Articolo di ricerca

Caratterizzazione rappresentativa e mirata dei geni della virulenza nello Staphylococcus aureus a causa delle infezioni diabetiche al piede

DOI:

10.3791/71373

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29 maggio 2026

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1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

In questo articolo

Sommario

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Questo studio ha caratterizzato i meccanismi della resistenza antimicrobica, i determinanti della virulenza e le caratteristiche genomiche degli isolati di Staphylococcus aureus recuperati da infezioni diabetiche ai piedi, utilizzando test di suscettibilità antimicrobica, profilazione della virulenza basata su PCR e sequenziamento dell'intero genoma.

Abstract

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Le infezioni diabetiche al piede (DFI) rappresentano una grave preoccupazione per la salute pubblica, e lo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) è tra i patogeni clinicamente più significativi. Questo studio ha indagato la prevalenza dei geni della virulenza (can e hlg), i profili di resistenza agli antimicrobici e le caratteristiche genomiche rappresentative degli isolati di S. aureus multi-resistenti ai farmaci recuperati da pazienti con DFI. Uno studio osservazionale trasversale è stato condotto su 125 pazienti con infezioni diabetiche al piede tra gennaio e dicembre 2024. I test di suscettibilità agli antimicrobici sono stati eseguiti utilizzando il metodo di diffusione su disco di Kirby–Bauer e lo screening della cefoxitina secondo le linee guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), con S. aureus ATCC 25923 utilizzato come ceppo di controllo qualità. La suscettibilità alla vancomicina è stata confermata tramite test di concentrazione inibitoria minima (CMI). La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata utilizzata per rilevare i geni della virulenza (can e hlg) e i geni blaOXA-gruppo I. Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) è stato eseguito su due isolati rappresentativi, tra cui uno isolato multi-resistente (MDR) e uno isolato fortemente resistente ai farmaci (XDR), utilizzando un approccio de novo sequenziamento per generare assemblaggi genomici in draft. Tra 125 campioni clinici, è stata osservata una crescita batterica in 90 campioni (72%), di cui 45 isolati (50%) identificati come S. aureus. Tra questi isolati, 35/45 (77,78%) erano classificati come MRSA e 36/45 (80%) erano multi-resistenti ai farmaci. Il gene hlg è stato rilevato in tutti gli isolati, mentre il gene can è stato identificato in 13/45 (28,89%) isolati. Non sono stati rilevati geni blaOXA-gruppo I. L'analisi genomica ha identificato molteplici geni associati alla resistenza, tra cui blaZ, tet(38), norA e vanT, insieme a elementi CRISPR-Cas e determinanti della resistenza associati al plasmidi. Questi risultati evidenziano l'elevata prevalenza di S. aureus multi-resistente nei DFI e supportano l'importanza di una sorveglianza genomica continua dei ceppi resistenti clinicamente rilevanti.

Introduzione

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Numerose caratteristiche di colonizzazione e virulenza rendono il batterio gram-positivo Staphylococcus aureus (S. aureus) un patogeno opportunista diffuso capace di causare una vasta gamma di infezioni, tra cui impetigine, infezioni delle ferite, furunccoli, ascessi cutanei, batteriemia ed endocarditeinfettiva 1. Alcune di queste infezioni possono evolvere in malattia grave e richiedere ricovero, in particolare nei pazienti con diabete mellito, immunosoppressione, neoplasia, cateterismo urinario o infezione da virus daimmunodeficienza umana 1.

I ceppi di S. aureus (MRSA) resistenti alla meticillina sono associati a una morbilità e mortalità sostanziali grazie alla loro capacità di acquisire rapidamente determinanti della resistenza antimicrobica e persistono negli ambientisanitari 1. I pazienti con diabete mellito sviluppano frequentemente ulcere diabetiche al piede a causa di neuropatia, insufficienza vascolare e risposte immunitariecompromesse 2. Le infezioni diabetiche al piede (DFI) hanno una fisiopatologia complessa e gli esiti clinici sono influenzati sia da fattori microbici che associati all'ospite, inclusa la virulenzabatterica 3. Sebbene le ulcere al piede diabetico possano contenere comunità polimicrobiche composte da batteri e funghi aerobici e anaerobi, S. aureus rimane uno dei patogeni predominanti isolati da questeinfezioni. L'organismo possiede diversi determinanti della virulenza che facilitano l'evasione immunitaria, l'invasione dei tessuti, la colonizzazione cronica e l'infezione persistente. Inoltre, l'acquisizione di resistenza alla meticilina mediata da mecA/SCCmec e di altri determinanti della resistenza antimicrobica ha limitato notevolmente le opzioni terapeutiche per le infezioni associate aDFI 4,5. Studi precedenti hanno riportato un'elevata prevalenza di isolati di S. aureus multi-resistenti (MDR) nelle infezioni diabetiche del piede, con una resistenza frequentemente associata ai geni β-lattamalasi, inclusi blaTEM, blaOXA e varianti blaCTX-M 6.

Diversi geni associati alla virulenza contribuiscono alla patogenicità e alla persistenza di S. aureus nelle infezioni croniche delle ferite. Tra questi, il gene hlg codifica γ-emolisina, un fattore citotossico associato alla distruzione tissutale, all'infiammazione, all'evasione immunitaria e alla persistenza di ceppi di MRSA acquisiti nellacomunità 7,8. Il gene CAN codifica un'adesina che lega il collagene e facilita l'adesione batterica ai tessuti ricchi di collagene e contribuisce alla colonizzazione cronica e alla persistenza delleinfezioni 8. Indagini precedenti hanno identificato un'alta prevalenza di hlg tra gli isolati di MRSA guariti da infezioni diabetiche del piede, sottolineando la co-occorrenza di virulenza e determinanti della resistenza antimicrobica in questeinfezioni9. L'esposizione inappropriata agli antibiotici, il ricovero prolungato, la penetrazione tissutale compromessa degli agenti antimicrobici e la progressione cronica della ferita contribuiscono ulteriormente all'emergere e alla diffusione degli organismi MDR nei pazienti conDFIs 10. Secondo definizioni internazionali, i batteri multi-resistenti ai farmaci (MDR) mostrano resistenza ad almeno un agente antimicrobico in tre o più classi antimicrobiche, i batteri estesivamente resistenti ai farmaci (XDR) rimangono suscettibili a una o due classi antimicrobiche, e i batteri pandrug-resistenti (PDR) sono resistenti a tutte le classiantimicrobiche testate 10. Nonostante l'importanza clinica riconosciuta di S. aureus nelle infezioni del piede diabetico, rimane limitata la formazione integrata molecolare e genomica che colleghi i determinanti della virulenza ai profili di resistenza antimicrobica negli isolati clinici di questa regione.

Pertanto, questo studio mirava a caratterizzare i modelli di resistenza agli antimicrobici, determinare la prevalenza di geni selezionati della virulenza (hlg e can), indagare la presenza di geni BLAOXA-gruppo I ed eseguire un'analisi rappresentativa del sequenziamento dell'intero genoma di isolati selezionati di S. aureus multi-resistenti recuperati da pazienti con infectioni diabetiche al piede.

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Protocollo

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1. Studiare i pazienti

Questo studio è stato approvato dal Comitato di Approvazione Etica dell'Università di Anbar, Ministero dell'Istruzione Superiore e della Ricerca Scientifica, Iraq (Approvazione n. 145), Ramadi City, Governatorato di Anbar, Iraq, il 24 dicembre 2023. Tutte le procedure che hanno coinvolto partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida etiche istituzionali dell'Università di Anbar. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima dell'iscrizione.

Uno studio osservazionale trasversale è stato condotto da gennaio a dicembre 2024 presso gli ospedali universitari di Ramadi e le cliniche private affiliate nel Governatorato di Anbar, Iraq. Durante il periodo dello studio sono stati arruolati in totale 125 pazienti idonei consecutivi con infectioni diabetiche al piede (DFI). La dimensione del campione è stata determinata in base al numero di pazienti idonei disponibili durante il periodo dello studio, piuttosto che tramite calcoli statistici. Clinicamente, la DFI è stata definita come la presenza di un'ulcera al piede di qualsiasi grado in pazienti con diabete mellito di tipo 1 (T1DM) o diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Sono stati inclusi pazienti maschi e femmine con diverse gravità delle ulcere.

I pazienti erano idonei se avevano una diagnosi clinica di ulcera diabetica al piede, si presentavano nelle strutture sanitarie partecipanti e fornivano il consenso informato. I criteri di esclusione includevano ulcere al piede non correlate al diabete mellito (ad esempio, ulcere traumatiche), invio da altre strutture sanitarie, incapacità di fornire un consenso informato a causa di malattia critica, ricezione di terapia antibiotica entro 48 ore prima del prelievo del campione e infezioni polimicrobiche. I pazienti con infezioni polimicrobiche sono stati esclusi per garantire una caratterizzazione fenotipica, molecolare e genomica accurata degli isolati di Staphylococcus aureus . Sono stati raccolti dati demografici e clinici, inclusi età, sesso, complicazioni diabetiche, durata del diabete mellito, storia antibiotica e condizioni comorbide, utilizzando un questionario strutturato.

I campioni clinici venivano trasportati al laboratorio di microbiologia entro 2 ore dalla raccolta in condizioni di refrigerazione (4 °C) utilizzando tamponi sterili contenenti il mezzo Amies e processati immediatamente per l'analisi microbiologica. Tutte le procedure che hanno coinvolto campioni clinici, colture batteriche, test di suscettibilità agli antimicrobici, reazione a catena della polimerasi (PCR) e visualizzazione ultravioletta (UV) sono state condotte secondo condizioni di laboratorio di Biosafety Level 2 (BSL-2) secondo le linee guida istituzionali di biosicurezza. Il personale di laboratorio utilizzava dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi camici da laboratorio, guanti usa e getta, maschere chirurgiche e protezioni oculari quando necessario. Sono state seguite rigorose procedure asettiche in tutte le procedure microbiologiche e molecolari per minimizzare i rischi di contaminazione ed esposizione. Aree di lavoro dedicate furono utilizzate per la gestione delle colture batteriche e le procedure di amplificazione del DNA per prevenire la contaminazione incrociata. I materiali contaminati, inclusi piastre di coltura, tamponi, punte di pipetta e usa e getta, sono stati autoclavati a 121 °C e 15 psi per 15–20 minuti prima dello smaltimento. Gli oggetti pungenti venivano scartati in contenitori designati per i biohazard resistenti alle punture. I rifiuti biologici venivano gestiti secondo i protocolli istituzionali di smaltimento dei rifiuti biomedici. Queste misure di biosicurezza hanno garantito la gestione sicura di organismi multi-resistenti ai farmaci, inclusi MRSA e isolati resistenti alla vancomicina (Figura 1).

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Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro clinico, microbiologico, molecolare, di sequenziamento dell'intero genoma e bioinformatica utilizzato nello studio. La figura riassume la raccolta di campioni, la coltura microbiologica, i test di suscettibilità agli antimicrobici, la rilevazione molecolare basata su PCR, il sequenziamento dell'intero genoma e le analisi bioinformatiche a valle. Questa figura è stata generata con l'assistenza della piattaforma di design basata sull'IA Gamma Pro (Gamma App) e successivamente revisionata, rivista e validata dagli autori per la sua accuratezza scientifica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I dati sono stati analizzati utilizzando la versione 22.0 del software SPSS. Sono state calcolate statistiche descrittive, inclusi medie e percentuali. Le associazioni tra variabili categoriche sono state analizzate utilizzando il test del chi-quadrato. Un p-valore <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

2. Trattamento e raccolta dei campioni

I campioni sono stati raccolti dalla porzione più profonda delle ulcere diabetiche del piede utilizzando la tecnica del tampone profondo. Due cotton fioc sterili pre-umiditi con brodo sterile venivano ruotati saldamente sulla base della ferita dopo il debridamento con un bisturi sterile e la pulizia con soluzione salina sterile per minimizzare la contaminazione da parte di microrganismi colonizzatrici. Un tampone è stato utilizzato per la colorazione di Gram, mentre il secondo è stato utilizzato per la coltura microbiologica. I froti diretti colorati con Gram sono stati esaminati microscopicamente.

Sono stati prelevati campioni di tessuto osseo da pazienti con sospetta osteomielite clinica in condizioni sterili dopo il debridemento chirurgico. Prima della raccolta del campione, le superfici delle ulcere sono state pulite con soluzione salina normale sterile per ridurre la contaminazione superficiale. I campioni di tessuto osseo venivano raccolti asepticamente con strumenti chirurgici sterili e immediatamente trasferiti in contenitori sterili per la lavorazione microbiologica.

Gli esemplari sono stati omogeneizzati o finemente tritati in condizioni sterili e inoculati su agar di sangue, agar di sale al manitolo (MSA), agar MacConkey e agar nutriente. Le piastre venivano incubate aerobicamente a 37 °C per 18–24 ore. L'agar nel sangue e l'agar nutrizionale supportavano la crescita di organismi gram-positivi e gram-negativi, mentre l'MSA veniva utilizzato per l'isolamento selettivo e la differenziazione delle specie di Staphylococcus , inclusa S. aureus. L'agar MacConkey veniva utilizzato per il recupero dei batteri gram-negativi. Le placche di coltura sono state esaminate dopo l'incubazione, e i campioni senza crescita visibile dopo 48 ore sono stati segnalati come "nessuna crescita".

L'identificazione batterica preliminare si basava sulla morfologia della colonia, sulla colorazione di Gram e sulle caratteristiche biochimiche, seguita dalla conferma molecolare di S. aureus tramite amplificazione PCR del gene nuc . L'identificazione biochimica includeva test della catalasi, test di coagulasi a vetrina e a prova, fermentazione del mannitolo e test della DNasi. Gli isolati confermati sono stati ulteriormente identificati utilizzando il sistema VITEK 2 Compact con la carta di identificazione GP VITEK 2. I risultati di identificazione sono stati accettati solo quando il livello di fiducia era ≥95%. I risultati discordanti o a bassa fiducia sono stati ritestati utilizzando analisi biochimiche ripetute e test VITEK ripetuti. Gli isolati puri sono stati conservati in glicerolo al 20% preparato in brodo di infusione cerebrale cardiaca (BHI) per analisi molecolari e genomiche successive (Figura 1).

3. Test di suscettibilità agli antimicrobici

I test di suscettibilità agli antimicrobici sono stati effettuati utilizzando il metodo di diffusione su disco di Kirby–Bauer secondo le linee guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) del 2022. I test sono stati condotti su agar Mueller–Hinton con una profondità standardizzata di 4 mm. Le colture batteriche fresche sono state regolate a uno standard McFarland di 0,5 utilizzando un densitometro prima dell'inoculazione. Sono stati utilizzati tamponi sterili per inoculare uniformemente le superfici dell'agar.

Sono stati utilizzati i seguenti dischi antimicrobici: ampicillina (10 μg), gentamicina (10 μg), amikacina (30 μg), cefoxitina (30 μg), cefuroxima (30 μg), piperacilina/tazobactam (100/10 μg), meropenem (10 μg), amoxicilina–acido clavulanico (30 μg), ossacilina (1 μg), levofloxacina (5 μg), clindamicina (2 μg), tigeciclina (15 μg), ciprofloxacina (5 μg), eritromicina (15 μg), trimetoprima–sulfametossazolo (25 μg), linezolide (30 μg), e vancomicina (30 μg). Le piastre venivano incubate aerobicamente a 37 °C per 16–18 ore. I diametri delle zone sono stati interpretati secondo i punti di rottura CLSI.

Lo Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA) è stato identificato tramite screening con cefoxitina (30 μg) secondo le raccomandazioni CLSI. I test di controllo qualità sono stati eseguiti utilizzando S. aureus ATCC 25923. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in duplicato per garantire la riproducibilità. Gli isolati multi-resistenti (MDR), estesamente resistenti ai farmaci (XDR) e pand-resistenti (PDR) sono stati classificati secondo definizioni standard internazionali basate sui profili di resistenza antimicrobica (Figura 1).

4. Rilevamento di S. aureus resistente alla meticillina (MRSA)

Un saggio di diffusione su disco a cefoxitina (30 μg) è stato utilizzato come metodo fenotipico per il rilevamento della MRSA. Gli isolati con zone inibitorie ≥22 mm sono stati classificati come S. aureus sensibile alla meticillina (MSSA), mentre gli isolati con zone inibitori ≤21 mm sono stati classificati come MRSA secondo i criteri CLSI (Figura 1).

5 Determinazione della resistenza alla vancomicina tramite test a concentrazione inibitoria minima (CIM)

Le concentrazioni minime inibitorie (MIC) di vancomicina sono state determinate tramite il metodo di microdiluizione del brodo secondo le linee guidaCLSI 11. Diluizioni seriali di vancomicina (4–512 μg/mL) furono preparate nel brodo Mueller–Hinton. Le sospensioni batteriche sono state regolate a uno standard McFarland di 0,5 e diluite a circa 1 × 105 CFU/mL.

Dopo l'incubazione a 37 °C per 24 ore, la MIC fu definita come la concentrazione più bassa in cui non si osservava alcuna crescita batterica visibile. La suscettibilità alla vancomicina è stata interpretata secondo i criteri CLSI come segue: suscettibile (≤2 μg/mL), intermedie (4–8 μg/mL) e resistente (≥16 μg/mL)11,12 (Figura 1).

6. Rilevamento molecolare

6.1 Estrazione del DNA

Gli isolati di Staphylococcus aureus sono stati coltivati in brodo di infusione cerebrale cardiaca (BHI) per 24 ore a 37 °C. Il DNA genomico batterico è stato estratto utilizzando un kit commerciale e un sistema automatico di estrazione degli acidi nucleici. Il DNA estratto veniva conservato a −20 °C fino all'uso. La concentrazione di DNA è stata misurata utilizzando un fluorometro per valutare l'idoneità all'amplificazione PCR. La concentrazione media di DNA era di 85 ± 8,2 ng/μL.

I primer che mirano ai geni can, hlg e classe D β-lattamasi (blaOXA-gruppo I) sono stati ottenuti commercialmente e utilizzati per l'amplificazione PCR come elencato nelle Tabelle 1, 13, 14, 15, 16.

Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per l'amplificazione PCR dei geni bersaglio studiate in questo studio. La tabella riassume i geni target, le sequenze di primer, le dimensioni attese degli amplicon, le temperature di ricottura e i riferimenti utilizzati per l'amplificazione PCR dei geni NUC, mecA, hlg, can ebla OXA-group I negli isolati di Staphylococcus aureus recuperati da infezioni diabetiche del piede. Clicca qui per scaricare questa tabella.

6.2 Rilevamento molecolare della virulenza e dei geni di classe D β-Lattamasi (blaOXA-gruppo I) tramite PCR

Le sequenze di primer utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 1. L'amplificazione PCR di mecA, nuc, geni associati alla virulenza e geni di classe D β-lattamasi (blaOXA-gruppo I) è stata effettuata in miscele di reazione da 25 μL contenenti 12,5 μL di GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL di MgCl2, 3 μL di DNA genomico, 1 μL ciascuno di primer frontale e inverso (10 pmol/μL) e 7 μL di acqua priva di nucleasi.

Le condizioni di ciclo termico consistevano in una fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 minuti, seguita da 30–35 cicli di amplificazione, inclusa la denaturazione a 95 °C per 30 s–1 minuto, ricottura a 50–62 °C per 30 s–1 min a seconda del set di innesco, e estensione a 72 °C per 30 s–1 min. L'estensione finale è stata eseguita a 72 °C per 7–19 minuti.

I prodotti PCR amplificati sono stati separati su gel di agarosio al 1,5%–2% colorati con Safe Red e visualizzati sotto illuminazione ultravioletta utilizzando un sistema di documentazione in gel. Controlli negativi erano inclusi in ogni esecuzione PCR per confermare la validità dell'amplificazione.

7. Sequenziamento dell'intero genoma (WGS)

Il sequenziamento del genoma completo (WGS) è stato eseguito su due isolati clinici rappresentativi di Staphylococcus aureus recuperati da campioni di tessuto osseo ottenuti da pazienti con infectioni diabetiche del piede. Gli isolati selezionati includevano un isolato multi-resistente (MDR) e uno estesivamente resistente ai farmaci (XDR), identificati tramite test fenotipici di suscettibilità antimicrobica e profili di resistenza confermati da MIC. Questa strategia ha permesso la caratterizzazione genomica rappresentativa di isolati resistenti clinicamente rilevanti (Figura 1).

La qualità, la concentrazione e l'integrità del DNA genomico sono state valutate prima del sequenziamento per garantire l'idoneità alla preparazione della libreria e all'analisi bioinformatica a valle. Il DNA è stato quantificato utilizzando un fluorometro e l'integrità è stata verificata tramite elettroforesi in gel di agarosio all'1% a 150 V per 40 minuti. Frammenti di DNA di lunghezza circa 200–400 bp sono stati selezionati per dimensione tramite purificazione con perle magnetiche, seguita da riparazione terminale, adenilazione 3′ e legazione con adattatore.

Le molecole circolari di DNA monofilamento sono state generate tramite amplificazione, purificazione e circolarizzazione di frammenti legati da adattatore utilizzando oligonucleotidi a stecca. Le nanosfere di DNA (DNB) sono state successivamente generate tramite amplificazione a cerchio rotante. Il sequenziamento è stato eseguito sulla piattaforma DNBSEQ utilizzando la chimica combinatoria Probe-Anchor Synthesis (cPAS).

Le letture di sequenziamento grezzo sono state sottoposte a procedure di controllo qualità per rimuovere letture di bassa qualità, contaminazione da adattatori, letture ambigue e sequenze duplicate. Sono state utilizzate letture pulite per le analisi a valle. L'assemblaggio del genoma è stato effettuato per stimare la dimensione del genoma, il contenuto di GC e la profondità di copertura del sequenziamento. Le bozze finali degli assemblaggi genomici sono state generate nei formati di invio FASTA, GenBank e NCBI.

L'annotazione genomica identificava sequenze codificanti (CDS), RNA di trasferimento (tRNA), RNA ribosomica (rRNA) e piccoli geni RNA (sRNA). L'annotazione funzionale dei geni previsti è stata effettuata utilizzando molteplici database, tra cui Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB e CARD, per geni associati alla resistenza alla virulenza e agli antimicrobici.

8. Analisi bioinformatica

L'assemblaggio e l'annotazione del genoma sono stati eseguiti utilizzando il Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center (BV-BRC). Le analisi filogenetiche sono state condotte utilizzando strumenti PARIC. Sono state generate mappe circolari di visualizzazione del genoma per illustrare sequenze codificanti, contenuto di GC, distorsione GC, determinanti della resistenza antimicrobica, geni associati alla virulenza ed elementi genetici mobili.

Le relazioni filogenetiche sono state determinate utilizzando le famiglie proteiche globali PATRIC (PGFams) identificate dai genomi di riferimento più vicini tramite analisi Mash/MinHash. Gli allineamenti proteici sono stati generati utilizzando MUSCLE, e i corrispondenti allineamenti dei nucleotidi sono stati mappati alle famiglie proteiche. Gli alberi filogenetici sono stati costruiti utilizzando RAxML con analisi rapida di bootstrapping (Figura 1).

I contigi genomici sono stati inoltre analizzati utilizzando Pathogenwatch per la conferma della specie e la rilevazione di geni di resistenza antimicrobica. I geni associati alla virulenza sono stati analizzati utilizzando ABRicate. Il Servizio di Annotazione Genomica PATRIC utilizzava un approccio basato su k-mer per identificare geni di resistenza antimicrobica e assegnare annotazioni funzionali, classi antimicrobiche e meccanismi di resistenza. Visualizzazioni circolari del genoma degli isolati rappresentativi di MDR e resistenti alla meticillina di S. aureus sono state generate come descrittoin precedenza 17. La Tabella Supplementare 1 riassume tutti gli strumenti bioinformatici, le versioni del software, i database e i parametri analitici utilizzati nelle analisi genomiche.

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Risultati

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Elaborazione dei campioni e positività della coltura

In questo studio sono stati raccolti e analizzati in totale 125 campioni clinici. La crescita batterica è stata osservata in 90/125 campioni (72%). Questi campioni positivi alla coltura sono stati successivamente processati per l'identificazione batterica e il test di suscettibilità agli antimicrobici. Statistiche descrittive, incluse frequenze e percentuali, sono state utilizzate per riassu...

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Discussione

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Le infezioni diabetiche al piede (DFI) causate da microrganismi multi-resistenti ai farmaci (MDR) stanno aumentando a livello globale, con un scarso controllo glicemico e un'igiene dei piedi inadeguata che contribuiscono a un aumento della morbilità e dellamortalità 18,19,20,21. Sebbene i DFI siano frequentemente polimicrobici, Staphylococcus aureus ri...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali note che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo studio.

Contributo alla paternità:

Shaymaa H. Al-Kubaisy ha contribuito alla concettualizzazione, allo sviluppo della metodologia, all'indagine, all'analisi formale e alla preparazione della bozza originale del manoscritto. Rawaa A. Hussein contribuì alla validazione, indagine e preparazione del manoscritto originale. Mushtak T.S. Al-Ouqaili ha contribuito alla concettualizzazione, supervisione, amministrazione del progetto, indagine e revisione e revisione dei manoscritti.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono l'uso della piattaforma di design basata sull'IA Gamma Pro (Gamma App) per la generazione della Figura 1. Tutti i contenuti generati sono stati attentamente revisionati, modificati e validati dagli autori per garantire accuratezza scientifica, coerenza e integrità. Gli autori non hanno ricevuto alcun supporto finanziario per la ricerca, la paternità e/o la pubblicazione di questo articolo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Abricate SoftwareGitHub (T. Seemann)Open-sourceRilevamento del geni della virulenza
AgaroseInvitrogen, USA16500-500Elettroforesi su gel
Agencourt AMPure XP KitBeckman CoulterA63881Purificazione del DNA e selezione della dimensione
Amikacin (30 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0107BAST
Dischi antibiotici (Ampicillina 20 e micro; g)Oxoid, Regno UnitoCT0003BTest di suscettibilità agli antimicrobici
Base di Agar di SangueOxoid, Regno UnitoCM0055Isolamento di batteri Gram-positivi e Gram-negativi
Brodo Brain Heart Infusion (BHI)Oxoid, Regno UnitoCM1135Coltivazione e stoccaggio degli isolati
Cefoxitin (30 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0119BRilevamento MRSA
Cefuroxime (30 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0026BAST
Ciprofloxacina (5 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0425BAST
Clindamicina (2 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0064BAST
Piattaforma DNBSEQBGI, CinaVariSequenziamento dell'intero genoma
Eritromicina (15 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0020BAST
FastQCSimon Andrews presso il Babraham Institute (Babraham Bioinformatics)NASistema di coda
Sistema di Documentazione GelBio-Rad, USAGel Doc™ XR+Imaging dei gel di elettroforesi
Gentamicina (10 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0024BAST
Glicerolo (Grado Molecolare)Sigma-AldrichG5516Utilizzato al 20% per la conservazione a lungo termine degli isolati
GoTaq Green Master Mix (2 volte)Promega, USAM7122Mix di amplificazione PCR
Levofloxacina (5 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT1587BAST
Linezolide (30 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, Regno UnitoCM0007Mezzo selettivo per batteri Gram-negativi
Mannitolo Sale Agar (MSA)Oxoid, Regno UnitoCM0085Mezzo selettivo/differenziale per le specie di Staphylococcus.
Meropenem (10 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0774BAST
Soluzione MgCl2Promega, USAVariComponente della reazione PCR
Mueller-Hinton AgarOxoid, Regno UnitoCM0337Usato per Kirby e Dash; Test di diffusione del disco Bauer
Strumento di allineamento MUSCLEOpen-sourceVariAllineamento delle sequenze proteiche
Acqua Priva di NucleasiPromega, USAP1193Componente della reazione PCR
Agar nutritivoOxoid, Regno UnitoCM0003Mezzo di crescita a uso generale
Oxacillina (1 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0159BAST
PathogenWatchIstituto Wellcome SangerStrumento onlineIdentificazione della specie e Rilevamento del gene AMR
PATRIC / BV-BRCCentro Risorse per la Bioinformatica BattericaPiattaforma onlineAssemblaggio del genoma e Annotazione
Piperacillina/Tazobactam (100/10 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT1628BAST
Strumento di visualizzazione del genoma ProkseeUniversità di TorontoStrumento onlineVisualizzazione della mappa genomica
Fluorometro QuantusPromega, USAE6150Quantificazione del DNA
Fluorometro a QubitThermo Fisher ScientificQ33238Quantificazione del DNA per WGS
RAxML SoftwareOpen-sourceVariAnalisi filogenetica
S. aureus ATCC 25923ATCC, USA25923Ceppo di controllo qualità per AST
Macchia Rossa sicuraiNtRON BiotecnologiaVariColorazione con gel di DNA
Kit di estrazione del DNA batterico SaMagSacace Biotechnologies, ItaliaVariEstrazione del DNA genomico
Sistema di Estrazione Automatica SaMag-12Sacace Biotechnologies, ItaliaSMG-12Estrattore automatico di acidi nucleici
Cotton Cotton Habbs steriliVari produttoriVariUtilizzato per la raccolta di campioni con tecniche di tampone profondo
Soluzione fisiologica normale sterileVari produttoriVariUsato per lavare la superficie dell'ulcera prima del campionamento
Lame sterili per bisturiVari produttoriVariUtilizzato per il debridamento ulceroso prima del campionamento
Tigeciclina (15 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT1849BAST
Trimetoprim-Sulfametoxazolo (25 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0052BAST
Trasilluminatore UVVari produttoriVariVisualizzazione dei prodotti PCR
Vancomicina (30 & micro; g) DiscoOxoid, Regno UnitoCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMé rieux, FranciaVariSistema di identificazione automatizzato
Carte d'identità VITEK 2 GNBioMé rieux, FranciaVariIdentificazione dei batteri Gram-negativi

Riferimenti

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