e (B) GPR37L1 espressione determinata da qRT-PCR. Correlazione tra memoria verbale e (C) SUCNR1 e (D) GPR37L1 espressione. I dati sono mostrati come media ± errore standard della media, dove applicabile. I valori p per le correlazioni sono mostrati nei pannelli corrispondenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi della rete di interazione proteina-proteina. (A) Rete PPI analizzata utilizzando un database di interazioni proteina-proteina. (B) Proteine classificate per grado di associazione nella rete PPI. (C) Sottorete visualizzata utilizzando software di visualizzazione della rete dopo l'analisi di estrazione della sottorete. Abbreviazione: PPI = interazione proteina-proteina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Variabile	Soggetti di controllo (n = 10)	Pazienti con schizofrenia (n = 10)
Età (anno)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Sesso femminile, n (%)	5 (50)	5 (50)
Tempo di sonno giornaliero (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Indice di massa corporea (BMI; kg/m²)	25,2 ± 4,1	22,9 ± 2,3
Punteggio della memoria verbale	61 ± 18	30.2 ± 10.8
I dati sono presentati come media ± deviazione standard o numero (%).

Tabella 1: Caratteristiche di base dei pazienti schizofrenici e dei soggetti di controllo.

Simbolo genico	Sequenza di innesco frontale (5'→3')	Sequenza di innesco inverso (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGTTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTGTGTGTGGGG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAAGTCAG
β-Actin	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa.

Tabella 2: Primer PCR per qRT-PCR.

GO ID	Termine	Valore p grezzo	Conte
VAI:0015267	Attività del canale	0.000000056	13
VAI:0022803	Attività passiva del trasportatore transmembrana	5.78E-08	13
VAI:0005216	Attività dei canali ionici	0.000000127	12
VAI:0022839	Attività dei canali a chiaro ionico	0.000000131	11
VAI:0022836	Attività a canale recitato	0.000000136	11
VAI:0022838	Attività del canale specifico del substrato	0.00000017	12
VAI:0005261	Attività dei canali cationici	0.00000668	9
VAI:0015276	Attività dei canali ionici dipendenti da ligando	0.000315	5
VAI:0022834	Attività dei canali a vincolo dei ligandi	0.000315	20
VAI:0022890	Attività del trasportatore transmembrana di cationi inorganici	0.000487	20
VAI:0008324	Attività del trasportatore transmembrana cationico	0.0009	18
VAI:0099094	Attività dei canali cationici a catena di ligando	0.00128	16
VAI:0005244	Attività dei canali ionici dipendenti dalla tensione	0.001382	16
VAI:0022832	Attività del canale dipendente dalla tensione	0.001382	18
VAI:0046873	Attività del trasportatore transmembrana di ioni metallici	0.001836	21
VAI:0022824	Attività dei canali ionici a trasmissione	0.002762	19
VAI:0022835	Attività dei canali con accesso al trasmettitore	0.002762	13
Nota: i valori P sono grezzi e non aggiustati; la significanza è stata definita come P grezzo < 0,05.

Tabella 3: Analisi ontologica genica dei geni espressi differenzialmente (grezzo P < 0,05).

ID	Descrizione	Valore p grezzo	Conte
HSA04911	Secrezione di insulina	0.007066	6
HSA04024	Percorso di segnalazione cAMP	0.010661	10
HSA03420	Riparazione tramite escissione di nucleotidi	0.013724	4
HSA04668	Percorso di segnalazione TNF	0.023694	6
HSA00480	Metabolismo del glutatione	0.02466	4
HSA04740	Trasduzione olfattiva	0.032104	15
HSA05222	Cancro ai polmoni a piccole cellule	0.03572	5
HSA00590	Metabolismo dell'acido arachidonico	0.035991	4
HSA04080	Interazione neuroattiva ligando-recettore	0.037546	12
HSA05031	Dipendenza da anfetamine	0.045653	4
HSA05203	Carcinogenesi virale	0.046404	8
HSA04933	Via di segnalazione AGE-RAGE nelle complicazioni diabetiche	0.04831	5
Nota: i valori P sono grezzi e non aggiustati; la significanza è stata definita come P grezzo < 0,05.

Tabella 4: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes per l'arricchimento dei geni (raw P < 0,05).

Simbolo genico	Nome completo ufficiale	logFC	Valore p grezzo
Ridimensionato
HCN3	Canale ciclico dipendente da nucleotidi attivati da iperpolarizzazione	-1.489	0.0001
OLFML2A	Proteina simile all'olfactomedina 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH ossidasi 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Membro del recettore accoppiato a proteina G correlata a MAS X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Proteina J del gruppo anemia di Fanconi	-1.699	0.0018
Sovraregolamentazione
CCL22	Chemochina C-C motivata 22	2.517	0.0041
PNMA2	Antigeni Ma paraneoplastici	2.159	0.0062
TBX20	Fattore di trascrizione T-box TBX20	1.866	0.0001
ERAS	Era GTPase	1.846	0.0008
C12orf68	Dominio a bobina avvolata contenente 184	1.839	0.0002
Nota: logFC e i valori P grezzi provengono dall'analisi di espressione differenziale dei microarray.

Tabella 5: I dieci DEG principali classificati per variazione di pieghe nei geni al rialzo e al ribasso.

Simbolo genico	Descrizione	Cogeni (n)	Valore P
RTP5	Proteina trasportatrice del recettore 5	14	0.000276
CXCL1	Alfa proteina regolata dalla crescita 1	8	0.011423
CXCL10	Chemoquina motivata C-X-C 10	7	0.046144
GPR37L1	Recettore della prosaposina GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Recettore dell'acido idrossicarbossilico 1	7	0.046572
OPRL1	Recettore della nociceptina 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Recettore della somatostatina tipo 4	7	0.006742
SUCNR1	Recettore succinato 1	7	0.000105
Bancomat	Serina-proteina chinasi ATM	5	0.004961
PPI: interazione proteina-proteina; DEG: geni espressi differenzialmente.

Tabella 6: I 10 geni hub principali identificati nella rete PPI per i DEG.

Tabella supplementare 1: Valori grezzi qRT-PCR Ct, flusso di lavoro completo di analisi bioinformatica e risultati processati (DEG, GO/KEGG e PPI) per lo studio Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La schizofrenia è un disturbo grave e multifattoriale che coinvolge numerosi fattori di suscettibilità^{genetica 13,14}. Sebbene siano stati fatti progressi nella comprensione della sua fisiopatologia, mancano ancora biomarcatori diagnostici affidabili. In questo studio, un approccio bioinformatico integrato ha identificato 473 DEG in campioni di sangue di pazienti con schizofrenia. Le analisi GO e KEGG hanno evidenziato l'arricchimento in termini e vie legate all'attività dei canali, inclusi la secrezione di insulina, la segnalazione cAMP, la riparazione da escissione di nucleotidi, la segnalazione del TNF e il metabolismo del glutatione. L'analisi della rete PPI ha inoltre identificato SUCNR1 e GPR37L1 come geni hub, e la loro espressione è stata associata alle prestazioni della memoria verbale, suggerendo la loro potenziale rilevanza come marcatori molecolari associati alla schizofrenia.

L'arricchimento dei termini GO per "attività canale" è in linea con le ricerche precedenti sulla schizofrenia. I canali di calcio voltaggio-dipendenti (ad esempio, CACNA1C, CACNB2) e i canali di potassio (ad esempio, Kv3, Kv2.1) sono stati implicati nella suscettibilità alla schizofrenia e nell'eccitabilità neuronale 15,16. Analogamente, i principali percorsi KEGG identificati sono coerenti con la letteratura esistente. Iperinsulinemia e anomalie della secrezione di insulina sono riportate nella schizofrenia^{precoce 17}. La via di segnalazione del cAMP è sempre più collegata alla fisiopatologia^{della malattia 18}. I meccanismi di riparazione per escissione dei nucleotidi, inclusa la modifica della variante itonica H2AX, possono anch'essi avere un ruolo 19,20,21,22^. Inoltre, la segnalazione del TNF e il metabolismo del glutatione sono stati associati alla patogenesi della^{schizofrenia 23,24}.

Il deficit della memoria verbale è un deficit cognitivo fondamentale nella schizofrenia, è presente all'insorgenza della malattia ed è associato a risultati funzionali. Il Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) è una misura ben validata dell'apprendimento verbale e della memoria. Valutare la correlazione tra espressione dei marcatori candidati e performance della memoria verbale aiuta a stabilire la rilevanza clinica, poiché il deficit cognitivo è un determinante importante della disabilità nella schizofrenia.

Sebbene i primi dieci DEG validati da qRT-PCR abbiano corrispondente ai dati dei microarray, non si allineavano strettamente con i risultati primari di GO/KEGG. Al contrario, SUCNR1 (alzato) e GPR37L1 (ridimensionato) erano significativamente associati all'"attività dei canali ionici" e arricchiti da "secrezione di insulina". Entrambi i geni codificano per recettori accoppiati con proteine G (GPCR), che sono bersagli critici degli antipsicotici e modulano l'attività dei canali^{ionici 25}.

SUCNR1 (GPR91) collega lo stress metabolico alla secrezione e resistenza dell'insulina ^26,27, e la resistenza all'insulina è un fattore di rischio noto per la schizofrenia²⁸. GPR37L1, un recettore orfano fortemente espresso nel cervello, è coinvolto nello sviluppo cerebrale e nella funzione^{motoria 29}, ed è stato implicato nel morbo di Parkinson³⁰ e nel trasporto renale di^{sodio 31}. Il suo ruolo nella schizofrenia può riguardare la modulazione dell'attività dei canali ionici.

Il deficit della memoria verbale è una caratteristica centrale della schizofrenia, riflettendo la responsabilità genetica e la gravità della^{malattia 32,33.} La correlazione inversa tra l'espressione di SUCNR1 e la correlazione positiva tra l'espressione GPR37L1 e i punteggi della memoria verbale supportano ulteriormente la loro potenziale rilevanza nella schizofrenia.

Devono essere riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, la dimensione del campione per la coorte di validazione (n = 10 per gruppo) era piccola, il che limita la potenza statistica e la generalizzabilità. In secondo luogo, tutti i pazienti con schizofrenia ricevevano farmaci antipsicotici, quindi i cambiamenti osservati nell'espressione potrebbero riflettere effetti del farmaco piuttosto che patologie della malattia. Gli studi futuri dovrebbero includere pazienti con il primo episodio innosu rispetto ai farmaci. In terzo luogo, la coorte di validazione mancava della conferma RNA-seq; Il sequenziamento a livello di trascricroma in coorti indipendenti più grandi è giustificato. In quarto luogo, il disegno trasversale esclude la valutazione delle relazioni causali tra i livelli di biomarcatori e la progressione della malattia. Quinto, le analisi di correlazione con la memoria verbale sono state esplorative e richiedono replicazione. In sesto punto, il dataset GSE54913 è stato generato su una piattaforma microarray che ha una sensibilità inferiore rispetto a RNA-seq. Le direzioni future includono studi longitudinali per monitorare i livelli di SUCNR1 e GPR37L1 durante la malattia e il trattamento, studi funzionali per chiarire i ruoli meccanicistici di questi GPCR nella fisiopatologia della schizofrenia e lo sviluppo di un test clinicamente validato per questi biomarcatori.

In sintesi, questa analisi integrata suggerisce che l'alterazione dell'espressione di SUCNR1 e GPR37L1 è associata alla schizofrenia e alla performance della memoria verbale. Questi geni potrebbero rappresentare marcatori molecolari candidati associati alla schizofrenia. Tuttavia, le limitazioni includono un campione relativamente piccolo e una valutazione parziale della gravità della schizofrenia tramite la memoria verbale. Ulteriori studi sono necessari per convalidare questi risultati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction