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Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Sun Yat-sen (Approvazione n. SYSU-IACUC-2026-B1278) e sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali.
1. Isolamento e coltura dei SLC primari di topo
- Dissezionare i testicoli dei topi C57BL/6 e rimuovere con cura la tunica albuginea.
- Trita i testicoli in piccoli pezzi.
- Dissociare le cellule interstiziali dai tubuli seminiferi incubando 1 mg/mL di collagenasi di tipo IV in DMEM/F12 a 37 ºC per 15 minuti.
- Aggiungi DMEM/F12 contenente il 10% di siero fetale bovino per fermare l'attività della collagenasi.
- Centrifuga a 1500 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendi il pellet in PBS e filtra attraverso un filtro da 70 μm.
- Arricchire le celle CD51⁺ tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) utilizzando un Influx Cell Sorter.
- Seminare le cellule arricchite in un mezzo colturale SLC composto da DMEM/F12 integrato con: 1 nM desametasone, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L insulina-transferrina-sodio selenite, estratto di embrione di pollo al 5%, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, 1% di amminoacidi non essenziali, 1% N2, 2% B27, fattore di crescita fibroblastico basico 20 ng/mL, fattore di crescita epidermico, fattore di crescita derivato dalle piastrine e oncostatina M.
- Coltivare i SLC in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂) fino a raggiungere la densità desiderata per la semina su idrogel.
2. Montaggio del contenitore in vetro per colata gel
- Ispezionare e pulire attentamente le lastre di vetro specializzate e i distanziatori utilizzati per la fusione dei gel di elettroforesi in gel di poliacrilammide (PAGE), assicurandosi che siano privi di polvere, danni e residui.
- Assemblare correttamente le lastre di vetro, i distanziatori e le pinze secondo le istruzioni del produttore, assicurandosi che l'insieme sia ben sigillato per evitare perdite durante la colata del gel.
- Posiziona il contenitore di vetro assemblato in modo sicuro su un supporto da laboratorio, pronto per la fusione.
NOTA: Il setup di colata utilizza lastre di vetro standard Western blot (solfato di dodecile di sodio [SDS]-PAGE) con distanziatori fissi di uno spessore di 1,0 mm, garantendo uno spessore riproducibile del gel e una superficie piatta per la coltura cellulare.
3. Preparazione della soluzione di gel PAGE
- Misurare con precisione i seguenti reagenti secondo il disegno sperimentale (vedi Tabella 1) in un tubo centrifuga sterile da 15 mL o 50 mL: soluzione stock di acrilammide al 40%, soluzione stock di bis-acrilammide al 2%, buffer HEPES 1M (pH 8,5), ddH₂O sterile.
ATTENZIONE: Acrilammide e bis-acrilammide sono neurotossine. Indossa sempre guanti e una maschera antipolvere quando pesi la polvere secca per evitare il contatto con la pelle e l'inalazione di particelle in sospeso aereo. Le procedure devono essere eseguite all'interno di una cappa a vapore.
4. Aggiunta di iniziatore e catalizzatore, e colata del gel
- Aggiungi sequenzialmente il seguente alla soluzione mista: Persolfato di Ammonio al 10% (APS): Agisce come iniziatore per avviare la reazione di polimerizzazione. N,N,N',N'--Tetrametiletenediamina (TEMED): Agisce come catalizzatore per accelerare la reazione di polimerizzazione. Per un volume totale di gel di 6 mL, aggiungere 60 μL di APS al 10% e 6 μL di TEMED (vedi Tabella 1 per la scala).
NOTA: La reazione di polimerizzazione inizia immediatamente dopo l'aggiunta di TEMED; Pertanto, i passaggi successivi devono essere eseguiti rapidamente.
5. Versare la soluzione mista
- Immediatamente pipetta o versa la soluzione mista costantemente lungo un bordo del contenitore di vetro per evitare di creare bolle.
6. Permettere al gel di polimerizzare
- Lascia il contenitore del gel gettato indisturbato a temperatura ambiente.
NOTA: La polimerizzazione di solito richiede 15–30 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).
- Procedere al passo successivo una volta visibile un'interfaccia chiara tra la miscela di gel non polimerizzato e il gel polimerizzato e il gel completamente solido (il gel non scorre quando il contenitore è inclinato).
- Immediatamente dopo la fusione, si sovrappone con cura uno strato sottile di etanolo assoluto (o etanolo saturo d'acqua) sulla miscela gel per escludere l'ossigeno atmosferico, che inibisce la polimerizzazione radicale. L'etanolo aiuta anche a formare una superficie superiore piatta.
- Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'etanolo prima di smontare le lastre.
7. Smontare il contenitore e raccogliere il gel
- Smonta con cura le pinze e usa uno stema o una spatola di plastica per separare delicatamente le lastre di vetro, permettendo al gel polimerizzato PAGE di rimanere intatto su una piastra sola.
- Prepara un piatto di coltura contenente una quantità abbondante di PBS sterile.
- Speggi con cura il gel dal piatto di vetro usando una spatola o una mano guantata e lascialo scivolare liscio nel PBS.
- Sigilla la ciotola contenente il gel in PBS e incuba a 4 °C durante la notte.
NOTA: Questo passaggio è cruciale. Il gel appena preparato è disidratato e deve assorbire completamente l'acqua e gonfiarsi fino alle dimensioni finali in PBS. Se questo passaggio viene saltato e il gel viene tagliato direttamente, continuerà ad espandersi nel successivo mezzo di coltura cellulare, probabilmente superando l'area del pozzo di coltura e rendendolo inutilizzabile. Lo spessore del gel dopo il gonfiore è di 1 mm. Questo è fondamentale perché quando lo spessore del gel scende sotto i 100 μm, le cellule possono percepire la rigidità della piastra di coltura rigida sottostante, il che interferirebbe con le misurazioni meccanobiologiche previste.
8. Taglio e trasferimento del gel su una piastra di coltura
- Il giorno dopo, recupera il gel da 4 °C. Utilizzando un punzone sterile per biopsia o un taglialama (con un diametro corrispondente alla dimensione del pozzo della piastra di coltura, ad esempio una piastra a 6 pozzi), tagliare il gel in condizioni sterili.
- All'interno di un armadietto di biosicurezza, usa una pinza sterile per sollevare delicatamente il disco di gel tagliato e posizionarlo al centro di un pozzo di coltura vuoto e sterile.
9. Lavaggio iniziale e irradiazione UV
- Aggiungi abbastanza PBS sterile al pozzo contenente il gel, assicurandoti che sia completamente sommerso.
- Dondola delicatamente la piastra di coltura per lavare la superficie del gel.
- Aspira il PBS usando una pipetta.
- Ripeti ancora una volta questo processo di lavaggio, per un totale di due lavaggi, ciascuno della durata di 3 minuti.
- Dopo il lavaggio, aggiungi abbastanza PBS sterile per coprire nuovamente il gel. Metti l'intera piastra di coltura con il coperchio leggermente socchiuso sotto una lampada UV (all'interno di un armadietto di biosicurezza o di un crosslinker UV dedicato) e irradia per 1 ora per la sterilizzazione di base.
10. Attivazione del reticolatore Sulfo-SANPAH
- All'interno dell'armadietto di biosicurezza, aspira con cura il PBS dal pozzo.
- Prima di aspirare, separare delicatamente il gel dalle pareti e dal fondo del pozzo usando una punta di pipetta per evitare di danneggiare il gel a causa della tensione superficiale del liquido.
- Trasferisci il gel in un altro pozzo pulito nella stessa piastra di coltura usando una pinza sterile.
NOTA: Durante il trasferimento del gel, aggiungere prima una piccola quantità di PBS al pozzo pulito può aiutare a espellere le bolle d'aria intrappolate tra il fondo del pozzo e il gel al momento della posazione, e funge anche da lavaggio aggiuntivo.
- Prepara la soluzione di lavoro per reticulatori: Prepara frescamente una soluzione di lavoro Sulfo-SANPAH da 0,2 mg/mL diluendo la soluzione di base (vedi Tabella 1) usando acqua sterile o il tampone raccomandato (ad esempio, PBS).
NOTA: Proteggi la soluzione dalla luce.
- Aggiungere una soluzione di lavoro sufficiente di Sulfo-SANPAH per coprire il gel (ad esempio, 250 μL per una piastra a 12 pozzi, 500 μL per una a 6 pozzetti), assicurandosi che il gel sia completamente coperto.
- Posizionare la piastra sotto lunghezza d'onda da 365 nm /120 mJ/cm 2 luce UV e irradiare per 1 ora.
NOTA: Questo passaggio attiva Sulfo-SANPAH, permettendogli di legarsi ai gruppi funzionali sulla superficie del gel.
11. Attivazione del reticolatore e lavaggi finali
- Dopo l'irradiazione, aspirare la soluzione di Sulfo-SANPAH dal pozzo all'interno dell'armadietto di biosicurezza.
- Aggiungi abbastanza PBS sterile al pozzo, dondola delicatamente per lavare la superficie del gel e aspira il PBS.
- Ripeti ancora una volta questo processo di lavaggio, per un totale di due lavaggi, ciascuno della durata di 3 minuti, per rimuovere completamente qualsiasi Sulfo-SANPAH non reagito.
12. Preparazione della soluzione lavorativa per collagene tipo I per la coda di ratto
- Usa una soluzione di acido acetico 0,02 M come solvente per diluire la soluzione di collagene tipo I per la coda di ratto.
- Regolare la concentrazione finale della soluzione lavorativa a 60–100 μg/mL. Ad esempio, se la concentrazione di stock di collagene è di 4 mg/mL, aggiungere 15–25 μL di stock a 985–975 μL di acido acetico 0,02 M per ottenere 1 mL di soluzione lavorativa.
13. Rivestimento e incubazione del collagene
- Aggiungere il volume appropriato di soluzione lavorativa a collagene a ogni pozzo contenente il gel attivato in base al tipo di piastra di piastra di rilievo: aggiungere 2 mL per una piastra a 6 pozzetti, oppure 1 mL per una a 12 pozzetti.
- Fai ruotare delicatamente la piastra di coltura per assicurarti che la soluzione di collagene copra uniformemente il gel e il fondo del pozzo.
- Copri la piastra e incuba durante la notte in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂ per permettere al collagene di fissarsi sulla superficie del gel tramite reticolazione Sulfo-SANPAH.
14. Irradiazione e fissazione secondaria dei raggi UV
- Il giorno dopo, rimuovi la piastra e irradia di nuovo sotto circa 120 mJ/cm 2 luce UV per 1 ora.
15. Rimuovere il collagene non legato e le cellule dei semi
- All'interno dell'armadietto di biosicurezza, aspira con cura la soluzione lavorativa di collagene tipo I della coda di ratto dai pozzi.
- Aggiungi PBS sterile ai pozzi, roccia delicatamente la superficie del gel e aspira il PBS.
- Ripeti il lavaggio ancora una volta, per un totale di due lavaggi, ciascuno della durata di 3 minuti.
- Dopo il lavaggio, la matrice del gel è pronta. Risospendere le cellule staminali di Leydig preparate nel mezzo di coltura SLC completo (composizione dettagliata nel passo 1).
- Semina la sospensione cellulare direttamente sulla superficie del gel. La densità di semina raccomandata è 2 × 104 cellule/cm2 (ad esempio, circa 2 × 105 celle per pozzo per una piastra standard a 6 pozzi).
- Incubare le piastre di coltura a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂.
- Per mantenere la vitalità ottimale delle cellule e la funzione steroidogenica, cambia il substrato di coltura ogni 48 ore.