Una procedura in vitro standardizzata per valutare i cambiamenti di microdurezza superficiale nei compositi di resina nanoibrida dopo l'esposizione a bevande proteiche di siero di latte

Summary

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato in vitro per valutare gli effetti delle bevande proteiche del siero sul microdurezza composta da resina. L'approccio consente una valutazione controllata dell'esposizione dietetica tramite immersione ciclica e test Vickers, fornendo un modello riproducibile per indagare l'interazione tra bevande nutritive e biomateriali restaurativi.

Abstract

L'obiettivo di questo studio in vitro era valutare l'effetto di diverse bevande proteiche del siero sul microdurezza superficiale di tre compositi nanoibridi in resina. Un totale di 90 campioni a forma di disco sono stati preparati da tre compositi nanoibridi di resina (n = 30 per materiale) e suddivisi in tre gruppi (n = 10) secondo il mezzo d'immersione: concentrato di siero di latte, isolato di siero e acqua distillata. Gli esemplari sono stati immersi per 10 minuti, due volte al giorno, per 30 giorni. La microdurezza superficiale è stata misurata alla base e dopo l'immersione utilizzando un tester di microdurezza Vickers, e la variazione di durezza è stata calcolata come ΔVHN. I dati sono stati analizzati utilizzando misure ripetute bidirezionali, ANOVA e test post-hoc. L'analisi ha rivelato che il tipo composito, la soluzione a immersione e la loro interazione hanno avuto effetti statisticamente significativi sui valori di ΔVHN (p < 0,0001). La maggiore perdita di durezza è stata osservata nel composito iniettabile esposto al concentrato di siero (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), mentre la variazione più bassa è stata registrata nel composito altamente pieno conservato in acqua distillata (ΔVHN: 0,9 ± 0,4). L'immersione nel concentrato di siero di latte ha comportato una perdita di durezza significativamente maggiore in tutti i compositi rispetto all'acqua distillata (p < 0,05). L'isolato di siero ha inoltre prodotto una perdita di durezza significativamente maggiore in tutti i compositi tranne quello altamente riempito, in cui non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa (p = 0,076). Questi risultati indicano che le bevande proteiche del siero di latte possono ridurre la microdurezza superficiale dei compositi in resina, con l'entità della degradazione che dipende sia dalla composizione del materiale sia dalla formulazione della bevanda.

Introduction

Il successo a lungo termine dei restauri in resina composita dipende dalla loro resistenza a complesse sfide ambientali orali, tra cui il carico meccanico, l'esposizione dietetica e la degradazione^{chimica 1,2}. I compositi a resina nanoibrida sono ampiamente utilizzati grazie alle loro favorevoli proprietà estetiche e meccaniche, in particolare la microdurezza superficiale, che rappresenta un importante indicatore della resistenza all'usura e del deterioramento^{strutturale 3,4}.

Indagini precedenti hanno dimostrato che l'esposizione a bevande acide come succhi di frutta, bevande gassate ed energie energetiche può influire negativamente sui restauri composti riducendo la microdurezza superficiale e alterando l'integrità^superficiale 5,6,7,8. Questi effetti degradanti sono influenzati da molteplici fattori, tra cui pH, tempo di esposizione e composizione filler–matrice. Tuttavia, la maggior parte dei modelli sperimentali esistenti si basa su soluzioni altamente acide, che potrebbero non riflettere accuratamente le sfide chimiche riscontrate nelle abitudini alimentari contemporanee.

Al contrario, le bevande proteiche del siero di latte hanno guadagnato ampia popolarità grazie al loro valore nutrizionale e al crescente consumo tra le persone orientate al fitness ^9,10. Nonostante il loro pH quasi neutro, queste bevande contengono lattosio, proteine e altri componenti organici che possono interagire con la matrice della resina e influenzare la stabilità del materiale. Pertanto, valutare i loro effetti richiede un protocollo che consideri non solo l'acidità, ma anche la composizione organica e i modelli di esposizione ripetuti.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un metodo in vitro standardizzato e riproducibile per valutare gli effetti delle bevande proteiche del siero di latte, in particolare formulazioni concentrate e isolate, sulla microdurezza superficiale dei compositi a resina nanoibrida. Questo metodo consente una simulazione controllata dell'esposizione dietetica giornaliera tramite immersione ciclica, migliorando così la rilevanza sperimentale delle condizioni di test in vitro .

Rispetto ai modelli convenzionali di esposizione a bevande acide, questo protocollo offre diversi vantaggi. Innanzitutto, consente di indagare la degradazione del materiale in condizioni di pH quasi neutro, permettendo la valutazione delle risposte del materiale oltre gli effetti acidi. In secondo luogo, il design a immersione ciclica riflette meglio i modelli di consumo reali. In terzo luogo, il metodo facilita la valutazione comparativa di diverse formulazioni composite basate su caratteristiche strutturali come il contenuto di riempimento e la composizione della matrice della resina.

Questo protocollo è particolarmente adatto ai ricercatori che mirano a valutare la stabilità chimica dei materiali restauratori in condizioni nutrizionalmente rilevanti, così come per studi che indagano l'interazione tra componenti alimentari e biomateriali dentali. Può anche essere adattato per testare formulazioni alternative di bevande, trattamenti superficiali o materiali compositi di nuova evoluzione.

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del campione

1. Preparare un totale di 90 campioni a forma di disco da tre compositi nanoibridi in resina (n = 30 per materiale).
2. Fabbricare i campioni utilizzando stampi cilindrici in silicone trasparente (6 mm di diametro × 2 mm di spessore) per garantire dimensioni standardizzate.
3. Inserire il materiale composito negli stampi in un unico incremento (spessore 2 mm) e coprire la superficie con un vetrino trasparente per ottenere una superficie piana.
4. Polimerizzare il campione utilizzando un'unità di polimerizzazione della luce LED blu (≈spettro di emissione 440–480 nm) posizionata a circa 1 mm dalla superficie con un'intensità di uscita di 1000 mW/^cm2 per 20 secondi.
5. Verifica l'intensità luminosa di polimerizzazione utilizzando un radiometro prima di ogni ciclo di polimerizzazione per garantire un'esposizione costante alla luce.
6. Conservare i campioni preparati in acqua distillata a 37 °C per 24 ore per consentire la post-polimerizzazione e simulare le condizioni orali iniziali.
   NOTA: I campioni possono essere conservati in acqua distillata a 37 °C per un massimo di 24 ore prima di ulteriori lavorazioni.

2. Procedura di finitura e lucidatura

1. Rifinitura e lucida le superfici superiori di tutti i campioni utilizzando dischi di lucidatura impregnati di ossido di alluminio. Tutte le procedure di lucidatura dovrebbero essere eseguite da un singolo operatore per garantire la standardizzazione della superficie.
2. Applicare la lucidatura in modo sequenziale usando dischi medi, fini e superfini per 10 secondi ciascuno sotto raffreddamento ad acqua a circa 10.000 giri/min con una pressione leggera e un movimento rotazionale unidirezionale.
3. Sostituire i dischi di lucidatura ogni cinque campioni per mantenere un'efficienza abrasiva costante e garantire la standardizzazione superficiale.
4. Dopo ogni fase di lucidatura, risciacqua i campioni con acqua distillata per 10 secondi per rimuovere i detriti e asciuga delicatamente all'aria per 5 secondi prima di passare al disco successivo.
5. Segna la superficie non lucidata di ogni campione con un codice di identificazione unico per garantire un'orientazione coerente durante i test successivi.
6. Conservare i campioni in acqua distillata a 37 °C per 24 ore prima del test di microdurezza di base.
   NOTA: I campioni possono essere conservati in acqua distillata a 37 °C per un massimo di 24 ore prima dei test di base.

3. Misurazione di microdurezza di base

1. Esegui il test di microdurezza Vickers (VHN) di base seguendo i protocolli precedentemente pubblicati utilizzando un tester di microdurezza^{Vickers 11}.
2. Applica un carico di 200 g per un tempo di permanenza di 15 s.
3. Fai tre rientranze per campione con almeno 1 mm di spazio. Esegui delle rientranze sulla superficie centrale di ogni campione per evitare effetti di bordo.
4. Calcola la VHN di base media.
5. Eseguire misurazioni con un singolo operatore calibrato per minimizzare la variabilità.
   NOTA: Gli esemplari possono essere conservati in acqua distillata a 37 °C per un massimo di 24 ore prima dell'immersione.

4. Preparazione dei mezzi a immersione

1. Prepara due formulazioni di proteine del siero di latte: concentrato di proteine del siero del siero (WC) e isolato di proteine del siero del siero (WI) utilizzando polveri disponibili commercialmente.
2. Sciogliere 25 g di polvere di proteine del siero in 200 mL di acqua distillata (0,125 g/mL) per preparare le soluzioni immersioni.
3. Mescola le soluzioni con uno shaker da laboratorio per 60 secondi fino a raggiungere la dissoluzione completa.
4. Lasciare che le soluzioni si equilibrino a temperatura ambiente per 5 minuti per minimizzare la formazione di schiuma e garantire l'omogeneità.
5. Misura e registra il pH di ogni soluzione utilizzando un misuratore digitale calibrato prima dell'immersione.
6. Prepara soluzioni fresche di siero prima di ogni ciclo di immersione per garantire una composizione chimica uniforme ed evitare la degradazione delle proteine.
7. Utilizzare 10 mL di soluzione per immersione per ogni campione per garantire un'immersione completa durante ogni ciclo.

5. Procedura di immersione

1. Dividere ogni gruppo composito in tre sottogruppi (n = 10).
2. Immergi i campioni nelle soluzioni assegnate per 10 minuti, due volte al giorno. Seleziona la durata e la frequenza dell'immersione basandosi su modelli di esposizione a bevande in vitro già stabiliti, progettati per simulare i modelli di consumo giornalieri^{ripetuti 7}.
3. Dopo ogni ciclo di immersione, risciacquare i campioni con acqua distillata e metterli nella saliva artificiale per 10 minuti per simulare l'esposizione a breve termine alle salivari.
4. Conservare i campioni in acqua distillata tra un ciclo di immersione e l'altro a 37 °C fino al ciclo di esposizione successivo.
5. Applica questa procedura solo ai gruppi esposti al siero di latte. Mantenere il gruppo di controllo continuamente in acqua distillata (DW) a 37 °C per tutto il periodo sperimentale.
   NOTA: Il protocollo di immersione può essere messo in pausa tra un ciclo e l'altro e ripreso il giorno successivo senza compromettere la coerenza sperimentale.
6. Continua il protocollo di immersione per 30 giorni.

6. Misurazione della microdurezza post-immersione

1. Sciacquare i campioni con acqua distillata e asciugare delicatamente.
2. Esegui il test di microdurezza Vickers utilizzando gli stessi parametri (200 g, 15 s).
3. Registra tre rientranze e calcola la media del VHN post-immersione.
4. Determinare ΔVHN per ogni esemplare.

7. Analisi statistica

1. Analizza i valori di microdurezza di Vickers utilizzando un modello ANOVA a misura ripetuta, con il punto temporale (base e post-immersione) come fattore all'interno del soggetto e il tipo composito e la soluzione di immersione come fattori tra i soggetti.
2. Quando opportuno, calcolare i valori di ΔVHN come misure descrittive per esprimere la grandezza della variazione di microdurezza per ciascun campione.
3. Effettua confronti post-hoc a coppie utilizzando il test della differenza onestamente significativa (HSD) di Tukey.
4. Calcola intervalli di confidenza del 95% per tutte le medie dei gruppi.
5. Riportare le dimensioni degli effetti utilizzando il parziale eta-quadrato (η²p) per i risultati ANOVA.
6. Confronta i valori di pH tra soluzioni di proteine del siero usando il test t di Welch.
7. Imposta il livello di significatività statistica a p < 0,05.
8. Oltre ai valori assoluti di ΔVHN, calcola la percentuale di variazione della microdurezza usando la seguente formula: [(VHN di base − VHN post-immersione) / VHN di base] × 100.

Results

Statistica descrittiva

I valori medi di ΔVHN (±SD) delle combinazioni composite-soluzione sono presentati nella Tabella 1.

Resina composita	Soluzione	ΔVHN (Media ± SD)	IC al 95%	n

Discussion

L'attuale protocollo fornisce un approccio standardizzato per valutare l'impatto chimico delle bevande proteiche del siero di latte sulla microdurezza composta in resina. I passaggi critici includono la fabbricazione uniforme del campione, condizioni di indurimento alla luce controllate e parametri di test Vickers standardizzati. Mantenere dimensioni e intensità di indurimento costanti del campione è essenziale, poiché le variazioni possono influenzare il grado di conversione e la stabil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dischi lucidanti in ossido di alluminio	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turchia	5714	Medio, fine, superfine, usato per rifinitura e lucidatura
Bilancia analitica			Usato per pesare i materiali
Soluzione saliva artificiale	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turchia		Usato per la conservazione tra i cicli di immersione
pHmetro digitale	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	Misura del pH delle bevande
Acqua distillata	Non specificato	Non applicabile	Usato come soluzione di controllo e per la conservazione dei campioni
Vetrina per microscopio	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, Cina	7102	Usato per ottenere una superficie del campione piatta durante l'apposizione composita
Cilindro graduato	Non specificato	Non applicabile	Usato per misurare i volumi dei liquidi
Composito nano ibrido altamente riempito (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokyo, Giappone)	10942	Usato come materiale restaurativo; differisce nel contenuto di filler e nella composizione della matrice di resina
Incubatore	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germania	UN55	Usato per la conservazione a 37 °C
Composito nano ibrido iniettabile (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Tokyo, Giappone)	12365	Usato come materiale restaurativo; differisce nel contenuto di filler e nella composizione della matrice di resina
Becher da laboratorio	Non specificato	Non applicabile	Usato per la preparazione delle soluzioni di proteine del siero del latte
Agitatore da laboratorio	Non specificato	Non applicabile	Usato per la miscelazione e l'omogeneizzazione delle soluzioni
Unità di polimerizzazione a luce LED e radiometro	Unità di polimerizzazione LED Woodpecker (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, Cina)	FD-300	Polimerizzazione e  verifica dell'intensità della luce
Manopola per micromotore	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Giappone	C1056002	Usato nella procedura di lucidatura
Composito nano ibrido moderatamente riempito (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)	6570A2	Usato come materiale restaurativo; differisce nel contenuto di filler e nella composizione della matrice di resina
Stampo in silicone	Non specificato	Non applicabile	A forma di disco, diametro 6 mm × spessore 2 mm, usato per la fabbricazione dei campioni
Vickers microdurometri	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Giappone	HMV-G31	Test del numero di durezza Vickers (VHN)
Polvere di concentrato di proteine del siero del latte	Proteine del siero del latte al gusto di fragola, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turchia		Contenuto di lattosio: ~1–2%, contenuto di proteine: ~85–90%
Polvere di proteine isolate del siero del latte	Proteine isolate del siero del latte al gusto di cioccolato, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turchia		Contenuto di lattosio: ~4–6%, contenuto di proteine: ~70–80%