Reazione a catena di ibridazione assistita da espansione - smFISH e immunoistochimica nel cervello di Drosophila

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro HCR-smFISH e immunoistochimico assistito dall'espansione per analisi quantitative, specifiche per tipo cellulare, dell'espressione di RNA e proteine nel cervello di Drosophila , inclusa l'imaging con microscopia a foglio luminoso o confocale e la quantificazione automatica di trascritti nucleari e citoplasmatici.

Abstract

L'analisi quantitativa e spazialmente risolta dell'espressione genica è essenziale per valutare i profili molecolari specifici per tipo cellulare. Nel sistema visivo di Drosophila , ampi strumenti genetici aprono un quadro per la valutazione diretta sia dei livelli di RNA che di proteine in popolazioni neuronali definite. Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo che combina HCR-smFISH (ibridazione a catena di ibridazione a fluorescenza in situ a singola molecola a catena di ibridazione) con l'immunoistochimica per consentire un'analisi quantitativa dei profili molecolari specifici per tipo cellulare in tipi neuronali di sistemi visivi definiti geneticamente. Il flusso di lavoro è ottimizzato per cellule marcate con marcatori localizzati nuclearmente o legati alla membrana, permettendo la misurazione dei livelli di trascrizione e proteina negli stessi neuroni. Dopo l'espansione tissutale, i campioni vengono fotografiati utilizzando microscopia a foglio luminoso per un'acquisizione volumetrica rapida, con un flusso di lavoro alternativo di montaggio e imaging dimostrato per microscopi laser a scansione invertita standard e a disco rotante. Forniamo inoltre un algoritmo di segmentazione automatico che distingue i trascrizioni nucleari e citoplasmatiche, consentendo analisi dello stato trascrizionale e della localizzazione subcellulare dell'RNA. Vengono fornite indicazioni pratiche sui parametri sperimentali e sulle insidie comuni che influenzano la qualità del segnale, l'integrità dei tessuti e le prestazioni quantitative. Le applicazioni rappresentative includono la validazione dell'interferenza RNA specifica per tipo cellulare quantificando i corrispondenti cambiamenti nei livelli di RNA e proteine. Consentendo misurazioni integrate a livello di RNA e proteina con specificità di tipo cellulare, questo approccio offre una strategia scalabile per l'analisi molecolare guidata da ipotesi e, in contesti mirati, un'alternativa pratica ai saggi trascritomici a singola cellula. Questo protocollo fornisce un approccio pratico per convalidare le perturbazioni molecolari specifiche per tipo cellulare, preservando al contempo il contesto anatomico del cervello intatto di Drosophila .

Introduzione

Il sistema visivo di Drosophila melanogaster ha rappresentato un potente modello per affrontare una vasta gamma di questioni nelle neuroscienze dello sviluppo, tra cui differenziazione^{neuronale 1,2}, specifica^{cellulare 3,4} e logica molecolare del cablaggio^{cerebrale 5,6,7}. Questo progresso è stato guidato da un kit sperimentale insolitamente ricco, che include grandi collezioni di linee motore genetiche specifiche per tipo^{cellulare 8,9,10}, recenti ricostruzioni connettomiche complete 10,11,12 e sempre più dettagliate trascrittomiche a cellula ^{singola 13,14} e^{multiomica 15} dataset. Insieme, queste risorse definiscono i tipi neuronali in modo multimodale e permettono manipolazioni genetiche precise. Di conseguenza, il campo può ora generare ipotesi sempre più predittive su come specifici geni regolano l'identità neuronale, la connettività e la loro funzione¹⁶.. Sebbene il sequenziamento dell'RNA a singola cellula fornisca potenti intuizioni sugli stati trascrizionali, l'abbondanza di RNA non predice sempre l'espressione^{proteica 17}, e molti esperimenti di perturbazione richiedono alla fine una misurazione diretta e quantitativa sia di RNA che di proteina negli stessi neuroni.

L'ibridazione in situ a fluorescenza singola (smFISH^)18,19 consente una misurazione quantitativa dell'abbondanza di trascrizione con risoluzione cellulare e subcellulare, preservando il contesto anatomico. La combinazione di smFISH con microscopia ad espansione 20,21,22 ha ulteriormente esteso la sua utilità ai cervelli intatti, ingrandendo fisicamente i tessuti all'interno di un idrogel gonfio, riducendo così l'affollamento molecolare, migliorando l'accesso ottico e aumentando la risoluzione spaziale efficace. Quando abbinato all'amplificazione del segnale basata su reazione a catena ibrida (^{HCR) 23}, lo smFISH assistito da espansione consente una rilevazione robusta di trascritti discreti in tessuto neurale spesso e supporta l'imaging dell'intero cervello utilizzando microscopia a foglio luminoso o confocale.

Una serie di approcci di imaging in situ per l'RNA è stata applicata al cervello di Drosophila , riflettendo diverse priorità sperimentali. L'HCR-FISH iterativo assistito dall'espansione ha permesso il rilevamento di RNA a risoluzione spaziale totale^{del cervello 24}. Parallelamente, approcci FISH non a espansione a montaggio intero sono stati utilizzati per misurazioni di RNA in neuroni geneticamente marcati, incluse strategie di mappatura dell'attività basate su HCR centrate sui geni immediatamente^{precoci 25} e flussi di lavoro di conteggio dei trascrizioni basati su segmentazione utilizzando marcatori geneticamente codificati^{legati a membrana 26}. Metodi commerciali basati su sonde come l'RNAscope hanno ulteriormente permesso il rilevamento multiplex di RNA in cervelli interi, spesso combinati con immunoistochimica per identificare popolazioni cellulari^{bersaglio 27}. Insieme, questi approcci stabiliscono che l'analisi spazialmente risolta dell'RNA nel cervello delle mosche è tecnicamente fattibile. Tuttavia, gli esperimenti di perturbazione guidati da ipotesi impongono un insieme più specifico di requisiti che non sono pienamente affrontati da un singolo flusso di lavoro esistente. Molti metodi danno priorità alla mappatura dei trascrizioni in stile multiplex di discovery, alla profilazione dello stato di attività o alla quantificazione solo dell'RNA, con l'immunocolorazione che tipicamente funge da identificatore cellulare piuttosto che come lettura corrispondente della proteina perturbata, oppure viene applicata in assenza dell'assegnazione genetica del tipo^{cellulare 28}. Inoltre, le applicazioni di routine trarrebbero beneficio dalla compatibilità con più piattaforme di imaging e da pipeline di analisi automatizzate e scalabili.

Qui presentiamo un flusso di lavoro integrato e passo dopo passo per il sistema visivo di Drosophila che combina HCR-smFISH assistito da espansione con immunoistochimica eseguita prima dell'espansione, consentendo la misurazione accoppiata dei livelli di RNA e proteina negli stessi neuroni all'interno dello stesso campione biologico. Basandoci sul framework^{FlySeg 29} che abbiamo precedentemente sviluppato, forniamo una pipeline automatica di quantificazione per la segmentazione nucleare e il conteggio dei trascrizioni che distingue punti nucleari e citoplasmatici, supportando sia misurazioni di espressione totale sia analisi sensibili allo stato trascrizionale. Il protocollo viene dimostrato sia su un microscopio a foglio luminoso sia su due sistemi confocali con flussi di lavoro alternativi di montaggio e di imaging. Infine, illustriamo l'utilità della lettura integrata RNA–proteina con un esperimento rappresentativo di validazione della perturbazione (cioè, knockdown mediato da RNAi di un bersaglio definito), fornendo indicazioni pratiche su parametri e insidie che influenzano la qualità del segnale, l'integrità dei tessuti e le prestazioni quantitative.

Questo protocollo si basa generalmente sul framework²⁴ EASI-FISH precedentemente descritto per il rilevamento dell'RNA a livello completo nel cervello Drosophila, mantenendo i suoi principi fondamentali di ancoraggio dell'RNA, espansione dell'idrogel e amplificazione del segnale basata su HCR. L'attuale protocollo estende e perfeziona questo approccio integrando immunoistochimica prima dell'espansione per consentire misurazioni abbinate di RNA e proteina negli stessi neuroni, rivedendo molteplici fasi di elaborazione e gestione durante il flusso di lavoro per migliorare robustezza e riproducibilità, fornendo strategie pratiche di montaggio e imaging sia per microscopi a foglio di luce che per microscopi confocali convenzionali invertiti, e incorporando segmentazione automatizzata del soma e quantificazione dei trascrizioni con separazione esplicita di pool di RNA nucleare e citoplasmatico.

Questo flusso di lavoro è più adatto a esperimenti mirati in cui l'obiettivo è quantificare letture definite di RNA e proteine nei neuroni geneticamente identificati, preservando il contesto anatomico. È particolarmente utile per convalidare le perturbazioni molecolari quando l'obiettivo è misurare la regolazione al rialzo o alla bassa di un gene definito o di un piccolo insieme di geni candidati, confrontare l'espressione tra genotipi o fasi di sviluppo, o valutare lo stato trascrizionale attraverso la localizzazione di trascrizioni nucleari rispetto a quelle citoplasmatiche. È meno adatto per la scoperta di trascrizioni imparziale o per la mappatura dell'espressione cerebrale a multiplo alto complesso, dove il sequenziamento a singola cellula, la trascrittomica spaziale o gli approcci FISH multiplexati iterativi possono essere più appropriati.

Protocollo

Dichiarazione etica

Questo protocollo utilizza Drosophila melanogaster. Non sono stati utilizzati animali vertebrati né soggetti umani. Pertanto, non era richiesta l'approvazione del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

NOTA: Usa la tecnica RNase clean-clean per tutta la durata. Indossa i guanti, pulisci superfici e strumenti con una soluzione di decontaminazione RNase e prepara tutte le soluzioni con acqua priva di RNasi.

Figura 1. Flusso di lavoro passo dopo passo del protocollo di preparazione del campione (A) Cronologia schematica del protocollo, che indica la progressione approssimativa giorno per giorno e i passaggi di incubazione notturni. (B–J) Panoramica schematica dei principali passaggi di preparazione del campione, dalla dissezione e fissazione cerebrale fino all'immunoistochimica, incrocio RNA/proteina, incorporamento idrogel, digestione, ibridazione della sonda e amplificazione del segnale HCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Dissezione cerebrale, fissazione e immunoistochimica (Giorno 1–3)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in una piastra multi-pozzetto in stile Terasaki, salvo diversa indicazione. Usa 10 μL per pozzo per incubazioni e lavaggi. Mantieni l'umidità posizionando una salvietta da laboratorio umidita in un angolo della piastrella.

ATTENZIONE: Paraformaldeide e fissativi gliossili sono tossici/irritanti. Maneggia con una cappa e indossa i DPI appropriati.

1. Dissezionare cervelli in mezzo S2 gelido. Trasferire i cervelli nei pozzi, fino a 10 cervelli per pozzo (Figura 1B–C).
   NOTA: Per gli esperimenti rappresentativi qui mostrati, sono stati utilizzati 72 cervelli pupali di circa 72 h.
2. Sostituisci il mezzo S2 con un fissatore da 10 μL per pozzo, sostituisci una volta.
3. Fissare con Addax gliossalo senza acidi con il 5% (p/v) di saccarosio durante la notte a 4 °C (Figura 1C).
4. Lavare il cervello 3× in 10 μL PBST (0,5% Triton X-100 in PBS) per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Il Triton X-100 è un irritante; Evita il contatto visivo con pelle e occhi.
5. Incubare i cervelli in una soluzione primaria di anticorpi da 10 μL (in PBST, alle diluizioni elencate nella Tabella dei Materiali) per 24 ore a 4 °C. (Figura 1D).
6. Lavare il cervello 3× per 10 minuti in 10 μL PBST a 4 °C. Per ogni lavaggio, sostituisci la soluzione una volta a metà incubazione (due scambi per lavaggio).
7. Incubare i cervelli in una soluzione secondaria di anticorpi da 10 μL (in PBST, alle diluizioni elencate nella Tabella dei Materiali) per 24 ore a 4 °C (Figura 1D).
   NOTA: Proteggi i campioni dalla luce.
8. Lavare il cervello 3× per 10 minuti in 10 μL PBST a 4 °C. Per ogni lavaggio, sostituisci la soluzione una volta a metà incubazione (due scambi per lavaggio).
   NOTA: Utilizzare concentrazioni di anticorpi primarie e secondarie 2–3 volte superiori rispetto alle concentrazioni standard di immunoistochimica a montaggio intero
   PUNTO DI PAUSA: Conservare i cervelli in 10 μL 1× PBS a 4 °C per un massimo di 96 ore.

2. Ancoraggio covalente di RNA e proteine (Giorno 4) (Figura 1E)

ATTENZIONE: Gli alchilatori che ancorano l'RNA e gli AcX sono pericolosi (tossici/irritanti; alcuni sono sospettati cancerogeni). Prepara e maneggia le soluzioni in una cappa chimica con DPI appropriati. Raccogliere tutti i rifiuti come rifiuti chimici pericolosi.

1. Incubare i cervelli in 10 μL di tampone MOPS da 20 mM (pH 7,7) per 20 minuti a 37 °C.
2. Prepara la soluzione di ancoraggio mescolando 49,5% (v/v) di 20 mM MOPS, 49,5% (v/v) di pellicola Melphalan (2,5 mg·^mL-1 in DMSO) e 1% (v/v) di acX (10 mg·^mL-1 in DMSO). Questo produce concentrazioni finali di 1,24 mg·^mL-1 melphalan e 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Sostituire il MOPS con una soluzione di ancoraggio da 7–8 μL per pozzo, sostituire la soluzione una volta e incubare durante la notte a 37 °C al buio.
   NOTA: Utilizzare 7–8 μL per minimizzare il trabocco e la miscelazione tra pozzi mantenendo la copertura completa del campione.

3. Gelazione (inserimento del cervello in un idrogel) e digestione della proteinasi K (giorno 5)

ATTENZIONE: I monomeri acrilici, APS e TEMED sono irritanti/tossici. Manipolare con DPI; Prepara componenti volatili/esotermici in una cappa a pompa.

1. Attacca una guarnizione adesiva in silicone spessa 0,5 mm a un vetrino di vetro non caricato (Figura 1F, in basso a sinistra), premi saldamente per garantire il contatto e la sigillatura completa.
2. Aggiungere 200 μL di soluzione di poli-L-lisina nella camera e distribuire uniformemente la superficie, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e rimuovere la soluzione con una pipetta.
3. Lascia che la poli-L-lisina evapori completamente finché la superficie non è visibilmente secca.
   NOTA: L'evaporazione della poli-L-lisina è lenta. Per risultati affidabili, prepara le camere in anticipo e lasciale asciugare durante la notte in un ambiente privo di polvere. In alternativa, si conservano camere a secco in un incubatore a 37 °C per ≥ 1 ora il giorno dell'utilizzo.
4. Lavare il cervello 2× in 10 μL 1× PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
5. Prepara la soluzione di monomeri gel e aggiungi i reagenti di polimerizzazione immediatamente prima dell'uso, mescolando la soluzione monomerica con 4HT, TOMED e APS (make fresh) in un rapporto di 47:1:1:1. La soluzione finale di gelificazione contiene 1 M acrilato di sodio, 14% acrilammide, 0,1% bis-acrilammide, 1× PBS, 0,01% 4HT, 0,2% TEMED e 0,2% APS.
6. Vortice brevemente e tieni la soluzione finale di gelificazione sul ghiaccio. Usa subito la soluzione.
7. Incubare i cervelli in una soluzione fredda di gelificazione da 10 μL per 15 minuti su ghiaccio.
8. Durante il pre-bilanciamento, usando una nuova lametta, taglia un canale stretto su ciascun lato della guarnizione in silicone per permettere all'aria di uscire durante il riempimento (Figura 1F, in alto a sinistra)
9. Utilizzando una punta di pipetta, trasferire i cervelli nella camera di gelificazione preparata, assicurandosi che ogni cervello rimanga sempre immerso nella soluzione gelificante.
   ATTENZIONE: Dopo l'ancoratura e l'equilibrio, i cervelli diventano altamente adesivi e si attaccano facilmente alle superfici di plastica. Per evitare la perdita di campione, usa punte a pipetta a largo calibro o rifila l'estremità di una punta standard per allargare l'apertura.
10. Rimuovi il rivestimento protettivo dall'adesivo in silicone della guarnizione superficiale e posiziona delicatamente un copertino pulito di vetro 1,5H sopra la camera, evitando bolle d'aria intrappolate.
11. Pipettare lentamente 200 μL di soluzione gelificante appena preparata nella camera attraverso uno dei canali laterali, finché la camera non è completamente riempita.
12. Posiziona la camera sigillata in un contenitore buio e incuba a 37 °C per 2 ore.
    NOTA: Inserire salviette da laboratorio umidite con acqua) all'interno del contenitore. Assicurati che il diavolo non entri in contatto diretto con acqua liquida.
13. Prepara un buffer di digestione composto da 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,5% (v/v) Triton X-100 in acqua priva di RNasi.
14. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere la proteinasi K a 1:100 da una scorta di 20 mg·^mL-1 a una concentrazione finale di 0,2 mg·^mL-1.
    ATTENZIONE: La proteinasi K è un irritante e va trattata con guanti; Evita l'inalazione e il contatto con la pelle.
15. Lascia raffreddare il vetrino a temperatura ambiente per 5 minuti prima di rimuovere il copertore. Ritaglia il gel con un bisturi in una forma rettangolare usando tagli singoli e dritti. Minimizza il volume di gel in eccesso che circonda ciascun cervello (Figura 1F, in alto a destra).
16. Inserire ogni gel rifilato in un singolo pozzo di una piastra a 24 pozzetti contenente una soluzione digertiva da 1000 μL. Assicurati che i gel siano completamente sommersi.
17. Sigilla la piastra con Parafilm e incuba tutta la notte a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g (Figura 1G).

4. Digestione DNasi e ibridazione con sonda HCR-smFISH (Giorno 6)

1. Aspirare con cura la soluzione digertiva utilizzando una pipetta posizionata al bordo del pozzo per evitare il contatto o la deformazione del gel.
2. Lavare gel 3× con 500 μL 1× PBS per 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g.
   PUNTO DI PAUSA: Conservare i gel immersi in 500 μL 1× PBS a 4 °C per un massimo di 7 giorni prima di procedere.
3. Preparare una soluzione di lavoro di DNasi da 500 μL per gel diluendo lo stock DNasi I dal set QIAGEN RNasi senza RNase 1:10 nel buffer RDD. La soluzione finale di lavoro contiene circa 0,27 unità di Kunitz·^μL-1.
4. Incubare gel in una soluzione di lavoro di DNasi da 500 μL per 2 ore a 37 °C con un leggero dondolo (Figura 1H).
5. Lavare gel 4× con 500 μL di PBS senza RNasi 1× per 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
6. Equilibrare i gel in un buffer di ibridazione con sonda preriscaldata da 500 μL per 30 minuti a 37 °C
7. Scorta di sonde HCR smFISH diluita (1 μM; Molecular Instruments) 1:300 nel buffer di ibridazione della sonda fino a una concentrazione finale di ~3,3 nM. Miscelazione tramite vortice
8. Sostituire il buffer di equilibrio con un mix di sonda da 500 μL per gel e incubare durante la notte a 37 °C su un oscillatore orbitale a 0,11g (Figura I).
   ATTENZIONE: I buffer di ibridazione della sonda contengono formamide, che è tossica. Usa i guanti ed evita di inalare.

5. Reazione a catena di ibridazione (giorno 7) (Figura 1J)

1. Lavare i gel 3× con tampone di lavaggio a sonda preriscaldata da 500 μL per 30 minuti ciascuno a 37 °C su uno shaker orbitale a 0,11 g.
   ATTENZIONE: I buffer di lavaggio delle sonde contengono formamide, che è tossica. Usa i guanti ed evita di inalare.
2. Lavare gel 3× con 500 μL 1× PBS per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g.
3. Lasciare i gel in 1 mL 1× PBS durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g.
   NOTA: Un lavaggio prolungato durante la notte migliora il rapporto segnale-rumore riducendo il legame fuori bersaglio della sonda e i punti di fondo. Per l'elaborazione nello stesso giorno, procedere direttamente all'amplificazione HCR.
   PUNTO DI PAUSA: Dopo i lavaggi post-ibridazione, conservare i gel in 1 mL 1× PBS a temperatura ambiente o 4 °C per un massimo di 96 ore prima dell'amplificazione HCR.
4. Sostituire il PBS con un buffer di amplificazione da 500 μL (precedentemente bilanciato alla temperatura ambiente) per pozzo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g.
5. Per ogni set di sonde, diluire le forcine h1 e h2 (stock da 3 μM; Molecular Instruments) in buffer di amplificazione 1:100 (concentrazione finale di 30 nM). Prepara 350 μL di miscela a forcina diluita per ogni pozzo.
6. Soluzioni a forcina diluite termicamente in tubetti PCR a 95 °C per 90 secondi in un termociclatore o blocco di calore. Utilizzare un volume totale di 100 μL per tubo per garantire un riscaldamento uniforme e un equilibrio della temperatura.
   NOTA: Le linee guida HCR raccomandano comunemente di riscaldare a scatto il forcina h1 e h2 separatamente e di combinarli solo dopo il raffreddamento; in alternativa, combinare H1 e H2 prima del riscaldamento rapido quando è richiesta una gestione semplificata.
7. Lascia raffreddare le forcine a temperatura ambiente per 10 minuti al buio senza disturbi.
8. Rimuovere il buffer di amplificazione e aggiungere 350 μL di miscela a forcina per pozzo.
9. Incubare gel per 2 ore a temperatura ambiente al buio su uno shaker orbitale a 0,11 g.
10. Lavare gel 3× con 500 μL 5× SSCT per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 0,11 g.
11. Recupera le soluzioni a forcina dopo l'amplificazione, proteggile dalla luce e conservale a -20 °C per il riutilizzo.
12. Trasferisci i gel a 500 μL 1× PBS e lava 3× per 30 minuti a temperatura ambiente.
13. Conservare i gel in 500 μL 1× PBS a 4 °C, protetti dalla luce.
    PUNTO DI PAUSA: I GEL AMPLIFICATI possono essere conservati fino a 2 settimane prima dell'imaging con una minima perdita di segnale.

6. Preparazione, montaggio e imaging di campioni espansi (Giorno 8) (Figura 2)

1. Incubare gel in 1× PBS contenente DAPI (1:1000) durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale a 0,11 g.
2. Usa una breve illuminazione UV per visualizzare il cervello all'interno del gel. Orienta il campione e ritaglia il gel in eccesso secondo necessità.
   ATTENZIONE: L'illuminazione UV viene utilizzata durante il posizionamento e il montaggio del campione. Indossa una protezione oculare adeguata.
3. Montare i campioni in 1× PBS integrati con DAPI (1:1000) utilizzando la configurazione appropriata per la piattaforma di imaging selezionata (vedi Tabella 1).
4. Lasciare che i campioni si equilibrino per almeno 1 ora prima dell'acquisizione.
5. Usa obiettivi di immersione in acqua con sufficiente distanza di lavoro per visualizzare attraverso il gel espanso.
6. Campioni di immagine utilizzando microscopia a foglio luminoso, microscopia confocale a scansione laser o microscopia confocale a disco rotante. I parametri rappresentativi specifici per piattaforma di montaggio e acquisizione utilizzati in questo studio sono riassunti nella Tabella 1.
   NOTA: Dopo l'imaging, sonde e forcine HCR possono essere rimosse tramite digestione DNase come descritto sopra. I gel possono quindi essere sottoposti a ulteriori cicli di ibridazione con sonda e amplificazione HCR.

Piattaforma	Visualizzazione, montaggio e localizzazione di esempi	Obiettivo / rilevatore	Impostazioni di acquisizione rappresentative
Zeiss Lightsheet 7	Usa brevi illuminazione UV per visualizzare la posizione del cervello nel gel. Taglia il gel in eccesso e orienta ogni cervello verso l'obiettivo di rilevamento. Posizionare 5–6 gel su un coperto coperto di 1 × 1 cm rivestito di poli-L-lisina, con gel rivolti verso l'esterno (Figura 2A). Attacca la copertura al portacampioni LS7 usando una piccola goccia di adesivo polimerizzabile ai raggi UV; spegni la lampada UV prima di applicare l'adesivo. Monta nella camera LS7 e localizza le regioni cerebrali usando la visualizzazione in tempo reale in ZEN Black.	Obiettivo di rilevamento dell'immersione in acqua 20×/1.0 NA; 2,5× zoom ottico (ingrandimento totale del 50×).	Z-step, 0,4 μm a 2,5× zoom e 2× espansione. Scansione pivot abilitata. Esposizione, 50 ms per tutti i canali. Laser: 405 nm al 5%, 488 nm al 2%, 561 nm all'8%. Emissioni: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Figura 2C, a sinistra)
Confocale per scansione laser Nikon Ti2-E AXR NSPARC	Usa una breve illuminazione UV per visualizzare il cervello all'interno del gel. Orienta un singolo gel in modo che il cervello sia rivolto verso il basso verso l'obiettivo invertito. Trasferire in una piastra di imaging a fondo di vetro riempita con 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Individuare il cervello con un obiettivo di 4×, identificare ROI con un obiettivo del 20× e registrare posizioni X-Y negli elementi NIS. Aggiungi un mezzo di immersione, rivisiti i ROI registrati e mettili a fuoco.	40× obiettivo a immersione in acqua a lunga distanza (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, distanza di lavoro 0,61 mm); Rivelatore NSPARC in modalità super-risoluzione.	Scansione galvanometro, 2048 × 2048 pixel, 1,6 μs/pixel, zoom 8,0×. Laser: 488 nm al 2%, 640 nm al 20%. Emissione: 502–546 nm e 666–732 nm.
			(Figura 2C, centro)
Confocale a disco rotante Evident Scientific IX85 / Yokogawa CSU-W1	Montare i campioni come per l'imaging confocale invertito: orientare il gel con il cervello rivolto verso l'obiettivo e posizionarlo in una piastra di vetro con fondo di vetro con 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Identificare le regioni di interesse come descritto per la microscopia confocale a scansione laser utilizzando il software cellSens.	obiettivo a immersione in acqua a lunga distanza 60× (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, distanza di lavoro di 1,5 mm); Fotocamera Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 pixel; dimensione pixel 6,5 × 6,5 μm).	Eccitazione di 488 nm al 75% di potenza, esposizione di 200 ms; Eccitazione a 640 nm al 100% di potenza, 800 ms di esposizione. Emissione: 500–550 nm e 665–705 nm.
			(Figura 2C, a destra)

Tabella 1: Montaggio rappresentativo, localizzazione del campione e parametri di imaging tra le piattaforme di microscopia. Riepilogo delle strategie di montaggio del campione, approcci di localizzazione, obiettivi e parametri di acquisizione utilizzati tra le piattaforme di microscopia a foglio luminoso e confocale.

7. Analisi quantitativa dell'espressione di RNA e proteine

NOTA: Scegli il flusso di lavoro di analisi in base all'obiettivo sperimentale. Un confronto di questi approcci è fornito nella Tabella Supplementare 1.

1. Quantificazione dei trascrizioni su scala popolazionale usando FlySeg.
   NOTA: L'analisi si basa sulla versione aggiornata della pipeline^{FlySeg 29} . Una panoramica schematica del flusso di lavoro di analisi è mostrata nella Figura 3A–B
   1. Installa FlySeg, un pacchetto basato su Python, creando un ambiente Conda utilizzando:
      conda env create -f environment.yml
   2. Attiva l'ambiente prima dell'analisi utilizzando:
      conda attiva flyseg
   3. Inizia l'analisi utilizzando:
      Python main.py --file >
      Usa formati di input supportati, inclusi file CZI o NPY.
   4. Personalizza l'analisi utilizzando argomentazioni opzionali secondo necessità, inclusi:
      Numero di canali (--canali)
      Canale dei nuclei (--nuclei_ch o --nuclei_wavelength)
      Canale citoplasmatico (--cytoplasm_ch o --cytoplasm_wavelength)
      Parametri di rilevamento dei nuclei (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Fattore di dilatazione nucleare (--nuclei_dilation)
      Soglie di rilevamento FISH (--fish_threshold_range)
      Directory di output (--output_dir)
      Visualizzazione tramite Napari (--visualizze)
   5. Visualizza tutte le opzioni disponibili utilizzando:
      Python main.py – aiuto
   6. Ispezionare i metadati delle immagini utilizzando:
      Python main.py --metadata_only.
      Conferma la dimensione del voxel, il numero di canali e l'identità del canale.
   7. Esegui l'analisi utilizzando parametri adeguati per il dataset. Tipicamente, si specifica il numero totale di canali, canale nuclei, canale del citoplasma (se disponibile) e fattore di dilatazione nucleare.
      NOTA: Imposta il valore --nuclei_dilation appropriato per il confine nucleare/citoplasmatico desiderato. Vedi la Figura 3C–D per un esempio.
   8. Monitora il registro di elaborazione. Tutti gli output vengono salvati in una cartella chiamata in base al file di input.
   9. Identificare i principali risultati per l'analisi a valle, inclusi:
      1. -Nuclei-df.csv
         che contiene misurazioni di caratteristiche per nucleo e i relativi conteggi di punti per ciascun canale FISH e fornisce dati quantitativi per l'analisi statistica.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Che è un diagramma a scatter usato per identificare i valori anomali di segmentazione basati sulla dimensione e intensità nucleare; escludere i nuclei segnalati come anomalie da ulteriori analisi.
   10. Utilizzare output intermedi aggiuntivi (ad esempio, maschere di segmentazione, tabelle di rilevamento punti e file di riepilogo FISH uniti) per un post-processing avanzato se necessario.
2. Conteggio dei trascrizioni in celle individualmente identificabili usando Imaris
   1. Utilizzando lo strumento Superfici, segmenta il neurone di interesse in base a un canale marcatore citoplasmatico o di membrana.
   2. Regolare i parametri di levigatura superficiale e soglia di intensità per garantire che la superficie risultante comprenda accuratamente il soma, escludendo le strutture vicine.
   3. Utilizzando lo strumento di rilevamento Spots, identifica i punti del trascrizione nel canale FISH. Imposta il diametro del punto stimato e la soglia di intensità basati sulla dimensione del punto e sull'intensità del segnale (ad esempio, 0,25 μM per espansione tissutale 2x).
   4. Limitare la rilevazione dei punti alla superficie precedentemente generata per assicurarsi che vengano conteggiati solo i punti all'interno del neurone.
   5. Estrai il numero totale di punti rilevati all'interno della superficie neuronale utilizzando il pannello Statistiche.
   6. Conteggi spot delle esportazioni e misurazioni associate per analisi a valle.
3. Quantificazione della fluorescenza basata sul ROI usando FIJI/ImageJ
   1. Apri le pile di immagini in FIJI e genera proiezioni di massima intensità utilizzando Image > Stacks > Z Project > Maximum Intensity Projection. Usa le stesse impostazioni di proiezione per tutti i campioni all'interno di un esperimento.
   2. Identificare la struttura neuronale di interesse utilizzando un canale marcatore anatomico (ad esempio, GFP membrana o citoplasmatica). Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera o poligono, delinea manualmente il ROI corrispondente alla struttura (ad esempio, dendrite a fibra gigante).
   3. Passa al canale proteico e misura l'intensità della fluorescenza all'interno del ROI definito usando Analizza > Misura. Registra i seguenti parametri: intensità media di fluorescenza; Densità integrata; Area ROI.
   4. Misurare l'intensità della fluorescenza in un ROI di fondo vicino di dimensioni simili che manca di un segnale specifico e si trova al di fuori della struttura neuronale marcata. Utilizzare la stessa strategia di ROI di fondo per tutti i campioni all'interno dell'esperimento e sottrarre il valore di fondo dalla misurazione del ROI.
   5. Utilizzare valori di densità integrata o di intensità media corretti per il background per il confronto quantitativo tra genotipi o condizioni sperimentali. Assicurarsi che vengano utilizzate impostazioni di imaging identiche per tutti i campioni da confrontare.

Risultati

Per convalidare il flusso di lavoro HCR-smFISH assistito dall'espansione e immunoistochimica in un contesto biologicamente rilevante, ci siamo concentrati sul circuito di fuga imminente del sistema visivo di Drosophila. Questo circuito è composto da neuroni di proiezione visiva LC4 definiti^{geneticamente 30,31} che rilevano stimoli imminenti e da un neurone discendente ben caratterizzato a Fibra Gigante (GF) che guida decolli^{rapidi 32,33}, fornendo un sistema anatomicamente stereotipato per misurazioni molecolari specifiche per tipo cellulare in cervelli intatti.

La proteina della giunzione gap di Drosophila Shaking-B (ShakB)³⁴ è stata implicata nella trasmissione elettrica all'interno di molteplici componenti del circuito GF, inclusi le sinapsi di uscita assonale³⁵ e gli input uditivi³⁵. Sebbene le prove dirette di accoppiamento elettrico nelle dendriti GF durante la rilevazione dell'incomposizione siano limitate, studi recenti indicano che i neuroni LC4 esprimono alti livelli di shakB³⁶. Queste osservazioni hanno motivato l'uso di strategie shakB knockdown e di marcatura come caso di prova per valutare se il protocollo possa valutare quantitativamente le perturbazioni molecolari mirate sia a livello di RNA che di proteina in tipi neuronali geneticamente definiti.

Abbiamo innanzitutto valutato l'efficienza del knockdown shakB nel GF e LC4 utilizzando HCR-smFISH combinato con colorazione con anticorpi ShakB. La GF, un singolo neurone per emisencefalo, era etichettata con un marcatore di membrana (Figura 4A). LC4, una popolazione di circa 60 neuroni per emisencefalo, è stata etichettata con un marcatore nucleare per consentire la quantificazione a livello di popolazione (Figura 4B). Nei cervelli di controllo, i trascrizioni shakB sono state chiaramente rilevate sia nei neuroni GF che LC4. L'espressione di RNAi shakB ha portato a una significativa riduzione dei punti dell'mRNA shakB nei neuroni target di entrambi i tipi cellulari (Figura 4C–D). In linea con il sito citoplasmatico dell'interferenza dell'RNA, la deplezione dei trascrizioni era più marcata nel compartimento citoplasmatico. La separazione dei punti nucleari e citoplasmatici tramite la quantificazione basata su FlySeg ha rivelato una riduzione selettiva dei trascritti di shakB citoplasmatici nella popolazione LC4, mentre i punti nucleari sono stati significativamente meno colpiti (Figura 4D, riduzione rispettivamente del 69% contro il 22%).

Abbiamo riscontrato la colorazione degli anticorpi ShakB localizzata nelle aree dove le dendriti GF si sovrappongono agli assoni degli Interneuroni Comisurali Giganti (GCI), che collegano le due Fibre Giganti e consentono risposte visive^{controlaterali 37} (Figura 4E). Queste osservazioni sono coerenti con studi^{precedenti 35} che hanno dimostrato un accoppiamento elettrico dipendente da ShakB tra GF e GCI. La colorazione con anticorpi ShakB è stata osservata anche nelle regioni in cui gli assoni LC4 entrano in contatto con le dendriti GF, anche se la localizzazione in questa regione è stata meno chiaramente risolta. Indipendentemente dalla localizzazione subcellulare precisa, il segnale degli anticorpi ShakB associato alla regione dendritica GF è stato notevolmente ridotto dopo l'espressione di RNAi (Figura 4F).

Tuttavia, la rilevazione basata su anticorpi non consente l'assegnazione inequivocabile della proteina ShakB ai terminali LC4 presinaptici rispetto ai dendriti GF postsinaptiche nei siti di contatto. Inoltre, l'espressione diffusa di shakB in tutto il sistema^{visivo 34,36} limita la quantificazione specifica per tipo cellulare nei neuroni LC4 tramite immunocolorazione anti-ShakB. Per superare queste limitazioni e valutare direttamente la localizzazione di ShakB specifica per tipo cellulare, abbiamo utilizzato un allele ShakB marcato endogenamente che avevamo precedentemente^{generato 36,38}. Questo ha permesso la visualizzazione selettiva della proteina ShakB specificamente all'interno dei neuroni LC4. ShakB marcato con SmGdP-10×V5 è stato arricchito sia da dendriti (corrispondenti a regioni di ingresso dai neuroni visivi a monte) sia dai terminali assonici in contatto con le dendriti GF (Figura 4G). L'espressione di RNAi shakB ha portato a una quasi completa scomparsa del segnale V5 sia nei compartimenti dendritici che assonali (Figura 4H). Questi risultati dimostrano che il protocollo consente la risoluzione specifica per tipo cellulare e subcellulare della localizzazione di proteine endogene all'interno di neuropili densamente innervati.

Come ulteriore controllo qualitativo, abbiamo testato la FISH non espansa combinata con immunoistochimica in popolazioni neuronali identificate (Figura Supplementare 1). Il segnale FISH proveniente da grd si è sovrapposto a LC22 somata, coerente con l'espressione prevista dai dati scRNA-seq del lobo ottico (Figura Supplementare 1A–C)¹³. Nei neuroni Tm3 che esprimono tdTomato, l'mRNA di tdTomato si sovrapponeva alla proteina di tdTomatoes, mentre l'mRNA di VGlut1 non si sovrapponeva a Tm3 somata, coerente con l'identità colinergica dei neuroni Tm3 (Figura Supplementare 1)¹³. Questi esempi illustrano che il FISH + IHC non espanso è sufficiente per la valutazione qualitativa della presenza/assenza, mentre l'espansione è necessaria per una quantificazione affidabile a singolo punto.

L'implementazione di successo di questo protocollo è indicata da una marcatura chiara specifica per tipo cellulare, punti discreti di smFISH con basso background, segmentazione affidabile dei singoli nuclei o volumi cellulari definiti manualmente, e una riduzione costante del segnale di RNA o proteina target dopo la perturbazione. Anche risultati negativi o a basso segnale dovrebbero essere interpretabili: ad esempio, l'RNAi shakB ha prodotto ridotti il segnale dell'mRNA shakB e della proteina ShakB, mentre il FISH non espanso ha mostrato mancanza di segnale VGlut1 nella somata Tm3 nonostante la rilevazione chiara dell'mRNA di tdTomatoes. Esiti subottimali includono segnale debole di anticorpi o smFISH, punti di fondo elevati, segmentazione incompleta, errata assegnazione dei punti o derivazione del campione durante l'imaging, tutti elementi che possono influenzare la quantificazione a valle.

Figura 2. Montaggio e imaging di campioni ampliati utilizzando piattaforme di microscopia a foglio luminoso e confocali. (A) Visualizzazione e ritaglio degli idrogel espansi (1–2), comuni a tutte le piattaforme di imaging, seguiti dal montaggio per microscopia a foglio luminoso (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Fotografia di un campione espanso montato su un microscopio confocale a scansione laser invertita (Nikon Ti2-E AXR). (C) Sezioni ottiche singole rappresentative (singoli piani Z) di un campione di sistema visivo ampliato di Drosophila (neuroni LC4 marcati con un marcatore nucleare fluorescente) sondate per l'mRNA shakB (vedi Figura 4), acquisito su tre piattaforme di imaging. Sbarre di squama, 10 μm (tessuto post-espansione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Analisi quantitativa dei punti di smFISH utilizzando FlySeg. (A) Panoramica schematica del flusso di lavoro di analisi FlySeg per segmentazione automatizzata e quantificazione dei punti all'interno delle celle identificate. (B) Tassellamento Voronoi tridimensionale che illustra la logica di segmentazione centrale di FlySeg. Il volume di imaging è suddiviso in domini spaziali (ciascuno mostrato in un colore distinto), con ogni partizione vincolata a contenere al massimo un nucleo, garantendo l'assegnazione di una singola cella. All'interno di ciascun dominio di Voronoi, il nucleo viene segmentato utilizzando una procedura di ottimizzazione funzionale che determina la superficie nucleare ottimale in base sia ai valori di intensità nucleare che a quelli circostanti. (C) Dimostrazione dell'opzione nuclei_dilation per distinguere i trascrizioni nucleari e citoplasmatici Una singola sezione ottica che mostra un nucleo marcato con GFP circondato da punti smFISH, con segnale diffuso DAPI che delinea il compartimento citoplasmatico dopo il trattamento con DNasi. Le linee indicano fattori di dilatazione 0 e 0,5, corrispondenti rispettivamente ai volumi nucleare e citoplasmatico. (D) Proiezione di massima intensità di (C), che illustra che i punti localizzano sia i compartimenti nucleari che quelli citoplasmatici. Sbarre di squama, 10 μm (tessuto post-espansione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Validazione del flusso di lavoro quantitativo utilizzando proiezioni di perturbazione molecolare (A) mediata da RNAi (spessore 10 μm, non coprendo l'intero volume cellulare) del soma Giant Fiber (GF) marcato con un marcatore di membrana e sondato per l'mRNA shakB in condizioni di controllo (superiore) e RNAi shakB (inferiore). I contorni verdi tratteggiati indicano i bordi soma per evidenziare la deplezione del pool citoplasmatico ma non del nucleo di mRNA. N, cervelli (un lato per ogni animale). (B) come (A) per i neuroni LC4 marcati con un marcatore nucleare. (C) Quantificazione dei punti FISH shakB nei neuroni GF (pool combinati nucleari e citoplasmatici) in condizioni di controllo e RNAi shakB . I punti rappresentano i singoli neuroni (un neurone per cervello, un lato per ogni animale). (D) Uguale a (C) per i neuroni LC4. I puntini rappresentano singoli cervelli (un lato per animale; il numero di punti per cellula è in media per cervello). (E) Proiezioni confocali delle dendriti GF etichettate con un marcatore di membrana e colorate per ShakB in condizioni di controllo (superiore) e RNAi shakB (inferiore). (F) Quantificazione dei livelli di proteina ShakB nelle dendriti GF misurata come intensità media di fluorescenza sotto controllo e condizioni di RNAi GF>shakB . N, cervelli (un lato per ogni animale). (G) Proiezioni confocali di neuroni LC4 marcati con un marcatore di membrana ed esprimono ShakB marcato smGdP-10xV5 in condizioni di controllo (in alto) e in shakB RNAi (in basso). I contorni verdi tratteggiati indicano aree di dendriti LC4 e terminali assonici su cui è stata valutata la densità di ShakB-V5 (H). Quantificazione dei livelli di proteine ShakB-smGdP-V5 nelle dendriti e terminali assonici LC4 misurata come intensità media di fluorescenza sotto controllo e condizioni LC4 > shakB RNAi. N, cervelli (un lato per ogni animale). Le barre di errore indicano la media ± SEM. Tutti i confronti statistici sono stati effettuati utilizzando i test t di Welch a due lati. Squame, 10 μm in tutte le immagini (tessuto post-espansione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo combina HCR-smFISH assistito da espansione, immunoistochimica pre-espansione e quantificazione dei trascrizioni basata su segmentazione per consentire misurazioni di RNA e proteine abbinate negli stessi neuroni geneticamente definiti. Integrando questi componenti in un unico flusso di lavoro, questo metodo dovrebbe facilitare un'analisi molecolare quantitativa specifica per tipo cellulare nel cervello intatto di Drosophila .

Diverse modifiche pratiche introdotte qui rappresentano passaggi critici per combinare immunoistochimica con HCR-smFISH assistito da espansione nel cervello^{di Drosophila 24}. Innanzitutto, dovrebbe essere eseguita immunoistochimica prima dell'espansione tissutale e dello smFISH. Poiché il protocollo include una fase di digestione della Proteinasi K, l'esecuzione di immunoistochimica dopo l'espansione può ridurre l'integrità dell'epitopo. È importante notare che l'incubazione con anticorpi pre-espansione (primaria 24 ore + secondaria 24 ore) non riduce sensibilmente l'intensità del segnale RNA quando si utilizzano la tecnica RNase-clean e l'ancoraggamento covalente dell'RNA. In secondo luogo, le concentrazioni di anticorpi primari e secondari dovrebbero essere aumentate, tipicamente di 2–3× rispetto all'IHC standard a montaggio intero, per compensare la perdita di segnale associata alla digestione della Proteinasi K e all'espansione dei tessuti. In terzo luogo, le condizioni di fissazione sono importanti per preservare sia il segnale proteico che quello di RNA. La fissazione gliossale senza acidi favorisce la conservazione della localizzazione delle proteine sinaptiche puntate, mantiene l'integrità strutturale dei processi neuronali e non compromette la rilevazione quantitativa dei punti dell'mRNA. Abbiamo inoltre osservato che l'ancoraggio simultaneo di RNA e proteina è compatibile sia con la rilevazione a valle di HCR-smFISH sia con l'immunofluorescenza. Insieme, questi aggiustamenti migliorano la compatibilità tra immunoistochimica e rilevamento assistito da espansione dei trascritti.

L'espansione aggiunge un singolo passaggio notturno e non è tecnicamente complessa, ma il suo utilizzo dipende dall'obiettivo sperimentale. Come dimostrato nella Figura Supplementare 1, la FISH non espansa combinata con immunoistochimica è sufficiente per valutare se un gene è espresso in un dato tipo cellulare, mentre l'espansione è necessaria quando i punti smFISH individuali devono essere risolti in modo affidabile, assegnati a singoli somata e analizzati quantitativamente, a causa dell'aumento sostanziale della risoluzione spaziale efficace. Analogamente, le piastre multipozzo in stile Terasaki non sono strettamente obbligatorie, ma riducono l'uso dei reagenti, permettono di elaborare molteplici condizioni in parallelo e aiutano a mantenere l'identità del campione su piccoli lotti; I tubi standard per microcentrifuga possono essere utilizzati anche quando il volume del reagente è meno limitante. Sebbene la microscopia a foglio luminoso permetta una rapida imaging volumetrica del tessuto espanso, dimostriamo che i sistemi confocali standard a scansione laser invertita e a disco rotante sono sufficienti per l'imaging completo delle popolazioni neuronali selezionate nel cervello espanso di Drosophila . Una limitazione comune della microscopia confocale è la breve distanza di lavoro. Tuttavia, poiché il cervello della mosca è piccolo e i campioni sono espansi di circa 2× in PBS, gli obiettivi di immersione in acqua a lunga distanza forniscono una profondità di penetrazione adeguata. Per i confronti quantitativi, le impostazioni di acquisizione dovrebbero essere mantenute identiche tra i campioni, evitare pixel saturi e la dimensione dei voxel dovrebbe essere sufficiente a risolvere i punti singoli di smFISH. Questo amplia l'accessibilità del protocollo ai laboratori senza strumenti dedicati per le lampade.

L'implementazione aggiornata di FlySeg si basa sul framework FlySeg precedentemente pubblicato e introduce due principali aggiunte per questo protocollo. Innanzitutto, un parametro di dilatazione nucleare configurabile permette di classificare i punti smFISH come nucleari o citoplasmatici in base alla loro relazione spaziale con i nuclei segmentati. La colorazione DAPI citoplasmatica dopo il trattamento con DNasi è importante per questo passaggio, poiché fornisce un segnale diffuso che delinea il corpo cellulare e supporta una segmentazione nucleare affidabile, favorendo la separazione dei pool di trascritti nucleari e citoplasmatici. In secondo luogo, la rilevazione automatica degli outlier identifica nuclei poco segmentati, che possono essere esclusi dalla quantificazione a valle. Oltre alla valutazione degli effetti molecolari del knockdown genico specifico per tipo cellulare, separare i trascrizioni nucleari e citoplasmatiche può essere informativo quando la localizzazione del trascrizione riflette un'attività trascrizionale continua. Nel cervello dei mammiferi, i trascriverti genici immediati indotti dall'attività appaiono prima nel nucleo e successivamente si accumulano nel citoplasma mentre gli mRNA vengono processati ed^{esportati 39}, un principio utilizzato nell'analisi catFISH⁴⁰ dei tempi di attivazione neuronale. Non si sa ancora se dinamiche trascrizionali comparabili si verifichino nel cervello di Drosophila , ma questo può essere esplorato in linea di principio utilizzando il flusso di lavoro attuale. In qualsiasi altro esperimento di inseguimento di impulsi, distinguere punti nucleari da punti citoplasmatici può quindi fornire informazioni temporali oltre il totale dei conteggi di trascrizioni. Allo stesso tempo, il flusso di lavoro non è limitato alla segmentazione nucleare e può essere adattato alla segmentazione cellulare whole-soma (cioè definita dalla membrana). L'attuale flusso di lavoro quantitativo è ottimizzato per i somata neuronali; sebbene le regioni neuropil possano essere visualizzate, l'assegnazione quantitativa dei punti dell'mRNA a singoli assoni o dendriti richiederebbe strategie di segmentazione specifiche per compartimento. FlySeg è particolarmente utile per la quantificazione automatizzata e ad alta produttività in popolazioni neuronali dense, dove sono necessarie statistiche a livello popolazionale. Per neuroni identificabili individualmente o compartimenti definiti manualmente, altri strumenti come Imaris o FIJI/ImageJ potrebbero essere più appropriati. Un riassunto di queste strategie di quantificazione, incluse le loro principali applicazioni, vantaggi e limitazioni, è fornito nella Tabella Supplementare 1.

I punti di risoluzione dei problemi comuni includono segnale di anticorpi debole, alto background smFISH, danni al gel o perdita di campione, deriva del campione durante l'imaging e scarsa segmentazione. Il segnale debole degli anticorpi può spesso essere migliorato aumentando ulteriormente la concentrazione di anticorpi o estendendo le incubazioni primarie e/o secondarie degli anticorpi da 24 ore a 48 ore. Un background smFISH elevato può spesso essere ridotto estendendo i lavaggi post-ibridazione ed evitando impostazioni di acquisizione sature. I danni al gel e la perdita di campione sono ridotti al minimo utilizzando punte a larga cilindrata, tagliando gel con tagli dritti e tagliando canali di ventilazione per evitare bolle durante il riempimento della camera. La deriva del campione durante l'imaging viene ridotta bilanciando i gel montati per almeno 1 ora prima dell'acquisizione; Se la deriva persiste, l'equilibrio può essere esteso a 2 ore o più. Una scarsa segmentazione può derivare da una debole colorazione DAPI citoplasmatica o da un bilanciamento incompleto del campione, che può ridurre il segnale di confine cellulare o causare spostamenti X-Y-Z durante l'acquisizione; questi dovrebbero essere controllati prima di regolare i parametri di FlySeg. In questo protocollo, i gel vengono mantenuti in 1× PBS, risultando in circa 2× espansione isotropa. Se è richiesta una risoluzione spaziale superiore, si può ottenere una maggiore espansione in PBS diluito o acqua deionizzata. Al contrario, quando l'obiettivo è solo valutare la presenza o l'assenza di espressione in un tipo cellulare definito, la FISH non espansa combinata con immunoistochimica può essere sufficiente, come dimostrato nella Figura Supplementare 1. Il protocollo rimane compatibile con i flussi di lavoro FISH iterativi. Sonde e forcine HCR possono essere rimosse tramite trattamento con DNasi, permettendo ulteriori cicli di ibridazione e amplificazione nello stesso campione. Le future estensioni tecniche potrebbero includere HCR-smFISH iterativo ad alto plex, registrazione automatizzata tra i round di imaging, segmentazione migliorata di intere cellule o neuriti e pipeline di analisi più standardizzate per confrontare segnali di RNA e proteine tra esperimenti. Ulteriori sviluppi di strategie di segmentazione specifiche per compartimento potrebbero estendere l'analisi quantitativa oltre i somati neuronali ad assoni e dendriti. Insieme, la lettura combinata RNA–proteina, la quantificazione dei trascrizioni risolte in compartimento e la compatibilità con le piattaforme di imaging standard rendono questo flusso di lavoro adatto a esperimenti di validazione molecolare mirata in neuroni geneticamente definiti del cervello intatto di Drosophila .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di idrossido di sodio 10N	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
Soluzione di idrossido di sodio 1N	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Buffer Salino-Citrato di Sodio	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Idrossi-TEMPO	Sigma-Aldrich	Cat# 176141
Soluzione di cloruro di sodio 5M	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Acrilammide	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Acido acrilico	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Acryloil-X, SE & NBSP;	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	N/A
Alexa Fluor 488 Anti-Pollo per Capre (1:200)	Laboratori di Immunoricerca Jackson	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
DMSO e nbsp anidro;	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Adesivo polimerizzatore UV	Bondic	Kit di avviamento Bondic
software di imaging cellSens v4.4.1	Evidente Scientifico	N/A
Pollo policlonale Anti-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (responsabile ambientale)	Anaconda, Inc	N/A
Corning e commercio; Vetri del microscopio sminacciato	Corning	Cat# 2948-75X25
Portacampioni LS7 Personalizzato	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Bisturi sterile in acciaio inossidabile usa e getta	MedPride	MPR-47101
Etilediamimina, acido tetraacetico	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Software di analisi immagini Fiji (ImageJ) v2.14.0	Consorzio ImageJ	N/A
FlySeg (pipeline personalizzata)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
Soluzione fissativa GAF	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® Piastre di coltura cellulare a 24 pozzi, non trattate	Genesee Scientific	Gatto # 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Centro Stock di Bloomington	#41315
Branco di donatori di siero di capra	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR™ Buffer amplificatore RNA-FISH(v3.0)	Strumenti molecolari	N/A
HCR™ Amplificatori RNA-FISH(v3.0): AF546, JF669	Strumenti molecolari	N/A
HCR™ Buffer di ibridazione della sonda RNA-FISH(v3.0)	Strumenti molecolari	N/A
HCR™ Buffer di lavaggio della sonda RNA-FISH(v3.0)	Strumenti molecolari	N/A
HCR™ Sonda ShakB RNA-FISH(v3.0)	Strumenti molecolari	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments	N/A
IXPlore IX85 SpinSR SpinSR Microscopio Confocale a Disco Rotante	Evidente Scientifico	N/A
Microscopio a foglio luminoso LS7	Carl Zeiss	N/A
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Anti-V5 monoclonale per topi (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'-Tetrametililedeniamina	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N'-Metilenebisacrilammide	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Napari	Comunità open-source	N/A
Software di imaging per ricerca avanzata di NIS-Elements	Nikon Corporation	N/A
Acqua Priva di Nucleasi	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ MiniTray con Nunclon e trade; Delta surface	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7,4	Gibco	Cat# 70011044
Detersivo Photo-Flo & nbsp;	Scienze della microscopia elettronica	Cat# 74257
Soluzione di poli-L-lisina	Ted Pella	Cat# 18026
Occhiali Precision Cover, spessore #1.5H	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal™ Isolatore in silicone con adesivo, un pozzo, diametro 20 mm, profondità 0,5 mm	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinasi K	New England  Biolabs	Cat# P8107S
Coniglio Anti-ShakB (1:400)	Dono di Geord Ammer	N/A
RNase AWAY & trade; Decontaminante superficiale	Invitrogen	Cat# 7002
RNase-Free DNase Set	Qiagen	Cat# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto et al., 2025	PMID: 41278920
Azida di sodio	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Microscopio stereo Stemi 508	Carl Zeiss	N/A
SYTO & trade; 41 Colorazione blu fluorescente di acidi nucleici	Invitrogen	Cat# S11352
Microscopio confocale laser a scansione Ti2E AXR NSPARC	Nikon Corporation	N/A
Tris Base	Fisher Scientific	Cat# BP152-500
Tritone e il commercio; X-100	Sigma-Aldrich	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo et al. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Centro Stock di Bloomington	#35785
UAS-myr::GFP;	Centro Stock di Bloomington	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer et al., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8,0 e nbsp;	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (fibra gigante)	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	N/A