Produzione su larga scala di vescicole extracellulari da colture cellulari 3D ad alta densità in bioreattori a perfusione di fibre cave

Sommario

Sono fornite istruzioni per l'installazione e l'uso di un bioreattore a fibre cave a perfusione 3D per la produzione di vescicole extracellulari da MSC e altri tipi cellulari. Questo protocollo descrive un metodo per produrre vescicole extracellulari ad alte concentrazioni su base continua mentre si controlla la densità cellulare nei bioreattori a fibre cave.

Abstract

I progressi nel campo della ricerca sugli esosomi sono ostacolati dal piccolo numero cellulare e dalla bassa produttività degli esosomi secreti nelle colture cellulari tradizionali 2D. Le colture cellulari ad alta densità nei bioreattori a fibre cave (HFBR) permettono la produzione continua di biomolecole secrete e vescicole extracellulari (EV), da un gran numero di cellule, per lunghi periodi di tempo, ad alte concentrazioni in colture 3D. Questo protocollo descrive la raccolta di esosomi concentrati secreti mantenendo la massa cellulare ottimale e condizioni di coltura per perfusione 3D a supporto della crescita cellulare ad alta densità per diverse settimane o mesi di produzione continua in un HFBR disponibile commercialmente. Il sistema è compatto, chiuso, monouso, può essere conforme a cGMP, semplice da usare e si adatta a un incubatore standard a CO² . Alcune cellule, come le cellule staminali mesenchimali (MSC) e le cellule staminali del liquido amniotico umano (HAFSC), possono mostrare una proliferazione ridotta in queste condizioni, influenzando potenzialmente la differenziazione e il fenotipo nel tempo. I risultati rappresentativi dimostrano le rese tipiche degli EV e la vitalità delle cellule per settimane o più di produzione continua. Questo metodo fornisce raccolti EV riproducibili e di alta qualità, adatti sia per applicazioni di ricerca che cliniche.

Introduzione

Le vescicole extracellulari sono sempre più riconosciute per il loro ruolo nella comunicazione intercellulare e nelle applicazioni terapeutiche, inclusa la medicina rigenerativa. I metodi tradizionali di coltura cellulare 2D sono laboriosi e di resa limitata, a volte richiedendo centinaia di fiaschette di coltura per ottenere EV sufficienti per esperimenti o studi sugli^{animali 1,2}. La scalabilità della traduzione clinica generalmente utilizza bioreattori tradizionali agitati che utilizzano microportatori o altri supporti. Questi sistemi sono intrinsecamente non fisiologici, inefficienti e possono avere risultati variabili. I bioreattori a fibre cave offrono un ambiente tridimensionale basato sulla perfusione che supporta colture cellulari ad alta densità all'interno di un'impronta compatta e su una scala potenzialmente adatta per applicazioni^{cliniche 3,4}.

Gli HFBR offrono un sistema compatto di coltura cellulare ad alta densità che consente la produzione continua di veicoli elettrici concentrati con ridotti manodopera, tempo e spazio rispetto alla tradizionale cultura^{2D 5}. Consentono colture cellulari ad alta densità in uno spazio compatto, supportando la produzione su larga scala di veicoli elettrici in qualsiasi laboratorio. Gli HFBR coltivano un gran numero di cellule (1X10⁹ a 1×10¹⁰) in un piccolo volume (20–60 mL), in un incubatore standard a CO₂ , e non richiedono attrezzature specializzate. Questi sistemi permettono prelievi continui e concentrati di veicoli elettrici per settimane o mesi, facilitando al contempo l'uso di sieri ridotti o mezzi definiti chimicamente. In un HFBR, le cellule sono trattenute nel piccolo volume dello spazio extracapillare (ECS) separato dal mezzo di ricircolazione da una membrana fibrosa cava semipermeabile con un taglio di peso molecolare (MWCO) definito (Figura 1). Piccole molecole come glucosio e lattato possono facilmente attraversare le fibre, mentre elementi più grandi come anticorpi o vescicole extracellulari vengono trattenuti e concentrati nell'ECS, dove possono essere raccolti.

Tre caratteristiche fondamentali differenziano la coltura cellulare a fibre cave da qualsiasi altro metodo: 1) l'elevato rapporto superficie-volume (200^{cm 2}/mL) consente densità cellulari in vivo, 1–2 × 10⁸celle per mL. 2) Le celle sono legate a un supporto poroso, non a un piatto plastico non poroso. La divisione delle celle non è richiesta³. Il taglio del peso molecolare (MWCO) della fibra può essere controllato. I prodotti secreti vengono trattenuti e concentrati 10–100X rispetto alla cultura delle fiaschette 2D all'interno dell'ECS della cartuccia. Inoltre, matrici proteiche specifiche, come fibronectina o collagene, possono essere facilmente applicate alla superficie della fibra senza influenzare il flusso attraverso le fibre.

HFBR offre un ambiente di coltura basato su perfusione 3D, più in vivo rispetto alla coltura^{2-D 6}, riducendo in modo unico la dipendenza delle cellule dal supporto sierico e semplificando le esigenze del mezzo. Questo ambiente di coltura ad alta densità potrebbe supportare differenze nel processamento delle proteine rispetto alla coltura 2D, insieme a un aumento riportato della bioattività EV ^7,8,9. I bioreattori a fibre cave sono "istocentrici"; Cercano di imitare le proprietà tessutali della fisiologia cellulare in ^{vivo 10}. Le due caratteristiche chiave di un bioreattore istocentrico sono: 1) un'elevata densità cellulare, che permette alle cellule di generare un proprio microambiente specifico, e 2) non è necessario dividere o passare le cellule, consentendo così a interazioni cellula e strutture 3D come gli sferoidi di svilupparsi organicamente nel tempo. Questo metodo consente densità cellulari difficili da raggiungere con i sistemi convenzionali di coltura 2D e può facilitare l'uso di mezzi semplificati, privi di proteine e definiti chimicamente.

Qualsiasi tipo di cellula che può essere coltivata in fiaschette può essere coltivata in un bioreattore a fibre cave. Le linee cellulari trasformate saranno^{proliferative 11}. Il parametro chiave da monitorare è il tasso di assorbimento del glucosio. Il monitoraggio della glicemia fornisce una misura diretta dell'attività metabolica, consentendo l'ottimizzazione del momento del raccolto e il controllo della densità^{cellulare 12}. È importante controllare la massa cellulare all'interno della cartuccia affinché la velocità di assorbimento del glucosio non superi la capacità del sistema di fornire ossigeno e rimuovere il^CO2. Questo avviene semplicemente rimuovendo la massa cellulare durante il prelievo. MSC e HAFSC non proliferano nel bioreattore a fibre cave ma rimangono quiescenti. Queste cellule necessitano di espansione prima di essere seminate nel bioreattore. Tuttavia, una volta stabilita la coltura, i veicoli elettrici possono essere raccolti ininterrottamente per settimane o mesi. Il fenotipo MSC non cambia dopo 30 giorni di coltura, tranne forse per l'espressione di CD105, che diminuisce in questo periodo. Quando le MSC del bioreattore sono state successivamente impiattate in una fiaschetta con un mezzo contenente siero, l'espressione del CD105 è tornata ai livelli^{iniziali 13}. L'espressione CD105 può fungere da indicatore per la coltura vs. 3D 2D. Le tecniche di trasfezione transitoria possono essere utilizzate anche per realizzare un¹⁴ transfettivo quasi stabile.

Esempi delle condizioni di coltura cellulare più in-vivo e dei vantaggi della coltura cellulare a fibre cave 3D includono modifiche post-traduzionali complete e uniformi nel^{tempo 15,16}, formazione di villi da epitelio gastrico per la coltura di cryptosporidium¹⁷,^{fegato 3D 18}, barriera emato-encefalica^{3D modello 19}, formazione di plasmodio sporozoite²⁰ e co-coltivazione midollo osseo/cellule^{staminali 21}.

Nell'HFBR, gli EV sono altamente concentrati, con una contaminazione ridotta da proteine intracellulari e frammenti di membrana, poiché la lisi cellulare è limitata. I bioreattori a fibre cave sono compatibili con qualsiasi mezzo, a condizione che non ci siano componenti di alto peso molecolare che non attraversino le fibre. Se necessario, queste grandi molecole possono essere aggiunte direttamente all'ECS del bioreattore. Si preferiscono substrati ad alto contenuto di glucosio, come il DMEM. Mezzi di coltura cellulari meno complessi e privi di proteine possono semplificare la purificazione riducendo il carico proteico. Cellule staminali mesenchimali e cellule staminali del liquido amniotico umano sono state coltivate in mezzi basali standard e FBS, oltre che in diverse formulazioni commerciali di substrati MSC. HFBR può produrre quantità di grammi di esosomi utilizzando cartucce pronte a gas. Un bioreattore a fibre cave è un metodo utile per la produzione su larga scala di esosomi in potenziali condizioni di cGMP e rappresenta un cambiamento di paradigma nell'avanzamento sia della ricerca sugli esosomi sia della trasposizione clinica.

L'uso riuscito di un bioreattore a fibre cave per la produzione di vescicole extracellulari è altamente specifico per protocollo. La manipolazione del bioreattore, la densità di semina delle cellule, la frequenza di raccolta e il mezzo utilizzato possono tutti contribuire a un funzionamento efficace del bioreattore. Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per l'utilizzo di un bioreattore a fibre cave per produrre e raccogliere vescicole extracellulari da colture cellulari ad alta densità. L'obiettivo è fornire un approccio riproducibile per il prelievo degli EV, inclusa indicazioni sulla configurazione del sistema, l'inoculazione cellulare, la manutenzione delle colture e le procedure di prelievo. Il metodo è pensato per supportare una produzione costante di veicoli elettrici per applicazioni di ricerca e fornire un quadro che possa essere adattato a diversi tipi cellulari e obiettivi sperimentali.

Protocollo

Tutte le procedure rispettano le linee guida standard di Buona Pratica di Laboratorio (GLP) e le Buone Pratiche di Coltura Cellulare e Tissutali.

NOTA: La cartuccia è preassemblata e sterilizzata tramite gamma software. È doppio sacchetto, e i condensatori Luer sono su ogni connessione, quindi è completamente sigillato e rimarrà sterile all'esterno dei sacchetti. Vedi la Figura 2 per l'identificazione della porta della cartuccia. Tutti i passaggi sono stati eseguiti a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare.

1. Preparazione e sterilizzazione del Cappuccio del Serbatoio.

1. Rimuovi i due brevi pezzi di tubo dalla cartuccia doppia in sacchetto.
2. Fissa il tubo alle spine del tubo sul tubo in acciaio inox del tappo del serbatoio.
3. Avvolgi il tubo corto e le estremità esposte del tubo in acciaio inox con carta stagnola per mantenere la sterilità dopo l'autoclavaggio. Metti i componenti assemblati in una borsa autoclave.
4. Autoclave usando un ciclo a secco a 121 °C per 15–30 minuti. Lascia raffreddare il tappo a temperatura ambiente prima di usarlo.

2. Attacca la cartuccia di fibra cava alla bottiglia del serbatoio

1. Trasferire 50 mL di PBS da una bottiglia da 1 L a un tubo conico da 50 mL per un uso successivo.
2. Rimuovi il tappo del serbatoio dal sacchetto dell'autoclave e rimuovi la carta protettiva dai lunghi tubi d'acciaio.
3. Rimuovi il tappo dalla bottiglia PBS e avvita il tappo del serbatoio al suo posto. Rimuovi la cartuccia dal sacco sterile interno.
4. Rimuovi la carta stagnola da uno dei pezzi di tubo sulla parte superiore del tappo del serbatoio.
5. Rimuovi il cappuccio luer da uno dei lunghi pezzi di tubo della cartuccia e attaccalo al tubo del serbatoio sul tappo del serbatoio. Usa un po' di backspin per evitare il piegatura.
6. Ripeti per la seconda connessione del tubo.
7. Stringi delicatamente il tubo marrone della pompa per far passare PBS attraverso il sistema finché tutte le bolle d'aria non vengono rimosse.

3. Riempimento dello spazio capillare extra (ECS)

1. Preleva 20 mL di PBS in una siringa sterile usando un ago di grande calibro lungo almeno 1,5"; Un ago smussato è preferito per sicurezza.
2. Disinfettare entrambi i raccordi di luer laterali con alcol e lasciarli asciugare.
3. Collega la siringa riempita di PBS a una porta laterale e una siringa sterile vuota all'altra porta. Chiudi entrambe le porte estreme e apri entrambe le porte laterali.
4. Inietta lentamente PBS nell'ECS tenendo la cartuccia con un leggero angolo per minimizzare le bolle d'aria. La siringa vuota sul lato opposto si riempirà d'aria.
5. Se nell'ECS è presente aria, apri la porta destra, preleva il liquido nella siringa vuota finché l'ECS non viene riempito di liquido (questo tira PBS dalla bottiglia del serbatoio, attraverso le fibre e nell'ECS).
6. Chiudi entrambe le fascette laterali delle porte, apri entrambe le fascette delle estremità e verifica il flusso comprimendo delicatamente il tubo della pompa con le dita.
7. Lascia le siringhe vuote attaccate alle prese laterali da tappi. Sostituisci le siringhe con altre ogni volta che sono uscite dalla cappa a flusso laminare.

4. Rivestimento delle fibre e inoculazione cellulare

NOTA: Le procedure per rivestire le fibre con una specifica proteina matriciale e per inoculare le cellule sono essenzialmente le stesse. Il liquido in eccesso scorre attraverso le fibre e entra nel serbatoio, mentre le celle o il materiale di rivestimento rimarranno all'esterno delle fibre nell'ECS. Si raccomandano 1 × 10^{8 celle per} la semina. Si raccomandano 100–500 μg di proteina matriciale in 20 mL di PBS per l'HFBR di 4.000^cm2 . Le proteine della matrice legate alle superfici delle fibre non influenzano il MWCO

1. Prepara la soluzione di rivestimento o la sospensione a celle in un tubo conico sterile da 50 mL. 1 x 108 cellule in un mezzo condizionato da espansione in fiaschetta o proteina matrice da 100–500 ug in PBS. Volume 20 mL.
2. Preleva 20 mL di cellule o soluzione di rivestimento in una siringa sterile usando un ago di grande calibro.
3. Attacca la siringa contenente la soluzione a una porta laterale e una siringa sterile vuota all'altra porta laterale.
4. Chiudi entrambe le porte estreme e apri entrambe le porte laterali.
5. Mescola delicatamente la soluzione trasferendo il liquido tra le due siringhe. Lascia metà della soluzione in ogni siringa. Chiudi entrambe le porte laterali.
6. Apri la porta destra, allenta il tappo del serbatoio di 1/4 di giro.
7. Inietta la soluzione da una siringa nell'ECS. Chiudi la porta laterale collegata.
8. Inietta la soluzione dall'altra siringa. Chiudi la porta laterale collegata. Apri entrambe le porte estreme.
9. Se si inoculano le cellule, lasciare la cartuccia in posizione orizzontale per 30 minuti a temperatura ambiente, poi ruotare di 180° lungo l'asse lungo e lasciarla riposare per altri 30 minuti.
   1. Se si ricoprono le fibre con proteine della matrice, lasciarle tutta la notte a temperatura ambiente.
10. Inserisci la cartuccia nel sistema di pompa Duet e avvia il flusso a 25.

5. Preparazione per la raccolta (vedi Figura 2)

1. Collega una siringa sterile vuota con un rubinetto di apertura a 3 vie e un filtro sterile sulla porta laterale destra.
2. Imposta il rubinetto di apertura a 3 vie per permettere la ventilazione attraverso il filtro sterile. Attacca una seconda siringa sterile vuota alla porta sinistra.

6. Raccolta del mezzo condizionato (Raccolto)

1. Apri la porta laterale destra e mantieni la ventilazione sterile attraverso il filtro.
2. Inclinare l'estremità destra della cartuccia verso l'alto e prelevare il mezzo condizionato (prodotto) nella siringa sinistra. Drena completamente il contenuto dell'ECS nella siringa sinistra.
3. Chiudi la porta destra. Chiudi la porta laterale sinistra, rimuovi la siringa e raccogli il raccolto in un tubo conico da 50 mL.
4. Sostituisci la siringa sul lato sinistro. Apri la porta sinistra. Apri la porta destra.
   Svita il tappo del serbatoio per 1/4 di giro.
5. Inclinare l'estremità sinistra della cartuccia verso l'alto e riempire l'ECS ritirando la siringa collegata alla porta sinistra. Riempi completamente l'ECS finché il menisco liquido non si trova al centro del tubo laterale.
6. Chiudi la porta destra. Apri la porta laterale destra e imposta il rubinetto di apertura a 3 vie per far uscire attraverso il filtro.
7. Apri la porta sinistra. Inclina la cartuccia a destra e svuota completamente l'ECS nella siringa sinistra.
8. Chiudi la porta sinistra. Rimuovi la siringa e raccogli l'ECS raccolto nel tubo conico da 50 mL.
9. Rimetti la siringa nella porta sinistra. Chiudi la porta destra. Apri la porta di estremità destra
10. Inclinare il lato sinistro della cartuccia verso l'alto e riempire l'ECS ritirando la siringa sinistra. Riempi completamente l'ECS finché il menisco liquido non si trova al centro del tubo laterale.
11. Chiudi la porta sinistra. Apri la porta sinistra. Stringi il tappo del serbatoio.
12. Confermare il flusso del sistema comprimendo manualmente il tubo della pompa prima di riportare la cartuccia alla pompa Duet.

7. Inserire il bioreattore nel sistema di pompa.

1. Imposta la portata della pompa a 25 sulla scatola di controllo. La cartuccia è più facile da installare mentre la pompa è in funzione.
2. Afferra il bordo destro del supporto del percorso di flusso. Fai scorrere il tubo della pompa dentro il tubo della pompa.
3. Fai scorrere la base del percorso di flusso nella fessura sulla base della pompa. Assicurati che il registro rettangolare si inserisca nel taglio del supporto del percorso di flusso.
4. Metti la bottiglia del serbatoio nell'incavatura laterale della base della pompa.
5. Il sottile cavo per l'alimentazione si inserisce tra la guarnizione dell'incubatore. La scatola di controllo ha un magnete per fissarla sul lato dell'incubatrice.

8. Monitorare i livelli di glucosio

1. Utilizzando una pipetta da 1 mL, rimuovi un campione di 1 mL di substrato dalla bottiglia del serbatoio.
2. Misura la concentrazione di glucosio utilizzando un glucometro compatibile posizionando una piccola goccia di mezzo campionato sulla striscia reattiva del misuratore.

9. Calcolo del tasso di assorbimento del glucosio

NOTA: Il tasso di assorbimento del glucosio viene calcolato sottraendo la misurazione di glucosio 24 ore dopo dalla misurazione iniziale del glucosio. Poiché la velocità dipende dal volume del serbatoio, moltiplica il calo della concentrazione di glucosio per il volume del serbatoio in litri. Ad esempio, se ci sono 250 mL nella bottiglia del serbatoio, moltiplica per 0,25 (25%). (Glucosio1-Glucosio2) X (bottiglia serbatoio in litri). 250 mL corrispondono a 0,25 L. Se è passato più di un giorno, dividere questo per il numero di giorni. Ad esempio: iniziare a prendere glucosio 4,5 g/L; misurare il glucosio 24 ore dopo: 2,7 g/L; Bottiglia serbatoio: 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X.25 (la bottiglia del serbatoio è 0,25 L), 0,45 g di glucosio consumato. Il tasso di assorbimento di glucosio è di 450 mg/giorno.

10. Verifica di Vitalità

1. Raccogli un piccolo campione di cellule utilizzando il protocollo di prelievo.
2. Mettere le cellule a piastra in una fiaschetta di coltura T 25 con un siero fresco contenente un mezzo siero al 10%. Valuta visivamente l'attaccamento e la vitalità.

11. Manutenzione giornaliera della cartuccia e la prima settimana di coltura.

NOTA: Durante la prima settimana di coltura, le cellule proliferative si espanderanno fino al loro tasso obiettivo di 1–2 grammi di glucosio consumati al giorno.

1. Giorno 0: Inoculare le cellule, determinare la concentrazione iniziale di glucosio dalla formulazione del substrato. Volume del serbatoio iniziale: 125 mL.
2. Giorno 1-2: Misura il glucosio ogni giorno. Quando il glucosio iniziale è esaurito al 50%, sostituire il serbatoio di 125 mL con 250 mL di substrato fresco e ridurre il siero al 7,5%.
3. Giorno 3-4: Misura il glucosio. Quando il glucosio iniziale è esaurito al 50%, sostituire il serbatoio di 250 mL con un substrato fresco da 500 mL e ridurre il siero al 5%.
4. Giorno 4-5: Misura il glucosio. Quando il glucosio iniziale è esaurito al 50%, sostituisci 500 mL con 1 litro di mezzo fresco. Riduci il siero al 2,5% e passa a substrati definiti chimicamente se lo desideri.
5. Giorno 6+: Misurare il glucosio, prelevare l'ECS. Controlla la densità cellulare prelevando per mantenere l'assorbimento di glucosio tra 1 e 2 grammi al giorno.
6. Per le cellule non proliferative, inizia con 125 mL nella bottiglia del serbatoio e cambia il mezzo ogni 3 giorni.
7. Se c'è un consumo significativo di glucosio, aumentare il serbatoio a 250 mL. Rimuovi il siero dall'ECS nei giorni 3-4 e sostituiscilo con un medium basale.

Risultati

Seguendo questo protocollo, una cartuccia^{da 4.000 cm 2} con linee cellulari proliferanti consuma tipicamente 1–2 g di glucosio al giorno. Questo si traduce in 1 L di mezzo ogni 2–3 giorni quando si utilizza un mezzo ad alto contenuto di glucosio come il DMEM. Le cellule raggiungono la densità massima entro una settimana dalla semina. Il prelievo dovrebbe iniziare dopo 5–7 giorni o quando il tasso di assorbimento del glucosio raggiunge 1 g al giorno e dovrebbe essere effettuato ogni giorno, se possibile. Durante questa prima settimana di coltura, il mezzo contenente siero nell'ECS può essere sostituito con un mezzo basale privo di siero, mantenendo il siero nel mezzo circolante, se necessario. Quando il tasso di assorbimento del glucosio raggiunge 1 g al giorno, puoi facilmente passare a mezzi a ridotto siero o ad altri mezzi definiti chimicamente. Gli MSC e gli HAFSC consumano glucosio a un tasso molto inferiore rispetto alle linee cellulari trasformate, come CHO, 293 o ibridomi. La formazione degli sferoidi è tipica di MSC e HAFSC, insieme ad altri tipi cellulari (Figura 3). Il monitoraggio giornaliero della glicemia fornisce una misura affidabile della salute della coltura e dell'attività metabolica. I supporti standard e commercialmente liberi da xeno sono stati utilizzati con successo con MSC e HAFSC. I volumi di raccolta sono circa 20 mL. Gli intervalli di 24 ore tra una raccolta e l'altra sono ottimali, poiché le concentrazioni di EV raggiungono un massimo dopo 24 ore (Figura 4). Le concentrazioni tipiche di esosomi nel mezzo raccolto variano da 1 a 5 × 10^{a 12} particelle/mL, a seconda del tipo di cellula, del numero di semina cellulare e di altri fattori, e possono risultare in pellet visibili dopo la centrifugazione (Figura 5). Un gran numero di cellule può essere seminato e dovrebbe basarsi sul numero di cellule, non sull'area di coltura (Figura 6).

I risultati dimostrano che la produzione di veicoli elettrici è correlata con l'attività metabolica misurata dal consumo di glucosio, fornendo un parametro pratico per monitorare e ottimizzare le prestazioni della coltura. La raccolta giornaliera a intervalli di 24 ore massimizza la concentrazione degli EV mantenendo la stabilità della coltura. Questi risultati supportano l'uso del monitoraggio del glucosio e della frequenza controllata di raccolta come parametri chiave per la produzione riproducibile di veicoli elettrici nei bioreattori a fibre cave.

Figura 1: Sezione trasversale del bioreattore a fibre cave. Il mezzo scorre attraverso l'interno delle fibre, e le cellule si attaccano all'esterno. Componenti di piccolo peso molecolare come glucosio e lattato possono facilmente attraversare le fibre. I prodotti secreti, come i veicoli elettrici, non possono attraversare le fibre e diventano altamente concentrati nell'area esterna alle fibre, chiamata ECS (spazio extracapillare). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Foto della cartuccia con porte e morsetti identificati. Le valvole di ritegno unidirezionali sul percorso di flusso generano un flusso di ricircolazione del mezzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cellule staminali mesenchimatose, cellule staminali del liquido amniotico umano, progenitori cardiaci e alcuni altri tipi cellulari formeranno sferoidi quando vengono inseriti nella cartuccia in quantità sufficienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misurazione delle concentrazioni di EV dopo diversi raccolti a intervalli di tempo. Dopo 24 ore, la concentrazione di EV raggiunge una concentrazione massima. La raccolta ottimale avviene dopo 24 ore. (Dati per gentile concessione di Paolo Neviani, EV core, Children's Hospital of Los Angeles). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Raccolto di una settimana di EV da cellule DIFI coltivate nel bioreattore a fibre cave C2011. EV isolati tramite centrifugazione differenziale. (dati per gentile concessione di Jeff Franklin, Università di Vanderbilt)^18,19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Un numero sorprendentemente elevato di cellule può essere seminato nel bioreattore a fibre cave. Gli MSC occupano una grande area nella cultura 2D; quando coltivati come sferoidi nella cultura 3D, occupano meno spazio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I bioreattori a fibre cave non sono in grado di produrre ragionevolmente proteine o anticorpi in quantità commerciali reali. Tuttavia, hanno una capacità unica di coltivare un numero relativamente grande di cellule ad alta densità e di secernere un prodotto EV concentrato su scala clinicamente rilevante. Solo negli ultimi anni sono stati riconosciuti i veri vantaggi di un bioreattore istocentrico. Le condizioni di coltura per perfusione ad alta densità portano a EV concentrate, utilizzando un mezzo conforme a cGMP, in quantità che possono essere adatte alla ricerca e a potenziali applicazioni cliniche. Un singolo raccolto da 4.000^cm2 può contenere 5 × 10¹² a 1 × 10¹⁴ EV in un volume di 10–20 mL. Queste rese rientrano nell'intervallo riportato negli studi che valutano la dosaggio EV²².

Il monitoraggio quotidiano del tasso di assorbimento del glucosio è un parametro importante per valutare le prestazioni della coltura ed è un indicatore diretto del metabolismo cellulare, del numero cellulare e della salute. Generalmente, si preferiscono substrati glucosici più elevati, come il DMEM, che ha una concentrazione iniziale di glucosio di 4,5 g/L. Il mezzo dovrebbe essere cambiato in mezzo fresco quando il glucosio è stato consumato al 50%. Alcune cellule, come le MSC, sembrano consumare glucosio e produrre lattato a concentrazioni superiori a 3 g/L, per poi passare al consumo di glutammina e alla produzione di ammoniaca a concentrazioni inferiori a 3 g/L. Non è ancora stata eseguita una profilazione metabolica completa delle MSC in coltura 3D.

Il parametro più critico per una coltura di bioreattore di successo è il numero di inoculazione cellulare. Un numero minimo di celle di inoculazione per un bioreattore²C2011 di 4.000 cm è 1 × 10⁸ celle. Per le cellule non proliferanti come MSC o HAFSC, si preferisce un numero maggiore, fino a 1 × 10⁹ cellule totali. Il volume del serbatoio dovrebbe essere proporzionale al numero di celle nella cartuccia. 1 × 10⁸ celle devono utilizzare un serbatoio non superiore a 125 ml. 1 × 10^{9 celle devono} avere un serbatoio non superiore a 1 L. Un serbatoio troppo grande può far entrare le cellule nella fase di ritardo. Questo è caratterizzato da un assenza di consumo di glucosio da parte delle cellule, anche se sono vitali come determinato dalla colorazione con Trypan Blue. In questo caso, riduci il volume del serbatoio o semina più cellule. Potrebbero essere necessarie inoculazioni multiple per ottenere numeri cellulari sufficienti a una coltura efficace del bioreattore. Basta seminare altre celle sopra quelle già presenti nella cartuccia. Quando si valuta le prestazioni del bioreattore, si notano la dimensione dell'inoculo cellulare. Un aumento di 10 volte nella semina delle celle può portare a una produzione EV 10 volte maggiore.

Le modifiche al protocollo possono includere modifiche nelle formulazioni del materiale, nei rivestimenti superficiali, nel numero delle cellule, nel volume di prelievo, nella frequenza di prelievo o nella dimensione della siringa, a seconda del tipo cellulare e della resa desiderata. La cultura continua consente un'ottimizzazione delle condizioni in tempo reale e facile, poiché durante la cultura possono essere apportate modifiche e ottenere risultati in tempo^{reale 21}. La risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sul mantenimento della sterilità e sul monitoraggio dell'attività metabolica. Assicurati che non ci siano ostruzioni o pieghe nei tubi, specialmente intorno alle fasce a slitta. La contaminazione batterica causerà un rapido consumo di glucosio e torbia nella bottiglia del serbatoio. La contaminazione fungina è indicata da un accumulo bianco soffice all'estremità sinistra della cartuccia, che blocca il flusso. L'uso del sistema di bioreattore a fibra cava richiede una gestione abile e una rigorosa aderenza ai protocolli. I passaggi critici includono la semina del numero corretto di cellule, il mantenimento della sterilità durante la raccolta e il monitoraggio attento del consumo di glucosio per prevenire una crescita eccessiva o la depurazione dei nutrienti. La maggior parte delle cellule si attacca alle fibre, talvolta dipendendo dalla matrice proteica rivestita di fibronectina, che facilita un rapido attacco cellulare. Alcune cellule, come MSC, HAFSC e progenitori cardiaci, rimangono attaccate alle fibre e formano sferoidi 3D.

Il sistema HFBR supporta colture ad alta densità, definite chimicamente e senza xeno della maggior parte dei tipi cellulari, facilitando la produzione su larga scala di EV²³. Il monitoraggio giornaliero della glicemia fornisce una metrica affidabile per le prestazioni del bioreattore. Il sistema chiuso, basato su perfusione, è compatibile con gli standard cGMP, e è possibile scalare l'uso di cartucce più grandi o addirittura più cartucce. La produzione di veicoli elettrici su scala grammatica può essere possibile in condizioni ottimizzate. Il bioreattore a fibra cava fornisce una piattaforma riproducibile per una produzione e raccolta costante di veicoli elettrici in condizioni controllate. Il protocollo qui descritto enfatizza considerazioni pratiche, tra cui la configurazione del sistema, la gestione asetttica e il monitoraggio metabolico, per supportare un funzionamento coerente e risultati affidabili. Potrebbero essere necessari ulteriori studi per valutare le caratteristiche e le proprietà funzionali degli EV in diverse condizioni di coltura e per confrontare le prestazioni con sistemi di produzione alternativi.

Questo metodo è ampiamente applicabile alla ricerca e alla produzione clinica di veicoli elettrici, inclusa la medicina rigenerativa e le applicazioni terapeutiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008