Analisi optogenetica del comportamento nella zanzara Aedes aegypti

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso dell'optogenetica per comprendere il comportamento della zanzara Aedes aegypti. Vengono presentati metodi per l'allevamento, la preparazione, i saggi e l'analisi per valutare la funzione neuronale durante l'attrazione verso gli animali ospite e l'alimentazione con sangue. Queste tecniche fondamentali permetteranno studi sui circuiti neurali e sul comportamento di questo importante vettore di malattie umane.

Abstract

La zanzara Aedes aegypti è un importante vettore di agenti patogeni virali e rappresenta un modello per altre specie di vettori. La trasmissione degli agenti patogeni avviene quando una zanzara punge un animale ospite, ma i circuiti neurali che controllano il comportamento di ricerca e di puntura rimangono sconosciuti. Questo articolo descrive metodi per manipolare l'attività neuronale nella zanzara mediante optogenetica, una tecnica fondamentale per determinare la relazione causale tra circuiti neurali e comportamento. Tali metodi comprendono l'allevamento delle zanzare per applicazioni optogenetiche e tre saggi progettati per misurare diversi passaggi della sequenza di attivazione, attrazione, sondaggio con il pungiglione e ingorgamento di sangue dell'ospite. Questi comportamenti si verificano su scale spaziali differenti e in risposta a stimoli sensoriali diversi. Ogni saggio comportamentale è dotato di LED rossi (~625 nm) per l'attivazione optogenetica. Per rilevare l'attivazione in risposta a stimoli olfattivi, vengono quantificati il volo e la deambulazione. Per valutare l'attrazione o l'atterraggio, le zanzare vengono esposte a un pasto ematico riscaldato in un'arena di grandi dimensioni. Il sondaggio con il pungiglione e l'ingorgamento vengono analizzati mediante video ad alta risoluzione, consentendo la misurazione degli arti e delle dimensioni dell'addome. Il protocollo descrive modelli di visione artificiale per consentire una quantificazione temporale ad alta risoluzione del comportamento e misurazioni finali dell'alimentazione. Questi metodi possono essere utilizzati per verificare il ruolo di qualsiasi popolazione neuronale accessibile geneticamente nel comportamento di puntura delle zanzare e possono essere estesi ad altri comportamenti.

Introduzione

Il morso della zanzara è uno dei più pericolosi al mondo, non per la sua ferocia o forza, ma per la sua efficienza come vettore di malattie. I parassiti responsabili della malaria si diffondono mediante Anopheles le zanzare sono responsabili di centinaia di migliaia di morti ogni anno, mentre Aedes aegypti e Aedes albopictus sono responsabili della diffusione della febbre gialla, del dengue, della chikungunya, della febbre Zika e di molte altre malattie potenzialmente letali¹. I moscerini sono presenti su ogni continente tranne l'Antartide e rappresentano una grande preoccupazione per la salute pubblica². Il comportamento di alimentazione ematica trasmette direttamente i patogeni, ma rappresenta anche una fase essenziale nella zanzara ciclo vitale, poiché è necessario un pasto ematico da vertebrati per deporre le uova. Pertanto, contenere la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare richiede la comprensione dei loro meccanismi di ricerca dell'ospite.

È ormai ben noto che le zanzare femmine utilizzano segnali a lunga e a corta distanza per localizzare gli ospiti^3,4. L'anidride carbonica (CO₂) è un gas altamente volatile presente nell'esalazione umana ed è spesso il primo segnale percepito dalla zanzara. Nei neuroni sensoriali olfattivi di Aedes aegypti, essa viene rilevata dalle proteine Gr1, Gr2 e Gr3, che formano il recettore per la CO₂⁵. L'esposizione alla CO₂ induce un comportamento di decollo e volo, noto anche come attivazione^6,7, che può persistere fino a 10–15 minuti, anche in assenza di ulteriori stimoli⁸. La CO₂ agisce in sinergia con l'odore della pelle per potenziare l'attivazione e l'attrazione^5,9. Dopo il rilevamento della CO₂ e dell'odore della pelle, la zanzara è predisposta a percepire ulteriori segnali dell'ospite più prossimali, come il calore, il contrasto visivo e l'umidità, che la guidano verso l'atterraggio su un ospite adatto al pasto ematico^{5,10,11,12,13}. L'integrazione di più segnali sensoriali consente alle zanzare di perseguire e localizzare efficacemente il loro ospite.

Quando una zanzara femmina si posa su un potenziale ospite, spinge il suo rostro verso la superficie finché non individua una zona della pelle, un processo noto come sondaggio^14,15. Dopo il sondaggio, lo stiletto trafigge la pelle, localizza un vaso sanguigno e contemporaneamente ingerisce sangue mentre inietta saliva, permettendo alla zanzara di raddoppiare il proprio peso corporeo in pochi minuti¹⁶. Il sangue viene indirizzato all'intestino medio, dove le proteine vengono digerite per la produzione delle uova. Curiosamente, l'ingorgamento sull'ospite non è necessario per la trasmissione del patogeno, poiché il solo sondaggio può trasmettere la malattia^16,17. Pertanto, comprendere ogni fase del comportamento di puntura potrebbe consentire lo sviluppo di strategie per interrompere la ricerca dell'ospite e il morso da parte delle zanzare femmine, e in ultima analisi controllare la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare.

Sono stati sviluppati numerosi strumenti in organismi modello per manipolare l'attività neuronale. I primi strumenti agivano in modo costitutivo o mediante attivazione termica^18,19,20,21. Sebbene utili, questi reagenti genetici presentano alcuni svantaggi. Gli strumenti costitutivi possono influenzare lo sviluppo, portando a fenotipi non attribuibili esclusivamente alla funzione circuitale dei neuroni. Le zanzare utilizzano il calore corporeo per identificare i vertebrati ospiti, rendendo i canali attivati termicamente particolarmente inadatti per lo studio del loro comportamento^22,23. Negli studi sul comportamento, l'optogenetica indica l'uso di strumenti genetici che rispondono a specifiche lunghezze d'onda della luce per controllare l'attivazione dei neuroni di interesse. Questa tecnica è già stata utilizzata in diversi sistemi, dall'esame della valenza della sete nei topi allo studio del comportamento di corteggiamento in Drosophila, fino al recupero della perdita visiva causata dalla retinite pigmentosa in studi clinici sull'uomo^24,25,26. I canali optogenetici funzionano assorbendo fotoni e permettendo il passaggio di specifici tipi di ioni attraverso la membrana plasmatica, attivando o inibendo il neurone. Introducendo nell'organismo geni transgenici che codificano per proteine sensibili alla luce, questa tecnica può essere utilizzata per attivare o inibire neuroni specifici che altrimenti sarebbero impossibili da manipolare. L'optogenetica offre vantaggi nel controllo temporale e spaziale, nonché una serie di controlli che permettono inferenze sperimentali.

Gli autori hanno recentemente descritto il primo utilizzo di strumenti optogenetici per lo studio del comportamento delle zanzare⁸. Questi strumenti si basano sul canale cationico attivato dalla luce rossa CsChrimson, un channelrodopsina con spostamento verso il rosso²⁷. Gli opsin microbici, incluso CsChrimson, richiedono un cofattore chimico, il retinale all-trans, per assorbire i fotoni²⁸. CsChrimson è fuso al reporter fluorescente tdTomato ed è sotto il controllo del sistema binario di espressione QF2/QUAS, consentendo una combinazione flessibile con diverse linee di attivazione²⁹. Per indirizzare i neuroni sensoriali del CO₂, è stata utilizzata una linea di attivazione che esprime il fattore di trascrizione QF2 nei neuroni che esprimono la subunità Gr3 del recettore del CO₂³⁰. Le zanzare hanno mostrato una risposta comportamentale minima dopo esposizione alla luce rossa da sola⁸; inoltre, la luce rossa è la più efficace nel penetrare i tessuti biologici, rendendo un opsin attivato dalla luce rossa ideale per l'optogenetica²⁵.

Questo articolo descrive i protocolli per tre saggi che misurano diversi aspetti del comportamento di ricerca dell'ospite e di alimentazione con il sangue, combinati con stimolazione optogenetica (Figura 1A). In primo luogo, viene fornito un protocollo per l'allevamento di linee di zanzare optogenetiche. La seconda sezione descrive l'opto-termociclatore, un termociclatore PCR modificato che può essere utilizzato per monitorare l'attivazione e la perforazione quando le zanzare sono esposte a stimoli termici e luminosi. Il saggio con l'opto-termociclatore è progettato per misurare questi comportamenti di ricerca su scale temporali prolungate, utilizzando ceppi attivatori per controllare l'attività neuronale mediante optogenetica. La terza sezione descrive il saggio della coperta di sangue, in cui le zanzare hanno accesso costante a un pasto artificiale di sangue sottile alla base di un termociclatore modificato, consentendo il monitoraggio del volo, della perforazione e dell'ingorgamento in diverse condizioni di luce e temperatura. Il saggio della coperta di sangue, basato sull'opto-termociclatore, fornisce un metodo per quantificare l'ingorgamento con un pasto artificiale di sangue, permettendo lo studio dei comportamenti di alimentazione delle zanzare mediante stimoli optogenetici e termici precisi nel tempo. L'ultima sezione descrive il distributore a membrana optogenetico, nel quale alle zanzare viene offerto un pasto di sangue caldo contenuto in un contenitore, consentendo il monitoraggio sia dell'attrazione verso una fonte di sangue sia dell'ingorgamento in presenza di stimoli luminosi. Il saggio con il distributore a membrana optogenetico viene utilizzato per studiare l'intera sequenza comportamentale di ricerca dell'ospite e di alimentazione con il sangue in un sistema di volo libero. Oltre agli output attesi per ciascun saggio, vengono descritti modelli di visione artificiale per tracciare le parti del corpo delle zanzare e identificare i comportamenti durante i saggi. I saggi con opto-termociclatore, coperta di sangue e distributore a membrana optogenetico consentono la misurazione di stadi distinti del comportamento di alimentazione con il sangue nelle zanzare, manipolando al contempo l'attività neuronale mediante luce. Queste tecniche innovative permettono di studiare come i circuiti neurali delle zanzare controllino comportamenti che rappresentano una minaccia per la salute pubblica.

Protocollo

Le zanzare utilizzate in questo protocollo contengono transgeni e, secondo le normative del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, devono essere allevate in strutture di contenimento per artropodi di livello II³². Le zanzare vengono contenute per prevenire fughe e smaltite come rifiuti biologici pericolosi. I protocolli di sicurezza biologica e di contenimento degli artropodi sono stati esaminati e approvati da Yale Environmental Health & Safety. Questo lavoro non prevede l'uso di soggetti umani o animali. Il genotipo delle zanzare può essere confermato mediante marcatori fluorescenti (3xP3-dsRed per Gr3-QF2 e 3xP3-CFP per QUAS-CsChrimson) o mediante PCR per il costrutto inserito⁸. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Allevamento optogenetico

1. Allevare le zanzare seguendo il protocollo standard³¹, con le seguenti eccezioni per massimizzare la risposta delle linee optogenetiche durante l'esperimento.
2. Eseguire gli incroci utilizzando ceppi omozigoti di Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e ceppi selvatici di Liverpool per generare le linee eterozigoti sperimentali Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+ e Gr3>CsChrimson.
3. Allevare le zanzare all'interno di un incubatore ermetico alla luce impostato a 28 °C e 80% di umidità, con un ciclo di 14 h di luce blu (450 nm) e 10 h di buio (Figura 1B).
   NOTA: L'uso della luce blu minimizza l'attivazione di canali attivati dalla luce rossa, come CsChrimson. Tutte le fasi di allevamento svolte all'esterno dell'incubatore devono essere effettuate in condizioni di scarsa illuminazione.
4. Iniziare gli esperimenti su zanzare adulte non prima di una settimana dopo l'eclosione.
   NOTA: Sebbene l'età ideale per gli esperimenti comportamentali sia di 2–3 settimane, possono essere utilizzate zanzare fino a 4 settimane dopo l'eclosione. I genotipi di controllo e sperimentali devono avere la stessa età, registrata come giorni dopo l'eclosione. Per standardizzare l'età degli animali, tutte le uova devono schiudersi nello stesso giorno.
5. Due giorni prima dell'esperimento, aspirare delicatamente le femmine accoppiate e non alimentate con sangue dalle gabbie e anestetizzarle a 4 °C. Trasferirle con cura, utilizzando una piuma o un aspiratore, nei contenitori sperimentali in base al saggio da eseguire.
6. Preparare un'aliquote di retinale all-trans (ATR) 0,2 M in dimetilsulfossido (DMSO), conservata a -20 °C. Fornire una soluzione di saccarosio al 10% e 400 µM di ATR tramite stoppini di cotone imbevuti posti sulla rete del contenitore. Gli animali possono nutrirsi per 1–3 giorni al buio con questo pasto.
   NOTA: L'alimentazione al buio, anziché sotto luce blu, previene lo sbiancamento dell'ATR (Figura 1B). Inoltre, in tutte le fasi del protocollo, le zanzare sono state anestetizzate esponendole a 4 °C per 5–10 minuti, fino a quando non si muovevano più. Al termine di ogni esperimento, le zanzare sono state eutanasiate esponendole a -20 °C per 24 ore.
   ATTENZIONE: La retinale all-trans può causare gravi irritazioni a contatto con la pelle e gli occhi. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, come camice da laboratorio, guanti e protezione oculare durante la manipolazione. Il dimetilsulfossido è un liquido infiammabile che può essere assorbito attraverso la pelle a contatto ed è necessario manipolarlo in un ambiente asciutto con dispositivi di protezione individuale e protezione oculare adeguati. Il DMSO deve essere conservato in contenitori chimici a prova di fuoco.
7. Un giorno (20–24 h) prima dell'esperimento, sostituire i distributori di saccarosio con nuovi distributori contenenti acqua distillata e 400 µM di ATR. Gli animali rimangono al buio fino all'inizio dell'esperimento (Figura 1B). Procedere alla sezione 2, 3 o 4.
   NOTA: Gli esperimenti devono essere eseguiti durante il fotoperiodo diurno delle zanzare per massimizzare il tasso di risposta.

2. Opto-termociclatore

1. Assemblaggio dei componenti del saggio
   1. Preparare le lastre in acrilico per contenere le zanzare (Figura 2). Fare riferimento alla Figura 2A per uno schema, Figura 2B per i componenti elettronici, e alla Figura 2C per un'immagine della lastra in acrilico. Consultare i file disponibili su (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) per i modelli.
      1. Per creare le pareti, tagliare al laser un foglio in acrilico da 3 mm in quattro rettangoli da 10 cm × 1 cm e sei rettangoli da 7 cm × 1 cm. Incollare i rettangoli con colla per acrilico in una matrice 5 × 3, dove ogni unità è una camera da 17 mm × 17 mm × 10 mm. Il modello per questi pezzi è nel file “14_animal_thick_v3.ai”.
         ​ATTENZIONE: La colla per acrilico è infiammabile e può causare irritazione respiratoria e agli occhi. Durante la manipolazione della colla per acrilico, si devono indossare idonei dispositivi di protezione individuale (DPI), come guanti, camice da laboratorio e occhiali protettivi, e il solvente deve essere utilizzato in un'area ben ventilata, lontano da fiamme libere.
      2. Per il fondo della camera, tagliare un foglio in acrilico da 1,5 mm di spessore in dimensioni 6,985 cm × 10,16 cm, rimuovendo la cavità in basso a destra. Tagliare un foglio in acrilico da 1,5 mm di spessore in un rettangolo da 6,985 cm × 10,16 cm per il coperchio. Il modello per questi pezzi è “14_animal_thin_v3.ai”.
   2. Tagliare un foglio in maglia nera resistente ai raggi UV alle stesse dimensioni del pezzo in acrilico inferiore (Figura 2C). Inserire la maglia tra le pareti della lastra e il pezzo inferiore, quindi incollarli con colla per acrilico. Rimuovere la maglia dalla cavità in basso a destra in modo che il foro sia libero da ostacoli.
2. Costruire una struttura che sostenga la fotocamera e i LED (Figura 2A).
   1. Costruire una struttura con quattro pilastri posti in ciascun angolo del termociclatore, utilizzando rotaie quadrate da 60,96 cm e 25 mm per costruzioni ottiche. Utilizzare due rotaie da 22,86 cm e 25 mm per collegare il pilastro anteriore destro a quello posteriore destro e il pilastro anteriore sinistro a quello posteriore sinistro, a 30 cm dal banco.
   2. Collegare i pilastri destro e sinistro nella parte anteriore con una rotaia da 30,48 cm e 25 mm, posizionata a 24 cm dal banco, e nella parte posteriore con una rotaia da 30,48 cm e 25 mm, posizionata a 42 cm dal banco.
   3. Montare su entrambi i lati della struttura, sui pilastri sinistro e destro, dei supporti ottici lunghi 30,48 cm. Fissare a ciascun supporto sei LED rossi da 627 nm collegati in serie, posizionati a 24 cm sopra il blocco PCR del termociclatore.
      NOTA: Sebbene la lunghezza d'onda di luce che determina l'attività massima di CsChrimson sia ~590 nm, lunghezze d'onda vicine a ~625 nm consentono di attivare efficacemente CsChrimson riducendo al contempo le risposte comportamentali alla luce nei controlli genetici²⁷. Applicare un dissipatore di calore e una lente su ciascun LED per focalizzare la luce verso il blocco del termociclatore.
   4. Fissare un supporto ottico da 30,48 cm sulla sommità dei due pilastri anteriori della struttura. Utilizzare una pinza ad angolo retto al centro del supporto ottico per montare un supporto da 15,24 cm orientato verso l'interno, sopra il blocco del termociclatore. Fissare una fotocamera con filtro passa-lungo a infrarossi all'estremità del supporto, orientata verso il basso, a 40 cm dal blocco.
   5. Utilizzando supporti ottici, costruire una struttura che si estende dalla rotaia di costruzione in un rettangolo intorno al blocco PCR, posizionato appena sopra la superficie. Fissare una striscia di LED a infrarossi, orientata verso il blocco PCR, per illuminare le zanzare a un angolo retto rispetto alla fotocamera.
      NOTA: L'illuminazione a infrarossi utilizzata per l'acquisizione video non riscalda in modo misurabile l'arena, poiché la superficie del termociclatore viene mantenuta a 24 °C per tutta la durata dell'esperimento.
   6. Coprire la struttura con una tenda oscurante per evitare interferenze dovute alla luce ambientale.
   7. Coprire la superficie e i lati del blocco PCR con un singolo strato di nastro oscurante per creare una superficie uniforme e piatta con sfondo scuro.
   8. Posizionare il sensore della termocoppia nell'angolo in basso a destra del blocco PCR e fissarlo con nastro oscurante. Verificare una distribuzione uniforme della luce sul blocco PCR utilizzando un misuratore di potenza. Regolare la tensione o la corrente dell'alimentatore per fornire una luce di 12 µW/mm².
   9. Sul bordo del blocco PCR, posizionare un LED a infrarossi per sincronizzare l'acquisizione video con l'uscita del segnale di stimolo (Figura 2C). Coprire la superficie con nastro nero in modo che la luce sia rilevabile senza creare riflessi nella fotocamera.
   10. Collegare la termocoppia, il LED di sincronizzazione e i LED rossi secondo lo schema riportato nella Figura 2B. Scaricare il software necessario (SpinView (versione 1.27.0.48), CoolTerm (versione 2.0.1), Arduino IDE (versione 1.8.12)). Scaricare il codice Arduino e il programma del termociclatore dal repository GitHub.
       ​NOTA: Il codice Arduino è programmato per erogare luce rossa, calore a temperatura corporea e la combinazione di questi due stimoli. Sono disponibili sette programmi di stimolo, con ordine randomizzato tra di essi, forniti come risorse. Questi possono essere modificati per erogare stimoli diversi. Ci sono nove stimoli per esperimento: tre con calore soltanto, tre con luce soltanto e tre con calore e luce simultaneamente. L'erogazione degli stimoli avviene quando Arduino rileva variazioni della temperatura superficiale del blocco PCR tramite la termocoppia, quindi eroga gli stimoli luminosi nei tempi specificati. Ulteriori dettagli sono disponibili nei commenti all'interno dei programmi di stimolo.
3. Preparazione della prova
   1. Allevare le zanzare seguendo il protocollo di allevamento optogenetico; vedere sezione 1 e Figura 1B.
   2. Due giorni prima dell'esperimento, trasferire 14 zanzare femmine con un aspiratore in un contenitore separato. Fornire ATR alle zanzare secondo il passaggio 1.6. Se si confrontano più genotipi, mantenere l'esperimentatore in cecità rispetto ai gruppi.
      ​NOTA: Una volta che le zanzare hanno ricevuto ATR, devono essere manipolate in luce fioca.
   3. Un giorno prima dell'esperimento (20–24 h), aspirare 14 zanzare femmine per ogni lastra in acrilico e anestetizzarle a 4 °C. Posizionare con attenzione una zanzara alla volta in ciascuna cavità, utilizzando una penna o un aspiratore.
   4. Fissare lateralmente il coperchio della lastra in acrilico con nastro adesivo trasparente. Non piegare il nastro sul bordo superiore o inferiore della lastra in acrilico, poiché ciò ostacolerebbe la visuale della fotocamera.
   5. Posizionare la lastra in acrilico sopra tre stoppini in cotone inumiditi con soluzione di ATR 400 µM in acqua distillata (vedere passaggio 1.6), disposti in parallelo. Allineare ciascuna delle tre file a uno stoppino in modo che tutte le zanzare abbiano accesso alla soluzione acqua-ATR. Collocare la lastra in acrilico in un incubatore buio per tutta la notte.
4. Esecuzione della prova
   1. Collegare la fotocamera, i LED e Arduino al computer. Accendere l'alimentatore. Pulire la superficie dell'opto-termociclatore con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare.
      ​ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile e può causare grave irritazione agli occhi. Si devono indossare idonei dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dell'etanolo. Inoltre, evitare qualsiasi fiamma libera.
   2. Utilizzando un contenitore scuro, trasferire la lastra in acrilico con le zanzare al centro del blocco PCR. Coprire l'opto-termociclatore con una tenda oscurante.
   3. Aprire SpinView sul computer. Fare clic sul nome della fotocamera per aprire la vista della fotocamera. Collegare le luci a infrarossi e verificare che il blocco PCR e la lastra in acrilico siano visibili nell'immagine.
   4. Se necessario, regolare la posizione della lastra in acrilico in modo che sia allineata, centrata e che la termocoppia sia visibile nell'angolo in basso a destra. Assicurarsi che la luce di sincronizzazione sia all'interno dell'inquadratura (Figura 2C).
   5. Regolare le impostazioni della fotocamera e di SpinView per ottenere un video nitido e ritagliato che mostri la lastra in acrilico. Nella scheda Image Format, modificare le opzioni Width, Height, Offset X e Offset Y per assicurare che la lastra in acrilico e la luce di sincronizzazione siano visibili. Nella scheda Settings, impostare Acquisition Frame Rate Enable su true e Acquisition Frame Rate su 30 fps.
   6. Disattivare Exposure Auto e Gain Auto. Regolare i valori di Exposure Time e Gain per ottenere un contrasto netto tra lo sfondo nero e le zanzare. Fare clic sul pulsante rosso di registrazione nell'angolo in alto a destra per aprire una finestra separata in cui salvare il file video.
   7. Nella finestra pop-up, impostare il percorso del file in alto: fare clic su Browse, spostarsi nella cartella sperimentale, fare clic su New folder e denominarla con il nome della prova. Impostare il numero di fotogrammi da registrare in base all'esperimento (ad esempio, 43.500) oppure impostarlo su 0 per interrompere manualmente la registrazione.
   8. Nella scheda Videos, impostare i seguenti campi: Video Recording Type: MJPG, Video File Split Size: 1000 MB, JPEG Compression Quality: 65. Aprire il programma ‘optothermo_lightheat_random1’ sul termociclatore e avviarlo. Il termociclatore dovrebbe iniziare con un passaggio di attesa a 25 °C.
   9. Aprire il programma corrispondente, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino’, nell'Arduino IDE e caricarlo sulla scheda. Aprire il monitor seriale e verificare che la temperatura sia approssimativamente 25 °C.
   10. Chiudere il monitor seriale nell'Arduino IDE. Aprire CoolTerm per iniziare l'acquisizione dell'output seriale di Arduino. Assicurarsi che la porta seriale e il canale corrispondano a quelli nell'Arduino IDE. L'output appare nella finestra di CoolTerm.
   11. Iniziare l'acquisizione dell'output di Arduino su un file di testo/binario. Avviare la registrazione video su SpinView. Fare clic su Resume per terminare l'attesa del termociclatore. Osservare l'output di Arduino in CoolTerm per verificare che la temperatura scenda a 18 °C e che il contatore degli stimoli aumenti a 1, avviando così la prova. Lasciare che il saggio prosegua fino al completamento della prova.
5. Pulizia
   1. Interrompere la registrazione video e l'acquisizione dell'output di CoolTerm. Chiudere entrambi i programmi. Terminare il programma del termociclatore. Rimuovere la lastra in acrilico con le zanzare dal termociclatore e posizionarla in un congelatore a -20 °C per tutta la notte per eutanasia delle zanzare.
      ​ATTENZIONE: Quando si pratica l'eutanasia su zanzare transgeniche, assicurarsi che rimangano in un ambiente a -20 °C per almeno 24 ore prima di smaltirle in un contenitore per rifiuti biologici per garantirne la morte.
   2. Se si intende avviare un'altra prova, ripetere la sezione 2.3. Scollegare i cavi della fotocamera e di Arduino. Spegnere l'alimentatore. Scollegare i LED a infrarossi. Pulire le lastre in acrilico rimuovendo il nastro adesivo trasparente e smaltendo le zanzare morte.
   3. Spruzzare il coperchio e la lastra in acrilico con etanolo al 70% e pulire accuratamente con un dito guantato tutti i lati delle cavità e della maglia. Risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata, quindi impilare le lastre in acrilico per lo stoccaggio, separando i coperchi con un tovagliolo di carta per evitare graffi.

3. Saggio del mantello ematico

1. Assemblaggio dei componenti del saggio (Figura 3)
   1. Assemblare il saggio opto-termociclatore come descritto nella sezione 2.1. Fare riferimento alle figure per il saggio (Figura 3A), lo stimolo termico (Figura 3B) e la piastra in alluminio (Figura 3C).
   2. Costruire una piastra riscaldante in alluminio per l’alimentazione con sangue artificiale, come mostrato in Figura 3C.
      1. Utilizzando un taglio laser o al getto d’acqua, realizzare la parte superiore e inferiore della piastra. La parte inferiore si ottiene tagliando una lamina di alluminio spessa 0,8 mm in dimensioni di 90 mm per 134 mm. La parte superiore si ottiene tagliando una lamina di alluminio spessa 1,6 mm in dimensioni di 90 mm per 134 mm. Praticare 15 fori rettangolari (17,2 mm per 18,6 mm) nella piastra superiore. I file modello sono disponibili nel repository GitHub blood blanket (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) sotto la voce “Modelli per la piastra in alluminio”.
      2. Inserire tra le parti in alluminio una guarnizione sottile in silicone (spessa 0,5 mm) per prevenire perdite. Tagliarla con il laser in modo da corrispondere alla forma della piastra superiore.
      3. Fissare gli strati insieme con otto viti esagonali standard da 4-40 con testa bombata di 0,47625 cm. Utilizzare una maschio filettatore per creare filetti per le viti nei pezzi metallici. Fissare le viti attraverso rondelle tonde e a forma di “W” nella parte inferiore della piastra per una maggiore sicurezza quando viene posizionata sopra il blocco termociclatore.
   3. Scaricare il codice Arduino e il programma termociclatore per il saggio blood blanket dal repository GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
   4. Preparare aliquote di ATP 20 mM in NaHCO₃ 25 mM e conservarle a -20 ˚C fino all’uso.
      ​NOTA: Preparare una soluzione fresca di ATP ogni sei mesi. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Preparare soluzioni stock di NaHCO₃ 1 M e NaCl 5 M (conservare entrambe a temperatura ambiente). Il NaHCO₃ in soluzione è stabile solo per 7 giorni.
2. Preparazione dell’esperimento
   1. Allevare le zanzare e trasferirle su piastre in acrilico come descritto nelle sezioni 1 e 2.2. Se si effettuano confronti tra diversi genotipi, mantenere l’esperimentatore in cecità rispetto ai gruppi.
   2. Il giorno dell’esperimento, preparare 10 mL di pasto sanguigno artificiale minimo (110 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃ e 1,5 mM ATP) aggiungendo 750 µL di ATP 20 mM, 220 µL di NaCl 5 M e 200 µL di NaHCO₃ 1 M a 8,83 mL di acqua deionizzata. Mescolare accuratamente capovolgendo il contenitore.
      NOTA: Preparare il pasto sanguigno artificiale fresco prima di ogni esperimento.
   3. Configurare la registrazione con SpinView seguendo i passaggi da 2.3.4 a 2.3.8.
   4. Aprire il file Arduino “Red-light-Only__BB_.ino” (o il file di stimolo desiderato) per l’esperimento.
3. Esecuzione delle prove
   1. Trasferire con pipetta 650 µL di pasto sanguigno artificiale minimo in ogni pozzetto della piastra, assicurandosi che il pasto riempia completamente ogni pozzetto senza traboccare.
   2. Tendere un quadrato di parafilm di 10,2 cm per 10,2 cm su un anello di diametro 20,3 cm. Posizionare il parafilm sulla piastra e premere i bordi fino a farlo aderire. Con un bisturi, tagliare un bordo largo 1,3 cm intorno alla piastra e ripiegare il parafilm in eccesso sotto di essa per sigillare il pasto.
   3. Posizionare la piastra direttamente sopra il blocco PCR per consentire il massimo trasferimento di calore (Figura 3A).
      NOTA: Il nastro nero viene utilizzato sulla superficie del blocco PCR per l’opto-termociclatore, ma non per il blood blanket.
   4. Posizionare la termocoppia sulla superficie del parafilm nell’angolo in basso a destra della piastra in alluminio. Collegare la fotocamera, i LED e l’Arduino al computer. Accendere l’alimentatore. Avviare il programma “BB_thermocycler_program.x50prog” sul termociclatore.
      NOTA: La velocità di variazione della temperatura corrisponde alla massima velocità di rampa del termociclatore, scelta per imitare al meglio l’atterraggio di una zanzara su un ospite per alimentarsi.
   5. Utilizzando un contenitore scuro e riducendo l’illuminazione della stanza per minimizzare l’esposizione alla luce, trasferire la piastra in acrilico con le zanzare sulla piastra in alluminio, assicurandosi che ogni pozzetto sia allineato con le zanzare. Verificare che la termocoppia sia nell’angolo in basso a destra della piastra e a contatto con il parafilm per misurare la temperatura del pasto sanguigno artificiale.
   6. Avviare il programma ricaricando nuovamente il programma “Red-light-Only__BB_.ino” nell’ambiente di sviluppo Arduino (IDE). Chiudere il monitor seriale. In CoolTerm, premere Connetti per visualizzare la temperatura corrente. Utilizzando questa temperatura iniziale, regolare la temperatura di attivazione nello script Arduino a circa 0,6 °C al di sotto di essa.
   7. Nella finestra di CoolTerm, selezionare Cattura in file di testo/binario e avviare la raccolta dati. Avviare la registrazione video nella finestra di registrazione di SpinView. Fare clic su Riprendi per terminare la fase di attesa del termociclatore. Monitorare l’uscita di Arduino in CoolTerm per assicurarsi che l’abbassamento termico sia stato rilevato e che la prova sia iniziata.
   8. Al termine della prova, fare clic su Interrompi registrazione. In CoolTerm, nella scheda Cattura in file di testo/binario, selezionare Interrompi per interrompere la scrittura dell’output seriale.
   9. Rimuovere la piastra con le zanzare dalla piastra del blood blanket e trasferirla nella stanza fredda per anestetizzare gli insetti. Contare il numero di zanzare con addome ingrossato che contengono il pasto sanguigno artificiale come esemplari saziati, inclusi quelli che si sono alimentati parzialmente.
   10. Tra una prova e l’altra, pulire la superficie del blocco PCR strofinandola con un fazzoletto di carta inumidito con etanolo al 70%. Rimuovere il parafilm e risciacquare la piastra in alluminio con acqua deionizzata. Ripetere la sezione 3.3 per ulteriori prove. Variare l’ordine delle prove nei diversi giorni per ridurre al minimo l’effetto dei cicli di attività circadiani.
4. Pulizia finale
   1. Interrompere la registrazione di tutti i programmi e chiuderli. Scollegare i cavi USB della fotocamera, dell’Arduino e delle luci a infrarossi. Spegnere il computer. Arrestare il programma “thermocycler_program.x50prog” in esecuzione sul termociclatore.
   2. Collocare le piastre con le zanzare in un congelatore a -20 °C per tutta la notte per uccidere gli insetti. Lavare la piastra in alluminio con acqua deionizzata. Immergere la piastra in acrilico nell’etanolo al 70%, quindi risciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare tutta la notte prima di caricare nuove zanzare.
      NOTA: Le piastre devono essere asciugate tutta la notte dopo il lavaggio per assicurarsi che non rimanga umidità. In caso contrario, si formerebbe condensa sul coperchio, interferendo con la registrazione video.

4. Saggio del distributore ottico sulla membrana

1. Assemblaggio dei componenti del saggio (Figura 4)
   1. Assemblare un telaio utilizzando componenti opto-meccanici e una piattaforma acrilica nera di 30,48 cm per 30,48 cm e spessa 0,635 cm. Creare un foro al centro dell’acrilico con un diametro di 11,43 cm utilizzando un taglio laser. Praticare fori a 2,54 cm da ciascun angolo per permettere alla piattaforma acrilica di appoggiarsi sui supporti del telaio, a circa 23,495 cm dalla base.
   2. Al centro, fissare un anello acrilico nero con un diametro interno di 19,05 cm e un diametro esterno di 20,32 cm (Figura 4A). I modelli per tutti i componenti acrilici sono disponibili nel repository GitHub opto-membrane feeder (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) insieme ai programmi Arduino. Vedere la figura per la configurazione generale (Figura 4A), lo stimolo (Figura 4B), lo schema del circuito (Figura 4C) e un'immagine estratta dal video (Figura 4D).
      ​NOTA: I materiali specifici utilizzati per assemblare questa piattaforma non sono critici; potrebbero essere disponibili opzioni più economiche.
   3. Fissare una telecamera con filtro infrarosso a lungo passaggio al di sotto del foro centrale, orientata verso l’alto in direzione del contenitore per zanzare. Regolare il diaframma in modo che sia completamente aperto, consentendo un fuoco selettivo sulla maglia superiore del contenitore (Figura 4A).
   4. Per realizzare i contenitori, tagliare un tubo in policarbonato trasparente con diametro di 11,43 cm in segmenti cilindrici di 12,7 cm.
      1. Realizzare i fondi dei contenitori tagliando al laser cerchi con diametro di 11,43 cm da acrilico spesso 0,3175 cm. I bordi dei cerchi vengono incisi al laser in modo da essere incassati all’interno del tubo. Fissarli ai tubi con colla per plastica.
      2. Creare un coperchio incassato utilizzando acrilico nero spesso 0,635 cm e 0,3175 cm e una rete nera resistente ai raggi UV. L’anello interno ha un diametro di 10,795 cm, mentre l’anello esterno ha un diametro di 12,065 cm, con la rete nera tesa sul cerchio più piccolo. La rete deve essere cucita attraverso fori praticati al laser utilizzando filo cerato.
         ​NOTA: I contenitori devono essere sempre posizionati su salviette di carta per evitare graffi sui fondi acrilici attraverso i quali viene registrato il video.
   5. Costruire contenitori acrilici per la somministrazione del pasto di sangue (Figura 4A).
      1. Tagliare un anello con diametro interno di 5,08 cm e diametro esterno di 6,6 cm da acrilico trasparente spesso 0,15875 cm. Fissarlo a un altro anello trasparente con diametro interno di 5,842 cm e diametro esterno di 6,604 cm utilizzando colla per acrilico.
      2. Posizionare un cilindro in rete metallica alto 13,97 cm e con diametro di 19,05 cm all’interno dell’anello acrilico nero al centro della piattaforma.
      3. All’interno della rete metallica, fissare una spirale di luci LED RGB distanti 3,81 cm dall’esterno del contenitore, da controllare con una scheda Arduino Uno, posizionata sulla piattaforma acrilica nera (Figura 4C).
      4. Utilizzando un misuratore di potenza, misurare l’intensità luminosa all’interno del cilindro e regolare la posizione delle luci in modo che l’area sia illuminata tra 3,5–6 µW/mm². All’esterno della rete metallica, fissare un anello di LED infrarossi a 850 nm al telaio con fascette stringicavo, orientati verso l’interno.
   6. Collegare un cavo USB alla scheda Arduino Uno e connetterla al computer. Collegare un cavo USB dalla telecamera al computer. Disattivare la connessione internet.
   7. Posizionare la struttura opto-membrana in un incubatore buio o in una stanza ambientale a 26 °C e umidità relativa dell’80% per tutta la durata degli esperimenti.
2. Preparazione dei contenitori per zanzare
   1. Prima dell’esperimento, lavare i contenitori per zanzare spruzzando etanolo al 70% e pulendo delicatamente con una spugna morbida. Risciacquare i contenitori con acqua deionizzata e farli asciugare all’aria per tutta la notte.
   2. Due giorni prima dell’esperimento, separare le zanzare maschio e femmina sotto anestesia fredda e inserire 20 femmine in ciascun contenitore. Fornire accesso all’ATR secondo il passaggio 1.6.
   3. In questo momento, il genotipo dovrebbe essere sconosciuto all’esperimentatore. L’ordine delle prove deve essere alternato tra i giorni per ridurre al minimo le differenze nei comportamenti dovute al momento dell’esperimento.
3. Esecuzione delle prove
   1. Per preparare il pasto di sangue, posizionare bottiglie da 119 mL di acqua in un bagno termico a 45 °C, una per ogni prova. Questo volume e temperatura mantengono il pasto di sangue vicino alla temperatura corporea per tutta la durata dell’esperimento.
   2. Preparare aliquote da 5 mL di sangue di pecora defibrinato. Conservare a 4 °C e capovolgere prima dell’uso per evitare separazioni. Preparare il pasto di sangue fresco prima di ogni esperimento.
      ATTENZIONE: Manipolare il sangue di pecora defibrinato indossando dispositivi di protezione individuale adeguati per ridurre al minimo l’esposizione a patogeni. I materiali riutilizzabili che entrano in contatto con il sangue devono essere immersi in una soluzione al 10% di candeggina e risciacquati con acqua deionizzata. Poiché la candeggina può causare gravi irritazioni cutanee e oculari, durante la manipolazione devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati.
   3. Posizionare la prima aliquota di sangue in un bagno termico a 45 °C per almeno 20 minuti prima della prova. Scongelare l’ATP sul ghiaccio. Stendere un quadrato di parafilm da 5,08 cm per 5,08 cm sul coperchio acrilico sul lato con il cerchio piatto più grande, creando una vaschetta per il pasto di sangue (Figura 4A).
   4. Pulire il computer con etanolo al 70% per rimuovere odori umani. Collegare il computer a un hard disk esterno. Collegare la telecamera e l’Arduino. Collegare le luci RGB e infrarosse a una fonte di alimentazione.
   5. Aprire il software SpinView e il file Arduino per lo stimolo appropriato. Creare una cartella sull’hard disk esterno per contenere i dati dell’esperimento. Caricare il file Arduino “blue_only.io” per fornire una luce blu debole a 471 nm dall’anello di LED RGB all’area (seguito da Figura 4B).
   6. Senza esporre le zanzare all’eccesso di CO₂ del respiro, esaminare il contenitore per la prova e registrare eventuali morti prima dell’esperimento. Posizionare il contenitore al centro e consentire un periodo di acclimatazione sotto luce blu debole per 10-20 minuti prima dell’esposizione allo stimolo.
      ​NOTA: Il passaggio di acclimatazione e l’esperimento vengono eseguiti sotto luce blu debole perché l’oscurità totale inibisce il volo delle zanzare.
   7. Abilitare la registrazione video
      1. Nel programma SpinView, selezionare la telecamera. Nella scheda Impostazioni, regolare l’esposizione e il guadagno secondo necessità per mantenere un alto contrasto tra gli insetti chiari e lo sfondo scuro (Figura 4D).
      2. Cliccare sul pulsante rosso di registrazione nella barra superiore per regolare le impostazioni di acquisizione video. Impostare il percorso del file cliccando su Sfoglia, quindi spostarsi sull’hard disk esterno. Creare una nuova cartella con un nome descrittivo per ogni prova. Non includere spazi nel nome della cartella.
      3. Nella scheda Opzioni di salvataggio, selezionare Cattura 0 frame, che permetterà la registrazione video fino a quando non verrà interrotta manualmente. Sotto Modalità di registrazione, selezionare Buffered. Nella scheda Video, impostare i seguenti campi: Tipo di registrazione video: MJPG, Dimensione suddivisione file video: 1000 MB e Qualità compressione JPEG: 65.
   8. Immediatamente prima dell’esposizione allo stimolo, pipettare 500 µL di ATP 20 mM, per una concentrazione finale di 2 mM ATP, nell’aliquota di sangue da 5 mL precedentemente preparata. Capovolgere il tubo diverse volte per mescolare.
   9. Versare la soluzione sangue-ATP nel contenitore del pasto di sangue. Sopra il pasto di sangue, posizionare una bottiglia da 119 mL capovolta riempita con acqua a 45 °C per mantenere la temperatura del sangue vicina a quella corporea umana per tutta la durata dell’esperimento.
   10. Nel software SpinView, selezionare Avvia registrazione. Senza stimolare le zanzare con il respiro, posizionare il pasto di sangue sopra il coperchio a maglia del contenitore in modo che le zanzare possano perforare la membrana di parafilm attraverso la maglia.
   11. Caricare il programma Arduino per “1sON_10sOFF.io” (Figura 4B), o lo stimolo desiderato. Questo fornirà 1 s di luce rossa a 624 nm ogni 10 s, finché il file “blue_only.io” non verrà caricato manualmente. La lunghezza d’onda di 624 nm è sufficiente per attivare in modo optogenetico CsChrimson.
   12. Posizionare l’aliquota di sangue nel bagno termico per la prova successiva. Dopo che la prova è durata per 15 minuti, selezionare Ferma registrazione. Caricare il file “blue_only.io” per interrompere lo stimolo con luce rossa.
   13. Rimuovere il supporto del pasto di sangue e la bottiglia d’acqua. Rimuovere il contenitore e anestetizzare le zanzare a 4 °C. Per eseguire ulteriori prove, tornare alla sezione 4.3. Esaminare visivamente le zanzare anestetizzate per determinare e registrare il numero che si è nutrito di sangue osservando l’addome riempito.
4. Pulizia
   1. Chiudere tutti i programmi. Espellere l’hard disk esterno e scollegarlo dal computer. Spegnere il computer.
   2. Pulire i contenitori per zanzare come descritto precedentemente al passaggio 4.2.1. Pulire i supporti acrilici per il pasto di sangue. Riempire per due terzi una vaschetta in policarbonato di dimensioni ridotte con acqua, quindi aggiungere 100 mL di candeggina.
   3. Aggiungere i supporti acrilici per il pasto di sangue e le bottiglie di plastica alla vaschetta. Coprire con un coperchio e lasciare in ammollo per 10 minuti. Rimuovere la candeggina e il parafilm. Spazzolare delicatamente e risciacquare per rimuovere eventuali residui di sangue.

5. Analisi del comportamento

1. Preparare i video per l'analisi comprimendoli in file .mp4 utilizzando ffmpeg (versione 8.0.1). Se i file video sono suddivisi, unirli in un singolo video utilizzando qualsiasi software di editing video. Aprire i video di addestramento in SLEAP (versione 1.4.1) in scala di grigi.
   ​NOTA: Se le impostazioni di registrazione video sono appropriate, tutto dovrebbe essere all'interno del campo inquadrato e le zanzare in movimento non dovrebbero risultare sfocate. È possibile utilizzare altri software per il tracciamento delle parti del corpo. La versione di SLEAP utilizzata in questo articolo è la 1.4.1. Consultare la documentazione di SLEAP per protocolli aggiornati.
2. Creare uno scheletro che etichetti le parti rilevanti degli animali in base ai comportamenti valutati (Figura 2D, Figura 3D e Figura 4E).
3. Utilizzando l'opzione “Frame casuale” nella scheda Suggested frame, selezionare casualmente 10 frame ed etichettare ciascuna zanzara come istanza. Se alcune parti della zanzara sono ostruite (ad esempio, la punta del proboiscide è inserita nella rete durante l'esplorazione), etichettare la posizione approssimativa della parte del corpo. Addestrare un modello sui frame etichettati con queste impostazioni
   1. Per un modello multi-animale Top-Down (utilizzato per il modello opto-termociclatore e coperta per sangue): nella scheda Training Pipeline, impostare Max Instances a 14. Nella scheda Centroid Model Configuration, impostare Crop Size a Auto, Plateau Min. Delta a 1e-04, Plateau Patience a 10, Stride a 8 e Anchor Part su torace.
   2. Per un modello multi-animale Bottom-Up (utilizzato per il distributore ottico a membrana): nella scheda Training Pipeline, impostare Max Instances a no max. Nella scheda Bottom-Up Model Configuration, impostare Crop Size a Auto, Plateau Min. Delta a 1e-04, Plateau Patience a 10 e Stride a 16.
4. Effettuare la previsione su un numero definito di frame con queste impostazioni: nella scheda Inference Pipeline, per l'opto-termociclatore e la coperta per sangue, impostare Max Instances a 14, Tracker a Semplice, Numero massimo di tracce a 14 e Collega interruzioni singola traccia a Vero.
5. Per il distributore ottico a membrana, impostare Nessun massimo per Max Instances e Numero massimo di tracce, Tracker a Semplice e Collega interruzioni singola traccia a Vero. Correggere i frame previsti e riaddestrare. Iterare attraverso cicli di previsione, etichettatura e addestramento sul set di dati di addestramento.
   NOTA: La validazione è stata eseguita verificando casualmente frame etichettati ed identificando errori ricorrenti (ad esempio, rilevamenti falsi di zanzare, predizioni duplicate, orientamento errato o assegnazioni errate delle parti del corpo), concentrandosi sui frame contenenti questi casi limite. Potrebbero essere necessari fino a 150 frame etichettati, a seconda della frequenza degli errori. SLEAP fornisce anche metriche di valutazione basate su interfaccia grafica per ulteriore validazione del modello. Una volta confermata un'accuratezza e precisione sufficienti tramite ispezione visiva, applicare il modello ai video sperimentali ed esportare i risultati in formato .csv o .h5 per l'analisi del comportamento. I classificatori di comportamento possono quindi essere addestrati utilizzando gli output della stima della posa, come descritto precedentemente⁸. I comportamenti sono definiti come segue: camminare, movimento traslazionale del corpo con movimento delle zampe; volare, movimento traslazionale rapido con ali estese; grooming, movimenti ripetitivi delle zampe sulle parti del corpo (antenne, proboiscide, ali o zampe); ed esplorazione (probing), inserimento del proboiscide attraverso la rete nella parte inferiore del contenitore. I classificatori di comportamento dovrebbero raggiungere un'accuratezza >90% rispetto alle annotazioni umane.
6. Eseguire l'analisi statistica scegliendo test non parametrici poiché i dati non sono tipicamente distribuiti in modo normale. Eseguire i test post-hoc appropriati con correzione per confronti multipli. Per i dati sull'ingorgamento, le repliche sperimentali sono gruppi di zanzare, mentre per i dati comportamentali, le repliche sono zanzare singole.

Risultati

Sono stati utilizzati tre saggi comportamentali per osservare i comportamenti di ricerca dell'ospite e di alimentazione ematica nelle zanzare, come mostrato in Figura 1A. Le zanzare sono state allevate in un ciclo luce scura blu (14:10 LD; Figura 1B) per sincronizzare i ritmi circadiani, consentendo di eseguire gli esperimenti durante i periodi di veglia. Due giorni prima degli esperimenti, le zanzare sono state trasferite al buio totale e fornite del cofattore opsina ATR. Se le zanzare non sono sincrone o non ricevono ATR, mostreranno un'attività ridotta nei saggi comportamentali. I genotipi utilizzati per ciascun saggio erano Gr3>CsChrimson e due controlli genetici: la linea driver Gr3-QF2 e la linea effettore QUAS-CsChrimson.

Il saggio con opto-termociclatore (Sezione 2) consente di valutare il comportamento di attivazione e di sondaggio delle zanzare per lunghi periodi in risposta a stimoli termici e luminosi. La somministrazione di calore imita l'avvicinamento della zanzara a un ospite a sangue caldo, mentre l'esposizione alla luce della durata di 5 secondi imita un lungo espiro del respiro³³L'uso di un termociclatore permette un rapido riscaldamento e raffreddamento della superficie, sincronizzato con l'attivazione optogenetica mediante un termocoppia e un microcontrollore (Figura 2A, B). I tre genotipi di zanzare sono stati posizionati su piastre acriliche con pozzetti isolati dotati di fondo a rete, in cui manifestano comportamenti di cammino, volo e sondaggio (Figura 2C). La posizione delle parti del corpo della zanzara è stata rilevata mediante algoritmi di tracciamento della postura, come SLEAP³⁴  e DeepLabCUT³⁵ (Figura 2D, E). Algoritmi di classificazione del comportamento possono essere utilizzati a partire dal tracciamento della postura (ad esempio, SimBA36, A-SOiD37) o dai video (ad esempio, FERAL³⁸) input. Figura 2E mostra le etichette di SLEAP durante il volo, la deambulazione e la protrusione della proboiscide, comportamenti essenziali per la ricerca dell'ospite e l'alimentazione. Questi comportamenti possono essere classificati in base alla velocità del torace e alla distanza tra la base e l'apice della proboiscide. Qui viene mostrata l'uscita del tracciamento comportamentale ottenuta mediante APT e JAABA³⁹. I moscerini sono stati esposti a un aumento di temperatura, a uno stimolo luminoso o a entrambi gli stimoli contemporaneamente, seguiti da una pausa di 20 minuti prima dello stimolo successivo⁸. (Figura 2F). Quando esposti al calore, tutti e tre i genotipi mostrano un breve periodo di sondaggio (Figura 2G). È importante notare che, quando esposti a uno stimolo luminoso di 5 secondi, i Gr3>CsChrimson le zanzare diventano eccitate o "attivate", mostrando un aumento dell'attività locomotoria e del volo che persiste fino a 10–15 minuti. Le zanzare mostrano inoltre un comportamento di sondaggio, definito come l'inserimento ripetuto della proboscide nella superficie a maglie del fondo delle piastre. I dati sono stati rappresentati come comportamento individuale delle zanzareFigura 2G) e proporzione di tutte le zanzare che mostrano ciascun comportamento nel tempo (Figura 2H). L'opto-termociclatore consente stimolazioni ottogenetiche e termiche ripetute e precise su più individui, rendendolo uno strumento utile per lo studio dell'arousal e l'analisi del comportamento.

Il saggio del "blood blanket" (Sezione 3) si basa sul saggio con opto-termociclatore, ma fornisce un pasto ematico artificiale minimo e appetibile, in modo da poter quantificare l'ingorgamento delle zanzare (Figura 3A). Un impulso di luce rossa di 5 secondi (~627 nm) è stato somministrato per attivare in modo optogenetico i neuroni sensoriali del CO₂, e lo strato sottile di pasto ematico artificiale è stato riscaldato da 25 °C a ~35 °C (come misurato alla superficie mediante una termocoppia; Figura 3B). I tre genotipi sono stati esposti ciascuno a un pasto ematico artificiale su una piastra alimentatrice in alluminio (Figura 3C). Le zanzare Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e Gr3>CsChrimson (n = 10 prove per gruppo genetico, 14 zanzare ciascuna) sono state esposte ciascuna a un pasto ematico artificiale su una piastra alimentatrice in alluminio (Figura 3C). Per misurare l'ingorgamento delle zanzare nel tempo durante l'esperimento, è stato utilizzato SLEAP per tracciare punti sul corpo della zanzara. Questo è stato fatto creando uno scheletro che includeva 5 nodi sull'addome della zanzara (Figura 3D). Al termine di ogni prova, il numero di zanzare ingorgate è stato contato manualmente. Le linee di controllo delle zanzare, Gr3-QF2 e QUAS-CsChrimson, hanno mostrato un ingorgamento medio simile (Figura 3E, p = 0,401). Al contrario, la linea Gr3>CsChrimson ha mostrato tassi di alimentazione significativamente più elevati, con un tasso medio di ingorgamento del 53% (Figura 3E, p = 0,00078 rispetto a Gr3-QF2 e p = 0,00097 rispetto a QUAS-CsChrimson). I dati sono stati rappresentati mediante grafici a violino e grafici a scatola (mediana, intervallo interquartile e intervallo) e analizzati utilizzando il test di Kruskal-Wallis e il test di Dunn con correzione di Holm a una soglia di significatività di p < 0,05. L'ingorgamento individuale delle zanzare nel tempo è stato identificato come la variazione dell'area addominale delimitata dai 5 nodi (Figura 3F). Questi risultati dimostrano che il saggio del "blood blanket" può essere utilizzato per valutare gli effetti dell'attivazione optogenetica delle popolazioni neuronali sensibili al CO₂ sul comportamento di ingorgamento delle zanzare in presenza di un pasto ematico artificiale.

Il saggio del distributore ottico sulla membrana (Sezione 4), in cui alle zanzare viene offerto l'accesso a un pasto di sangue caldo in un'arena cilindrica, permette lo studio dell'attrazione delle zanzare verso una fonte di sangue e del loro ingorgamento. Per determinare se l'attivazione optogenetica dei neuroni sensoriali del CO₂ sia sufficiente a indurre attrazione verso una fonte di sangue e alimentazione da essa, zanzare Gr3>CsChrimson e di controllo (n = 10 per ogni genotipo, dove n indica il numero di prove eseguite, con 20 zanzare per contenitore per prova) sono state esposte a un pasto di sangue caldo nel distributore ottico sulla membrana, sottoponendole a impulsi ripetuti di luce rossa intensa della durata di 1 secondo ogni 10 secondi per un periodo totale di 15 minuti (Figura 4B). Per misurare l'attrazione verso il distributore sulla membrana, è stato utilizzato un modello SLEAP con tre punti per tracciare la testa, il torace e l'addome delle zanzare atterrate, contando quelle presenti nella regione di interesse (Figura 4D, Figura 4E). Le zanzare Gr3>CsChrimson hanno mostrato un'attrazione aumentata verso la zona del pasto di sangue nel tempo rispetto al controllo Gr3-QF2 (Figura 4F, p = 0,027). Le zanzare Gr3>CsChrimson non hanno mostrato un'attrazione statisticamente più elevata rispetto al controllo QUAS-CsChrimson (Figura 4F, p = 0,310). I gruppi di significatività sono stati determinati mediante il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn con correzione di Holm. La soglia di significatività è stata fissata a p < 0,05. I dati sono stati rappresentati come percentuale media di zanzare attratte dal pasto di sangue, con l'area ombreggiata che indica l'errore standard. I genotipi di controllo Gr3-QF2 e QUAS-CsChrimson hanno mostrato un ingorgamento simile, rispettivamente del 26% e del 29%, valutato manualmente come descritto (Figura 4G, p = 0,351). Al contrario, le zanzare Gr3>CsChrimson hanno mostrato una percentuale di ingorgamento significativamente più alta rispetto a entrambi i controlli, con una media del 61% (Figura 4G, p < 0,001 rispetto a Gr3-QF2 e p = 0,002 rispetto a QUAS-CsChrimson). I dati sono stati rappresentati mediante grafici a violino e grafici a scatola (mediana, intervallo interquartile e intervallo totale) e analizzati utilizzando il test di Kruskal-Wallis e il test di Dunn con correzione di Holm, con una soglia di significatività di p < 0,05. Questi risultati indicano che il saggio del distributore ottico sulla membrana è un metodo valido per valutare gli effetti dell'attivazione optogenetica dei neuroni del CO₂ sull'attrazione delle zanzare e sul loro ingorgamento da un pasto di sangue.

Figura 1: Saggi e allevamento per gli esperimenti di optogenetica nelle zanzare. (A) Schema dei comportamenti delle zanzare nella ricerca dell'ospite, con le caratteristiche dei saggi comportamentali presentati. I passaggi della ricerca dell'ospite misurati da ciascun saggio comportamentale sono indicati con barre grigie. (B) Linea temporale dell'allevamento delle zanzare per esperimenti di optogenetica. La Figura 1 è stata creata dagli autori per questa pubblicazione utilizzando Adobe Illustrator e non è richiesta alcuna licenza per il suo utilizzo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Il termociclatore ottico quantifica i comportamenti di attivazione e ricerca durante l'attivazione optogenetica. (A) Schema del saggio con termociclatore ottico, costituito da una piastra di zanzare posizionata sul blocco di un termociclatore PCR con LED sovrastanti e una telecamera. (B) Diagramma del circuito del microcontrollore che rileva la temperatura del termociclatore e controlla i LED. Il diagramma del circuito è stato creato con Fritzing secondo la licenza CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). Tale licenza consente anche il riutilizzo completo dell'immagine, a condizione che venga attribuita la corretta paternità. (C) Immagine ferma del saggio che mostra la piastra in acrilico che può contenere fino a 14 zanzare. Il termocoppia si trova nel pozzetto in basso a destra. (D) Lo scheletro della zanzara utilizzato nel modello SLEAP per stimare le posture. I punti etichettati sul corpo includono: l'apice e la base della proboscide, utilizzati per rilevare il comportamento di sondaggio (mostrati in rosso); le zampe anteriori, nel punto in cui si collegano al torace, dove il femore si unisce alla tibia e dove la tibia si unisce al tarso (mostrati in blu); e l'apice dell'addome (mostrato in giallo). È stato utilizzato un modello multi-animale visto dall'alto. Gli stimatori di postura e i classificatori comportamentali sono stati impiegati per quantificare l'attivazione e il comportamento di sondaggio delle zanzare. (E) Esempi di comportamento di cammino, volo e sondaggio delle zanzare, con le previsioni di SLEAP sovrapposte. Il cammino e il volo sono utilizzati come parametri comportamentali per misurare l'attivazione. (F) Output della somministrazione degli stimoli. Le linee ondulate gialle indicano stimoli termici alla temperatura corporea, mentre i LED rossi indicano stimoli di luce rossa. (G) Etogrammi dei comportamenti di cammino, volo e sondaggio di zanzare Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson e Gr3>CsChrimson (n = 22–23 zanzare singole per genotipo) dopo la somministrazione dello stimolo. (H) Comportamento prolungato dopo l'attivazione optogenetica in zanzare Gr3>CsChrimson (n = 68–70 zanzare singole). I pannelli della figura A–E sono stati creati dagli autori per questa pubblicazione utilizzando Adobe Illustrator, e non è richiesta alcuna licenza d'uso per il copyright. I dati in (F–H) sono riprodotti da Sorrells et al., 2022, con licenza CC BY 4.0⁸. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Il saggio del "blood blanket" quantifica l'ingorgamento in risposta all'attivazione optogenetica. (A) Schema del saggio del "blood blanket". La zanzara è contenuta in una gabbia in acrilico in cui un pasto ematico artificiale accessibile viene presentato al di sotto di una rete metallica. (B) Lettura della temperatura e dello stimolo luminoso rosso provenienti dal saggio. (C) Schema del montaggio della piastra riscaldante in alluminio per l'alimentazione. (D) Lo scheletro SLEAP utilizzato per la stima della posizione includeva i punti descritti nella Figura 2D, oltre a quattro punti lungo i lati dell'addome in corrispondenza del giunto con il torace e ai margini della parte più spessa dell'addome. L'ingorgamento è stato misurato come area compresa tra i cinque punti lungo il perimetro dell'addome, utilizzando le previsioni di un modello multi-animale visto dall'alto. (E) Grafico a violino che mostra la percentuale media di ingorgamento sul pasto ematico artificiale per genotipo (n = 10 prove, ciascuna con 14 zanzare per genotipo). La significatività è stata determinata mediante il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn con correzione di Holm. Lettere diverse indicano una significatività di p < 0,05 tra i gruppi, dove gruppi con la stessa lettera non differiscono significativamente tra loro. (F) Ingorgamento nel tempo in un animale Gr3>CsChrimson, misurato in base all'area addominale. La linea di tendenza rossa mostra una finestra mobile di 30 secondi su un periodo di otto minuti della prova, con x = 0 che indica il momento in cui inizia l'ingorgamento. Tutti gli schemi della Figura 3 sono stati creati dagli autori per questa pubblicazione utilizzando Adobe Illustrator, e non è stata richiesta alcuna licenza di copyright per il loro utilizzo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Il saggio con alimentatore a membrana optogenetico misura l'attrazione e l'alimentazione con sangue. (A) Schema dell'alimentatore a membrana optogenetico con i singoli componenti. (B) Linea temporale delle prove sperimentali. La linea blu rappresenta una luce blu debole durante tutto il periodo di ambientamento e l'esperimento. Viene mostrato un segmento dello stimolo sperimentale, che rappresenta impulsi di luce rossa di 1 secondo distanziati di 10 s. (C) Diagramma che illustra il cablaggio dell'alimentatore a membrana optogenetico. Il diagramma del circuito è stato creato con Fritzing sotto licenza CC-BY dagli autori. (D) Esempio di fotogramma tratto dal video dell'alimentatore a membrana optogenetico. Le zanzare nel cerchio rosso vengono contate per determinare la percentuale di attrazione. (E) Esempi di una zanzara non nutrita e di una zanzara sazia, con testa, torace e addome etichettati dal modello di tracciamento SLEAP per l'alimentatore a membrana optogenetico. È stato utilizzato un modello SLEAP multi-animale a partire dal basso per misurare l'attrazione verso la regione di interesse in cui viene posizionato il pasto di sangue. (F) Grafico a linee che mostra la percentuale media di occupazione della zona del pasto di sangue (utilizzata come parametro comportamentale per l'atterraggio) nel tempo, per genotipo (n = 10 prove di 20 zanzare per genotipo). La media è riportata ogni 30 s. Le aree ombreggiate indicano l'errore standard. La significatività è stata determinata mediante il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn con correzione di Holm. Lettere diverse indicano gruppi significativamente diversi; la soglia è stata definita come p < 0,05. (G) Grafico a violino che mostra la percentuale media di sazietà dopo il pasto di sangue per genotipo. Nei grafici (F, G), la significatività è stata determinata mediante il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn con correzione di Holm. I genotipi elencati con la stessa lettera non sono significativamente diversi tra loro. La soglia di significatività è definita come p < 0,05. La Figura 4 è stata creata utilizzando Adobe Illustrator, i dati sono stati raccolti dagli autori per questa pubblicazione e non è stata richiesta alcuna licenza d'uso. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo articolo descrive protocolli dettagliati per saggiare la capacità di specifici tipi di cellule neuronali di innescare le fasi dell'attrazione verso l'ospite e del morso. Il comportamento del morso comprende una serie di fasi comportamentali, dalla rilevazione a lunga distanza, all'attrazione a breve distanza, fino alla perforazione della pelle e all'ingorgamento. In linea teorica, i tipi neuronali potrebbero controllare azioni o fasi specifiche, indirizzare il comportamento verso particolari sequenze, aumentare la durata dell'intero comportamento, oppure svolgere molteplici altri ruoli. Pertanto, i diversi saggi presentati sono necessari per analizzare la funzione neuronale in questo processo.

Diversi errori comuni possono causare scarse risposte delle zanzare in questi saggi. Un'attività ridotta e un basso tasso di alimentazione possono essere evitati eseguendo gli esperimenti durante il periodo di massima attività delle zanzare, vicino ai passaggi tra i cicli chiaro e scuro nelle loro camere di incubazione. Scarsi tassi di alimentazione nel blood blanket e nel feeder a membrana ottica potrebbero dipendere da un pasto ematico artificiale di scarsa qualità o da una temperatura non corretta. Assicurarsi che tutti i reagenti (NaHCO₃, ATP, sangue di pecora defibrinato) non siano scaduti e siano stati conservati correttamente. Si raccomanda di preparare tutte le soluzioni il giorno stesso dell'esperimento per garantirne la massima freschezza. Verificare che la piastra del blood blanket sia a diretto contatto con la superficie del blocco del termociclatore PCR. Le piastre dell'opto-termociclatore e del blood blanket possono accumulare condensa se presente umidità residua. Prima degli esperimenti, appoggiare le piastre su fazzoletti di carta per assorbire qualsiasi umidità. In caso di scarsa risposta optogenetica, assicurarsi che le zanzare abbiano almeno una settimana di vita e che ricevano un tempo adeguato per nutrirsi di ATR, un cofattore chimico essenziale per i canali CsChrimson.

Sono stati sviluppati strumenti optogenetici sensibili a lunghezze d'onda che vanno dal blu (~450 nm) al rosso (~650 nm), coprendo l'intero spettro visibile. La luce rossa è particolarmente utile negli insetti, poiché solitamente presentano una bassa sensibilità e/o risposte comportamentali a queste lunghezze d'onda⁴⁰. Curiosamente, le zanzare mostrano attrazione durante il volo verso aree di stimoli visivi con lunghezze d'onda lunghe presenti nei toni della pelle umana⁴¹. Pertanto, l'uso della luce rossa potrebbe rappresentare una limitazione che complica l'interpretazione dell'attivazione optogenetica nei saggi di attrazione dell'ospite nelle zanzare. Tuttavia, le zanzare di controllo genetic o  mostrano risposte minime alla luce rossa applicata in modo diffuso, anche a intensità elevate (Figure 2–4). Si raccomandano controlli genetici privi del costrutto driver o di quello effettore, nonché controlli senza luce, per garantire un'interpretazione accurata degli effetti comportamentali. Un controllo privo del cofattore della rodopsina ATR è spesso utilizzato negli esperimenti di optogenetica in altre specie; tuttavia, il cibo per pesci utilizzato per nutrire le larve di zanzara contiene vitamina A, il precursore dell'ATR, rendendo questo controllo meno efficace in questo sistema.

Gli stimoli optogenetici presentati qui si limitano a stimoli continui con intensità luminosa regolabile. Gli stimoli optogenetici che riproducono in modo più fedele i modelli naturali di attività neuronale sono quelli più probabili ad elicitare il comportamento d'interesse. Pertanto, se sono disponibili registrazioni neurali, lo stimolo può essere progettato in modo da corrispondere all'intensità e alla dinamica temporale osservate. Quando queste informazioni non sono note, la funzione dei neuroni può essere analizzata utilizzando diversi stimoli e contesti comportamentali, con la limitazione che i risultati potrebbero non riflettere la funzione dei neuroni durante un comportamento naturalistico. Tuttavia, indurre un'attività neuronale al di fuori del range naturale può essere utile per esplorare i circuiti o le proprietà comportamentali in modi specifici, proprio come l'elettrofisiologia può essere impiegata per studiare le proprietà cellulari. Attualmente, gli strumenti optogenetici sono stati utilizzati solo nei neuroni sensoriali della zanzara, un'applicazione che offre alcuni vantaggi rispetto alla somministrazione di stimoli naturali. Le strategie tradizionali per misurare la ricerca dell'ospite da parte delle zanzare si basano sulla somministrazione di gas CO₂ reale. L'uso di CO₂ reale richiede un flusso d'aria filtrato e umidificato, il che implica l'impiego di apparati sperimentali complessi necessari per erogare e rimuovere il gas con incrementi di tempo brevi^9,10,42,43. Il flusso d'aria e l'umidità sono entrambi segnali per l'attrazione e la navigazione delle zanzare, rendendo l'uso dell'optogenetica un metodo interessante per studiare gli effetti degli stimoli olfattivi separatamente da questi altri stimoli. Gli strumenti optogenetici sono stati inoltre utilizzati in precedenza per studiare l'effetto del sesso e dello stato fisiologico sul comportamento⁸, fornendo informazioni preziose su queste importanti questioni della biologia delle zanzare.

Oltre all'optogenetica, questi protocolli utilizzano saggi standard impiegati per valutare il comportamento delle zanzare, i quali presentano alcuni limiti. Per facilitare la pulizia, il panno ematico ricorre a un pasto artificiale contenente soltanto i sapori necessari affinché le zanzare si riempiano. Questa limitazione potrebbe essere superata utilizzando sangue (come nel distributore a membrana optogenetico) o materiali biomimetici in grado di riprodurre aspetti dei tessuti dell'ospite. Il calore nell'opto-termociclatore e nel panno ematico viene fornito a zanzare in cammino o ferme, piuttosto che in volo, ed è limitato dalla velocità di rampa del termociclatore PCR. Di conseguenza, questi saggi possono rilevare il comportamento di sondaggio e di alimentazione, ma non l'attrazione. Un’altra limitazione dei saggi di laboratorio è che, per comprendere l'effetto comportamentale di specifici stimoli, vengono esclusi altri stimoli utilizzati dalle zanzare. Potrebbero essere sviluppati saggi di laboratorio sempre più complessi e saggi seminaturali per studiare ulteriori aspetti degli ambienti naturali in cui le zanzare si nutrono sugli ospiti.

Un’altra limitazione dell’optogenetica nella zanzara è che sono state create poche linee di driver al di là di quelle per i neuroni sensoriali. Pertanto, il suo pieno potenziale si realizzerà quando sarà combinata con driver espressi nei neuroni intercalari che non possono essere direttamente stimolati con altri approcci. Risorse recentemente emergenti, come l’Atlante delle Cellule della Zanzara Aedes aegypti, aprono la strada a progressi nella neurogenetica della zanzara⁴⁴. Sarà necessario sviluppare ulteriori lavori futuri per ottenere tali driver e indagare i circuiti neurali della zanzara. Analogamente, sono necessari ulteriori strumenti optogenetici per l’inibizione, al fine di determinare se un particolare tipo di neurone sia necessario per un determinato comportamento. Sebbene i saggi presentati in questo articolo siano progettati per misurare l’attrazione verso l’ospite e l’alimentazione con sangue, questi approcci potrebbero essere estesi per studiare ulteriori fasi della ricerca dell’ospite e comportamenti come l’accoppiamento, la deposizione delle uova e l’alimentazione con nettare. Gli studi optogenetici forniranno nuove informazioni su come il comportamento della zanzara è controllato a livello di circuito neurale e potrebbero portare a nuovi approcci per prevenire la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1⁄Acrilico nero da 8 pollici	McMaster-Carr	8650K32	Struttura del distributore a membrana ottica
1⁄8 pollici in acrilico trasparente	McMaster-Carr	8536K134	Contenitore del distributore a membrana ottica
¼ Acrilico nero da 1 pollice	McMaster-Carr	8560K259	Struttura del distributore ottico a membrana
Adattatore di corrente	Jameco ReliaPro	2197581	Struttura del distributore ottico a membrana
Colla acrilica	United States Plastic Corp	97562	Barattolo del distributore ottico-membranoso, gabbia per strato di sangue
Adenosina 5′sale di sodio e magnesio dell'acido trifosforico, idrato	Sigma Aldrich	A6419-1G	Pasto artificiale di sangue
Tutto trans-retinico	Spectrum Chemical	R3041-1GM	Allevamento optogenetico
Tavola di montaggio in alluminio	Thorlabs	MB12	Struttura del distributore ottico a membrana
Lamiera di alluminio 0,03125 in	McMaster-Carr	89015K11	Piastra per alimentazione con copertura ematica
Lamiera di alluminio 0,0625 pollici	McMaster-Carr	89015K37	Piastra per l'alimentazione con strato di sangue
Animal Part Tracker (APT)	Laboratorio Branson presso l'HHMI Janelia Farm	N/A	Versione 3.0, dati riprodotti dal termociclatore ottico (Figura 2), scaricato il 9 luglio 2020
Arduino IDE	Arduino	N/A	Versione 1.8.12, utilizzata per il controllo degli stimoli per opto-termociclatore, coperta riscaldata per sangue, &alimentatore ottico e a membrana
Scheda microcontrollore Arduino Uno Rev3	Arduino	A000066	Programmazione del distributore ottico-membranoso
Schermo per finestre in fibra di vetro nera	Prodotti Premium Breakthrough	IHLRS3684BL	Gabbia con coperta termica per sangue
Nastro adesivo nero	Thorlabs	T137-2.0	Opto-termociclatore
Fascette stringitubo nere con chiusura a zip	Cable in plastica e altro	ct242	Struttura del alimentatore ottico a membrana
Telo oscurante	Imposta negozio	6520SF	Opto-termociclatore e coperta per sangue
Luci LED blu	21LEDUSA	RB5730BLWP	Allevamento di zanzare
Bottiglia	Bottiglia SKS &e confezionamento	0604-07	Riscaldatore del sangue con alimentatore a membrana ottica
Pellet per pesci del fondo	API	5352983	Alimentazione delle larve
Telecamera	Blackfly	U3-13S2M-CS, FLI	Registrazione di video per saggi
Contatore di clic	ULine	H-7350	Diradamento delle larve
Computer	Asus	X1407Q	Esecuzione dei saggi
Candeggiante concentrato (ipoclorito di sodio 8,25%)	VWR	89501-620	Pulizia del distributore a membrana ottica
CoolTerm	Freeware di Roger Meier	N/A	Versione 2.0.1, utilizzata per la registrazione tramite porta seriale per opto-termociclatore, coperta riscaldante per sangue, & alimentatore opto-membrana
Sangue di pecora defibrinato	Laboratori di emoclastasi	DSB100	Pasto ematico per alimentatore opto-membranoso
Bullone esagonale con testa a cupola 4-40	McMaster-Carr	92949A105	Piastra per l'alimentazione con copertura ematica
Epossidico	Loctite	1363118	Piastra acrilica del termociclatore ottico, struttura alimentatore della membrana ottica
Etanolo	Decon Labs	2716	Sanificazione
Disco rigido esterno	LaCie	LAC9000298	Archiviazione video
ffmpeg	FFmpeg	N/A	Versione 8.0.1, pre-elaborazione video
Stopper di cotone da quattro pollici	Richmond Dental	201226	Alimentazione di zanzare adulte
GitHub	GitHub, Inc	N/A	Repository per il codice, i file delle parti e i modelli SLEAP per opto-thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), blood blanket (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) e opto-membrane feeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
Gr3>CsChrimson	N/A	N/A	Creato per questo studio, descritto al punto 1.2
Zanzare Gr3-QF2	N/A	N/A	Reagente genetico, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
Incubatrice con Porta Opaca	Caron	7340-25	Allevamento di zanzare
Luce LED a infrarossi	Adafruit	387	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Striscia LED a infrarossi	Illuminazione a forma d'onda	7031.85	Opto-termociclatore, coperta riscaldante per sangue e struttura opto-membranare
Filtro passa-infrarossi	Edmund Optics	65-796	Registrazione di video per saggi
Gabbia per insetti	Bugdorm	DP1000	Recinto per zanzare adulte
Janelia Automatic Animal Behavior Annotator (JAABA)	Laboratorio Branson presso l'HHMI Janelia Farm	N/A	Opto-thermocycler riproduce i dati (Figura 2); Versione 0.5.0
Grande tazza per zuppa	WebstaurantStore	50016SOUPPLA	Allevamento di zanzare
Dissipatore di calore a LED	Luxeon Star	N25-15B	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Lente LED	Luxeon Star	10209	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Supporto per lente LED	Luxeon Star	10235	Opto-termociclatore e coperta per sangue
Nastro per lente LED	Luxeon Star	LT-01	Opto-thermociclatore e coperta per sangue
Luce LED	Luxeon Star	SP-01-D9	Stimolo con luce rossa per Opto-thermocycler e coperta termica
Nastro termico LED	Luxeon Star	LXT-S-12	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Binari di Costruzione Ottici	Thorlabs	XE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12	Opto-thermociclatore e struttura della coperta ematica
Post ottico	Thorlabs	TR12	Struttura del distributore ottico-membranoso
Carta assorbente	Pacific Blue	27385	Pulizia del contenitore
Parafilm	Amcor	PM-996	Membrana per coperta ematica, contenitore per pasto opto-membrana
termociclatore PCR	Eppendorf	2231001196	Opto-termociclatore e coperta per sangue
Coppetta di porzione in plastica	Scelta	999P2C	Alimentazione di zanzare adulte
Coperchio per bicchiere dosatore in plastica	Scelta	999PL2	Alimentazione di zanzare adulte
Piastra in policarbonato	Cambro	21410CWCHCL	Allevamento di larve
Piastra in policarbonato di dimensioni ridotte	Cambro	24CW135	Pulizia della membrana ottica
Coperchio in policarbonato, dimensioni ridotte	Cambro	20CWCH135	Pulizia del pasto mediante membrana ottica
Coperchio in policarbonato per padella	Cambro	10CWCH135	Allevamento di larve
Tubo in policarbonato	McMaster-Carr	8585K56	Contenitore del distributore ottico della membrana
Misuratore di potenza	Coerente	1299161	Tutti i saggi
Zanzare QUAS-CsChrimson	N/A	N/A	Reagente genetico, DOI: 10.7554/eLife.76663
Luci RGB	Digikey	289-1189-ND	Consegna dello stimolo mediante alimentatore ottico della membrana
Morsetto ad angolo retto	Thorlabs	RA90	Struttura del distributore ottico a membrana
Scotch Magic Tape	3M	104	Opto-thermociclatore e coperchio acrilico per coperta termica
Guarnizione in silicone, 0,5 mm	McMaster-Carr	1460N22	Piastra per l'alimentazione con copertura ematica
SLEAP	Talmo Lab	N/A	Versione 1.4.1a2, tracciamento della posizione di zanzare in ciascuno dei saggi
Bicarbonato di sodio, soluzione tampone 1 M, pH 8,0	Thermo Scientific	J62495.AP	Pasto artificiale di sangue
soluzione di cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5150-1L 100 3532552	Pasto artificiale di sangue
SpinView	Teledyne Vision Solutions	N/A	Versione 1.27.0.48, software per la registrazione video per tutti e tre i saggi
Bottiglia a spruzzo	Uline	S-11686	Sanificazione
Saccarosio	Sigma Aldrich	S0389-500G	Alimentazione di zanzare adulte
Termocoppia (tipo T)	Harold G Schaevitz Industries LLC	CPTC-120-X-N	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Amplificatore per termocoppia	Adafruit	MAX31856	Opto-termociclatore e coperta termica per sangue
Timer	EnduraLight	RAC-MT	Controllo del ciclo luminoso per l'allevamento di zanzare
Pipetta di trasferimento	Thermo Scientific	SAM-225	Diradamento delle larve
Sacchetto della spazzatura	Uline	S-23040	Trasporto di insetti
Maglia resistente ai raggi UV	McMaster-Carr	87655K13	Contenitore alimentatore ottico a membrana
Acqua	Sigma Aldrich	W4502-1L	Pasto ematico artificiale per blood blanket
Filo cerato	McMaster-Carr	6356K91	Coperchio del contenitore ottico a membrana
Rete metallica	McMaster-Carr	9322T65	Struttura del distributore ottico a membrana