Bioinformatica e analisi quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi di SUCNR1 e GPR37L1 nella schizofrenia

Sommario

Questo studio valuta SUCNR1 e GPR37L1 come marcatori molecolari candidati associati alla schizofrenia attraverso l'analisi bioinformatica integrata del dataset GSE54913, la validazione quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) e l'analisi di correlazione con la memoria verbale in una coorte indipendente.

Abstract

La schizofrenia è un disturbo mentale grave, complesso e multifattoriale che coinvolge numerosi elementi di suscettibilità genetica, portando a una disabilità significativa, morbilità e mortalità. Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della sua fisiopatologia ed eziologia, i biomarcatori diagnostici specifici per la schizofrenia restano sfuggenti. Questo studio mirava a identificare i marcatori molecolari candidati associati alla schizofrenia. Un'analisi integrata di bioinformatica è stata effettuata sul dataset pubblico di microarray GSE54913. Le analisi delle vie della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) hanno rivelato che i termini GO più significativamente arricchiti erano correlati all'attività dei canali, inclusa l'attività passiva del trasportatore transmembrana, l'attività dei canali ionici, l'attività dei canali a gate e l'attività dei canali specifici del substrato. Le cinque principali vie di KEGG arricchite erano secrezione di insulina, via di segnalazione cAMP, riparazione dell'escissione di nucleotidi, via di segnalazione TNF e metabolismo del glutatione. La validazione è stata effettuata utilizzando reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) su un set di campioni indipendenti dell'Ospedale Rongjun Youfu di Wuhan. I risultati qRT-PCR sono stati in gran parte coerenti con l'analisi microarray (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). L'analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI) ha identificato due geni hub, SUCNR1 e GPR37L1, che erano significativamente associati al termine GO 'attività dei canali ionici' e arricchiti nella via KEGG 'secrezione di insulina'. Inoltre, l'espressione di SUCNR1 ha mostrato una correlazione negativa con i punteggi di memoria verbale (r = -0,54, P = 0,015), mentre GPR37L1 espressione ha mostrato una correlazione positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Questi risultati suggeriscono che l'alterazione dell'espressione di SUCNR1 e GPR37L1 potrebbe essere associata alla schizofrenia e rappresentare marcatori molecolari candidati per ulteriori indagini.

Introduzione

La schizofrenia è un disturbo mentale cronico e complesso di eziologia non identificata, caratterizzato da gravi disfunzioni cerebrali, compromissione cognitiva e deficit^{psicosociali.} Rappresenta un grave onere sanitario globale, che colpisce oltre 21 milioni di persone^{in tutto il mondo 2}. Sebbene gli approcci diagnostici e terapeutici si siano evoluti notevolmente negli ultimi cinquant'anni, la patogenesi centrale rimane poco chiara e gli esiti a lungo termine associati a disabilità sostanziali, morbilità e mortalità non sono migliorati in modo significativo³. Pertanto, è fondamentale identificare potenziali geni chiave e obiettivi regolatori.

La fisiopatologia della schizofrenia, pur non essendo completamente chiara, è ampiamente attribuita a polimorfismi genetici e variazioni di^espressione. Ad esempio, la variazione genetica nel gene alfa degli estrogeni può influenzare la suscettibilità alla schizofrenia attraverso una regolazione genica alternativa e l'elaborazione dei trascriverti⁵. Analogamente, una variante promotrice funzionale di NRG1 è stata collegata alla schizofrenia e correlata a una riduzione dell'espressione dell'isoforma^{NRG1 di tipo III 6}. Studi post-mortem hanno mostrato un'espressione significativamente ridotta delle isoforme di PDE4B nei cervelli schizofrenici, suggerendo il suo potenziale^{predittivo 7}. Altri candidati includono il trasportatore di dopamina (DAT), il trasportatore vesicolare di monoamine (VMAT2) e la monoaminossidasi (MAO), che regolano i livelli sinaptici di dopamina e possono fungere da^{biomarcatori 8}. Inoltre, TCP1 può contribuire a deficit del citoscheletro tramite un ripiegamento improprio dell'actin nella^{schizofrenia 9}. Pertanto, chiarire i profili di espressione genica nella patogenesi della schizofrenia potrebbe fornire informazioni sulla previsione del rischio, la comprensione meccanicistica e la valutazione terapeutica.

Approcci computazionali recenti hanno fatto avanzare l'identificazione dei geni associati a malattie attraverso l'analisi integrata delle reti e metodi di apprendimento^automatico 10,11,12. Nonostante numerosi studi genetici, non sono stati tradotti nella pratica clinica per la schizofrenia biomarcatori diagnostici basati sul sangue affidabili. Per colmare questa lacuna, il presente studio ha utilizzato un approccio bioinformatico integrato per rianalizzare il dataset GSE54913, che contiene dati trascritomici ematici provenienti da pazienti ben caratterizzati con schizofrenia e controlli sani. Il dataset è stato selezionato perché (1) i campioni di sangue periferico sono minimamente invasivi e clinicamente pratici, (2) include un campione relativamente ampio tra i dataset di microarray sulla schizofrenia disponibili pubblicamente, e (3) i dati grezzi erano disponibili per la rianalisi. Gli obiettivi di questo studio erano: (1) identificare geni differenzialmente espressi nei pazienti schizofrenici rispetto ai controlli sani utilizzando il dataset GSE54913; (2) eseguire analisi di arricchimento funzionale e reti PPI per identificare i geni hub; (3) convalidare l'espressione di geni candidati tramite qRT-PCR in una coorte indipendente; e (4) esplorare la correlazione tra l'espressione genica hub e la performance della memoria verbale. A conoscenza degli autori, questo è il primo studio a identificare SUCNR1 e GPR37L1 come marcatori molecolari ematici candidati per la schizofrenia.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Rongjun Youfu di Wuhan (codice di identificazione del progetto, YF-IRB202310215) e condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti erano residenti della comunità cinese e hanno fornito un consenso scritto e informato.

Soggetti dello studio e prelievo di sangue
Dieci adulti diagnosticati con schizofrenia e dieci volontari sani di controllo senza storia familiare di malattie mentali entro tre generazioni sono stati arruolati. Criteri di inclusione per i pazienti con schizofrenia: (1) diagnosi di schizofrenia secondo i criteri DSM-5 confermata da due psichiatri senior indipendenti; (2) età 18–65 anni; (3) nessun cambiamento del farmaco antipsicotico per almeno 4 settimane prima del prelievo di sangue; (4) disponibilità a fornire un consenso informato scritto. Criteri di esclusione: (1) malattie mediche gravi comorbide (ad esempio, diabete, malattie cardiovascolari, cancro); (2) abuso o dipendenza da sostanze negli ultimi 6 mesi; (3) disabilità intellettiva; (4) gravidanza o allattamento. Criteri di inclusione per i controlli sani: (1) nessuna storia personale o familiare (entro tre generazioni) di alcuna malattia mentale; (2) nessun uso attuale o passato di farmaci antipsicotici; (3) abbinata per età e sesso al gruppo schizofrenico; (4) nessuna grave malattia medica. La durata media della malattia per i pazienti schizofrenici è stata di 12,5 ± 6,8 anni; Tutti i pazienti assumevano antipsicotici stabili (6 con risperidone, 4 con olanzapina); il punteggio totale medio PANSS era 76,4 ± 12,3. I controlli sono stati abbinati per età (±5 anni) e sesso (5 maschi, 5 femmine per gruppo). La memoria verbale è stata valutata utilizzando il punteggio totale di richiamo nel Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Tutti i soggetti sono stati reclutati dall'Ospedale Wuhan Rongjun Youfu tra il 1° gennaio e il 31 luglio 2025. Le date demografiche di base sono riassunte nella Tabella 1.

La dimensione del campione è stata determinata utilizzando software di calcolo della dimensione del campione per un test t indipendente a due code con una dimensione d'effetto di 1,2, α = 0,05 e potenza (1-β) = 0,80, ottenendo almeno nove soggetti per gruppo.

Il sangue venoso veniva prelevato in tubi anticoagulati con EDTA e processato senza ritardo. Le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) sono state quindi separate dai campioni tramite centrifugazione a gradiente di densità utilizzando un mezzo a gradiente di densità. Per un breve periodo, il sangue veniva diluito 1:1 con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4), stratizzato sul mezzo a gradiente di densità e centrifugato a 400 × g per 30 minuti a 20 °C con il freno staccato. Dopo la centrifugazione, l'interfaccia contenente PBMC veniva accuratamente trasferita in un nuovo tubo. Le celle sono state risciacquate due volte con PBS, con ogni lavaggio seguito da centrifugazione a 300 × g per 10 minuti a 4 °C, e l'ultimo pellet è stato sospeso nel PBS. La vitalità è stata valutata utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano e sono state utilizzate solo preparazioni con cellule vitali al ≥95%. I PBMC isolati sono stati aliquotati e conservati a −80 °C per un massimo di 3 mesi prima dell'estrazione dell'RNA.

Dati di microarray
Il flusso di lavoro dello studio è mostrato nella Figura 1. Il dataset di microarray GSE54913 è stato scaricato dal database GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Questo dataset è stato selezionato perché (1) contiene dati trascrittomici provenienti da campioni di sangue periferico, che sono minimamente invasivi e clinicamente pratici per la scoperta di biomarcatori; (2) include un campione relativamente ampio tra i dataset di microarray sulla schizofrenia disponibili pubblicamente (18 pazienti, 12 controlli); (3) i dati grezzi erano disponibili per la rianalisi. Secondo il registro GEO, i campioni sono stati estratti da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), non dal plasma. La descrizione originale 'campioni di plasma' nella versione precedente era un errore ed è stata corretta.

Preprocessing dei dati e screening genico differenzialmente espresso (DEG)
Dati grezzi (. file CEL) venivano preprocessati utilizzando software di pre-elaborazione di microarray. La correzione di background è stata eseguita utilizzando il metodo Robust Multichip Average (RMA), seguita dalla normalizzazione quantile e dalla trasformazione log2. I sonde senza alcuna annotazione genetica venivano filtrati. Le sonde con valori mancanti del >20% tra i campioni sono state escluse; I valori mancanti per le sonde rimanenti sono stati imputati utilizzando l'algoritmo k-vicini più prossimi (k = 10) implementato nel software di imputazione dei valori mancanti. Gli effetti batch non erano presenti poiché tutti i campioni venivano processati in un unico lotto secondo il registro GEO. Dopo la pre-elaborazione, sono stati ottenuti valori di espressione per 17.200 geni per l'analisi a valle. Le DEG tra pazienti schizofrenici e controlli sani sono state identificate tramite software di analisi differenziale dell'espressione. I geni con tasso di falsa scoperta (FDR) < 0,05, cambiamento assoluto di piega (FC) > 1,2 e P < 0,05 sono stati considerati espressi differenzialmente. È stata scelta una soglia di FC relativamente bassa (FC assoluta > 1,2) perché la schizofrenia è un disturbo psichiatrico complesso in cui le differenze nell'espressione genica individuale sono spesso sottili piuttosto che drammatiche.

Analisi GO e arricchimento dei percorsi
Analisi di arricchimento funzionale per i termini Gene Ontology (GO) e i percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state effettuate utilizzando software di analisi dell'arricchimento funzionale. Il set genico di fondo comprendeva tutti i geni che avevano superato la pre-elaborazione (17.200 geni). Sono stati riportati termini di arricchimento e percorsi con valori P grezzi < 0,05. Poiché i valori P grezzi sono stati utilizzati per i risultati di arricchimento GO e KEGG, questi risultati devono essere interpretati come esplorativi.

Analisi della rete PPI e identificazione dei geni hub
Un database di interazione proteina-proteina è stato utilizzato per costruire una rete PPI, con un punteggio combinato di interazione > 0,9 fissato come soglia. La rete veniva visualizzata utilizzando software di visualizzazione della rete. I geni hub sono stati identificati tramite un plugin di identificazione genica hub con l'algoritmo Degree. I primi 10 nodi con i punteggi di laurea più alti sono stati selezionati come geni hub. La sottorete dei geni chiave dell'hub è stata estratta utilizzando un plugin di estrazione di sottorete con parametri predefiniti (cutoff di grado = 2, cutoff del punteggio node = 0,2, K-core = 2, profondità massima = 100).

Isolamento totale dell'RNA e qRT-PCR
β-Actin veniva utilizzata come gene di riferimento interno (gestione domestica). La stabilità dell'espressione di β-actina tra i campioni è stata confermata dall'assenza di differenze significative nei valori di Ct tra i gruppi schizofrenia e di controllo (P > 0,05). La quantificazione relativa è stata eseguita utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt . Tutte le reazioni venivano eseguite in triplice e il valore medio di Ct veniva utilizzato per il calcolo (vedi sequenze di innesco nella Tabella 2). I dieci migliori DEG (cinque più significativamente al rialzo e cinque più significativamente al ribasso per variazione di pieghe) sono stati selezionati per la validazione iniziale qRT-PCR per confermare l'affidabilità complessiva dei dati del microarray. Successivamente, SUCNR1 e GPR37L1 sono stati selezionati per una validazione focalizzata basandosi su tre criteri: (1) sono stati identificati come geni hub nell'analisi della rete PPI (grado ≥ 7); (2) erano significativamente associate al termine GO arricchito di alto livello 'attività dei canali ionici' e alla via KEGG 'secrezione di insulina'; (3) entrambi codificano i GPCR, che sono noti bersagli farmacologici nella schizofrenia.

Analisi statistica
La normalità è stata valutata con il test di Shapiro–Wilk. Le variabili che mostravano una distribuzione approssimativamente normale (P > 0,05) sono state analizzate utilizzando metodi parametrici, incluso il test t di Student per confronti a due gruppi e ANOVA unidirezionale per confronti che coinvolgono più di due gruppi. Quando l'assunzione di normalità non veniva soddisfatta, venivano utilizzati test Mann–Whitney U o Kruskal–Wallis, secondo il caso. Tutti i test statistici erano a doppia coda. Per confronti multipli (ad esempio, nei test post-hoc ANOVA), è stato applicato il metodo del tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg (FDR), con una soglia FDR di 0,05. Per le analisi di correlazione, non è stata applicata alcuna correzione a confronto multiplo, poiché sono state eseguite solo due correlazioni; i valori grezzi P sono riportati con cautela.

Risultati

Identificazione dei DEG e clustering gerarchico
L'analisi del dataset GSE54913 ha identificato 473 geni differenzialmente espressi (DEG), inclusi 357 geni alzati e 116 sottoregolati, tra pazienti con schizofrenia e controlli (Figura 2A,B). Il raggruppamento gerarchico di questi DEG ha distinto i campioni di schizofrenia dai controlli (Figura 2C).

Analisi de...

Discussione

La schizofrenia è un disturbo grave e multifattoriale che coinvolge numerosi fattori di suscettibilità^{genetica 13,14}. Sebbene siano stati fatti progressi nella comprensione della sua fisiopatologia, mancano ancora biomarcatori diagnostici affidabili. In questo studio, un approccio bioinformatico integrato ha identificato 473 DEG in campioni di sangue di pazienti con schizofrenia. Le analisi GO e KEGG hanno evidenziato l'arricchim...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction