Caratterizzazione funzionale dei partner individuali pre- e postsinaptici nel sistema nervoso centrale larvale di Drosophila utilizzando CaMPARI

Summary

Questo protocollo valuta l'attività sinaptica funzionale tra partner neuronali definiti in vivo nel sistema nervoso centrale delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando strumenti codificati geneticamente. CsLa stimolazione optogenetica mediata da Chrimson dei neuroni sensoriali presinaptici cIVda induce la fotoconversione dipendente dal calcio di CaMPARI negli interneuroni postsinaptici del Bacino-4.

Abstract

Gli studi sui connettomi, con connettività, hanno ampiamente ampliato la comprensione della connettività sinaptica nei sistemi nervosi di varie specie. Mentre la caratterizzazione dei partner sinaptici tramite microscopia elettronica (EM) fornisce informazioni anatomiche dettagliate, gli aspetti funzionali delle reti neuronali richiedono approcci complementari. Studi recenti su Drosophila hanno rivelato non solo il connettore completo della larva, così come il sistema nervoso centrale maschile e femmina adulto, ma anche i componenti cellulari delle reti neuronali che regolano comportamenti specifici, come la rete nocicettiva larvale. Al terzo stadio larvale, i neuroni sensoriali multidendritici di classe IV (nocicettori) di arborizzazione dendritica di classe IV stabiliscono la maggior parte dei contatti sinaptici con gli interneuroni del Baci-4. Per valutare la rilevanza funzionale di queste connessioni anatomiche, l'indicatore di calcio geneticamente codificato CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivable Ratiometric Integrator) è stato impiegato in larve di terzo stadio vive e non dissezionate come reporter dipendente dall'attività per valutare la connettività sinaptica tra neuroni cIVda e interneuroni del Basin-4. CaMPARI è un indicatore fluorescente proporzionale il cui spettro di emissione cambia in risposta a livelli elevati di calcio intracellulare. In condizioni di base, CaMPARI fluoresce di verde; In presenza di alte concentrazioni di calcio e all'esposizione alla luce di fotoconversione (~400 nm), passa irreversibilmente alla fluorescenza rossa. Poiché l'afflusso di calcio nei neuroni postsinaptici è un segno distintivo dell'attivazione sinaptica, la fotoconversione CaMPARI fornisce una lettura della segnalazione sinapttica funzionale. Viene presentato un metodo passo dopo passo per immobilizzare le larve di terzo stadio su un vetrino microscopico per l'attivazione optogenetica dei nocicettori cIVda utilizzando la channelrodopsina CsChrimson spostata verso il rosso, combinata con la fotoconversione simultanea di CaMPARI nei neuroni del Bacino-4. La fotoconversione dipendente dal calcio nei neuroni del Bacino-4, nonostante i movimenti interni e i cambiamenti del piano focale, fornisce prove funzionali di connettività sinaptica tra queste cellule. Questo funge da prova di principio per l'uso di CaMPARI in combinazione con la stimolazione optogenetica presinaptica in larve di Drosophila intatte e non dissezionate.

Introduction

L'identificazione di partner sinaptici precisi nel sistema nervoso centrale (SNC) consente di monitorare la formazione e il perfezionamento delle connessioni sinaptiche durante lo sviluppo del sistema nervoso. Di conseguenza, gli sforzi si sono concentrati sull'uso della microscopia elettronica volumetrica (EM) per ricostruire non solo connettomi completi in potenti organismi modello genetici come Caenorhabditis elegans ^1,2 e Drosophila melanogaster ^3,4,5, ma anche volumi elettromagnetici su scala millimetrica di cervelli mammiferi complessi, inclusi la corteccia visiva^{primaria del topo 6} e la corteccia temporale^{umana 7}. Questi studi offrono una visione unica dei principi organizzativi alla base della connettività sinaptica a livello anatomico. Tuttavia, la caratterizzazione funzionale dei partner sinaptici fornisce una comprensione complementare della connettività neuronale ed è necessaria per convalidare i risultati anatomici.

Drosophila offre numerosi vantaggi per lo studio della connettività neuronale, tra cui la disponibilità di connetti completi per la larva³, così come per il sistema nervoso centrale adulto^{femmina 4} e^{maschio 5}, oltre a circuiti neuronali ben caratterizzati che regolano comportamenti prevedibili ^8,9,10. La rete nocicettiva larvale rappresenta uno di questi circuiti ben adatti allo studio della connettività sinaptica^{precisa 11}. La ricostruzione elettromagnetica di questa rete ha rivelato partnership sinaptiche dettagliate necessarie per elaborare stimoli nocicettivi, portando al comportamento caratteristico di fuga noto come rolling^{nocifensivo 12,13}.

All'interno di questa rete, i neuroni di arborizzazione dendritica di classe IV (cIVda^{) 14} funzionano come nocicettori sensoriali primari responsabili della rilevazione del dolore 11,12,13,15,16. I loro corpi cellulari e dendriti si trovano perifericamente nella parete corporea, mentre i loro assoni si proiettano nel midollo nervoso ventrale larvale (VNC⁾¹⁵. All'interno del SNC, i neuroni cIVda arborizzano i loro terminali assonali in uno schema stereotipato e formano la maggior parte dei loro contatti sinaptici con gli interneuroni del Bacino-4 11,12,13,17. Questa relazione sinaptica definita stabilisce i neuroni cIVda e gli interneuroni del Basin-4 come una coppia ideale per la valutazione funzionale della connettività sinaptica in vivo. Lo sviluppo di metodi per analizzare le connessioni funzionali tra partner sinaptici individualmente identificati faciliterà l'indagine dei meccanismi alla base dello sviluppo e del raffinamento sinaptico, in particolare in sistemi geneticamente trattabili con circuiti neurali stereotipati.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivable Ratiometric Integrator)¹⁸ è un indicatore fluorescente proporzionale geneticamente codificato il cui spettro di emissione si sposta in risposta a livelli elevati di calcio intracellulare. In condizioni di base, CaMPARI fluoresce di verde; In presenza di alte concentrazioni di calcio e esposizione alla luce di fotoconversione (~400 nanometri (nm)), si converte irreversibilmente in fluorescenza^{rossa 18}. Poiché l'afflusso di calcio nei neuroni postsinaptici è un segno distintivo dell'attivazione sinaptica, la fotoconversione CaMPARI fornisce una lettura della segnalazione sinaptica^{funzionale 19,20}.

Oltre a CaMPARI, l'attività neuronale può essere visualizzata utilizzando sensori reversibili come indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI) tra cui GCaMP o RCAMP²¹, così come indicatori di tensione codificati geneticamente (GEVI⁾²² come Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ o VARNAM²⁵. Sebbene questi sensori veloci e reversibili siano ben adatti al monitoraggio dell'attività transitoria in tempo reale, sono suscettibili ad artefatti di movimento durante l'imaging in vivo . Al contrario, le proprietà integrative e irreversibili di fotoconversione di CaMPARI permettono la cattura dell'attività in una finestra temporale definita, consentendo la rilevazione dell'attivazione neuronale anche quando i piani focali si spostano durante l'imaging²⁰. Inoltre, la fotoconversione CaMPARI può essere regolata regolando l'intensità della luce viola, permettendo il rilevamento di input di riduzione della forza sinaptica^{o di sottosoglia 26}. Queste proprietà hanno permesso la mappatura dell'attività in animali in movimento libero senza fissazione o attacchi della testa, inclusi studi su corteccia^{di topo 27}, cervello di pesce^{zebra 28}, C. elegans²⁹ e Drosophila^{adulta 20}.

Viene descritto un protocollo per visualizzare partner sinaptici funzionali tramite fotoconversione CaMPARI combinata con stimolazione optogenetica presinaptica tramite microscopia confocale in larve di Drosophila intatte e non dissezionate. In questo approccio, CaMPARI viene utilizzato per rilevare l'afflusso postsinaptico di calcio negli interneuroni del Bacini-4 dopo l'attivazione optogenetica dei neuroni cIVda in larve vive di terzo stadio. I neuroni cIVda esprimono la channelrodopsina attivata dalla luce rossa CsChrimson^30,31, mentre gli interneuroni del bacino-4 esprimono CaMPARI. L'esposizione alla luce rossa attiva selettivamente i nocicettori, imitando uno stimolo nocicettivo in modo temporalmente^{controllato 16,30}. Questa strategia consente di valutare se l'attivazione presinaptica induca la fotoconversione CaMPARI dipendente dal calcio nei neuroni postsinaptici, fornendo così prove funzionali della connettività sinaptica.

Diversi vantaggi tecnici supportano l'uso di CaMPARI in combinazione con CsChrimson per l'analisi della connettività cIVda–Basin-4. Innanzitutto, le dendriti cIVda formano una tassellatura completa e non sovrapposta della parete corporea^{larvale 32}, consentendo l'attivazione optogenetica dei neuroni sensoriali intatti senza effetti di confusione da danni indotti dalla^{dissezione 16}. In secondo luogo, sebbene le larve siano fisicamente immobilizzate su un vetrino microscopico, i movimenti interni alterano frequentemente la posizione del SNC e il piano focale durante l'imaging; La fotoconversione CaMPARI è meno sensibile a tali artefatti di movimento e fornisce una lettura stabile e integrata nel tempo dell'attività neuronale. In terzo luogo, le proprietà integrative e sintonizzabili di CaMPARI permettono di rilevare l'attività sinaptica anche quando la forza sinaptica o il numero di contatto sono ridotti, come durante le prime fasi dello sviluppo, supportando così futuri studi sulla formazione e raffinamento delle sinapsi.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali che hanno coinvolto Drosophila melanogaster sono state condotte secondo le linee guida istituzionali. Il genotipo w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (ottenuto dalla ricombinazione di RRID:BDSC_54899¹² e RRID:BDSC_32079¹⁶) è stato utilizzato per guidare l'espressione optogenetica e CaMPARI (utilizzando la linea w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo ottenuto ricombinando RRID:BDSC_81085 con marcatori cromosomici secondari) rispettivamente nei partner pre- e postsinaptici. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle larve

1. Impostare incroci genetici tra donne vergini UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) e maschi di una linea di mosche contenente due sistemi binari, ad esempio, con il neurone presinaptico di interesse che guida l'espressione di GAL4 e il neurone postsinaptico di interesse che guida^{LexA 33,34}.
2. Inserire incroci genetici in fiale di plastica contenenti medium standard di agar di farina di mais 35,36,37,38 integrato con 0,5 mM all-trans retinal (ATR) per l'attivazione di CsChrimson^30,33. Preparare fiale parallele senza ATR come controlli no-ATR.
   NOTA: Scioglie il mezzo di agar di farina di mais senza bollire. Lascialo raffreddare senza solidificarsi. Prepara una soluzione ATR da 40 mM (ATR in polvere diluita al 95% di etanolo secondo le istruzioni del produttore), poi diluisci a 0,5 mM nel mezzo e mescola accuratamente.
3. Copri completamente le fiale con carta di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   NOTA: Mantenere condizioni di allevamento in costante oscurità grazie alla sensibilità alla luce dell'ATR e per prevenire un'attivazione neuronale involontaria. Sebbene CsChrimson sia più sensibile alla luce rossa (590–680 nm), può anche essere attivato da altre lunghezze d'onda visibili^31,39.
4. Incubare le fiale a 25 °C e alzare le larve al terzo stadio instar.

2. Immobilizzazione larvale

1. Raccogli una larva di terzo stadio usando un pennello. Lavare le larve in una piastra micro spot a tre pozzi contenente 0,1 M PBS per rimuovere il cibo.
   NOTA: Non rimuovere l'eccesso di PBS; Aiuta a mantenere l'idratazione.
2. Posiziona una piccola quantità di argilla da modellare a ciascun angolo di un coperto pulito (18 × 18 mm). Posizionare la larva in una goccia di PBS sulla copertura e lasciarla orientare con il lato ventrale verso il basso.
   NOTA: Per l'imaging del cordone nervoso ventrale (VNC), si monta la larva sul lato dorsale in modo che la superficie ventrale entri in contatto con il copertore. Questa orientazione permette agli interneuroni del Bacino-4 nel VNC di rivolgersi all'obiettivo attraverso il copertura.
3. Posiziona un vetrino pulito sul copertore contenente la larva.
4. Fissa il coperto applicando ulteriore argilla da modellare agli angoli. Applicare una pressione sufficiente per immobilizzare la larva evitando la rottura della larva o il copricolamento.

3. Flusso di lavoro di stimolazione, fotoconversione e imaging

1. Acquisire uno stack z di base di neuroni postsinaptici che esprimono CaMPARI utilizzando canali simultanei verdi (488 nm, 0,8% potenza laser) e rossi (~561 nm, 0,8% potenza laser). Utilizzare un passo Z di 1 μm, risoluzione di 256 × 256 pixel, media lineare di 2, scansione bidirezionale e velocità di scansione di 9 su un microscopio confocale dotato di obiettivo 40×/1,2. Esegui tutte le immagini in un ambiente buio. Mantenere parametri identici dello z-stack durante tutto l'esperimento.
   NOTA: Aspettatevi corpi cellulari verde brillante in posizioni stereotipate nel VNC larvale e nessuna fluorescenza rossa rilevabile alla linea di base.
2. Stimolare la larva in modo continuo per 30 secondi utilizzando luce di fotoconversione simultanea (405 nm, 0,5% potenza laser) e luce di stimolazione optogenetica (594 nm, 0,8% potenza laser).
3. Acquisire uno stack z post-stimolazione usando gli stessi parametri del passo 3.1 sia sotto i canali rossi (~561 nm) che verdi (488 nm). Aspettatevi corpi cellulari VNC in posizioni simili a quelle della linea di base. Rilevare la fluorescenza rossa di CaMPARI nei neuroni attivati durante la stimolazione nelle larve alimentate con ATR, con fotoconversione minima nei controlli no-ATR.
   NOTA: Il flusso di lavoro e i parametri sono riassunti nella Figura 1.

Figura 1: Flusso di lavoro per stimolazione, fotoconversione (PC) e imaging. Sono state utilizzate tre fasi di imaging sequenziali per valutare l'attività del calcio nei neuroni del Bacino 4. Durante la fase di base, gli z-stack sono stati acquisiti utilizzando laser da 488 nm e 561 nm per catturare la fluorescenza verde e rossa di CaMPARI prima della stimolazione. Durante la fase di stimolazione, i neuroni cIVda sono stati attivati optogeneticamente tramite CsChrimson (594 nm) mentre l'illuminazione simultanea a 405 nm ha fotoconvertito CaMPARI attivo da fluorescenza verde a rossa; Non furono effettuate esami di imaging durante questo periodo di 30 anni. Durante la fase post-stimolazione, gli z-stack sono stati riacquisiti utilizzando le stesse impostazioni laser della linea di base per rilevare il segnale rosso fotoconvertito nei corpi cellulari del Basin-4. Tutte le pile Z sono state acquisite a 256 × 256 pixel con Z-step di 1 μm, media lineare di 2 e scansione bidirezionale in condizioni di buio utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo NA 40×/1.2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi di imaging

1. Apri immagini z-stack in Fiji (RRID:SCR_002285) con Bio-Formats abilitati. Imposta la visualizzazione dello stack su Hyperstack, la modalità colore su Composite e abilita l'Autoscala. Scorri tra i piani Z e seleziona il piano con la messa a fuoco ottimale. Duplica il piano selezionato (Immagine → Duplicata; Canali: 1–2; Z-piano selezionato).
2. Canali divisi rosso e verde (Immagine → Colore → Canali Divisi).
   NOTA: Regola luminosità e contrasto usando Immagine → Regola → Luminosità/Contrasto → Auto per entrambi i canali.
3. Sottrai il background da entrambi i canali (Processo → Sottrai Fondo) usando un raggio di rolling ball di 50 px.
4. Configurare le misurazioni (analizzare → impostare le misurazioni) per includere area, valore grigio medio, densità integrata (IntDen), deviazione standard e valori grigi minimi e max.
5. Disegna le regioni di interesse (ROI) attorno a ogni cella nel canale verde usando lo strumento a mano libera. Aggiungi i ROI al ROI Manager e misura. Applica gli stessi ROI al canale rosso e misura.
6. Annota tutte le misurazioni in un foglio di calcolo, inclusi identificatori di larve e cellule.
   NOTA: Esegui misurazioni sia per immagini pre che post-stimolazione.
7. Calcola i rapporti di fluorescenza rosso-verde usando i valori di densità integrata per ottenere (R/G)_post e (R/G)_pre per ogni cella. Valori medi a livello cellulare per larva.
   NOTA: La densità integrata (area × media) permette il confronto tra celle di diverse dimensioni.
8. Calcola Δ(R/G) come (R/G)_post − (R/G)_pre usando le medie larvali. Interpretare valori positivi di Δ(R/G) come un aumento dell'attività calciale postsinaptica durante la fotoconversione.
   NOTA: I valori negativi di Δ(R/G) possono derivare dal rumore o dall'asimmetria di fondo. Imposta valori negativi a 0. In questo dataset, una larva mostrava un valore negativo (−0,008), impostato a 0.

Results

Seguendo questo protocollo, la connettività funzionale tra neuroni cIVda e interneuroni del Basin-4 è stata valutata in larve di terzo stadio di D. melanogaster vive e non dissezionate utilizzando CaMPARI (Figura 2). Prima di qualsiasi stimolazione con luce di fotoconversione (PC) o attivazione optogenetica, gli interneuroni del Bacino-4 mostravano fluorescenza verde dovuta all'espressione citosolica di CaMPARI (Figura 2A). Non è stata rilevata fluoresc...

Discussion

Il protocollo descritto qui consente una valutazione qualitativa e quantitativa della connettività sinaptica tra partner sinaptici definiti in larve intatte di D. melanogaster . Questo approccio sfrutta la combinazione di stimolazione optogenetica dei neuroni sensoriali cIVda con la visualizzazione basata su CaMPARI degli interneuroni postsinaptici del Bacino 4 attivati per monitorare l'attività sinaptica nel sistema nervoso centrale (SNC) delle larve non dissezionate. Le applic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Chimico utilizzato nella soluzione per idratare e montare le larve
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chimico aggiunto al cibo per attivare gli strumenti optogenetici
Microscopio confocale	ZEISS	LSM900 Confocal	Microscopio confocale, Lente obiettivo (40×/1.2 NA), Sorgente luce/laser (405, 488, 561 nm)
Coverslip (18x18mm)	VWR	48366-205	Usato per montare gli animali per l'imaging
Etanolo (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Usato come solvente per la polvere ATR
Fiji (ImageJ)	Open source	RRID:SCR_002285	Usato per l'analisi delle immagini
Prism versione 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Usato per l'analisi statistica
Lamine per microscopio	VWR	48300-041	Usate per montare gli animali per l'imaging
Argilla modellante	Flinn scientific	FB0600	Usata per tenere la vetrina di copertura sul vetrino del microscopio con le larve in mezzo
Pennello	Genesee scientific	59-204	Usato per trasferire le larve tra diverse posizioni
Terreno standard in agar di farina di mais	Genesee scientific	66-123	Il cibo può essere preparato anche usando ricette e ingredienti standard simili
Fiale di plastica standard per Drosophila (fiale strette da 25mm x 95mm per Drosophila)	Genesee scientific	32-109	Si possono usare anche fiale o bottiglie grandi
Piatto a tre pozzetti micro spot	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Piatto usato per separare e pulire le singole larve
Stoccaggio Drosophila (genotipo: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Ottenuta ricombinando RRID:BDSC_54899 e RRID:BDSC_32079
Stoccaggio Drosophila (genotipo: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Ottenuta ricombinando RRID:BDSC_81085 con marcatori del secondo cromosoma