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Articolo di ricerca
Questo studio ha utilizzato la farmacologia di rete, il docking molecolare e un modello di puntura caudale-disc su ratti per indagare i potenziali effetti preclinici della Decoction Yi Qi Huo Xue sulla degenerazione del disco lombare, con particolare attenzione ai candidati bersagli, tra cui AKT1, BCL2 e STAT3, e a vie come la segnalazione PI3K-AKT.
In questo studio, la farmacologia di reti, l'aggancio molecolare, la simulazione della dinamica molecolare e la validazione sperimentale sono state utilizzate per indagare la base farmacologica e i potenziali meccanismi molecolari della Decoction di Yi Qi Huo Xue (YQHXD) nella degenerazione del disco lombare (LDD). Sono stati identificati in totale 678 bersagli attivi correlati ai composti di YQHXD e 296 potenziali bersagli terapeutici associati a LDD. L'analisi delle reti di interazione proteina-proteina e l'analisi topologica hanno identificato diversi candidati bersagli, tra cui AKT1, IL6, TNF, BCL2 e STAT3. Analisi di arricchimento utilizzando Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes hanno indicato che i target candidati erano collegati a funzioni come il legame proteico e il legame ATP, con arricchimento delle vie che includeva la segnalazione PI3K-AKT. L'aggancio molecolare prevedeva interazioni tra composti attivi selezionati, come quercetina, tetraneurina A e isorhamnetina, e i bersagli centrali. Le simulazioni della dinamica molecolare suggerirono inoltre che i complessi a energia più bassa rimanevano stabili. Settanta maschi di ratti Sprague-Dawley sono stati assegnati casualmente ai gruppi controllo, a gestione simulata, modello, controllo positivo e YQHXD a dosi basse, medie e elevate. Dopo l'istituzione di un modello di puntura del disco intervertebrale coccigeo nei gruppi modello, controllo positivo e YQHXD, ai ratti è stato somministrato YQHXD o celecoxib tramite gavage orale per 8 settimane, mentre i gruppi di controllo e operato con simulazione hanno ricevuto soluzione salina normale. La valutazione istopatologica ha mostrato che il trattamento YQHXD era associato a una riduzione della degenerazione del disco intervertebrale in questo modello. Il saggio immunosorbente legato agli enzimi, la reazione a catena della polimerasi e le analisi western blot hanno mostrato cambiamenti nei livelli di espressione di mRNA e proteine di target selezionati, inclusi AKT1, BCL2 e STAT3. Questi risultati suggeriscono che YQHXD possa esercitare effetti protettivi preclinici nella LDD attraverso la regolazione multicomponente e multi-bersaglio che coinvolge meccanismi correlati all'infiammazione e all'apoptosi. Questo studio fornisce prove precliniche preliminari a supporto di ulteriori indagini su YQHXD per la LDD.
La degenerazione del disco lombare (LDD) è una comune condizione ortopedica legata all'età, caratterizzata da insorgenza tardiva, difficoltà di trattamento, alta recidiva e disabilità. La LDD comporta cambiamenti patologici degenerativi associati a uno squilibrio tra il metabolismo catabolico e quello anabolico della matrice extracellulare (ECM) nel disco intervertebrale (IVD) ed è strettamente associata al mal di schiena lombare (LBP)1. Studi epidemiologici mostrano che la LBP è una delle principali cause di disabilità nella praticaclinica 2.
Dal 1990 al 2017, il numero di casi globali è aumentato da 42,5 milioni a 64,9milioni 3, influenzando la vita quotidiana e imponendo un notevole onere sociale ed economico. Pertanto, un trattamento efficace della LDD rimane clinicamente importante. Nella pratica clinica, la LDD viene spesso gestita con trattamenti sintomatici conservativi o chirurgici, che possono alleviare i sintomi ma generalmente non invertiscono la degenerazione del disco intervertebrale (IVDD). I farmaci antinfiammatori orali non steroidei comunemente usati per trattamenti conservativi possono anche essere associati a effetti avversi renali, gastrointestinali e cardiovascolari.
La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) è da tempo utilizzata nella gestione dellemalattie 4. Sono stati segnalati che composti erboristici e singoli componenti ritardano la progressione della IVDD e promuovono la rigenerazione deitessuti 5. Nella pratica clinica, le formule della MTC sono utilizzate anche come parte di strategie di gestione conservativa per malattie degenerative ossee e articolarie. La scuola di medicina della famiglia Wu nell'area di Suzhou ha utilizzato la Decoczione Yi Qi Huo Xue (YQHXD) come prescrizione principale per i disturbi della IVD lombare; tuttavia, sono necessarie ulteriori prove meccanicistiche per chiarirne il potenziale ruolo nella LDD.
Studi precedenti hanno suggerito che YQHXD potrebbe ritardare IVDD promuovendo l'autofagia cellulare ed esercitando effetti anti-invecchiamento 6,7. Tuttavia, i meccanismi farmacologici con cui YQHXD può influenzare la LDD rimangono poco chiari e manca ancora un'analisi sistematica della sua modalità d'azione. In questo studio, la farmacologia di rete è stata utilizzata per analizzare le caratteristiche multi-componente e multi-bersaglio di YQHXD in relazione alla LDD. L'aggancio molecolare è stato utilizzato per valutare le interazioni tra composti e proteine bersaglio, seguito da simulazioni di dinamica molecolare. Queste previsioni sono state poi valutate utilizzando un modello di puntura caudale-disc del ratto per indagare i potenziali meccanismi di YQHXD in LDD8. Come mostrato nella Figura 1, questo studio fornisce prove precliniche che YQHXD può influenzare i processi correlati alla LDD modulando geni e proteine come AKT1, BCL2 e STAT3, con arricchimento delle vie che coinvolge la segnalazione PI3K-Akt e altre categorie di vie correlate alla malattia.
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Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Consiglio di Revisione Istituzionale dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (Codice di Protocollo: 202501A018) e sono stati condotti in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute (NIH). Tutte le procedure sperimentali rispettavano le linee guida ARRIVE.
Farmaci sperimentali
La soluzione campione YQHXD conteneva 20 g di radice di membranaceus di Astragalus , 20 g di radice di Angelica sinensis , 15 g di rizoma Ligusticum chuanxiong , 6 g di radice di Stephania tetrandra , 15 g di frutto di Chaenomeles speciosa e 10 g di semi maturi di Sinapis alba , con un peso totale grezzo di 86 g per prescrizione. Tutti i materiali erboristici sono stati autenticati secondo la Farmacopea Cinese (edizione 2020) dal Dipartimento di Farmacia dell'Ospedale Ruikang affiliato all'Università di Medicina Cinese del Guangxi. La soluzione campione YQHXD è stata preparata utilizzando un metodo di decoction acqueosa. È stata aggiunta acqua distillata sterile a 8 volte il volume totale di grezza del farmaco, e le erbe sono state immerse per 30 minuti fino a essere completamente sommerse. La miscela è stata poi bollita e decoctata a fuoco basso per 30 minuti prima della filtrazione. I residui sono stati estratti nuovamente con lo stesso volume di acqua distillata sterile seguendo la stessa procedura. I filtrati delle due estrazioni sono stati combinati e concentrati a 55,5 mL a pressione ridotta tramite evaporazione rotativa per ottenere la soluzione di stocco YQHXD. In base al peso totale del farmaco grezzo, la concentrazione finale del farmaco grezzo era di 1,55 g/mL, con una resa di estrazione di circa il 64,5%. Il dosaggio somministrato ai ratti sperimentali è stato convertito dalla dose clinica adulta utilizzando il metodo di normalizzazione della superficie corporea. Il coefficiente di conversione tra umani e ratti era di circa 6,3; Pertanto, la dose per ratti (mg/kg) è stata calcolata come la dose umana (mg/kg) × 6,3. Il gruppo ad alta dose ha ricevuto 15,48 g/kg/giorno come dose di riferimento, mentre i gruppi a dose media e bassa hanno ricevuto rispettivamente 7,74 g/kg/giorno e 3,87 g/kg/giorno. Per un volume di gavaga di 10 mL/kg, le corrispondenti concentrazioni operative erano rispettivamente 1,548, 0,774 e 0,387 g/mL per i gruppi ad alta, media e bassa dose. La soluzione standard è stata diluita di conseguenza per raggiungere il dosaggio target per ciascun gruppo sperimentale prima della somministrazione. Dopo la preparazione, i decocti venivano raffreddati, allicitati in condizioni sterili e conservati a −40 °C fino all'uso.
Analisi farmacologica delle reti
Previsione delle proteine target dei principi attivi
Il 24 novembre 2025, composti attivi sono stati recuperati dal database TCMSP utilizzando i termini di ricerca "Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua e Jiezi." I composti sono stati selezionati in base alla biodisponibilità orale (OB ≥ 30%) e alla somiglianza del farmaco (DL ≥ 0,18)9. La motivazione di queste soglie è la seguente: il database TCMSP integra dati di composti provenienti da fonti autorevole come PubChem, ChEMBL e ChemSpider e fornisce parametri relativi all'ADME, inclusa la biodisponibilità orale. La biodisponibilità orale si riferisce alla proporzione di una dose somministrata per via orale che raggiunge la circolazione sistemica senza variazioni, e un alto livello di OB è essenziale per identificare molecole bioattive. La somiglianza farmacologica è un indicatore utilizzato per valutare la farmacogabilità dei composti e per prevedere la loro solubilità e stabilità. In questo studio, è stata applicata una soglia di OB più rigorosa (≥30%), superiore al valore raccomandato dal database (≥20%), per identificare composti candidati con assorbimento orale favorevole e profili farmacocinetici. Nel frattempo, DL è stato utilizzato per stimare il potenziale farmacologico dei composti, e è stato adottato un cutoff di DL ≥ 0,18 basato sul valore medio di DL osservato nei composti della medicina tradizionale cinese. I composti attivi selezionati sono stati recuperati in formato SMILES dal database PubChem e importati nel database SwissTargetPrediction per la previsione dei bersagli, impostando la specie su Homo sapiens. Le proteine target sono state standardizzate utilizzando simboli genici ufficiali, e sono stati mantenuti solo bersagli con valori di probabilità superiori a 0 per migliorare l'affidabilità della previsione. I composti senza obiettivi previsti sono stati esclusi dall'analisi di rete successiva. Dopo aver unito tutti i target, le voci duplicate venivano rimosse tramite software di fogli di calcolo per garantire che ogni target fosse rappresentato solo una volta nel dataset finale.
Raccolta di obiettivi chiave
I geni correlati alla malattia sono stati recuperati dai database GeneCards10, OMIM11 e TTD12 utilizzando la parola chiave "degenerazione del disco lombare". I bersagli genici raccolti sono stati fusi e le voci duplicate sono state rimosse per ottenere un insieme finale di bersagli associati alla malattia.
Potenziali obiettivi di YQHXD per il trattamento della LDD
La piattaforma Venny 2.1.0 veniva utilizzata per determinare i potenziali obiettivi di YQHXD in LDD. È stata quindi generata una rete per mostrare le associazioni tra i componenti attivi e i loro obiettivi previsti. I componenti attivi principali sono stati selezionati in base ai loro valori di grado nella rete.
Costruzione di reti di componenti farmaceutici e bersagli di intersezione di malattie
I principi attivi, le proteine bersaglio e i geni correlati alla LDD dalla formula TCM YQHXD sono stati importati nel softwareCytoscape 13 per costruire un diagramma di rete farmaco-componente-bersaglio-malattia.
Costruzione della rete PPI e identificazione dei principali target principali
Bersagli intersecanti sono stati inviati alla piattaformaSTRING 14 per l'analisi, con l'organismo impostato su Homo sapiens. Per costruire la rete di interazione proteina-proteina (PPI), la soglia del punteggio di interazione è stata impostata a >0,4, i nodi disconnessi sono stati nascosti e tutte le altre impostazioni sono state lasciate come predefinite. I dati risultanti venivano importati nel software, dove lo strumento NetworkAnalyzer veniva utilizzato per valutare le proprietà topologiche e calcolare i gradi dei nodi. I primi cinque nodi, classificati per grado, sono stati identificati come obiettivi chiave dell'hub.
Analisi dell'arricchimento dei target principali
I target intersecanti sono stati caricati nel databaseDAVID 15 per l'annotazione funzionale Gene Ontology (GO) e l'analisi di arricchimento dei percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Il background dell'organismo è stato impostato come Homo sapiens, con il cutoff di arricchimento definito secondo i parametri DAVID predefiniti, inclusi una soglia EASE < 0,1 e una soglia di conteggio ≥ 2. L'universo genico si basava sul background predefinito del genoma completo fornito da DAVID. I test multipli sono stati corretti utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg per controllare il tasso di false scoperte (FDR), e i risultati DAVID sono stati adeguati su questa base. I percorsi arricchiti sono stati ordinati per valore di conteggio in ordine decrescente. I grafici a barre di arricchimento GO e KEGG sono stati prodotti utilizzando una piattaforma di bioinformatica online.
Aggancio molecolare
Per prevedere le interazioni tra i componenti attivi chiave di YQHXD e i bersagli principali di LDD, in questo studio è stata effettuata un'analisi di docking molecolare. I primi cinque composti attivi chiave, classificati secondo i valori topologici della rete e la rilevanza del bersaglio, sono stati selezionati come liganti, mentre le corrispondenti proteine target principali sono state utilizzate come recettori. I file SDF dei ligandi sono stati recuperati da PubChem, e le strutture tridimensionali delle proteine target sono state scaricate dal Protein Data Bank (PDB). L'analisi dell'attracco è stata effettuata sulla piattaforma CB-Dock2 utilizzando il suo protocollo di attracco cieco completamente automatizzato. Dopo aver caricato le strutture proteiche, la piattaforma rimuoveva automaticamente gli eteroatomi, inclusi piccole molecole, ioni e molecole d'acqua, e successivamente riparava gli atomi mancanti. È stata utilizzata la modalità Auto Blind Docking. In questa modalità, CB-Dock2 identifica potenziali sacche di legame proteico-superficie con un algoritmo di rilevamento delle cavità basato sulla curvatura e poi esegue calcoli di attracco utilizzando il motore Vina16 integrato AutoDock. Durante il processo di aggancio, le proteine sono state trattate come strutture rigide, mentre i liganti sono stati considerati flessibili e tutti i parametri di aggancio sono stati impostati ai valori predefiniti della piattaforma. I risultati dell'agganciamento sono stati sottoposti a visualizzazione tridimensionale e analisi di interazione utilizzando gli strumenti integrati di CB-Dock217, e sono state calcolate le energie di legame per stimare le affinità di legame previste tra i composti attivi e le proteine bersaglio.
Simulazione della dinamica molecolare
Sono state effettuate simulazioni di dinamica molecolare per il complesso proteina-ligando target utilizzando GROMACS 2022.2. La proteina è stata modellata con il campo di forza Amber14SB, e il sistema solvente è stato rappresentato utilizzando il modello idrico TIP3P. Le cariche atomiche dei ligandi venivano calcolate utilizzando il metodo AM1-BCC implementato in Antechamber, seguiti dall'assegnazione dei tipi di atomi GAFF2. I file topologici risultanti furono convertiti in un formato compatibile con GROMACS utilizzando ACPYPE. I parametri ionici coerenti con il modello idrico TIP3P sono stati assegnati in base al set di parametri Joung-Cheatham. Il complesso di partenza è stato inserito in una scatola di simulazione dodecaedra troncata con almeno 1,2 nm tra la superficie della proteina e il bordo della scatola. Sono state aggiunte molecole d'acqua TIP3P per solventare il sistema, e sono stati introdotti ioni Na+ e Cl− per neutralizzare la carica del sistema e impostare la forza ionica a 0,15 M. La minimizzazione dell'energia è stata eseguita con l'algoritmo di discesa più ripida fino a quando la forza massima è stata inferiore a 1.000 kJ·mol−1·nm−1. Il sistema veniva quindi bilanciato per 100 ps sotto l'ensemble NVT a 298 K e 1 bar. Dopo l'equilibrio, veniva eseguita una simulazione di produzione di 100 ns sotto l'insieme NPT con un passo temporale di 2 fs. Le interazioni non legate venivano gestite con il sistema di corte Verlet. Le interazioni elettrostatiche venivano calcolate utilizzando il metodo Ewald a rete particellare (PME), e veniva utilizzato un cutoff di 1,2 nm sia per le interazioni di van der Waals che per quelle di Coulomb. I legami contenenti idrogeno erano vincolati dall'algoritmo LINCS. La temperatura veniva controllata con il termostato Nosé-Hoover, e la pressione con il barostato Parrinello-Rahman, mantenendo il sistema a 298 K e 1 bar. Le traiettorie venivano salvate ogni 10 ps. La dinamica strutturale e le interazioni intermolecolari sono state analizzate utilizzando gli strumenti integrati di GROMACS, VMD e PyMOL. L'energia libera di legame è stata stimata con gmx_MMPBSA dove applicabile.
Studi sugli animali
Allevamento degli animali
Settanta maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) di età compresa tra 3 e 8 settimane sono stati assegnati casualmente a sette gruppi sperimentali (n = 10 per gruppo) utilizzando numeri casuali generati al computer, assicurando che non ci siano differenze statisticamente significative nel peso corporeo di base tra i gruppi. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni controllate (22 ± 1 °C, 55 ± 10% di umidità relativa, 12 ore di ciclo chiaro/buio) con libero accesso a cibo e acqua. Le posizioni della gabbia sono state randomizzate ad ogni cambio di gabbia per minimizzare il bias ambientale. Dopo una settimana di acclimatazione, i ratti dei gruppi modello hanno subito una puntura caudale IVD per indurre la degenerazione. È stata somministrata un'anestesia di infiltrazione locale con bupivacaina preoperatoriamente per ridurre il dolore. Gli animali sono stati monitorati attentamente durante l'intervento chirurgico e durante il recupero post-operatorio. Le osservazioni postoperatorie includevano tempi di recupero, ripristino dell'attività spontanea, assunzione di cibo e acqua e cambiamenti di peso corporeo. Una settimana dopo l'istituzione del modello, due ratti di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente per l'imaging radiografico digitale (DR) post-operatorio e la colorazione di ematossilina ed eosina (HE). L'analisi radiografica ha mostrato una riduzione dell'altezza della IVD caudale, mentre la colorazione con HE ha rivelato una marcata riduzione delle cellule notocordiali del nucleo pulposo (NP) e una disorganizzazione della struttura lamelare dell'anulusfibrosus 18, confermando il successo dell'istituzione del modello. Otto settimane dopo l'intervento, i ratti sono stati soppressi per inalazione di un'overdose di isoflurano, e sono stati raccolti campioni di tessuto caudal e sangue. Dopo la validazione preliminare, sono stati utilizzati tre campioni indipendenti per gruppo che soddisfacevano i criteri di qualità predefiniti per le analisi finali di istologia, ELISA, PCR e western blot. Le sezioni istologiche sono state valutate in condizioni di cieco singolo, con vetrine etichettate solo tramite numeri identificabili degli animali. Per ELISA, PCR e western blot, è stata applicata la codifica cieca durante l'aliquotazione e l'etichettatura del campione, e l'ordine di test di tutti i campioni è stato randomizzato prima degli esperimenti. I dati grezzi, inclusi i valori di assorbanza, valori Ct e intensità delle bande, venivano decodificati in identità di gruppo da uno statistico non coinvolto nel raggruppamento sperimentale o nell'elaborazione del campione e successivamente analizzati dal personale statistico. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate da statistici non coinvolti nel raggruppamento sperimentale o nell'elaborazione del campione. Eventuali eventi avversi, inclusi infezioni della ferita, deiscenza, sanguinamento o letargia grave, venivano immediatamente registrati e valutati. Le condizioni lievi sono state attentamente monitorate con cure di supporto rafforzate. Sono stati applicati parametri umani se i ratti hanno mostrato perdita di peso corporea superiore al 20% rispetto al valore di base, dolore intenso non alleviato dagli analgesici, perdita di mobilità, incapacità di accedere a cibo o acqua, infezione, necrosi, altre gravi complicazioni post-operatorie, difficoltà respiratoria o qualsiasi condizione potenzialmente letale. In tali casi, gli animali venivano soppressi umanamente per inalazione di un'overdose di isoflurano.
Modellazione sperimentale
I ratti sono stati anestesiati con isoflurano inalato e posizionati a terra prono. Le IVD di coda Co6/7, Co7/8 e Co8/9 erano localizzate sotto guida fluoroscopica a raggi X. Un ago da 21 G veniva avanzato verticalmente nella IVD fino a raggiungere il lato opposto della pelle, dopodiché la punta dell'ago veniva ritirata verso il centro della coda. Un secondo ago serviva come riferimento posizionale. Per indurre una degenerazione persistente della IVD, l'ago veniva ruotato di 360°, mantenuto in posizione per 30 secondi e poi rimosso. Nel gruppo Sham, la profondità della puntura attraverso la pelle e il muscolo era di circa 2 mm, senza danneggiare la flebo. Negli altri gruppi, l'ago veniva inserito 5 mm verso il centro della IVD, evitando i vasi sanguigni. Dopo l'inserimento, l'ago veniva ruotato di 360° e lasciato in posizione per 30 secondi. Il sito della puntura è stato disinfettato, segnato e protetto con garze sterili. Una settimana dopo la modellazione, le immagini a raggi X della colonna caudale hanno mostrato una diminuzione dell'altezza della IVD. La colorazione con HE ha rivelato una significativa riduzione delle cellule notocordali NP e una disorganizzazione della struttura della lamella annulare, confermando l'istituzione del modello di successo. Dopo una modellazione di successo, ai gruppi che ricevevano trattamenti con MTC e al gruppo di controllo positivo (PC) sono state somministrate le dosi appropriate, calcolate in base al rapporto sulla superficie corporea tra umani e ratti.
Raggruppamento e intervento
In questo esperimento sono stati utilizzati in totale 70 maschi di ratti SD di età 3–8 settimane, suddivisi in sette gruppi:
(1) Gruppo di controllo (Ctrl): I ratti di questo gruppo sono stati assegnati casualmente nello stesso momento e nelle stesse condizioni dei gruppi sperimentali. Venivano ospitati in gabbie individuali in una struttura per animali a livello SPF, con accesso gratuito al cibo standard e all'acqua potabile.
(2) Gruppo finto: I ratti sono stati anestetizzati inalando isoflurano. Dopo l'anestesia, la pelle della coda veniva disinfestata con povidone-iodio e i ratti venivano posizionati a terra. Le IVD Co6/7 e Co7/8 erano localizzate sotto guida fluoroscopica a raggi X. L'ago è stato avanzato di circa 2 mm attraverso la pelle e il muscolo senza danneggiare la flebo IVD. L'acqua distillata (10 mL/kg) veniva somministrata una volta al giorno tramite gavage per 8 settimane.
(3) Gruppo modello: I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano inalato. Dopo l'anestesia, la pelle della coda veniva disinfestata con povidone-iodio e i ratti venivano posizionati a terra. Sotto guida fluoroscopica a raggi X, sono stati individuati i IVD Co6/7, Co7/8 e Co8/9. Un ago da 21 G veniva avanzato verticalmente nella IVD fino a raggiungere il lato opposto della pelle, e la punta dell'ago veniva poi ritratta verso il centro della coda.
Un secondo ago veniva usato come riferimento posizionale. L'ago veniva ruotato di 360° e mantenuto fermo per 30 secondi per indurre la degenerazione continua della IVD prima della rimozione. L'acqua distillata (10 mL/kg) veniva somministrata quotidianamente tramite gavage per 8 settimane, e il recupero dei ratti veniva monitorato attentamente dopo l'intervento.
(4) gruppo PC: Il gruppo di controllo positivo è stato sottoposto alla stessa procedura di modellazione del gruppo modello e successivamente ha ricevuto una gara orale di celecoxib (20 mg/kg/giorno), preparata come sospensione in carbossimetilcellulosa al 0,5% di sodio (CMC-Na), per 8 settimane consecutive, con un volume gavage di 10 mL/kg di peso corporeo.
(5) YQHXD gruppo a bassa dose [YQHXD(L)]: La modellazione è stata eseguita come nel gruppo modello. I ratti hanno ricevuto YQHXD a 3,87 g/kg/giorno tramite gavage per 8 settimane, con un volume gavage di 10 mL/kg e una concentrazione operativa di 0,387 g/mL.
(6) YQHXD gruppo a dosi medie [YQHXD(M)]: La modellazione è stata eseguita come nel gruppo modello. I ratti hanno ricevuto YQHXD a 7,74 g/kg/giorno per gavage per 8 settimane, con un volume gavage di 10 mL/kg e una concentrazione operativa di 0,774 g/mL.
(7) YQHXD gruppo ad alta dose [YQHXD(H)]: La modellazione è stata eseguita come nel gruppo modello. I ratti hanno ricevuto YQHXD a 15,48 g/kg/giorno per gavage per 8 settimane, con un volume gavage di 10 mL/kg e una concentrazione operativa di 1,548 g/mL.
Cambiamenti patologici
Il tessuto caudale IVD del ratto è stato isolato chirurgicamente e sono stati osservati cambiamenti nella IVD e nei tessuti muscolari circostanti. Il tessuto raccolto veniva poi lavorato in sezioni patologiche, con i campioni preparati in sezioni longitudinali per l'osservazione morfologica. La IVD vertebrale caudale, fissata in formaldeide per 96 ore, è stata rapidamente decalcificata usando una soluzione decalcificante, disidratata tramite una serie alcolica gradata e eliminata con xilene. Dopo l'immersione nella paraffina, sono state preparate sezioni di paraffina da 5 μm. Dopo la deparaffinizzazione con xilene e la disidratazione attraverso una serie di gradienti alcolici, le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina. Furono poi disidratati, liberati e montati. I campioni sono stati osservati al microscopio ottico per esaminare i cambiamenti morfologici nella struttura caudale IVD tra i vari gruppi. Successivamente fu eseguita la colorazione tricroma di Masson. Le sezioni sono state colorate sequencialmente con soluzione di dicromato di potassio ed ematossilina per 3 minuti ciascuna, seguite da differenziazione con etanolo acido, e poi colorate con Picrosirius Red per 10 minuti. Dopo il trattamento con acido fosfotongstico per 10 minuti, le sezioni sono state colorate con blu di toluidina per 5 minuti. Dopo la disidratazione, le sezioni sono state pulite con xilene, montate e osservate al microscopio per esaminare i cambiamenti nella IVD caudale.
Rilevamento ELISA delle proteine bersaglio sierie
Otto settimane dopo l'intervento, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano inalato e è stato prelevato sangue aortico addominale. I campioni di sangue periferico sono stati conservati a temperatura ambiente per 1 ora e centrifugati a 1.400 × g per 10 minuti. Il siero veniva separato e conservato a −80 °C fino all'uso. I livelli sierici di AKT1, STAT3 e Bcl-2 sono stati quantificati tramite un saggio immunoenzimatico legato (ELISA). I test venivano eseguiti secondo i protocolli dei produttori. L'assorbanza è stata rilevata a 450 nm e le concentrazioni sono state determinate da curve standard. I range di rilevamento per AKT1, STAT3 e BCL-2 erano rispettivamente 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL e 0,16–10 ng/mL, con sensibilità di 0,1 ng/mL, 10 pg/mL e 0,1 ng/mL. Tutti i campioni di siero sono stati analizzati senza diluizione e tutti i risultati rientravano nei corrispondenti intervalli standard di curva. Tutti i campioni e gli standard sono stati analizzati in duplicato e la normalizzazione è stata effettuata sulla base di volumi sierici uguali.
Rilevamento PCR dei livelli di espressione genica
I tessuti del disco intervertebrale sono stati sezionati dalle vertebre caudali del ratto e sono stati raccolti circa 20 mg da ciascun campione. I tessuti sono stati polverizzati in azoto liquido e lisati in 500 μL di tampone di lisi non enzimatica per 15 minuti. Veniva quindi estratto l'RNA totale e la sua concentrazione e purezza venivano misurate con uno spettrofotometro. Campioni con valori A260/A 280 di 1,8–2,0 sono stati accettati per l'analisi e le concentrazioni di RNA sono state regolate a 500 ng/μL. La trascrizione inversa è stata effettuata secondo il protocollo del produttore. La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita su un sistema PCR in tempo reale per misurare l'espressione di mRNA di Akt1, Bcl-2 e Stat3 . Le sequenze di primer sono fornite nella Tabella 1. Il programma PCR consisteva in una denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli a 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi. Dopo l'amplificazione è stata condotta un'analisi della curva di fusione per verificare la specificità del prodotto. Il Gapdh è stato utilizzato come gene di riferimento e tutti i campioni sono stati analizzati in triplice. L'efficienza dell'amplificazione degli innesco era del 90%–110%. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt .
Western blotting per i livelli di espressione proteica
La proteina totale è stata isolata dai tessuti caudali del disco intervertebrale di ciascun gruppo. I tessuti sono stati lisati in un tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi. La concentrazione proteica è stata misurata utilizzando un kit di analisi proteica BCA e regolata a 2 μg/μL. Quantità proteiche uguali (15 μg per campione) sono state separate da SDS-PAGE al 10% e trasferite alle membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF) a corrente costante di 300 mA per 90 minuti utilizzando un sistema di trasferimento umido. Le membrane sono state poi bloccate con latte scremo al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro AKT1 (1:5.000), STAT3 (1:6.000), Bcl-2 (1:1.500) e β-actin (1:4.000). Dopo il lavaggio con TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) a una diluizione di 1:5.000 per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state rilevate utilizzando un reagente a chemiluminescenza potenziata (ECL) e le immagini sono state acquisite con un sistema di imaging a gel in condizioni di esposizione identiche. Le intensità delle bande sono state misurate utilizzando ImageJ e normalizzate in β-actin per determinare l'espressione proteica relativa. Ogni esperimento è stato condotto indipendentemente in triplice, con ogni campione ottenuto da un animale diverso.
Statistiche
I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). Le differenze tra i gruppi sono state valutate tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguite dal test post hoc della differenza minima significativa (LSD). La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.
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Conclusioni derivate dallo studio
Questo studio ha integrato farmacologia di rete, docking molecolare, simulazioni di dinamica molecolare ed esperimenti in vivo per indagare i potenziali effetti protettivi dello YQHXD contro la LDD. I risultati suggeriscono che YQHXD potrebbe agire, almeno in parte, attraverso la regolazione dell'asse di segnalazione AKT1/STAT3/BCL-2, caratterizzato da una riduzione dell'espressione di STAT3 e un aumento dell'espressione di A...
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È stato riportato che le medicine tradizionali cinesi esercitano effetti farmacologici, tra cui attività antinfiammatorie, analgesiche e di promuovimento della circolazionesanguigna 19. Studi precedenti hanno suggerito che la decoczione Xiaosui Huahe, la formula precursore dello YQHXD, possa favorire il riassorbimento di un'ernia IVD massiccia influenzando la riassorbimento del nucleo pulposo (NP) e l'assorbimento dellaIVD 20; tuttavia, i m...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Siamo grati al dottor Jintao Liu dell'Ospedale Affiliato dell'Ospedale Tradizionale Tradizionale di Suzhou Affiliato all'Università di Medicina Cinese di Nanchino di Suzhou per il loro aiuto in tutte le fasi di questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del National Natural Science Foundation of China Project (82474529); Liu 2024, Progetto della National Natural Science Foundation of China (82374220); Jiang 2023, la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Jiangsu (N. BK20250396); il Progetto di Sviluppo della Scienza e della Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della provincia del Jiangsu (NO. QN202419); il Progetto di Innovazione Scientifica e Tecnologica (Scienze e Tecnologie di Ricerca Applicata di Base (medica e sanitaria) di Suzhou (n. SYWD2024154); Progetto di Sviluppo della Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia del Jiangsu (MS2022080); la terza classe di talenti leader nella medicina tradizionale cinese nella provincia del Jiangsu (Su TCM Science and Education [2023] n. 17); Progetto di Potenziamento delle Capacità Scientifiche ed Educative della Provincia del Jiangsu: Progetto di Costruzione della Disciplina Medica Chiave e Laboratorio Chiave Medica della Provincia del Jiangsu (Suwei Science and Education [2022] No. 17); Progetto della Fondazione Provinciale per le Scienze Naturali del Jiangsu (n. BK20241802); Il 29° Gruppo del Piano di Sviluppo Scientifico e Tecnologico di Suzhou per il 2022 (Progetto di Costruzione di Nuovi Laboratori Chiave) (SZS2022019); il Progetto di Miglioramento delle Capacità di Ricerca di Base per Giovani e Mezza Età nelle Università del Guangxi a Yuan Chai (2024KY0300); Progetto di Ricerca Scientifica Autofinanziato (GXZYA20240113) dell'Amministrazione della Regione Autonoma Zhuang del Guangxi per la Medicina Tradizionale; Una sovvenzione del Progetto di Ricerca a livello universitario dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guangxi a Yuan Chai (2023QN010); Una sovvenzione dal Progetto di Formazione all'Innovazione per Studenti Universitari nella Regione Autonoma Guangxi Zhuang a Yongyuan Li (202410600022); Una sovvenzione del Progetto di Formazione all'Innovazione per studenti universitari dell'Università di Medicina Cinese del Guangxi a Sujie Liu (X202410600062); Una sovvenzione del Progetto di Formazione all'Innovazione per studenti universitari dell'Università di Medicina Cinese del Guangxi a Mengfei Lin (S202410600084)
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5% sodio carbosilmetilcellulosa (CMC-Na) | Non specificato | Veicolo usato per preparare la sospensione a celecoxib per la garva. | |
| Ago da 21 G | Non specificato | Utilizzato per la puntura del disco intervertebrale caudale. | |
| 2 e volte; Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | G3326 | reagente di amplificazione qPCR. |
| Soluzione gel 30% di acrilammide/bis-acrilammide (29:1) | Solarbio Co., Ltd. | Soluzione di preparazione del gel per SDS-PAGE; Indicata nella tabella dei materiali originali come soluzione gel 30%/29:1. | |
| Macchina trificata per la smerficazione 3D | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Usato per l'omogeneizzazione/macinazione dei tessuti. | |
| 4 e volte; Tampone gel concentrato SDS-PAGE (pH 6,8) | Solarbio Co., Ltd. | Reagente per la preparazione del gel Western Blot. | |
| Etanolo acido | Non specificato | Utilizzato per la differenziazione della colorazione istologica. | |
| ACPYPE | Progetto ACPYPE | Utilizzato per convertire file di topologia ligando in un formato compatibile con GROMACS. | |
| Kit AKT1 ELISA | Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1928 | Usata per misurare i livelli sierici di AKT1; Portata di rilevamento 0,625– 40 ng/mL. |
| Metodo di carica AM1-BCC | Utensili per anticamera/AMRA | Utilizzato per il calcolo della carica atomica dei ligandi. | |
| Campo di forza Amber14SB | Campo di forza AMBERO | Campo di forza proteico utilizzato nella simulazione della dinamica molecolare. | |
| Radice di Angelica sinensis | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 20250503 | YQHXD componente botanica; 20 g per prescrizione. |
| Etanolo anidro | Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd. | Utilizzato nella lavorazione/disidratazione dei tessuti. | |
| Anticamera | Utensili AMBER | Utilizzato per il calcolo della carica dei ligandi e la tipizzazione degli atomi. | |
| Anticorpo anti-AKT1 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primario per il Western blotting; diluizione 1:5.000. | |
| Anticorpo anti-Bcl-2 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primario per il Western blotting; diluizione 1:1.500. | |
| Anticorpo anti-STAT3 | Wuhan Sanying Co., Ltd. | 10253-2-AP | Anticorpo primario per il Western blotting; diluizione 1:6.000. |
| Reagente APS | Beyotime/Biyuntian Co. | Reagente di polimerizzazione con gel Western Blot. | |
| Radice di Astragalus membranaceus | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 20250405 | YQHXD componente botanica; 20 g per prescrizione. |
| Autoclave | SANYO, Giappone | Attrezzatura per la sterilizzazione. | |
| Motore AutoDock Vina | Progetto AutoDock/Vina | Motore di attracco utilizzato all'interno di CB-Dock2. | |
| Kit per il test proteico BCA | Solarbio Co., Ltd. | Usata per determinare la concentrazione proteica prima del Western blotting. | |
| Kit ELISA BCL-2 | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | PMK1545 | Utilizzato per misurare i livelli di Bcl-2 nel siero; Portata di rilevamento 0,16– 10 ng/mL. |
| Bupivacaina | Non specificato | Anestetico di infiltrazione locale usato preoperatoriamente. | |
| CB-Dock2 | Server web CB-Dock2 | Piattaforma automatica cieca di attracco molecolare. | |
| Celecoxib | Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd. | H20233911 | Farmaco a controllo positivo; 20 mg/kg/giorno per Gavage. |
| Frutto di Chaenomeles speciosa | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 231001 | YQHXD componente botanica; 15 g per prescrizione. |
| Cytoscape | Consorzio Cytoscape | Versione 3.9.0 | Utilizzato per costruire e analizzare diagrammi di rete. |
| Kit per reagenti cromogenici DAB (20 e volte) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Elencato nella tabella dei materiali esistenti. | |
| DAVID | Istituto Nazionale del Cancro | Versione 6.8 | Database per Annotazione, Visualizzazione e Scoperta Integrata; utilizzata per l'analisi di arricchimento GO e KEGG. |
| Soluzione di decalcificazione | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Utilizzato per la decalcificazione del tessuto IVD vertebrale caudale. | |
| Shaker di decolorazione | Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Pechino | Scuottore da laboratorio. | |
| Acqua DEPC | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Lavoro sull'RNA/preparazione dei reagenti. | |
| Sistema di imaging per radiografia digitale | Non specificato | Utilizzato per la validazione dei modelli radiografici postoperatori. | |
| Acqua distillata | Non specificato | Preparazione del veicolo/controllo e decoction YQHXD. | |
| Substrato chemiluminescente ECL | Biosharp Co. | Reagente per il rilevamento del segnale Western Blot. | |
| Soluzione di prelievo antigenico EDTA (pH 8,0) | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | Elencato nella tabella dei materiali esistenti. | |
| Apparecchiature di elettroforesi | Non specificato | Utilizzato per l'elettroforesi SDS-PAGE. | |
| Buffer di elettroforesi | Servicebio Co. | Soluzione elettroforesi Western Blot. | |
| Macchina del ghiaccio FM40 | Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Pechino | Macchina del ghiaccio. | |
| Formaldeide | Non specificato | Fissativo usato per il tessuto endovenoso caudale vertebrale. | |
| Tipi di atomi GAFF2 | Utensili AMBER | Tipi di atomi di ligando utilizzati per simulazioni di dinamica molecolare. | |
| Sistema di imaging a gel | Tianen Scientific, Shanghai | Usato per catturare immagini Western Blot. | |
| GeneCards | Istituto Weizmann di Scienze | Versione 5.26 | Database genetico umano utilizzato per recuperare bersagli associati a malattie. |
| gmx_MMPBSA | gmx_MMPBSA progetto | Utilizzato per la stima dell'energia libera del legame MM-PBSA quando applicabile. | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 8.0 | Software statistico/grafico elencato nella versione manoscritta precedente degli autori. |
| Sfere di macinazione | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Usato per la macinazione/omogeneizzazione dei tessuti. | |
| GROMACS | Team di sviluppo GROMACS | Versione 2022.2 | Utilizzato per simulazioni di dinamica molecolare. |
| Reagenti di colorazione di ematossilina ed eosina | Non specificato | Utilizzato per la colorazione con HE delle sezioni caudali IVD. | |
| Centrifuga ad alta velocità | Eppendorf, Germania | Centrifuga da laboratorio. | |
| Molatrice di tessuto ad alta velocità a bassa temperatura | Servicebio, Cina | Utilizzato per la macinazione dei tessuti a bassa temperatura. | |
| Shaker orizzontale | Chirinbell Company | Scuottore da laboratorio. | |
| Anticorpo anti-coniglio marcato con HRP | Servicebio Co. | Anticorpo secondario per il Western blotting; diluizione 1:5.000. | |
| HyperScript III RT SuperMix per qPCR con gDNA Remover | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente di trascrizione inversa elencato nella tabella dei materiali esistenti. | |
| Macchina del ghiaccio | SIMAG, Cina | Macchina del ghiaccio. | |
| ImageJ | Istituti Nazionali di Salute | Utilizzato per la quantificazione dell'intensità delle bande Western Blot. | |
| Microscopio biologico rovesciato | Olympus, Giappone | Utilizzato per la microscopia di sezioni colorate. | |
| Isoflurano | Non specificato | Anestetico inalatorio/agente per l'eutanasia. | |
| Reagente isopropanolo | China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd. | Reagente di estrazione di RNA. | |
| Parametri ionici di Joung-Cheatham | Non applicabile | Set di parametri ionici utilizzati per simulazioni di dinamica molecolare. | |
| Rizoma di Ligusticum chuanxiong | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 20250301 | YQHXD componente botanica; 15 g per prescrizione. |
| Azoto liquido | Non specificato | Utilizzato per la macinazione dei tessuti prima dell'estrazione dell'RNA. | |
| Centrifuga a bassa velocità | Eppendorf, Germania | Utilizzato per la separazione del siero e altri passaggi di centrifugazione a bassa velocità. | |
| Soluzione di colorazione tricroma di Masson | Non specificato | Utilizzato per la colorazione Masson delle sezioni IVD caudali. | |
| Lettore di microplacche (TECAN) | TECAN, Svizzera | Utilizzato per la misurazione dell'assorbanza a 450 nm; elencati nella tabella dei materiali esistenti. | |
| Lettore di micropiastre (Thermo Fisher Scientific) | Thermo Fisher Scientific, USA | Lettore di micropiastre multifunzionale elencato nella tabella dei materiali esistenti. | |
| Software Microsoft Excel/fogli di calcolo | Microsoft | Utilizzato per rimuovere voci duplicate di destinazione e gestire i dati tabellari. | |
| Spettrofotometro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, USA | Utilizzato per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA. | |
| Buffer di lisi non enzimatico | Non specificato | Utilizzato per la lisi tissutale prima dell'estrazione dell'RNA. | |
| OMIM | Facoltà di Medicina dell'Università Johns Hopkins | Eredità Mendeliana Online nell'Uomo; usata per recuperare bersagli associati a malattie. | |
| Piattaforma online di tracciamento bioinformatico | Non specificato | Usato per generare grafici di barre GO e KEGG. | |
| Agente polimerizzato gel PAGE | Solarbio Co., Ltd. | Reagente per la preparazione del gel Western Blot. | |
| Paraffina | Non specificato | Mezzo di incorporamento per sezioni istologiche. | |
| Primer PCR per Akt1, Bcl-2, Stat3 e Gapdh | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1. | |
| PDB | RCSB PDB | Banca Dati Proteiche; usata per ottenere strutture 3D di proteine bersaglio. | |
| Inibitori fosforilati/proteasi | Servicebio Co. | Aggiunto al buffer di lisi RIPA per l'estrazione proteica. | |
| Acido fosfotongstico | Non specificato | Usato nella tintura di Masson. | |
| Picrosirius Red | Non specificato | Usato nella tintura di Masson. | |
| Membrana di difluoruro di polivinilidene (0,45 μ m) | Servicebio Co. | Membrana PVDF utilizzata per il trasferimento Western blot. | |
| Veicolo antidroga a controllo positivo | Non specificato | Veicolo con sospensione CMC-Na al 0,5% per celecoxib. | |
| Povidone-iodio | Non specificato | Utilizzato per la disinfezione del sito chirurgico. | |
| Marcatore proteico | Thermo Fisher Scientific, USA | Marcatore del peso molecolare per il Western blotting. | |
| Apparecchiature di trasferimento proteico | Bio-Rad, USA | Attrezzatura per il trasferimento a umido per Western blotting. | |
| Modulo di trasferimento proteico (trasferimento umido) | Bio-Rad, USA | Modulo di trasferimento wet-blot occidentale. | |
| PubChem | Centro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI) | Utilizzato per ottenere file SMILES/SDF di strutture composte. | |
| Sistema di preparazione dell'acqua pura | Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai | Usato per la preparazione di acqua pura. | |
| PyMOL | Schrö dinger, LLC | Utilizzato per la visualizzazione e l'analisi delle dinamiche molecolari e degli output di docking. | |
| Sistema PCR in tempo reale qPCR | Applied Biosystems QuantStudio, USA | Utilizzato per l'amplificazione quantitativa per PCR. | |
| Tampone di lisi tessuto/cellulare RIPA | Solarbio Co., Ltd. | Usate per l'estrazione totale di proteine. | |
| Soluzione per la dissoluzione dell'RNA | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente per la gestione dell'RNA. | |
| Evaporatore rotativo | Non specificato | Utilizzato per concentrare i filtrati combinati YQHXD a pressione ridotta. | |
| Semi maturi di Sinapis alba | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 20240801 | YQHXD componente botanica; 10 g per prescrizione. |
| Ratti di Sprague-Dawley | Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd. | SCXK (Shanghai) 2022-0004 | Settanta maschi di ratti, di età 3 e ndash; 8 settimane, usata per il modello a puntura caudale-disco. |
| SPSS | IBM, USA | Versione 21.0 | Software statistico elencato nella versione manoscritta precedente degli autori. |
| Kit STAT3 ELISA | Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd. | SYP-R1555 | Usata per misurare i livelli di STAT3 sierico; Portata di rilevamento 31.25– 1000 pg/mL. |
| Radice di Stephania tetrandra | Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, Cina | Lotto n. 230301 | YQHXD componente botanica; 6 g per prescrizione. |
| Garza sterile | Non specificato | Usata per proteggere il sito della puntura dopo la modellazione. | |
| STRING | Consorzio STRING | Versione 12.0 | Piattaforma di rete di interazione proteina-proteina. |
| SweScript All-in-One RT SuperMix per qPCR | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | G3337 | Reagente di trascrizione inversa elencato nella tabella dei materiali esistenti. |
| Previsione SwissTarget | SIB Istituto Svizzero di Bioinformatica | Usata per prevedere potenziali bersagli di composti. | |
| Buffer TBST | Non specificato | Utilizzato per il lavaggio delle membrane durante il Western blotting. | |
| TCMSP | Centro di Bioinformatica, College of Life Science, Northwest A & Università F | Versione 2.3 | Database dei Sistemi di Farmacologia della Medicina Tradizionale Cinese; usata per ottenere ingredienti attivi di composti erboristici cinesi. |
| Modello ad acqua TIP3P | Non applicabile | Modello idrico utilizzato nelle simulazioni di dinamica molecolare. | |
| Blu toluidina | Non specificato | Usato nella tintura di Masson. | |
| Buffer di trasferimento | Servicebio Co. | Buffer di trasferimento western blot. | |
| Reagente TriQuick | Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan | Reagente di estrazione di RNA. | |
| Reagente Trizol | Non specificato | Reagente di estrazione totale di RNA menzionato nel manoscritto. | |
| TTD | L'Università Cinese di Hong Kong (IDRBLab) | Database dei bersagli terapeutici; usata per recuperare bersagli associati a malattie. | |
| Venny | BioinfoGP, CNB-CSIC | Versione 2.1.0 | Utilizzato per identificare bersagli sovrapposti tra YQHXD e LDD. |
| Schema di taglio del verlet | GROMACS | Schema di interazione non legata utilizzato nelle simulazioni di dinamica molecolare. | |
| Apparecchiature di elettroforesi verticale | Bio-Rad, USA | Utilizzato per SDS-PAGE. | |
| VMD | Università dell'Illinois a Urbana-Champaign | Utilizzato per la visualizzazione e l'analisi degli output della dinamica molecolare. | |
| Sistema di trasferimento a umido | Bio-Rad, USA | Utilizzato per il trasferimento proteico nel Western blotting. | |
| Sistema di fluoroscopia a raggi X | Non specificato | Utilizzato per identificare i livelli di IVD caudale durante la modellazione della puntura. | |
| Xylene | Non specificato | Usato per la deparaffinizzazione/clearing durante l'istologia. | |
| Anticorpo primario β-actin | Wuhan Sanying Co., Ltd. | Anticorpo primario di controllo del carico per Western blotting; diluizione 1:4.000. |