Dal tessuto alla morfometria: un flusso di lavoro passo dopo passo di Golgi–Cox per l'analisi neuronale e dendritica della colonna vertebrale nei topi adulti

Sommario

Questo articolo descrive un metodo passo dopo passo per la colorazione di Golgi–Cox nei topi adulti, che copre la preparazione della soluzione, l'impregnazione dei tessuti, la crioprotezione, la sezionazione, lo sviluppo e il montaggio. Enfatizza la conservazione dei tessuti e la colorazione omogenea a basso fondo, permettendo una chiara visualizzazione della morfologia neuronale. Il metodo etichetta gli alberi dendritici e supporta l'analisi morfometrica quantitativa delle spine dendritiche.

Abstract

L'analisi della morfologia neuronale in ambito sanitario e malattia è fondamentale per comprendere la funzione cerebrale e per valutare gli effetti degli interventi sperimentali. La colorazione di Golgi–Cox rimane una tecnica classica, ma molto rilevante per visualizzare alberi neuronali completi e spine dendritiche. Tuttavia, i protocolli pubblicati spesso differiscono in fasi procedurali critiche e spesso mancano di dettagli metodologici essenziali, portando a una notevole variabilità nella qualità della colorazione e rendendo la standardizzazione di laboratorio lunga e impegnativa. Qui viene presentato un protocollo Golgi–Cox completo e passo dopo passo per topi adulti, che comprende l'intero flusso di lavoro, dalla manipolazione in vivo e l'elaborazione dei tessuti fino all'imaging e all'estrazione dei dati morfometrici. Essa dettaglia considerazioni pratiche e insidie comuni che influenzano l'efficienza di impregnazione, l'integrità della sezione e il rapporto segnale-rumore, fornendo indicazioni metodologiche per migliorare la riproducibilità. Nel complesso, questo protocollo consente una visualizzazione affidabile e un'analisi quantitativa di neuroni interi, segmenti dendritici e spine dendritiche. Si prevede che questa risorsa faciliterà l'implementazione della colorazione di Golgi–Cox con maggiore coerenza, trasparenza e rigore tecnico, offrendo al contempo un quadro chiaro per adattare il metodo a diversi contesti di laboratorio.

Introduzione

L'obiettivo generale del metodo di colorazione di Golgi–Cox è consentire la visualizzazione ad alta risoluzione della morfologia neuronale completa, inclusi alberi dendritici e spine dendritiche, nel tessuto cerebrale^fisso 1,2,3,4. Questa tecnica consente un'analisi strutturale dettagliata dei singoli neuroni all'interno di circuiti neurali complessi, rendendola particolarmente preziosa per studi sulla plasticità sinaptica, neurosviluppo, neurodegenerazione e rimodellamento strutturale dipendente^{dall'esperienza 5,6}.

La ragione per lo sviluppo e il continuo utilizzo dei metodi basati su Golgi risiede nella loro capacità unica di produrre un'impregnazione neuronale scarsa^{e completa 1,2}. Originariamente descritto da Camillo Golgi nel 1873 e raffinato nel 1891 da^{Cox 7,8}, il metodo si basa sulla precipitazione del cromato d'argento all'interno di un sottoinsieme limitato di neuroni, consentendo una completa ricostruzione morfologica senza marcature^{sovrapposte 3}. La modifica Golgi–Cox sostituisce il nitrato d'argento usato nel metodo originale di Golgi con cloruro mercurico, migliorando la penetrazione dei tessuti e la consistenza della^{colorazione 2}. Rispetto a tecniche alternative di marcatura neuronale come l'espressione proteica fluorescente, il tracciamento virale o gli approcci di riempimento di colorante, la colorazione di Golgi–Cox offre diversi vantaggi. Non richiede manipolazione genetica, iniezioni stereotassiche o apparecchiature di microscopia specializzate, e consente la visualizzazione di spine dendritiche ad alto contrasto sotto microscopia a campo^{chiaro 1,2}. Sebbene i metodi moderni basati su fluorescenza forniscano specificità per tipo cellulare, la colorazione di Golgi–Cox rimane particolarmente vantaggiosa per il campionamento morfologico^{imparziale 9,10} e per l'uso in specie o condizioni sperimentali dove non sono disponibili strumenti transgenici.

All'interno della letteratura più ampia, i metodi basati su Golgi sono stati ampiamente impiegati per quantificare la densità e la morfologia della colonna vertebrale dendritica in studi su apprendimento e^{memoria 5}, stress e disturbi psichiatrici^11, et๲ anni e malattie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer 12,13,14. Il suo uso continuo per decenni ne evidenzia l'affidabilità per la neuroanatomia^{strutturale 2}. Questo metodo è particolarmente adatto ai ricercatori che analizzano l'architettura dendritica e la morfologia della colonna vertebrale nel tessuto cerebrale quando è richiesta la visualizzazione dell'intera^{cellula 1}. È particolarmente adatta a studi morfologici comparativi tra gruppi sperimentali. Tuttavia, i ricercatori che richiedono specificità di tipo cellulare, imaging live o localizzazione molecolare potrebbero trarre maggior beneficio da approcci di marcatura fluorescenti o codificati^{geneticamente 9,10}.

Protocollo

In questo studio sono state utilizzate femmine adulte di topi selvatici B6129SF2/J (n = 3). Tuttavia, colorazioni simili possono essere effettuate utilizzando entrambi i sessi nella fase adulta. Tutte le procedure sperimentali hanno ricevuto l'approvazione precedente del Comitato di Bioetica. (#117.A, Istituto di Neurobiologia (INb), Università Nazionale Autonoma del Messico)

1. Preparazione delle soluzioni

ATTENZIONE: Il cloruro mercurico è altamente tossico e corrosivo. Maneggiare all'interno di una cappa chimica indossando guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi. Smaltire i rifiuti in un contenitore etichettato per rifiuti pericolosi. Il dicromato di potassio e il cromato di potassio sono ossidanti tossici e cancerogeni. Manetta all'interno di una cappa chimica ed evita il contatto con la pelle o l'inalazione.

1. Prepara soluzioni di impregnazione per il stock
   1. Pesa 15 g di dicromato di potassio. Scioglietelo in 300 mL di acqua doppiamente distillata per ottenere una soluzione al 5% (p/v).
   2. Pesa 15 g di cloruro mercurico. Scioglietelo in 300 mL di acqua doppiamente distillata per ottenere una soluzione al 5% (p/v).
   3. Pesa 15 g di cromato di potassio. Scioglietelo in 300 mL di acqua doppiamente distillata per ottenere una soluzione al 5% (p/v).
   4. Avvolgi tutti i contenitori in carta stagnola e conserva a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
2. Prepara la soluzione operativa di Golgi–Cox
   1. Mescola 50 mL di soluzione di dicromato di potassio, 50 mL di cloruro mercurico e 40 mL di soluzione di cromato di potassio.
   2. Aggiungi 100 mL di acqua distillata e mescola bene.
   3. Incubare la miscela per 48 ore a temperatura ambiente, protetta dalla luce.
   4. Lascia che il precipitato si depositi. Usa solo il sovrantagente per l'impregnazione dei tessuti.
      NOTA: La soluzione di Golgi–Cox può essere conservata fino a 1 mese se protetta dalla luce. Per ridurre gli sprechi di reagenti e garantire la freschezza della soluzione, preparare solo il volume richiesto sia delle soluzioni stock sia della soluzione finale di Golgi–Cox necessaria per l'esperimento. Preparare almeno 23 mL per cervello per ottenere 20 mL di soprantantante utilizzabile dopo la perdita di precipitazione.
3. Prepara la soluzione crioprotettiva
   1. Sciogliere 300 g di saccarosio in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 0,1 M, pH 7,4, preparata con dibasico fosfato di sodio anidro, monobase monoidratata fosfato di sodio e cloruro di sodio.
   2. Regola il volume finale a 1 L.
   3. Conserva a 4 °C per un massimo di una settimana.

2. Raccolta e impregnazione dei tessuti

1. Eseguire perfusione intracardiaca
   1. Anestetizzare l'animale con pentobarbital sodico (252 mg/kg, i.p.). Confermare una profondità adeguata dell'anestesia assenza di ritiro del pedale prima di procedere.
   2. Eseguire una perfusione intracardiaca con circa 30 mL di PBS di 0,1 M (pH 7,4) finché l'effluente non sarà pulito, assicurando la completa rimozione del sangue dal tessuto cerebrale. Non fu usato alcun fissatore; la soluzione di Golgi–Cox stessa funge da fissativo in questo flusso di lavoro.
   3. Estrai il cervello con cura e sciacqualo in acqua distillata. Assicurarsi che il cervello sia correttamente perfuso e privo di residui di sangue (Figura 1A).
2. Tessuto impregnato
   1. Dividere il cervello in emisferi o blocchi coronali (spessore ~3 mm) usando una matrice cerebrale per migliorare l'impregnazione. I blocchi tissulari più piccoli facilitano un'impregnazione più uniforme e riducono la variabilità, mentre i campioni più grandi possono richiedere tempi di incubazione più lunghi e mostrare una colorazione meno omogenea.
   2. Inserire il cervello in una soluzione di Golgi–Cox da 10 mL. Proteggi dalla luce.
      NOTA: Un volume di 10 mL di soluzione di Golgi–Cox è sufficiente per un intero cervello di topo adulto. Quando si utilizza un singolo emisfero o blocchi coronali più piccoli (~3 mm di spessore), il volume di soluzione può essere ridotto proporzionalmente, a condizione che il tessuto rimanga completamente immerso. Se si utilizza l'intero cervello, si raccomanda di sezionarlo preservando la regione di interesse per garantire una penetrazione ottimale del reagente e un'impregnazione omogenea.
   3. Incubare per 24 ore a temperatura ambiente.
   4. Sostituisci con 10 mL di soluzione fresca di Golgi–Cox. Incubare per 10-14 giorni a 22–25 °C al buio.
      PUNTO DI PAUSA: Conservare il tessuto in soluzione di Golgi–Cox fino a 15 giorni senza una perdita significativa di vitalità.
      NOTA: Dopo l'impregnazione di Golgi–Cox, il cervello assume un aspetto dorato scuro e diventa molto fragile; pertanto, maneggiarlo con attenzione (Figura 1B). Si consiglia l'uso di pinzette di plastica per la manipolazione, per evitare reazioni chimiche con materiali in acciaio.

3. Crioprotezione

1. Trasferire il tessuto in una soluzione crioprotettiva da 10 mL (30% di saccarosio (p/v) in 0,1 M PBS, pH 7,4, preparato nello step 1.3).
2. Incubare per 24 ore (4 °C).
3. Alla stessa temperatura (4 °C), sostituire con una soluzione crioprotettiva fresca e incubare per almeno 4–7 giorni.
   PUNTO DI PAUSA: Prima della sezione, conservare il tessuto in una soluzione crioprotettiva fino a 3 settimane a 4 °C.

4. Incassamento e sezionamento

1. Tessuto di inserzione
   1. Prepara l'8% (p/v) di agarosio in acqua calda distillata. Lascia raffreddare fino a circa 40 °C.
   2. Posiziona il tessuto in stampi di incorporazione e orienta correttamente.
   3. Versa agaroso sul tessuto e lascialo solidificare per 1 ora a temperatura ambiente o 30 minuti a 4 °C (Figura 1°C).
   4. Riduci l'eccesso di agarosio dal blocco (Figura 1D).
2. Tessuto di sezione
   1. Fissa il blocco di agarosio allo stadio del vibratome usando dell'adesivo. (Figura 1E)
   2. Riempi la camera di taglio con soluzione crioprotettiva.
   3. Tessuto di sezione con spessore 100–200 μm. Sezioni più sottili (ad esempio, 100–120 μm) sono raccomandate per l'analisi della spina dendritica al fine di migliorare la risoluzione di immagini, mentre sezioni più spesse (ad esempio, 150–200 μm) possono essere utilizzate per la ricostruzione dell'intero neurone. In questo studio, le sezioni sono state tagliate a 120 μm (Figura 1F).
   4. Raccogli le sezioni usando un pennello morbido.
      NOTA: Registra le impostazioni del vibratomo nella Tabella dei Materiali. Non risciacquare le slide in nessuna circostanza, una volta montate le sezioni. Il saccarosio proteggerà il tessuto fino alla fase di sviluppo.

5. Montaggio

1. Preparazione di vetrini rivestiti di gelatina
   1. Prepara una soluzione di rivestimento sciogliendo 0,5 g di gelatina in 100 mL (0,5% w/v) di acqua distillata riscaldata fino a ebollizione.
   2. Mescola finché la gelatina non si scioglie completamente e lascia raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.
   3. Aggiungi 0,05 g di solfato di cromo potassio (0,05% p/v) e mescola fino a disciolto. Rimuovi la schiuma residua se necessario.
   4. Filtrare la soluzione di gelatina attraverso carta filtrante per rimuovere particelle non disciolte e schiuma residua, assicurando un rivestimento uniforme delle vetrine.
   5. Lava i vetri con detersivo neutro e acqua, risciacqua accuratamente e poi risciacquo con acqua distillata.
   6. Immergi i vetri in etanolo al 96% finché non restano goccioline visibili.
   7. Asciutto si lascia in forno a 50–60 °C per 30 minuti o finché non è completamente asciutto.
   8. Immergi la soluzione nella gelatina e lascia che l'eccesso di liquido scolpi.
   9. Metti i vetri in forno a 50–60 °C per 30 minuti o finché non sono completamente asciutti.
   10. Ripeti il processo di rivestimento e asciugatura almeno cinque volte per garantire una corretta adesione.
   11. Dopo l'ultimo passaggio di asciugatura, lascia raffreddare i vetri a temperatura ambiente in un ambiente privo di polvere (ad esempio, all'interno di una cappa chimica) e conservale in un contenitore pulito e chiuso fino all'uso.
       NOTA: Prepara solo il volume di soluzione di gelatina necessario per il numero di vetrine da rivestire. Le quantità di reagente possono essere scalate proporzionalmente mantenendo le concentrazioni specificate (w/v).
2. Posizionare le sezioni su vetrine di microscopio rivestite di gelatina usando un pennello morbido
   NOTA: Utilizzare vetri microscopici rivestiti con almeno cinque strati di gelatina allo 0,5%. Prepara le vetrine con cura per garantire l'integrità dei tessuti durante lo sviluppo. I vetri elettrocaricati non sono stati testati in questo protocollo.
3. Immergi la carta assorbente con una soluzione crioprotettiva e mettila sopra le sezioni.
4. Premere delicatamente con il palmo per eliminare le bolle d'aria e garantire un contatto uniforme tra la sezione tissutale e il vetrino rivestito di gelatina, favorendo un'adesione stabile durante la lavorazione successiva.
   NOTA: La pressione gentile migliora l'adesione massimizzando il contatto tra la sezione e lo strato di gelatina, riducendo il rischio di distacco durante lo sviluppo acquoso.
5. Rimuovi la carta con cura e lascia asciugare le vetrine al buio per 2–3 giorni a temperatura ambiente.
   NOTA: L'asciugatura in un ambiente a bassa umidità è fondamentale per un'adesione stabile. La protezione dalla luce minimizza le alterazioni fotochimiche del tessuto impregnato di Golgi–Cox, sensibile alla luce a causa della presenza di sali di cromato. Inoltre, l'agarosio residuo non interferisce significativamente con il processo di sviluppo e può essere osservato intorno al tessuto nella sezione sviluppata (Figura 2A). La presenza di agarosio facilita una gestione più sicura del tessuto durante il montaggio, poiché il tessuto impregnato di Golgi–Cox è altamente fragile. Se desiderato, l'agarosio in eccesso può essere rimosso manualmente con cura dopo che le sezioni sono state montate sulle vetrine.
   PUNTO DI PAUSA: Proteggi le slide dalla luce.

6. Sviluppo

ATTENZIONE: Lo xilene è infiammabile e tossico all'inalazione. Maneggia una cappa chimica ed evita le fiamme aperte. L'ammoniaca è corrosiva e produce vapori irritanti. Maniglia in una cappa a fumo.

1. Sezioni di Reidratazione
   1. Immergi i slide in acqua distillata per 5 minuti.
   2. Trasferisci in acqua distillata fresca per 5 minuti.
   3. Immergi nel 50% di etanolo per 5 minuti.
      NOTA: La fase del 50% di etanolo fornisce una transizione graduale da condizioni acquose alla disidratazione, facilitando la penetrazione dei reagenti e aiutando a preservare l'integrità dei tessuti prima della fase di sviluppo.
2. Sviluppo della colorazione
   1. Incubare le vetrine in soluzione acquosa di ammoniaca preparata mescolando 2 volumi di ammoniaca al 25% con 1 volume di acqua distillata (2:1, v/v) per 8 minuti
   2. Lavare in acqua distillata per 5 minuti.
   3. Lava di nuovo in acqua distillata per 5 minuti.
   4. Incubare in tiosolfato di sodio al 5% (p/v) in acqua distillata per 10 minuti al buio.
   5. Lavare in acqua distillata per 1 minuto.
   6. Lava di nuovo in acqua distillata per 1 minuto.
      NOTA: Completare il processo di sviluppo senza interruzioni una volta iniziato.
3. Disidratazione e Pulizia
   1. Immergi i vetri nel 70% di etanolo per 5 minuti.
   2. Immergi i vetri in etanolo al 96% per 5 minuti.
   3. Immergi i vetri in etanolo al 100% per 5 minuti.
   4. Trasferisci i vetrini nello xilene per almeno 6 minuti.

7. Montaggio permanente

1. Applicare un mezzo di montaggio Permount® (indice di rifrazione ~1,52) su ogni sezione.
   NOTA: L'indice di rifrazione del mezzo di montaggio dovrebbe essere compatibile con gli obiettivi a immersione in olio per garantire una qualità ottimale dell'immagine.
2. Metti con cura una copertura per evitare bolle d'aria.
3. Sigilla i bordi con uno smalto trasparente.
4. Lascia asciugare i vetrini al buio per 48 ore a temperatura ambiente.

8. Imaging

NOTA: Le modalità di imaging e le configurazioni di acquisizione variano a seconda del marchio del microscopio; Le impostazioni ottimali dovrebbero essere determinate per ciascun sistema.

1. Accendi il microscopio.
2. Apri il software del microscopio
3. Metti un vetrino sul palco del microscopio.
4. Cattura un'immagine 2D a grandezza della sezione cerebrale usando un obiettivo a basso ingrandimento come 1X/0,04 N.A. o 4x/0,10 (Figura 2A, B).

9. Imaging di neuroni interi

1. Cattura pile di immagini ad alta risoluzione dell'area che contiene il neurone di interesse, utilizzando un obiettivo N.A. 10x/0,25 o 20x/0,40 N.A. (Figura 2C).
   NOTA: I neuroni selezionati per l'analisi dovrebbero presentare un'impregnazione completa e omogenea di Golgi–Cox, con arbori dendritici chiaramente definiti e una colorazione di fondo minima. Le cellule con processi troncati, impregnazione incompleta, strutture sovrapposte o alto segnale di fondo devono essere escluse per garantire un'analisi morfometrica accurata.
2. Metti a fuoco l'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, inclusi l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
3. Imposta i limiti superiori e inferiori per la pila di immagini.
4. Imposta la distanza di passo a 0,5 μm all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
5. Cattura lo stack di immagini usando il comando software per l'acquisizione dello stack.
6. Ripeti i passaggi sopra per catturare ogni area di interesse.
7. Salva il file di dati e salva tutti i file immagine. Formato TIFF per l'elaborazione esterna.

10. Imaging delle spine dendritiche

1. Cattura pile di immagini ad alta risoluzione dell'area che contiene il neurone di interesse, utilizzando un obiettivo a immersione in olio a 63x/1,4 N.A. in un microscopio a campo chiaro appropriato (Figura 2D).
   NOTA: Nel presente manoscritto, immagini ad alta risoluzione delle spine dendritiche mostrate nella Figura 2D sono state ottenute utilizzando la modalità campo chiaro di un microscopio confocale, modello Zeiss LSM 780. Tuttavia, altri microscopi a campo chiaro possono servire a ottenere immagini z-stack di alta qualità 63x, i cui parametri dovrebbero essere standardizzati da ciascun laboratorio.
2. Applica 1–2 gocce di olio a immersione sulla slide e posiziona l'obiettivo sopra il corretto, assicurandoti di entrare in contatto tra l'obiettivo e l'olio.
3. Metti a fuoco l'immagine e regola le impostazioni della fotocamera, inclusi l'esposizione e il bilanciamento del bianco.
4. Imposta i limiti superiori e inferiori per la pila di immagini.
5. Imposta la distanza di passo a 0,3 μm all'interno della finestra di acquisizione dell'immagine.
6. Cattura lo stack di immagini usando il comando software per l'acquisizione dello stack.
7. Ripeti i passaggi sopra per catturare ogni area di interesse
8. Salva il file dati e salva tutti i file immagine in formato TIFF per l'elaborazione esterna.
   NOTA: Per i passaggi 9 e 10. Se il microscopio non è dotato di uno stadio motorizzato per l'acquisizione a pila Z, le immagini possono essere raccolte manualmente regolando la messa a fuoco micrometrica. Tuttavia, la distanza tra le sezioni ottiche può essere meno precisa. In questo caso, gli Z-stack possono essere ricostruiti successivamente in software di elaborazione immagini (ad esempio, ImageJ) a partire dalla sequenza di immagini acquisita.

11. Analisi morfometrica

NOTA: A questo scopo possono essere utilizzati vari approcci e programmi software specializzati. Alcuni strumenti di accesso gratuito per l'analisi della colonna dorsale dendritica includono ImageJ o, come in questo studio, PyReconstruct¹⁵. Per una descrizione più dettagliata di PyReconstruct e delle sue funzionalità per la ricostruzione neuronale e l'analisi morfometrica, si veda la fonte di riferimento.

1. Procedura per l'analisi morfometrica delle spine dendritiche
   1. Una volta aperto il file in ImageJ, cambia il formato in RGB selezionando Image > Tipo > RGB Color.
   2. Converti le pile Z in una sequenza di immagini in ImageJ: clicca su File > Salva come > sequenza di immagini. Salva ogni sequenza di immagini in una cartella separata per l'analisi successiva. In PyReconstruct, carica la sequenza delle immagini cliccando su File > Nuovo > Da Immagini.
   3. Apparirà una finestra di dialogo, che inviterà l'assegnazione di un nome al file (ad esempio, WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Poi appariranno tre finestre di dialogo successive. Nella prima finestra, inserisci il valore di calibrazione (μm/px). Queste informazioni sono disponibili nei metadati dello Z-stack e possono essere consultate su ImageJ.
   5. Nella seconda finestra, inserisci lo spessore di ogni sezione ottica consecutiva (μm). Infine, la serie di immagini inizierà a caricarsi automaticamente (Figura Supplementare 1A).
   6. Una volta identificato il segmento di interesse, secondo i criteri di inclusione definiti dal ricercatore, procedere con il tracciamento per ottenere dati quantitativi.
   7. Assegna un nome e un dominio distinti a ciascun tipo di traccia. Individua i domini nel pannello inferiore, dove sono rappresentati da forme geometriche colorate diverse (Figura Supplementare 1B).
   8. Disegna una linea corrispondente alla lunghezza desiderata del campione usando lo strumento matita. Successivamente, genera una seconda traccia attraverso la pila Z lungo il segmento dendritico usando lo strumento Z.
   9. Utilizzare la traccia iniziale per determinare la lunghezza appropriata del segmento e verificarla sotto Liste > Lista di traccia Z (Figura Supplementare 1B).
   10. Naviga attraverso la pila Z e identifica le teste dorsale dendritiche con la messa a fuoco ottimale. Con lo strumento matita, traccia la regione distale più larga di ogni testa spinale. Poi, usa lo strumento Z per tracciare il collo della colonna vertebrale lungo tutta la pila Z (Figura supplementare 1C, D). Ripetere questa procedura finché tutte le teste e i colli delle spine all'interno del segmento dendritico selezionato non sono stati tracciati.
2. Misurazioni della testa spinale di esportazione
   1. Apri le liste contenenti le misurazioni di larghezza e lunghezza della testa dorsale. Accedi a queste sotto Listie > Lista di tracce (per la larghezza) e Liste > Lista di tracce Z (per lunghezza), rispettivamente.
   2. Esporta i dati nella posizione desiderata sul computer. Verranno generati due file Excel separati, ciascuno contenente i relativi dati di misurazione.
3. Classifica la morfologia delle spine e calcola la densità
   1. Estrai le misurazioni di larghezza e lunghezza delle teste e del collo della colonna dorsale dai file Excel generati in precedenza.
   2. I dati devono essere organizzati nelle colonne corrispondenti etichettate come Larghezza e Lunghezza per la classificazione morfologica basata sui seguenti^{criteri: 16}: filopodia (>2 μm), sottile (< 2 μm), stubby (rapporto lunghezza-larghezza testa ≤1) e fungo (larghezza della testa >0,6 μm). (Figura supplementare 1E). I filopodi sono stati raramente osservati nei segmenti dendritici analizzati e quindi non sono stati inclusi nell'analisi.
   3. Il numero totale di spine per segmento dendritico analizzato è determinato in questa fase, insieme alla densità spinosa (spine per μm lineare), nonché al tipo e al numero di ciascun sottotipo di spina. Il modello Excel¹⁶ usato per questa analisi è disponibile e è disponibile nella fonte di riferimento. Utilizzando questo metodo, la densità spinale dendritica basale è stata quantificata nella regione CA1 dell'ippocampo in topi femmine di 12 mesi.
   4. Esportare dati quantificati e generare grafici con software scientifici specializzati progettati per l'analisi dei dati, la graficazione grafica e la statistica. Qui, il grafico nella Figura 3 è stato costruito con il software GraphPad Prism.

Risultati

Impregnazione e sezionamento dei tessuti
Il protocollo Golgi–Cox descritto qui ha prodotto una colorazione neuronale affidabile e omogenea nel tessuto cerebrale del topo adulto. Dopo l'impregnazione in soluzione di Golgi–Cox, il cervello ha acquisito una caratteristica colorazione dorata scura, indicando una diffusione riuscita della soluzione di colorazione in tutto il tessuto. La sezionazione con vibratomi ha preservato l'integrità strutturale dei processi somata e ...

Discussione

Il metodo di colorazione di Golgi–Cox rimane una delle tecniche più utilizzate per visualizzare la morfologia neuronale e le spine dendritiche nel tessuto cerebrale^{fisso 3,4}. Impregnando un piccolo sottoinsieme casuale di neuroni, questo metodo consente la visualizzazione di alberi dendritici completi con una minima colorazione di fondo. Nel protocollo attuale, la tecnica ha permesso una chiara visualizzazione dei neuroni piramid...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	Life Technologies	15510-027	CAS 9012-56-6
Soluzione ammoniaca 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Pericoloso.
Dibase fosfato di sodio anidro	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Microscopio a campo chiaro	Nikon	Eclipse Ci
Solfato di cromo potassico	Sigma-Aldrich	243361
Microscopio Confocale	Zeiss	LSM 780
Bilanciamento digitale	Strumenti Accuris	W3200-1200
Embedding stamps	Merck	E6032	Dimensioni: 22x22 mm
Etanolo	Meyer	394
Animali sperimentali	Il Laboratorio Jackson	2124-01	B6129SF2/J ceppo di topo
Polvere di gelatina	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad Prism Software	GraphPad Software Inc.		Versione 8.0.2
ImageJ Fiji Software	Istituto Nazionale di Salute degli Stati Uniti		Versione 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Cloruro mercurico	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Pericoloso.
Camera per microscopio	Nikon	DS-Vi1
Obiettivo microscopico (10x)	Nikon	93183	Piano 10x/0,25 N.A.
Obiettivo per microscopio (1x)	Nikon	93180	Piano UW 1x/0.04 N.A.
Obiettivo microscopico (20x)	Nikon	93184	Piano 20x/0.40 N.A.
Obiettivo microscopico (4x)	Nikon	93182	Piano 4x/0.10 N.A.
Obiettivo per microscopio (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Vedute per microscopio	Sigma-Aldrich	S8902
Monobase monoidrata fosfato di sodio	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Smalto per unghie	COLORI PECCAMINOSI	COLORE AUDACE	Trasparente
Supporti di montaggio permount	Fisher Scientific	SP15-500
Cromato di potassio	Productos Quí Micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Pericoloso.
Dicromato di potassio	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Pericoloso.
PyReconstruct Software	Università del Texas, Austin		Versione 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Cloruro di sodio	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Tiosolfato di sodio	Productos Quí Micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Pericoloso.
Sucrosio	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 e gradi Rotazione specifica, reagente ACS
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	VELOCITÀ 20 mm/s, AMPL e ndash; 0,60 mm
Xylene	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Pericoloso.