Quantificazione citometrica del flusso sanguigno totale delle piastrine fattori-tessutali positive: un flusso di lavoro armonizzato multicentrico

Sommario

Qui presentiamo un flusso di lavoro armonizzato per la quantificazione della citometria di flusso delle piastrine a fattore tessutale positivo in studi multicentrici. Il protocollo descrive procedure standardizzate per la raccolta del sangue, la fissazione del sangue totale, la colorazione e l'armonizzazione degli strumenti, permettendo di effettuare analisi sia localmente che centralmente, a seconda delle capacità di laboratorio.

Abstract

Le piastrine a fattore tissutale (TF^)pos rappresentano un sottoinsieme della popolazione piastrinica. Recentemente, questo sottoinsieme ha dimostrato di prevedere la mortalità cardiovascolare nei pazienti con malattia coronarica, affermandolo come biomarcatore utile per la stratificazione del rischio trombotico. La quantificazione accurata delle piastrine^pos TF tramite citometria a flusso richiede una rigorosa standardizzazione della gestione pre-analitica, delle procedure di colorazione e delle impostazioni degli strumenti, in particolare negli studi multicentrici dove la variabilità tecnica può influenzarne la misurazione. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro armonizzato per la valutazione della citometria a flusso sanguigno totale delle piastrine^{TF pos} circolanti, progettato per garantire la riproducibilità tra laboratori con infrastrutture tecniche differenti. La procedura include la raccolta standardizzata del sangue e la fissazione del sangue intero per preservare il fenotipo piastrino in vivo. Sono forniti due diversi metodi per la preparazione del campione in base alle capacità del laboratorio locale: spedizione di campioni fissi al Core Laboratory per la colorazione, acquisizione e analisi centralizzate nei centri senza strutture di citometria a flusso, oppure colorazione e acquisizione locale per centri dotati di strumentazione di citometria a flusso e personale formato. La valutazione della percentuale di piastrine^pos TF avviene tramite marcatura diretta con anticorpi anti-TF Star Fluor 488 e anti-CD41 PerCP-Cy5.5 per identificare rispettivamente la proteina target e il marcatore della popolazione piastrinica. L'armonizzazione del citometro a flusso si ottiene tramite un modello di acquisizione condiviso per modelli identici di citometri o tramite allineamento basato su perle per piattaforme diverse. Il flusso di lavoro incorpora inoltre un approccio standardizzato di gating e un'analisi centralizzata dei dati per consentire un confronto affidabile delle misurazioni^TF pos-piastrine tra i siti. I risultati rappresentativi hanno dimostrato che questo flusso di lavoro supporta la quantificazione riproducibile delle^{piastrine pos} TF attraverso le impostazioni di acquisizione multicentrica validate e validate. Questo protocollo potrebbe facilitare un'applicazione più ampia della valutazione^{delle piastrine pos} in TF nella stratificazione del rischio trombotico e supportare una più ampia standardizzazione della citometria del flusso piastrino nella ricerca traslazionale e clinica.

Introduzione

Il fattore tissutale (TF) è il principale fattore di origine della cascata di coagulazione del sangue e un determinante chiave della generazione di trombine. Oltre alla sua espressione classica da parte delle cellule subendoteliali e dei leucociti, TF è anche associata a piastrine ^circolanti 1,2,3,4,5. Durante la trombopoiesi, i megacariociti trasferiscono TF a un sottoinsieme di^{piastrine 6}. In condizioni fisiologiche, circa il 20–30% delle piastrine circolanti contiene TF immagazzinata all'interno del sistema canalicole aperto, spazialmente separata dal fattore plasmatico VII⁷. In questo stato compartimentato, la TF è funzionalmente schermata dai fattori di coagulazione circolanti e rimane inattiva. Di conseguenza, solo una piccola frazione di piastrine mostra TF superficiale rilevabile quando il sangue intero di individui sani viene analizzato tramite citometria a flusso, riflettendo l'omeostasi^{fisiologica 2,8}. Condizioni patologiche caratterizzate da attivazione piastrinica e squilibrio trombo-infiammatorio possono alterare questo equilibrio, portando a un aumento dell'esposizione superficiale della TF. Proporzioni elevate di piastrine TF-positive (TF^pos) sono state segnalate in diversi disturbi trombotici 9,10,11,12,13,14,15. In particolare, nella malattia coronarica, i livelli di pos-piastrine TF superiori al 4% prevedono indipendentemente la mortalità cardiovascolare al follow-up di 5 anni, stabilendo la percentuale di^{PI pos} come biomarcatore clinicamente rilevante del rischio^{trombotico 16}.

La quantificazione accurata e riproducibile delle piastrine^pos TF è quindi essenziale sia per applicazioni di ricerca traslazionale che clinica. Un flusso di lavoro di citometria di flusso piastrinico pubblicato in precedenza per la valutazione^{delle piastrine TF pos} ha migliorato lo studio di questa proteina in contesti monocentrici¹⁷ , fornendo consigli sull'ottimizzazione di alcuni passaggi pre-analitici o analitici. Tuttavia, tale approccio non è stato specificamente progettato per affrontare le ulteriori sfide logistiche e analitiche degli studi multicentrici, incluse le procedure di spedizione, la lavorazione standardizzata dei campioni e la considerazione anche della necessità di armonizzare l'acquisizione di campioni tra diverse piattaforme di citometri di flusso. Inoltre, devono essere considerate le diverse infrastrutture e i livelli di competenza tecnica dei centri partecipanti.

In questo contesto, il valore aggiunto dell'attuale protocollo risiede nel fornire un flusso di lavoro dettagliato che combina prelievo di sangue standardizzato e fissazione del sangue intero, protocolli flessibili di elaborazione del campione, armonizzazione dell'acquisizione multipiattaforma e colorazione diretta e controllo centralizzato della qualità tramite analisi dei dati.

L'obiettivo di questo lavoro è quindi fornire un quadro operativo per l'implementazione armonizzata multicentrica dell'analisi^{PIOS-TF pos} nel sangue totale tramite citometria a flusso. Questo disegno integrato riduce la variabilità pre-analitica, analitica e inter-strumento, stabilendo così la condizione per una valutazione coerente delle piastrine^pos TF in contesti multicentrici.

Protocollo

Tutti i donatori di sangue hanno fornito un consenso informato scritto approvato dal Comitato Etico dell'Istituzione (n.70/24, CE 18.06.24).

Il flusso di lavoro multicentrico per la quantificazione della citometria a flusso sanguigno totale delle piastrine^pos TF è riassunto nella Figura 1. Il protocollo descritto di seguito guiderà l'utente attraverso cinque passaggi principali.

Figura 1: Flusso di lavoro multicentro per l'analisi^TF pos-piastrine. Rappresentazione schematica della pipeline analitica per la valutazione multicentrica delle^{piastrine pos} TF circolanti tramite citometria a flusso sanguigno totale. Dopo l'arruolamento dei soggetti e il prelievo del sangue, i campioni vengono fissati e processati secondo le risorse tecniche disponibili in ogni Unità Clinica. I centri senza strutture di citometria a flusso inviano campioni fissi al Core Laboratory per la colorazione, acquisizione e analisi. I centri dotati di citometri di flusso possono effettuare colorazioni e acquisizioni in loco utilizzando modelli di acquisizione standardizzati. L'armonizzazione degli strumenti si ottiene tramite modelli condivisi (stesso modello di strumento), modelli generati presso il Core Laboratory (modello diverso disponibile per l'allineamento), oppure calibrazione con sfere fluorescenti quando l'armonizzazione diretta dei template non è fattibile. L'analisi dei dati viene eseguita centralmente utilizzando un flusso di lavoro standardizzato di gate. Il diagramma è stato creato utilizzando ChatGPT (OpenAI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Raccolta del sangue

NOTA: La valutazione delle^{piastrine pos} TF richiede un massimo di 50 μL di sangue intero.

1. Raccogli sangue venoso periferico dalla vena antecubitale usando un ago a farfalla calibro 19. Applica il laccio emostatico solo per la venipuntura e rilascialo immediatamente dopo il posizionamento dell'ago per minimizzare l'attivazione ex vivo delle piastrine.
2. Scarta il primo tubo EDTA. Poi raccoglie sangue in un vacuainatore di citrato di sodio da 0,129 M, riempiendo il tubo fino al marchio del produttore per preservare il corretto rapporto sangue/anticoagulante.
3. Inverti delicatamente 5 volte per mescolare bene sangue e anticoagulante.
4. Mantieni il tubo verticale a temperatura ambiente, evitando agitazioni, refrigerazione o trasporti pneumatici.
5. Processare il campione entro 3 ore dalla prelieva.

2. Preparazione del campione

NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere acquistati dal Core Laboratory e devono provenire tutti dallo stesso lotto. Se durante lo studio in corso diventa necessario un cambiamento di batch, il nuovo lotto di reagenti dovrebbe essere collegato direttamente al lotto in uso tramite test paralleli nelle stesse condizioni di analisi e adottato solo se viene confermata una prestazione comparabile. I reagenti comunemente usati (ad esempio, PBS – soluzione salina tamponata con fosfato – e PFA – paraformaldeide) possono essere acquistati da ciascun centro partecipante; tuttavia, i codici prodotto devono corrispondere a quelli utilizzati dal Core Laboratory e la coerenza dei lotti deve essere mantenuta durante tutto lo studio.

1. Sistemate il campione.
   NOTA: Prima di iniziare l'analisi del sangue, prepara PFA all'1% diluendo il 4% con PBS a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: La PFA è tossica e dovrebbe essere maneggiata con un cappuccio chimico indossando l'attrezzatura di protezione personale adeguata (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi). Evita l'inalazione e il contatto con pelle o occhi. SMALTIMENTO DEI RIFIUTI: Raccogliere tutte le soluzioni contenenti PFA, i campioni fissi e i materiali di consumo contaminati in contenitori di rifiuti pericolosi correttamente etichettati e chiusi, in conformità con le normative istituzionali e locali.
   1. Inverti delicatamente il vacutainer 5 volte per mescolare sangue e anticoagulante.
   2. Trasferire 50 μL di sangue in un tubo da 2 mL contenente 950 μL di PFA all'1%.
   3. Mescola delicatamente il campione e incuba per 1 ora e 30 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aggiungi 500 μL di PBS.
   5. Centrifuga a 1500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
      NOTA: Checkpoint tecnico: Dopo la centrifugazione, verifica che il pellet sia visibile prima di rimuovere il sovrandante. Rimuovi con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Dopo la risospensione, verifica che il campione sia omogeneo e privo di grumi o aggregati visibili.
   7. Spedire il campione fissato al Laboratorio Centrale in un imballaggio a temperatura controllata, mantenuto a 2-8 °C entro 24 ore dopo la fissazione. Non congelare. Tempo di raccolta documenti, tempo di fissazione e tempo di spedizione.
2. Etichettatura campione per l'analisi della citometria a flusso.
   NOTA: Anti-TF Star Fluor 488 (clone HTF1; anti-CD142) è diretto contro il fattore tissutale, mentre anti-CD41 PerCP-Cy5.5 riconosce l'integrina piastrinica alphaIIb. Prima di iniziare la procedura di colorazione, centrifugare gli anticorpi a 17000 x g per 5 minuti a +4 °C per rimuovere qualsiasi^{aggregato 18}. Diluire anticorpi anti-TF Star Fluor 488 (1:100) con PBS. L'Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 non richiede diluizione intermedia e dovrebbe essere utilizzato al volume raccomandato dal produttore.
   1. Prepara quattro tubi di polipropilene da 2 mL.
   2. Erogare 80 μL di campione fisso in ogni provetta.
   3. Aggiungete a ogni tubo il volume corretto di PBS e anti-TF Star Fluor 488 come indicato nella Tabella 1 (Giorno 1).
   4. Mescola delicatamente i campioni.
   5. Incubare O/N a 4 °C al buio.
   6. Il giorno successivo (Giorno 2), aggiungere Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 ai tubi 3 e 4 come indicato nella Tabella 1.
   7. Mescola delicatamente i campioni.
   8. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
   9. Diluire ogni tubo con 300 μL di PBS.
   10. Conserva i campioni colorati al buio fino all'acquisizione della citometria di flusso.
       NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di tre giorni^{e 17}. Una conservazione più lunga provoca un decadimento progressivo del segnale e dovrebbe essere evitata.

		Giorno 1		Giorno 2
No.	ID del tubo	1X PBS (μL)	Anti-TF Star Fluor 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Senza macchie	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabella 1: Protocollo di colorazione per la valutazione delle^{piastrine TF pos}.

3. Standardizzazione dell'acquisizione del citometro a flusso

1. Impostazione di un modello di acquisizione (da parte del Laboratorio Core).
   1. Configurazione del template per il Citometro di Flusso A.
      1. Apri il software A v2.6.
      2. Crea un dot plot FSC-A/SSC-A [Tutti gli eventi] in scala logaritmica per visualizzare le popolazioni cellulari (Figura 2A).
      3. Crea un grafico di punti CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Tutti gli Eventi] in scala logarittima per identificare le piastrine all'interno di una porta [Piastrine] (Figura 2B).
      4. Crea un grafico pseudocolore PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Tutti gli Eventi] per verificare lo spillover/compensazione (Figura 2C).
      5. Crea un grafico dei punti FSC-A/FSC-H nella porta [Platelets] e definisci una regione per identificare i singolini ([Singlets]; Figura 2D).
      6. Crea un grafo di punti CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A nella porta dei [Singolet] per identificare le piastrine^pos TF (Figura 2E).
      7. Imposta la soglia a 1000 su SSC-H.
      8. Imposta la portata su "Lento".
      9. Imposta il guadagno B525 a 315 per garantire una discriminazione ottimale tra eventi positivi e negativi; Regolare se necessario in base allo strumento utilizzato.
      10. Imposta il guadagno di B690 in base al QC giornaliero. L'acquisizione è accettabile solo se la popolazione piastrinica^{CD41 pos}- è completamente risolta dal fondo negativo e rimane all'interno della porta di riferimento predefinita stabilita nel modello durante l'acquisizione.
      11. Esporta il template usando il "Export Experiment Template".
      12. Scarica: Il modello di acquisizione per l'analisi^{piastrine TF pos} sul Flow Cytometer A è disponibile per il download come File Supplementare 1 e Figura Supplementare 1.
          NOTA: È incluso un grafico per verificare lo spillover/compensazione (Figura 2C), sebbene non richiesto per questa analisi multiparametrica. Dovrebbe comunque essere considerato se verrà utilizzata una combinazione di fluorocromi diversa da quella proposta in questo protocollo.
   2. Crea un modello per il Flow Cytometer B.
      1. Crea un file di protocollo che includa l'intera configurazione dell'acquisizione come descritto nella 3.1.1.
      2. Esporta il template utilizzando la funzione "Esporta protocollo" nel software B v1.6, generando un file di protocollo.
      3. Sullo strumento ricevente, importa il file del protocollo utilizzando la funzione "Importa Protocol" all'interno del software.
   3. Creazione di template per il Citometro a Flusso C.
      1. Crea un file workspace che includa l'intera configurazione di acquisizione come descritto nella 3.1.1. e esportarli.
      2. Sullo strumento ricevente, importa il file workspace utilizzando la funzione "Copia" del software C v3.1.
2. Armonizzazione dei citometri a flusso usando perle di calibrazione.
   NOTA: Usa perle di calibrazione Rainbow a 6 picchi.
   1. Definizione del valore target.
      NOTA: Utilizzare la seguente formula per definire l'Intensità di Fluorescenza Mediana (MdFI) del primo picco nel canale di fluorescenza B525:
      MdFI_CU =
      dove CU: strumenti dell'unità clinica e RI: strumento di riferimento.
   2. Preparazione del campione.
      1. Vortice la fiala a perla.
      2. Aggiungi 5 gocce di perline a un tubo campione.
      3. Aggiungi 1 mL di PBS.
      4. Vortice per 5-10 secondi.
   3. Acquisizione delle perline.
      1. Crea un puntino FSC-A/SSC-A in scala logaritmica che mostri [Tutti gli Eventi], e definisci una regione chiamata [Sfere] (Figura 3A).
      2. Crea un dot plot FSC-A/FSC-H nella porta [Beads] e definisci una regione per identificare i singolini [Singlet] (Figura 3B).
      3. Crea un grafico istogrammatico per il canale di fluorescenza Star Fluor 488 (B525).
      4. Visualizza solo [Singlet]  sull'istogramma.
      5. Disegna una porta che attraversa tutta la larghezza del primo picco (regione B nella Figura 3C).
      6. Nel ribbon Statistiche, visualizza i valori della Mediana X (X-Med).
      7. Rimuovi qualsiasi compenso esistente.
      8. Imposta la portata su "Lento".
      9. Inizia l'acquisizione in modalità "Run".
      10. Dall'impostazione "Acquisizione", modificare la tensione/guadagno del B525 per raggiungere l'obiettivo X-Med calcolato in base al valore target.
      11. Registra un file dati di 10.000 eventi nella porta [Singlet] solo dopo che quel criterio di accettazione è stato raggiunto. Non acquisire campioni di studio finché non si raggiunge il range target.

File supplementare 1: Modello di acquisizione per l'analisi piastrinica^{TF pos} sul Flow Cytometer A disponibile per il download. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: Screenshot del modello di acquisizione per l'analisi^{delle piastrine TF pos} sul Flow Cytometer A. (A) Il dot plot FSC-A vs SSC-A fornisce una rappresentazione visiva della distribuzione complessiva degli eventi. (B) Le piastrine vengono identificate in un grafico CD41 vs SSC-A e indicate come [Piastrine]. (C) È incluso un grafico PerCP-Cy5.5 vs Star Fluor 488 per valutare il potenziale spillover. (D) I doppietti sono esclusi all'interno della porta [Piastrine] usando un grafico FSC-A vs FSC-H, definendo la popolazione [Singoline]. (E) le piastrine^{TF pos} sono identificate all'interno della porta dei [Singolet] basandosi sulla fluorescenza di PerCP-Cy5.5 e Star Fluor 488. (F-H) Le impostazioni di acquisizione, inclusi il flusso di campionamento (Lento), la soglia primaria (SSC) e i guadagni del rivelatore (B525 e B690), come implementato nel template, sono mostrate. I dettagli completi dell'assetto e del flusso di lavoro per l'acquisizione sono forniti nella sezione 3.1. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2: Modello di acquisizione e strategia di gating per l'identificazione delle piastrine^pos TF. (A) FSC-A/SSC-A dot plot (scala logarithmica) che mostra tutti gli eventi rilevati. (B) Grafico di punti CD41-A/SSC-A utilizzato per identificare la popolazione piastrinica. (C) Grafico pseudocolore PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilizzato per valutare i requisiti di spillover spettrale e compensazione. (D) Grafico FSC-A/FSC-H nella porta [Piastrine] usato per escludere i doppietti e definire i singoli. (E) Grafico di punti PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 nei [singoli] utilizzato per identificare le^{piastrine pos} TF. I campi statistici visualizzati tra parentesi vengono automaticamente popolati con valori specifici per campione quando il template viene applicato durante l'acquisizione del campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura di calibrazione degli strumenti basata su perle. (A) Grafico FSC-A/SSC-A usato per identificare gli eventi di perla. (B) Grafico FSC-A/FSC-H all'interno degli eventi a perla usati per escludere aggregati e definire i singolini. (C) Istogramma della fluorescenza di Star Fluor 488 che mostra i picchi delle sfere con gating applicato al primo picco della sfera per la determinazione dell'intensità mediana della fluorescenza. Le statistiche visualizzate devono essere considerate rappresentative. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Acquisizione di campioni di citometria a flusso per l'analisi piastrinica^pos-TF

1. Acquista utilizzando un modello FCM.
   1. Importa il modello di acquisizione utilizzando la funzione "Importa Template" all'interno del software A.
   2. Raccogli i campioni preparati nel passo 2.
   3. Verifica che le porte piastrine e singole corrispondano alla geometria del grafico di riferimento prima della registrazione dei dati. Regola i gate se necessario.
   4. Inizia a registrare dopo 5–10 secondi di flusso stabile. Registra un file dati di 20.000 eventi all'interno del portale  dei [Singolet]  (vedi Figura 2D). Salva file .fcs non compensati e inoltrali al Laboratorio Centrale.
2. Acquisizione senza un modello FCM.
   1. Ricrea un foglio di lavoro per l'acquisizione come riportato nella sezione 3.1, includendo i cinque grafici descritti e la gerarchia dei cancelli: Tutti gli eventi > piastrine > singoletti > quadranti TF/CD41.
   2. Imposta la soglia a 1000 su SSC-H.
   3. Imposta la portata su "Lento".
   4. Imposta la tensione/guadagno B525 come definito in 3.2.3.
   5. Preparate il campione nel passo 2. Inizia la registrazione dopo 5–10 secondi di flusso stabile; acquisire 20.000 eventi all'interno del cancello [Singlets]. Salva file .fcs non compensati e inoltrali al Laboratorio Centrale.
      NOTA: L'acquisizione è accettabile solo se viene approvato lo strumento QC giornaliero. Se non si raggiunge l'obiettivo di 20.000^{piastrine pos}– CD41, si acquisiscono almeno 10.000 eventi pos-piastrine CD41.

5. Analisi dei dati

NOTA: Il flusso di lavoro di analisi descritto di seguito è destinato a supportare le attività del Laboratorio Centrale responsabile dell'elaborazione centralizzata dei dati e del controllo qualità.

1. Apri un nuovo foglio di analisi e carica i file .fcs.
2. Per ogni campione, crea un modello di analisi come mostrato nella Figura 2. Per piattaforme non identiche, si utilizza un template equivalente specifico per piattaforma con la stessa struttura di gate e output statistici.
3. Verifica che il gating identifichi correttamente la popolazione piastrinica secondo le caratteristiche di scatter predefinite e la strategia di discriminazione dei singolini (Figura 4A, B, D).
4. Controlla la presenza di spillover/compensazione tramite un diagramma pseudocolore [Tutti gli Eventi] (Figura 4C).
   NOTA: La stella fluorocroma Fluor 488 ha un'emissione spettrale a 520 nm, rispetto a PerCP-Cy5.5, che ha un'emissione spettrale a 676 nm, spiegando la mancanza di sovrapposizione e la necessità di non avere compensazione.
5. Applica la seguente sequenza di gating nel grafico di punti Star Fluor 488 (Figura 5):
   1. Non colorato: definire i quadranti usando il controllo non colorato in modo che gli eventi^pos TF di fondo rimangano a o sotto lo 0,01% degli eventi piastrinosi, escludendo l'autofluorescenza piastrinica (Figura 5A).
   2. TF: applicare le coordinate quadrantiali definite nel campione non colorato per identificare il segnale^pos TF nei campioni con singola colorazione (Figura 5B).
   3. CD41: definire i quadranti utilizzando il singolo campione colorato CD41 per escludere la fluorescenza di fondo delle piastrine (Figura 5C).
   4. TF/CD41: applicare le stesse coordinate di quadranti per identificare il segnale^pos TF nei campioni colorati con TF/CD41 (Figura 5D).
      NOTA: La percentuale finale di pos-piastrine TF è ottenuta dalle statistiche generate dal software di analisi ed è riportata come la percentuale di^pos-eventi CD41 che rientrano nel^{quadrante pos} TF della popolazione piastrinica bloccata.
6. Eseguire un controllo di qualità centralizzato sull'identificazione dei nomi file, i lotti di reagenti, l'intervallo fissazione-acquisizione, la temperatura di spedizione, il conteggio degli eventi e le distribuzioni di fluorescenza degli outlier. I file che mostrano deviazioni documentate nella gestione locale, spedizione, tempistica di fissazione o impostazioni di acquisizione dovrebbero essere segnalati, revisionati centralmente e esclusi o ripetuti, secondo il piano di gestione delle deviazioni specifico per lo studio.

Figura 4: Strategia di gating sequenziale per l'analisi^TF pos-piastrine. Il flusso di lavoro di analisi rappresentativa illustra l'identificazione delle popolazioni di piastrine dopo il caricamento dei file .fcs. (A-B) Grafici a punto che confermano la corretta gating delle popolazioni piastrinere. (C) Grafico pseudocolore PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilizzato per valutare lo spillover spettrale. (D) Grafico FSC-A/FSC-H all'interno della porta piastrinica usato per escludere i doppietti e definire i singoli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Modello per l'analisi dei dati. Grafici rappresentativi di punti del controllo non colorato (A) utilizzati per definire l'autofluorescenza di base e il posizionamento dei quadranti. (B) campione TF a singola colorazione; (C) Campione singolo colorato CD41 usato per definire il posizionamento del quadrante. (D) Campione con doppia colorazione TF/CD41 utilizzato per l'analisi^{delle piastrine TF pos}. I numeri indicano la percentuale di piastrine^pos TF in un campione rappresentativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Questo flusso di lavoro è stato progettato specificamente per permettere a centri con infrastrutture tecniche eterogenee di partecipare a studi multicentrici che richiedono la quantificazione delle^{piastrine pos} TF. La Figura 1 illustra il diagramma del flusso di lavoro organizzativo progettato per supportare studi multicentrici volti a misurare le^{piastrine pos} delle TF circolanti tramite citometria a flusso sanguigno totale. Vengono implementate diverse procedure di preparazione del campione a seconda delle risorse tecniche disponibili nei centri partecipanti. In particolare, (i) quando un'Unità Clinica non dispone di una struttura di citometria a flusso o di personale addestrato, i campioni di sangue intero vengono fissati immediatamente dopo la raccolta e poi inviati al Laboratorio Centrale per una colorazione, acquisizione e analisi centralizzate. (ii) In alternativa, i centri dotati di strutture di citometria a flusso possono effettuare localmente colorazioni e acquisizioni. In questi casi, l'acquisizione dei dati segue un flusso di lavoro armonizzato definito dal Core Laboratory. Se il modello dello strumento corrisponde a quello utilizzato nel Core Laboratory, l'acquisizione viene effettuata utilizzando un modello standardizzato fornito dal Core Laboratory. Quando si utilizzano modelli di strumenti diversi, l'armonizzazione può essere ottenuta tramite trasferimento di template - quando strumenti sono disponibili per l'allineamento presso il Core Laboratory - o tramite procedure di calibrazione basate su perle prima dell'acquisizione del campione. I campioni possono quindi essere acquisiti e analizzati secondo il flusso di lavoro standardizzato.

I seguenti risultati rappresentativi sono destinati a illustrare la fattibilità del flusso di lavoro e i passaggi chiave di armonizzazione, piuttosto che fornire una validazione formale del saggio multicentrico. Per garantire una rilevazione affidabile delle TF, la strategia di colorazione è stata inizialmente valutata per la compatibilità spettrale e la stabilità del segnale. Le piastrine sono state identificate utilizzando Anti-CD41 PerCP-Cy5.5, mentre la rilevazione di TF si è basata su un anticorpo monoclonale anti-TF coniugato a Star Fluor 488. Controlli a colorazione singola sono stati utilizzati per verificare l'assenza di riversamento di fluorescenza tra i canali di rilevamento. Come mostrato nella Figura 6A, i campioni di PerCP-Cy5.5 con singola colorazione CD41 non producevano alcun segnale rilevabile nel canale Star Fluor 488. Costantemente, la percentuale di piastrine^pos TF misurate nei campioni doppiamente colorati era comparabile a quella ottenuta nei campioni TF con singola colorazione (Figura 6B).

Figura 6: Validazione della specificità della colorazione. (A) Campione anti-CD41 PerCP-Cy5.5 con colorazione singola analizzato in un grafico puntuale PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 per verificare la specificità del segnale. (B) Le percentuali di^{piastrine pos} TF misurate nei campioni con singola colorazione TF rispetto a quelli doppiamente colorati con TF/CD41 sono mostrate come misurazioni individuali accoppiate (punti) e media ± SD (n = 18 soggetti indipendenti). I dati sono stati analizzati dal test Wilcoxon con coppie abbinate e rango firmato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.La sensibilità analitica del saggio proposto è stata valutata su campioni di n=200 soggetti sani. Utilizzando campioni biologicamente vuoti, il limite calcolato di vuoto (LoB) era lo 0,39%, il limite di rilevamento (LoD) era lo 0,77% e il limite di quantificazione (LoQ) era l'1,12%, definito come il livello più basso associato a un CV ≤ il 20%. La riproducibilità interoperatorio della strategia di gating è stata valutata su 40 campioni indipendenti analizzati da 6 operatori utilizzando il modello di analisi predefinito, ottenendo un ICC di 0,985 (IC 95%: 0,978-0,990).

La stabilità della rilevazione della TF dopo la fissazione del sangue intero è stata poi valutata colorando campioni fissi longitudinalmente. Rispetto ai campioni basali colorati il giorno della fissazione (D0), i livelli di pos-piastrine di TF sono rimasti stabili fino a quattro giorni dopo la fissazione (D3-D4), mostrando solo una diminuzione non significativa di circa il 22% a D3-D4 (77,8 ± 7,2% - percentuale relativa nelle piastrine^pos di TF) rispetto al livello di D0. Quando la colorazione è stata eseguita a D5-D6, la rilevazione di^{piastrine pos} TF è diminuita significativamente al 53,8% ± 20,7% (percentuale relativa nelle piastrine^pos TF; p< 0,0001; Figura 7). Questi risultati indicano che i campioni fissi possono essere analizzati in modo affidabile entro quattro giorni dalla fissazione con una modesta perdita di segnale.

Figura 7: Analisi del corso temporale dopo la fissazione del campione. La quantificazione delle^{piastrine pos} TF misurata in diversi momenti dopo fissazione è indicata nell'asse x come segue: D0 = giorno di prelievo del sangue; D1 = giorno 1; D2 = giorno 2; D3-4 = giorno 3 o 4; D5-6 = giorno 5 o 6. I dati sono espressi come media ± percentuale relativa di SD rispetto a D0 (n = 7-10 soggetti sani, valutati nei punti di tempo post-fissazione indicati). I dati sono stati analizzati utilizzando Anova seguiti dal test di confronto multiplo di Dunnett. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le prestazioni del flusso di lavoro armonizzato di acquisizione sono state successivamente valutate su diverse piattaforme di citometria a flusso. L'armonizzazione basata su template è stata inizialmente valutata utilizzando strumenti FACSLyric e MACSQuant come citometri di riferimento. Strumenti aggiuntivi degli stessi modelli situati in strutture esterne furono utilizzati come piattaforme di prova. Campioni di sangue intero contenenti piastrine a riposo sono stati prelevati sia su strumenti di riferimento che di prova utilizzando il modello standardizzato di acquisizione. Come mostrato nella Figura 8A,B, sono state ottenute percentuali comparabili di^{TF pos-piastrine} tra citometri di riferimento e test, confermando la riproducibilità dell'approccio a modello condiviso.

Figura 8: Riproducibilità tra strumenti utilizzando modelli di acquisizione condivisi. Percentuali di^{piastrine pos} TF misurate nel sangue intero da n=6 soggetti sani acquisiti su strumenti di riferimento e test FACSLyric (A) o MACSQuant (B) tramite un modello di acquisizione condiviso applicato tra gli strumenti. I dati sono espressi come determinazioni individuali (punti) e media ± SD. I dati sono stati analizzati tramite un test t accoppiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, è stata valutata l'armonizzazione basata su perline per allineare strumenti di diverse configurazioni. Il citometro A veniva usato come strumento di riferimento, e un FACSymphony come strumento di prova. L'allineamento è stato eseguito utilizzando sfere di calibrazione Rainbow a 6 picchi regolando la tensione del rivelatore FACSymphony a 488 nm fino a quando l'intensità di fluorescenza delle sfere non è scesa entro l'intervallo target predefinito. I profili istogrammatici che illustrano la distribuzione dei picchi delle perle prima e dopo l'allineamento sono mostrati nella Figura 9A. I campioni di sangue intero venivano poi prelevati sullo strumento di prova prima e dopo la calibrazione. Prima dell'armonizzazione, le percentuali di piastrine^pos TF differivano tra le due piattaforme. Dopo l'allineamento basato su perle, i valori corrispondevano strettamente a quelli ottenuti sul citometro di riferimento (Figura 9B), dimostrando un'armonizzazione cross-platform di successo e una quantificazione riproducibile di TF.

Figura 9: Armonizzazione degli strumenti basata su perline. (A) Istogramma rappresentativo di fluorescenza delle sfere di calibrazione Rainbow a 6 picchi acquisite prima (picchi rossi) e dopo (picchi verdi) all'allineamento dello strumento. (B) Percentuali di piastrine^pos TF misurate in campioni a riposo preparati da n=6 soggetti sani acquisiti sullo strumento di prova prima e dopo (Pre) e dopo (Post) armonizzazione. Le misurazioni ottenute sullo strumento di riferimento sono mostrate per il confronto. I dati sono stati analizzati tramite un test t accoppiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro passo dopo passo per la quantificazione della citometria a flusso sanguigno totale delle piastrine^{TF pos}, specificamente progettato per un'implementazione multicentrica. Il suo principale vantaggio metodologico rispetto ai flussi di lavoro convenzionali basati sull'analisi citometrica del flusso piastrinico è che standardizza l'intero processo analitico, dalla raccolta del sangue e fissazione del sangue intero all'etichettatura del campione, all'armonizzazione degli strumenti prima dell'acquisizione del campione e all'analisi centralizzata e al controllo della qualità dei dati. Questo permette ai centri senza la possibilità di elaborare campioni di partecipare a studi multicentrici, se possono fornire campioni di sangue. L'attuale flusso di lavoro affronta le fonti pratiche di variabilità tra i centri più rilevanti, considerando che solo una piccola percentuale di piastrine presenta TF associata alla superficie rilevabile in condizioni^{fisiologiche 7,8}. Queste fonti includono differenze nella gestione locale dei campioni, nell'accesso alle strutture di citometria a flusso, nella configurazione degli strumenti e nell'analisi dei dati dipendente dall'operatore.

Per superare questi problemi, il sangue intero viene fissato poco dopo la prelieva, stabilizzando il fenotipo piastrino in vivo ed evitando la necessità di marcatura immediata e acquisizione del campione. I risultati rappresentativi indicano che questo approccio a campione fisso consente un'elaborazione centralizzata ritardata all'interno dell'intervallo post-fissazione validato. Ciò amplia il potenziale di partecipazione agli studi verso centri privi di strutture di citometria a flusso in loco, mantenendo al contempo un flusso di lavoro pre-analitico coerente. Un secondo vantaggio del protocollo è l'uso di una strategia semplificata di colorazione diretta con un semplice pannello bicolore, che riduce la complessità della procedura.

Nel panel abbiamo utilizzato il ben caratterizzato clone monoclonale anticlonale anti-TF HTF1, che riconosce il sito catalitico della TF e compete con il legame del fattore VII, rendendolo uno dei reagenti più affidabili disponibili per il rilevamento della TF, anche nelle^{piastrine 14, 16, 17}. L'anticorpo è stato coniugato a Star Fluor 488, un fluorocromo luminoso e fotostabile spettralmente simile al FITC ma con maggiore stabilità del segnale. È importante sottolineare che l'eccitazione a 488 nm consente la rilevazione del campione con la configurazione laser blu disponibile praticamente su tutti i citometri a flusso convenzionali, inclusi gli strumenti entry-level. Questa combinazione di specificità epitopica e semplice rilevamento del fluorocromo migliora la sensibilità analitica e la scalabilità su più siti. In questo saggio, le soglie di positività sono state definite utilizzando controlli non colorati e FMO come opzione migliore rispetto al controllo isotipo per la posizione delle soglie in popolazioni a bassa^{frequenza 18}.

L'uso di diversi citometri a flusso può rappresentare una fonte di variabilità negli studi di citometria a flusso^{multicentrico} 19,20,21. In passato abbiamo fornito consulenza sulla gestione pre-analitica, l'impostazione delle colorazioni e l'ottimizzazione locale degli strumenti¹⁷. Tuttavia, queste misure non garantiscono segnali di fluorescenza coerenti su diverse piattaforme. L'attuale flusso di lavoro affronta questa questione combinando analisi centralizzata con armonizzazione delle acquisizioni potenziali. I modelli di acquisizione condivisa possono essere utilizzati quando sono disponibili citometri identici, mentre l'allineamento basato su perline può essere applicato quando devono essere incluse piattaforme diverse. Questa strategia duale offre un vantaggio pratico rispetto ai modelli analitici multicentrici che si basano esclusivamente sull'analisi centralizzata dopo acquisizioni locali eterogenee, riducendo la variabilità dell'analisi dei dati ab initio e supportando un'applicazione più riproducibile di gate tra i siti.

La generalizzazione del flusso di lavoro non va sottovalutata. Il protocollo è stato convalidato utilizzando specifiche condizioni di fissazione del sangue intero, la combinazione anti-TF-Star Fluor 488 e anti-CD41 PerCP-Cy5.5, procedure di armonizzazione e un set limitato di configurazioni di citometri a flusso. Se vengono utilizzati altri cloni anti-TF, combinazioni di fluorocromo, tempi di fissazione o concentrazioni fissative, o citometri di flusso con ottiche sostanzialmente diverse, è necessario verificare la performance analitica del flusso di lavoro. In generale, eventuali fallimenti di protocollo devono essere gestiti tramite le regole di deviazione predefinite suggerite. A seconda della gravità della deviazione, i dati possono essere segnalati, ripetuti o esclusi secondo il piano di deviazione specifico dello studio. All'interno di questi limiti, il protocollo attuale dovrebbe essere considerato come un quadro operativo per l'implementazione multicentrica dell'analisi^TF pos-piastrine. La validazione analitica formale, inclusa una valutazione più ampia delle prestazioni inter-laboratoriali, la validazione delle spedizioni e la ripetibilità dei sani, è attualmente oggetto di uno studio internazionale dedicato alla standardizzazione della International Society of Thrombosis and Hemostasis. La rilevanza clinica di una quantificazione accurata^{delle piastrine pos} TF è sottolineata dalle evidenze che ne dimostrano il valore prognostico nella malattia coronarica, dove livelli di^{piastrine pos} TF superiori al 4% prevedono indipendentemente la mortalità cardiovascolare a lungo termine al^{follow-up quinquennale 16}. Una misurazione multicentrica affidabile è quindi essenziale per convalidare le^{piastrine pos} TF come biomarcatore e per estenderne l'applicazione a studi clinici prospettici e registri reali. L'implementazione futura di algoritmi di normalizzazione automatizzati e strategie di autogating potrebbe ulteriormente ridurre il bias degli operatori e supportare l'analisi decentralizzata, mantenendo al contempo la comparabilità^{cross-site 22,23}.

In conclusione, questo flusso di lavoro armonizzato fornisce un approccio pratico e riproducibile per la quantificazione delle^{piastrine pos} TF tramite citometria a flusso sanguigno totale in contesti multicentrici. Combinando procedure pre-analitiche standardizzate, elaborazione semplificata dei campioni e strategie di armonizzazione degli strumenti, il protocollo consente un confronto affidabile tra siti di misurazioni^{di piastrine TF pos}. Oltre a supportare la valutazione delle^{piastrine pos} TF come biomarcatore del rischio trombotico, i principi qui descritti potrebbero contribuire a sforzi più ampi per standardizzare la citometria a flusso piastrino per applicazioni traslazionali e di ricerca clinica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1X PBS senza Calcio e Magnesio	Gibco	10010-015	Per diluizione di anticorpi e campioni
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anticorpo monoclonale anti umano CD41a utilizzato come marcatore della popolazione piastrinica; dovrebbe essere fornito dal Laboratorio Centrale
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anticorpo monoclonale anti Fattore Tissutale Umano (CD142); dovrebbe essere fornito dal Laboratorio Centrale
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	Nel testo, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	Nel testo, software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Per prelievo di sangue
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	Nel testo, software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	Nel testo, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	Nel testo, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	Nel testo, software C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Per fissazione del sangue intero
Paraformaldeide	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Per fissare i campioni
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Per trasferire campioni di sangue
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Per trasferire campioni di sangue
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Per trasferire campioni di sangue
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Necessario per l'acquisizione del flow cytometer
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Per l'armonizzazione del flow cytometer
Vacutainer EDTA	BD	368857	Per raccogliere i primi 3ml di sangue
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Per il prelievo di sangue
Vacutainer one use holder	BD	364815	Per il prelievo di sangue
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Per raccogliere il sangue