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L'acupotomia regola l'asse RIC8A/P38 MAPK basandosi sullo scaffold di circRNA per promuovere la riparazione della cartilagine nell'osteoartrite del ginocchio

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DOI:

10.3791/71422

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18 agosto 2026

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1Department of Tuina, Shuguang Anhui Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of First Clinical Medical College, Anhui University of Chinese Medicine, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha indagato se l'acupotomia favorisca la riparazione della cartilagine in un modello di coniglio di osteoartrite del ginocchio. Cinquanta conigli sono stati assegnati a cinque gruppi. L'acupotomia è stata somministrata settimanalmente per 4 settimane. Sono stati valutati il gonfiore articolare, l'istopatologia, le citochine infiammatorie e i marcatori relativi all'asse circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK per esplorare il meccanismo sottostante.

Abstract

L'osteoartrosi del ginocchio (KOA) è caratterizzata da una degenerazione progressiva della cartilagine e da infiammazione. Questo studio ha indagato gli effetti terapeutici dell'acupuntura in un modello di KOA nel coniglio e la sua associazione con l'asse di segnalazione dell'RNA circolare fosfodiesterasi 4B (circPDE4B)/resistenza agli inibitori della colinesterasi 8A (RIC8A)/chinasi mitogen-attivata p38 (MAPK). Cinquanta conigli albini della Nuova Zelanda sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi (n = 10 per gruppo): controllo, modello KOA, celecoxib, acupuntura e acupuntura finta. La KOA è stata indotta mediante il metodo modificato di Videman. A partire da 6 settimane dopo la creazione del modello, l'acupuntura è stata somministrata una volta alla settimana per 4 settimane, mentre il celecoxib è stato somministrato giornalmente per via orale a 24 mg/kg per 4 settimane. Sono state valutate il gonfiore del ginocchio e l'istopatologia della cartilagine. I livelli di interleuchina-1β (IL-1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e interleuchina-6 (IL-6) negli omogenati del tessuto cartilagineo sono stati misurati mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). L'espressione genica e proteica associata al metabolismo della cartilagine e all'asse circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK è stata valutata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa e immunoblotting. Rispetto al gruppo modello KOA, l'acupuntura ha ridotto il gonfiore del ginocchio, migliorato i punteggi istopatologici, diminuito i livelli di citochine infiammatorie, ridotto l'espressione di metalloproteasi della matrice-3 (MMP-3), metalloproteasi della matrice-13 (MMP-13), RIC8A e p38 MAPK fosforilata, e aumentato l'espressione del fattore di trascrizione SRY-box 9 (SOX9), dell'aggrecano e del circPDE4B relativo. I suoi effetti sono risultati paragonabili a quelli del celecoxib, mentre l'acupuntura finta non ha prodotto alcun miglioramento significativo. Questi risultati indicano che l'acupuntura attenua l'infiammazione e la degenerazione della cartilagine nel modello di KOA nel coniglio ed è associata alla modulazione dell'asse circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.

Introduzione

L'osteoartrosi del ginocchio (KOA) è una malattia articolare degenerativa diffusa, caratterizzata da degradazione progressiva della cartilagine, infiammazione sinoviale, sclerosi ossea subcondrale e formazione di osteofiti1,2,3. Con l'invecchiamento della popolazione mondiale, l'incidenza della KOA continua ad aumentare, rendendola una delle principali cause di disfunzione articolare e dolore cronico negli adulti di mezza età e negli anziani a livello globale4,5,6. I trattamenti clinici attuali si concentrano principalmente sul sollievo sintomatico mediante agenti farmacologici, come i farmaci anti-infiammatori non steroidei (NSAID) e le iniezioni intra-articolari di corticosteroidi. Tuttavia, le terapie modificanti la malattia in grado di arrestarne la progressione o di promuovere la riparazione della cartilagine rimangono limitate7,8.

Evidenze emergenti hanno evidenziato i cruciali ruoli regolatori degli RNA non codificanti (ncRNA) nella patogenesi e nel decorso dell'artrosi del ginocchio (KOA)9,10,11. Tra questi ncRNA, gli RNA circolari (circRNA) hanno attirato crescente attenzione a causa della loro struttura unica a loop chiuso covalentemente, che conferisce maggiore stabilità rispetto agli RNA lineari, e delle loro diverse funzioni biologiche12,13. Shen et al. hanno riportato che circPDE4B agisce come uno scaffold molecolare che regola la resistenza agli inibitori della via di segnalazione della resistenza alla colinesterasi 8A (RIC8A)/p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), influenzando così il metabolismo della matrice extracellulare e le risposte infiammatorie dei condrociti14. La via RIC8A/p38 MAPK svolge un ruolo importante nel regolare l'infiammazione, il catabolismo, l'apoptosi e la senescenza nei condrociti, tutti processi che contribuiscono alla patogenesi dell'artrosi15.

L'acupotomia è un approccio terapeutico minimamente invasivo che integra la teoria della medicina tradizionale cinese con i principi anatomici moderni e ha dimostrato un'efficacia promettente nella gestione clinica dell'artrosi del ginocchio16,17. Questa tecnica utilizza un apposito strumento a ago-lama per sciogliere le aderenze dei tessuti molli, migliorare la circolazione locale e ripristinare l'equilibrio biomeccanico intorno alle articolazioni interessate, alleviando così il dolore e migliorando la funzionalità nei pazienti con artrosi del ginocchio18. Nonostante questi benefici clinici riportati, i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici dell'acupotomia, in particolare la sua eventuale regolazione delle vie di segnalazione mediate da circRNA coinvolte nella riparazione della cartilagine, rimangono in gran parte inesplorati.

Da un punto di vista meccanicistico, l'acupotomia genera stimoli meccanici locali attraverso il rilascio dei tessuti molli periarticolari. I condrociti sono cellule meccanosensibili che rispondono a segnali biomeccanici, e si è dimostrato che gli circRNA partecipano alle risposte di meccanotrasduzione dei condrociti19,20. Sebbene manchi evidenza diretta che colleghi l'acupotomia alla regolazione di circRNA specifici della cartilagine articolare, è biologicamente plausibile che i segnali meccanici generati dall'acupotomia possano modulare circRNA meccanosensibili come circPDE4B. Questa possibilità ha costituito la base della presente indagine.

Basandosi su precedenti scoperte riguardo al ruolo regolatorio di circPDE4B nell'asse di segnalazione RIC8A/p38 MAPK, lo studio attuale ha utilizzato un modello coniglio di OA del ginocchio (KOA) indotta con il metodo modificato di Videman per verificare l'ipotesi che l'acupotomia promuova la riparazione della cartilagine modulando la via di segnalazione circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. L'acupotomia è stata scelta per questo studio piuttosto che altre interazioni per la KOA per diversi motivi. In primo luogo, rispetto ad agenti farmacologici come i farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) e il celecoxib, che forniscono principalmente un sollievo sintomatico e sono associati a effetti limitati sulla modifica della malattia e potenziali eventi avversi a lungo termine7,8, l'acupotomia offre un approccio non farmacologico che agisce sia sui fattori meccanici locali sia sulle vie di segnalazione biologica. In secondo luogo, a differenza delle iniezioni intra-articolari di corticosteroidi o acido ialuronico, che richiedono somministrazioni ripetute e comportano rischi di infezione e danni articolari, l'acupotomia mira ai tessuti molli periarticolari e può esercitare effetti biomeccanici e biochimici sostenuti21. In terzo luogo, evidenze cliniche hanno dimostrato che l'acupotomia produce risultati paragonabili o superiori rispetto alle terapie convenzionali nel ridurre il dolore e migliorare la funzione articolare nei pazienti con KOA, e studi sperimentali hanno suggerito che l'acupotomia modula le risposte infiammatorie e il metabolismo dei condrociti21,22. Tuttavia, i percorsi molecolari specifici attraverso cui l'acupotomia esercita i suoi effetti condroprotettivi rimangono poco caratterizzati, in particolare per quanto riguarda la segnalazione mediata da circRNA. Pertanto, l'indagine dell'associazione tra acupotomia e l'asse circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK potrebbe fornire nuove intuizioni meccanicistiche e sostenere l'uso dell'acupotomia come intervento modificante la malattia per la KOA16,18. Gli endpoint primari sono stati il gonfiore dell'articolazione del ginocchio, la degenerazione cartilaginea istopatologica (punteggi di Mankin e Moran), i livelli di citochine infiammatorie (interleuchina-1β, fattore di necrosi tumorale-α e interleuchina-6), l'espressione di marcatori legati al metabolismo della cartilagine (metalloproteasi della matrice-3, metalloproteasi della matrice-13, fattore di trascrizione SRY-box 9 e aggrecano), nonché l'espressione di circPDE4B e RIC8A e la fosforilazione di p38 MAPK. L'acupotomia è stata somministrata una volta alla settimana per 4 settimane in punti periarticolari selezionati, utilizzando la tecnica in quattro passaggi (rilascio longitudinale, separazione trasversale e incisione dei noduli). Sono state utilizzate valutazioni istopatologiche, misurazioni delle citochine infiammatorie e analisi dell'espressione genica e proteica per caratterizzare gli effetti dell'acupotomia ed esplorarne la base molecolare potenziale nella KOA.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato Etico per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Anhui (numero di approvazione AHUCM-rabbits-2023195). I reagenti, i prodotti chimici, il software e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali sperimentali e raggruppamento
Cinquanta conigli albini maschi adulti sani della razza New Zealand White (età di 6 mesi, peso di 2,0–2,5 kg) sono stati ottenuti dall'allevamento Laifu del distretto di Pukou, Nanjing (Licenza per la produzione di animali: SCXK (Su) 2024-0007). Tutti gli animali hanno subito un periodo di adattamento di 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Il ginocchio destro è stato designato per la valutazione del gonfiore e il ginocchio sinistro per il prelievo del tessuto cartilagineo, seguendo una convenzione procedurale uniforme e non in base a un'ipotesi sperimentale specifica. Al termine dell'adattamento, i conigli sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi (n = 10 per gruppo): un gruppo di controllo, al quale non è stato applicato alcun intervento di modellizzazione né trattamento; un gruppo modello di OA gonocomiale (KOA), in cui la KOA è stata indotta mediante il metodo modificato di Videman; un gruppo trattato con celecoxib, nel quale il trattamento farmacologico è stato avviato 6 settimane dopo la modellizzazione; un gruppo trattato con acupotomia, in cui il trattamento con acupotomia è stato avviato 6 settimane dopo la modellizzazione; e un gruppo di acupotomia finta (sham), in cui è stata effettuata l'inserzione dell'ago senza taglio o rilascio del tessuto, avviata anch'essa 6 settimane dopo la modellizzazione.

2. Creazione del modello di artrosi del ginocchio (KOA)
Tutti i conigli, tranne quelli del gruppo di controllo, sono stati sottoposti alla procedura modificata di Videman per indurre l'artrosi del ginocchio. Gli animali sono stati privati dell'alimentazione per 12 ore prima dell'intervento chirurgico. L'anestesia è stata indotta mediante somministrazione endovenosa, attraverso la vena marginale dell'orecchio, di pentobarbital sodico al 3% alla dose di 30 mg/kg. Dopo la preparazione standard del sito chirurgico, la disinfezione e la copertura sterile, è stata eseguita un'incisione longitudinale lungo l'aspetto mediale dell'articolazione del ginocchio. Il legamento collaterale mediale e il legamento crociato anteriore sono stati recisi in successione e il menisco mediale è stato completamente asportato. L'incisione è stata quindi chiusa a strati.

Per ridurre il rischio di infezione postoperatoria, la penicillina è stata somministrata per via intramuscolare a 40.000 U/kg/die per 3 giorni consecutivi. Dopo l'intervento chirurgico, i conigli sono stati restituiti alle loro gabbie e lasciati liberi di muoversi senza immobilizzazione articolare.

3. Trattamento placebo con ago-scissione
A 6 settimane dalla modellizzazione dell'artrosi del ginocchio, i conigli del gruppo placebo con ago-scissione subirono le stesse procedure di palpazione e marcatura dei punti utilizzate per il trattamento attivo con ago-scissione. Un ago sterile monouso per ago-scissione di dimensioni 0,35 mm × 25 mm veniva inserito perpendicolarmente attraverso la cute in ciascun punto marcato fino al raggiungimento del tessuto sottocutaneo. Non venivano eseguiti tagli, allentamenti, manipolazioni trasversali né altre manovre meccaniche di rilascio. L'ago veniva estratto immediatamente dopo l'inserimento, senza alcuna manipolazione del tessuto. Il trattamento placebo veniva somministrato una volta alla settimana per 4 settimane consecutive.

4. Trattamento con acupotomia
A 6 settimane dalla modellizzazione della OA del ginocchio, i conigli del gruppo sottoposto ad acupotomia sono stati immobilizzati su un tavolo di trattamento. I tessuti periarticolari intorno al ginocchio interessato sono stati sottoposti a palpazione, in particolare intorno alla rotula e agli spazi articolari mediale e laterale, per identificare strutture di tipo cordonale o noduli duri. Sulla base dei risultati della palpazione, sono stati selezionati da quattro a sei punti di trattamento e segnati sulla cute.

L'area da trattare è stata rasata e disinfettata utilizzando procedure sterili standard. Un ago monouso sterile per acupotomia, di dimensioni 0,35 mm × 25 mm, è stato inserito lentamente e perpendicolarmente in ciascun punto segnato fino al raggiungimento della superficie ossea. La procedura è stata eseguita secondo la tecnica dell'acupotomia in quattro fasi. È stata effettuata prima una liberazione longitudinale, seguita da una separazione trasversale. Quando si incontrava un nodulo duro, veniva inciso fino a quando non si percepiva chiaramente attraverso l'ago-lama una sensazione di rilascio. Al termine della procedura, l'ago è stato rimosso e ciascun sito di inserzione è stato compresso brevemente con garza sterile e coperto con una medicazione adesiva. Il trattamento è stato somministrato una volta alla settimana per 4 settimane consecutive.

5. Trattamento farmacologico
A 6 settimane dalla modellizzazione di KOA, i conigli del gruppo celecoxib hanno ricevuto una sospensione di celecoxib per somministrazione orale a 24 mg/kg una volta al giorno per 4 settimane consecutive. La sospensione è stata preparata fresca ogni giorno in soluzione salina fisiologica. Le informazioni sul fornitore e sul numero di catalogo sono riportate nella Tabella dei Materiali.

6. Valutazione del gonfiore dell'articolazione del ginocchio
Alla fine del periodo di intervento, corrispondente a 10 settimane dopo la modellizzazione dell'artrosi del ginocchio (KOA), è stato valutato il gonfiore dell'articolazione del ginocchio. Un filo morbido di seta è stato avvolto attorno alla regione più gonfia del ginocchio destro, tipicamente a livello della piastra tibiale. Il filo è stato rimosso e misurato al millimetro più vicino con un righello, e la lunghezza registrata è stata definita come circonferenza del ginocchio.

Il rapporto di gonfiamento relativo è stato calcolato utilizzando la seguente equazione:

Formula del rapporto di gonfiamento relativo, equazione del confronto della circonferenza del ginocchio nello studio sperimentale su coniglio.

7. Raccolta del campione
Al termine del periodo di intervento, i conigli sono stati anestetizzati mediante somministrazione endovenosa di pentobarbital sodico al 3% a una dose di 30 mg/kg attraverso la vena marginale dell'orecchio. L'articolazione del ginocchio sinistro è stata aperta utilizzando una lama di bisturi n. 23 per esporre le superfici articolari della piastra tibiale e dei condili femorali. Il tessuto di cartilagine articolare è stato prelevato da queste regioni.

Ogni campione di cartilagine è stato diviso in due porzioni. Una porzione è stata fissata in paraformaldeide al 4% per l'esame istopatologico. La seconda porzione è stata posta in provette criogeniche, congelata rapidamente in azoto liquido e conservata a −80 °C fino all'esecuzione delle analisi molecolari. Immediatamente al termine di tutte le procedure di raccolta dei tessuti, i conigli sono stati sottoposti a eutanasia mediante embolia aerea, ottenuta tramite rapida iniezione endovenosa di aria attraverso la vena marginale dell'orecchio.

La colorazione istologica e la valutazione secondo i punteggi di Mankin e Moran sono state eseguite utilizzando campioni di cartilagine prelevati da tutti e 10 i conigli per gruppo (n = 10). Le immagini rappresentative di ematossilina-eosina e di Safranina O–Fast Green sono state selezionate da tre conigli scelti casualmente per gruppo. L'immunohistochimica e il Western blotting sono stati eseguiti utilizzando campioni di tre conigli selezionati casualmente per gruppo (n = 3). La reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa e il saggio immunoenzimatico (ELISA) sono stati eseguiti utilizzando campioni di sei conigli selezionati casualmente per gruppo (n = 6). Tutte le selezioni dei sottogruppi sono state effettuate in modo casuale, senza conoscere in anticipo l'assegnazione ai gruppi.

8. Colorazione con ematossilina ed eosina
Il tessuto cartilagineo fissato in paraformaldeide al 4% è stato decalcificato in soluzione al 10% di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a pH 7,4 per 4–6 settimane. La soluzione decalcificante è stata sostituita ogni 3 giorni. Dopo aver confermato la decalcificazione mediante penetrazione con ago, il tessuto è stato disidratato mediante una serie alcolica progressiva al 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, chiarito nello xilene e incluso in paraffina. Il tessuto incluso è stato sezionato con uno spessore di 5 µm utilizzando un microtomo, e i campioni sono stati montati su vetrini.

Per la colorazione con ematossilina ed eosina, i preparati sono stati riscaldati a 60 °C per 60 minuti, disparaffinizzati nello xilene con tre passaggi di 5 minuti ciascuno e reidratati in modo sequenziale con etanolo al 100%, 95%, 80% e 70%, seguiti da acqua distillata. I preparati sono stati quindi colorati con ematossilina per 5 minuti, risciacquati sotto acqua corrente per 10 minuti, differenziati in acido cloridrico all'1% preparato in etanolo al 70% per 2–3 secondi e nuovamente risciacquati con acqua distillata. Successivamente, i preparati sono stati colorati con eosina per 2 minuti, risciacquati con acqua distillata, disidratati passando attraverso etanolo al 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, chiarificati nello xilene e montati con resina neutra. È stata esaminata la morfologia della cartilagine ed acquisite immagini rappresentative mediante microscopio ottico.

9. Colorazione con Safranina O–Verde Fast
Le sezioni di cartilagine in paraffina sono state disincrostate e riidratate come descritto nella sezione 8. Le sezioni sono state colorate con ematossilina di Weigert al ferro per 5 minuti e risciacquate con acqua distillata. Successivamente, le sezioni sono state colorate con soluzione al 0,05% di Verde Fast per 3 minuti, risciacquate brevemente in acido acetico all’1% per 10–15 secondi e quindi colorate con soluzione allo 0,1% di Safranina O per 5 minuti.

Dopo la colorazione, i preparati sono stati rapidamente disidratati in etanolo al 95% e al 100%, chiariti nello xilene e montati con resina neutra. I preparati colorati sono stati esaminati mediante microscopio ottico. L'intensità della colorazione con Safranina O, che riflette il contenuto di proteoglicani, è stata analizzata in modo semiquantitativo utilizzando un software di analisi delle immagini.

10. Valutazione istologica
Due patologi, ignari dei gruppi sperimentali assegnati, hanno valutato in modo indipendente le sezioni colorate utilizzando i sistemi di punteggio di Mankin e Moran per determinare il grado di degenerazione della cartilagine. Prima della valutazione, a tutte le sezioni è stato assegnato un codice identificativo casuale. Le assegnazioni dei trattamenti non sono state divulgate ai patologi fino al completamento di tutte le valutazioni23.

11. Saggio immunoenzimatico
Il tessuto cartilagineo congelato è stato pesato, aggiunto a soluzione salina tamponata al fosfato a pH 7,4 ed omogeneizzato accuratamente sul ghiaccio. L'omogenato è stato centrifugato a 3.000 × g per 20 minuti a 4 °C e il soprannatante è stato raccolto per l'analisi. Le concentrazioni di interleuchina-1β (IL-1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e interleuchina-6 (IL-6) nel soprannatante tissutale sono state misurate utilizzando kit specifici per coniglio per saggio immunoenzimatico, seguendo le istruzioni del produttore.

12. Reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa
L'RNA totale è stato estratto dal tessuto cartilagineo utilizzando un metodo basato su fenolo–cloroformo. In breve, il tessuto è stato lisato in un reagente per l'estrazione dell'RNA e il cloroformo è stato aggiunto per separare le fasi acquosa e organica. È stata raccolta la fase acquosa e l'RNA è stato precipitato con isopropanolo, lavato con etanolo al 75%, essiccato all'aria e disciolto in acqua trattata con pirobicarbonato di dietile. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state misurate utilizzando uno spettrofotometro.

Prima della trascrizione inversa, il DNA genomico residuo è stato eliminato utilizzando un reagente per l'eliminazione del DNA genomico. Il DNA complementare è stato quindi sintetizzato mediante un kit di trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore. È stata eseguita una reazione a catena della polimerasi quantitativa utilizzando un metodo di rilevamento a base di SYBR Green su un sistema di reazione a catena della polimerasi in tempo reale. Le condizioni di ciclaggio erano le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 20 s e di ibridazione ed estensione a 60 °C per 1 min. È stata effettuata un'analisi della curva di dissociazione per valutare la specificità dell'amplificazione.

Sono stati misurati i livelli di espressione della metalloproteasi della matrice-3 (MMP-3), della metalloproteasi della matrice-13 (MMP-13), del fattore di trascrizione SRY-box 9 (SOX9), dell'aggrecano, di RIC8A e di circPDE4B. β-actin è stato utilizzato come gene di riferimento interno. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo. Le sequenze dei primer sono riportate nella Tabella 1.

13. Analisi di Western blot
Il tessuto cartilagineo è stato lisato in un buffer per saggio di radioimmunoprecipitazione integrato con fluoruro di fenilmetilsolfonile. Il lisato è stato centrifugato a 12.000 × g per 15 min a 4 °C e il soprannatante è stato raccolto come frazione proteica totale. La concentrazione proteica è stata determinata mediante un saggio con acido bicinconinico.

Quantità uguali di proteina (30 µg per corsia) sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio al 10% e trasferite su membrane in fluoruro di polivinilidene precedentemente attivate nel metanolo. Il trasferimento è stato eseguito a 300 mA a 4 °C. I tempi di trasferimento sono stati i seguenti: aggrecano (250 kDa) per 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) e MMP-13 (52 kDa) per 50 min; e p38 MAPK (41 kDa) e GAPDH (36 kDa) per 40 min. Le membrane sono state bloccate con latte in polvere scremato al 5% in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 per 2 h a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), aggrecano (1:1.000), RIC8A (1:1.500), p38 MAPK fosforilata (1:1.000) e p38 MAPK totale (1:2.000). GAPDH (1:2.000) è stato utilizzato come controllo di caricamento. Dopo tre lavaggi con soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 (10 min ciascuno), le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (1:20.000) per 1,2 h a temperatura ambiente. Dopo ulteriori tre lavaggi, le bande proteiche sono state visualizzate mediante un substrato chemiluminescente migliorato e acquisite con un sistema di documentazione elettroforetica. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando il software ImageJ e normalizzate rispetto a GAPDH.

14. Immunohistochemica
Le sezioni di cartilagine in paraffina sono state deparaffinizzate e reidratate mediante una serie di etanoli a concentrazione decrescente (tre passaggi con xilolo, 5 min ciascuno; seguiti da etanolo al 100%, 95% e 80%, 3 min ciascuno). Il recupero dell'antigene è stato effettuato riscaldando le sezioni in tampone EDTA (pH 9,0) in una pentola a pressione. Il tampone è stato portato a ebollizione e, dopo la pressurizzazione, il recupero è proseguito per 2 min, seguito da raffreddamento a temperatura ambiente. L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 10 min a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, il legame non specifico è stato bloccato con siero di capra per 20 min a temperatura ambiente al buio.

Le sezioni sono state incubate con anticorpi primari contro la p38 MAPK fosforilata (1:800) e contro il fattore nucleare kappa B (NF-κB) fosforilato (1:300) per 60 minuti a 37 °C. Dopo tre lavaggi con soluzione salina tamponata al fosfato contenente Tween 20, le sezioni sono state incubate con gli anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano per 30 minuti a 37 °C. Dopo ulteriori tre lavaggi, è stato utilizzato il diaminobenzidina per lo sviluppo del colore (controllato al microscopio), seguito da una controcolorazione con ematossilina (2 minuti), differenziazione in acido cloridrico 1% in etanolo al 70% e bluing in soluzione di carbonato di litio (30 s). Le sezioni sono quindi state disidratate, chiarificate, montate ed esaminate al microscopio ottico. La valutazione della colorazione è stata effettuata mediante software ImageJ e la densità ottica integrata è stata calcolata per l'analisi semiquantitativa.

15. Analisi statistica
I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). I confronti tra più gruppi sono stati effettuati mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

La acupotomia attenua le alterazioni istologiche nella cartilagine articolare
Come mostrato nelle Figure 1A,B, la circonferenza del ginocchio e il rapporto di gonfiore relativo erano significativamente aumentati nel gruppo modello di OA rispetto al gruppo di controllo. Entrambe le misure sono risultate significativamente ridotte dopo il trattamento con acupotomia o celecoxib, mentre l'acupotomia finta non ha prodotto alcun miglioramento significativo rispetto al gruppo modello di OA.

Come mostrato nelle Figure 1C,D, il punteggio di Mankin era significativamente più alto nel gruppo modello di OA rispetto al gruppo di controllo ed era significativamente ridotto dopo il trattamento con acupotomia o celecoxib. Nessuna riduzione significativa è stata osservata nel gruppo con acupotomia finta. Il punteggio di Moran mostrava un andamento opposto.

Le colorazioni con ematossilina-eosina e Safranina O–Fast Green hanno evidenziato un assottigliamento e una discontinuità della superficie della cartilagine articolare, con erosione localizzata, nel gruppo modello di artrosi del ginocchio (KOA) rispetto al gruppo di controllo (Figura 1E,F). L'acupotomia e il celecoxib hanno attenuato questi cambiamenti patologici, come indicato da contorni della cartilagine più definiti e da un ridotto danno strutturale. Al contrario, il gruppo sottoposto ad acupotomia finta ha mostrato caratteristiche patologiche simili a quelle del gruppo modello KOA. Questi risultati indicano che l'acupotomia ha prodotto effetti paragonabili a quelli del celecoxib nel ridurre il gonfiore articolare e la degenerazione della cartilagine, nonché nel migliorare i punteggi istologici nel modello KOA.

La acupotomia riduce i livelli di citochine infiammatorie
Come mostrato nella Figura 2A–C, le concentrazioni di interleuchina-1β (IL-1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e interleuchina-6 (IL-6) negli omogenati di tessuto cartilagineo erano significativamente più elevate nel gruppo modello di artrosi del ginocchio (KOA) rispetto al gruppo di controllo. Il trattamento con acupotomia o celecoxib ha ridotto in modo significativo i livelli di tutte e tre le citochine infiammatorie. Al contrario, il gruppo sottoposto a finta acupotomia non ha mostrato una riduzione significativa rispetto al gruppo modello KOA.

La modulazione della via di segnalazione RIC8A/p38 MAPK a livello proteico mediante acupotomia
L'analisi immunohistochemica ha mostrato che l'espressione della proteina chinasi mitogeno-attivata p38 fosforilata (p-p38 MAPK) e del fattore nucleare kappa B fosforilato (NF-κB) era significativamente inferiore nei gruppi trattati con acupotomia e con celecoxib rispetto al gruppo modello di artrosi del ginocchio (KOA) (Figura 3A). Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra il gruppo con acupotomia finta e il gruppo modello KOA.

L'analisi mediante Western blot ha mostrato che i livelli proteici della metalloproteina matriciale-3 (MMP-3), della metalloproteina matriciale-13 (MMP-13), della resistenza agli inibitori della colinesterasi 8A (RIC8A) e di p-p38 MAPK erano significativamente più elevati nel gruppo modello di artrosi del ginocchio (KOA) rispetto al gruppo di controllo, mentre i livelli delle proteine legate alla sintesi della cartilagine, fattore di trascrizione SRY-box 9 (SOX9) e aggrecano, erano significativamente più bassi. Rispetto al gruppo modello di KOA, i gruppi trattati con acupotomia e con celecoxib hanno mostrato una riduzione dell'espressione di MMP-3, MMP-13, RIC8A e p-p38 MAPK e un aumento dell'espressione di SOX9 e aggrecano. Il gruppo con acupotomia finta ha mostrato un profilo di espressione proteica simile a quello del gruppo modello di KOA, senza variazioni significative nelle proteine misurate (Figura 3B–I). Questi risultati indicano che gli effetti dell'acupotomia e del celecoxib sulla KOA sono associati alla modulazione della via di segnalazione RIC8A/p38 MAPK.

La acupotomia modula la via di segnalazione RIC8A/p38 MAPK a livello trascrizionale
Come mostrato nelle Figure 4A–G, i livelli di espressione di MMP-3, MMP-13 e RIC8A erano significativamente più elevati nel gruppo modello di OA del ginocchio (KOA) rispetto al gruppo di controllo, mentre l'espressione di SOX9 e aggrecano era significativamente più bassa. Rispetto al gruppo modello di KOA, la acupotomia e il celecoxib hanno ridotto l'espressione di MMP-3, MMP-13 e RIC8A e aumentato l'espressione di SOX9 e aggrecano. Il gruppo con acupotomia finta non ha mostrato differenze significative rispetto al gruppo modello di KOA nei livelli trascrizionali misurati.

L'acupotomia ha inoltre aumentato l'espressione relativa di circPDE4B, indicando che i suoi effetti terapeutici erano associati alla modulazione dell'asse di segnalazione circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK e a una ridotta segnalazione infiammatoria e catabolica.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio, inclusi i dati di ELISA, colorazione H&E, immunohistochemica, RT‑qPCR, colorazione con Safranina O–Fast Green e western blot, sono disponibili liberamente nel repository Figshare all'indirizzo https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.

Confronto tra trattamenti per l'osteoartrosi del ginocchio; grafici a barre, immagini istologiche; analisi degli effetti del trattamento.
Figura 1. L'acupotomia riduce il gonfiore del ginocchio e la degenerazione della cartilagine articolare nei conigli con osteoartrosi del ginocchio. (A) Circonferenza del ginocchio. (B) Rapporto relativo di gonfiore del ginocchio. (C) Punteggio istologico di Mankin. (D) Punteggio istologico di Moran. (E) Sezioni rappresentative di cartilagine articolare colorate con ematossilina ed eosina dai gruppi controllo, modello di KOA, celecoxib, acupotomia e acupotomia finta. (F) Sezioni rappresentative colorate con Safranina O–Fast Green dai cinque gruppi sperimentali. La valutazione istologica (punteggi di Mankin e Moran) è stata effettuata utilizzando campioni di tutti e 10 i conigli per gruppo (n = 10), mentre le immagini rappresentative per le colorazioni H&E e Safranina O–Fast Green sono state ottenute da 3 conigli scelti casualmente per gruppo. I dati sono espressi come media ± SEM. I confronti statistici sono stati effettuati mediante analisi della varianza ad un solo fattore seguita dal test post hoc di Tukey. Le barre orizzontali indicano i gruppi confrontati. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Barre della scala: 100 µm. Abbreviazioni: KOA = osteoartrosi del ginocchio; SEM = errore standard della media. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Confronto a barre dei livelli di IL-1β, IL-6, TNF-α nei gruppi trattati con acupotomia e controlli nell'artrosi del ginocchio.
Figura 2. L'acupotomia riduce i livelli di citochine infiammatorie nei conigli con artrosi del ginocchio. (A) Concentrazione di interleuchina-1β. (B) Concentrazione di interleuchina-6. (C) Concentrazione di fattore di necrosi tumorale-α. Le concentrazioni di citochine sono state misurate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) su campioni prelevati da sei conigli per gruppo (n = 6). I dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). I confronti statistici sono stati effettuati mediante analisi della varianza ad un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. Le barre orizzontali indicano i gruppi confrontati. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abbreviazioni: IL-1β = interleuchina-1β; IL-6 = interleuchina-6; KOA = artrosi del ginocchio; SEM = errore standard della media; TNF-α = fattore di necrosi tumorale-α. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Immagini di istologia, analisi dell'espressione proteica, grafici a barre; risultati del trattamento dell'artrosi del ginocchio.
Figura 3. L'acupotomia modula le proteine legate all'infiammazione e al metabolismo della cartilagine nei conigli con artrosi del ginocchio. (A) Immagini immunohistochimiche rappresentative che mostrano l'espressione del fattore nucleare kappa B fosforilato e della proteina chinasi mitogeno-attivata p38 fosforilata nella cartilagine articolare dei gruppi controllo, modello di KOA, celecoxib, acupotomia e acupotomia finta. Barre della scala, 100 µm. (B) Immunoblot rappresentativi che mostrano l'espressione di SOX9, RIC8A, MMP-13, p38 MAPK fosforilata, p38 MAPK totale, MMP-3, aggrecano e GAPDH. (C) Quantificazione densitometrica dell'aggrecano normalizzata rispetto a GAPDH. (D) Quantificazione di MMP-13 normalizzata rispetto a GAPDH. (E) Quantificazione di MMP-3 normalizzata rispetto a GAPDH. (F) Quantificazione della p38 MAPK totale normalizzata rispetto a GAPDH. (G) Quantificazione della p38 MAPK fosforilata normalizzata rispetto a GAPDH. (H) Quantificazione di SOX9 normalizzata rispetto a GAPDH. (I) Quantificazione di RIC8A normalizzata rispetto a GAPDH. Le analisi tramite immunoblot sono state eseguite utilizzando campioni di tre conigli per gruppo (n = 3). I dati sono espressi come media ± SEM. I confronti statistici sono stati effettuati mediante analisi della varianza ad un solo fattore seguita dal test post hoc di Tukey. Le barre orizzontali indicano i gruppi confrontati. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abbreviazioni: GAPDH = deidrogenasi del gliceraldeide-3-fosfato; KOA = artrosi del ginocchio; MAPK = proteina chinasi mitogeno-attivata; MMP-3 = metalloproteasi della matrice-3; MMP-13 = metalloproteasi della matrice-13; NF-κB = fattore nucleare kappa B; p-NF-κB = fattore nucleare kappa B fosforilato; p-p38 MAPK = p38 MAPK fosforilata; RIC8A = resistenza agli inibitori della colinesterasi 8A; SEM = errore standard della media; SOX9 = fattore di trascrizione della scatola SRY 9. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici a barre delle espressioni proteiche (Aggrecano, MMP, p38 MAPK, SOX9) rispetto a β-actina, effetti del trattamento farmacologico.
Figura 4. L'acupotomia modula i trascritti legati al metabolismo della cartilagine e l'espressione di circPDE4B nei conigli con osteoartrite al ginocchio. (A) Espressione relativa dell'aggrecano. (B) Espressione relativa di MMP-3. (C) Espressione relativa di MMP-13. (D) Espressione relativa di p38 MAPK. (E) Espressione relativa di SOX9. (F) Espressione relativa di circPDE4B. (G) Espressione relativa di RIC8A. L'espressione è stata misurata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa e normalizzata rispetto al gene di riferimento. Le analisi sono state eseguite utilizzando campioni di sei conigli per gruppo (n = 6). I dati sono riportati come media ± SEM. I confronti statistici sono stati effettuati mediante analisi della varianza unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey. Le barre orizzontali indicano i gruppi confrontati. P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001. Abbreviazioni: circPDE4B = RNA circolare fosfodiesterasi 4B; KOA = osteoartrite al ginocchio; MAPK = chinasi attivata da mitogeni; MMP-3 = metalloproteina della matrice 3; MMP-13 = metalloproteina della matrice 13; RIC8A = resistenza agli inibitori della colinesterasi 8A; SEM = errore standard della media; SOX9 = fattore di trascrizione SRY-box 9. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

GeneDimensione dell'ampliconePrimer direttoPrimer inverso
(bp)(5'→3')(5'→3')
β-actin113CAGCCCTCCTTCATCGGTATGACATGACGTTGTTGGCGTA
MMP-3108TGTGAGTTGAAGTGGCTCATCCTGTTTGAACACCCGTAAC
MMP-13119GGCTCCTAGGCAAGTACAATGTGTACGCCCATCAGGATAA
SOX985GGAGGAAGTCGGTGAAGAATGCCTTGAAGATGGCGTTG
Aggrecan70TTGATGAGTGCCTTTCAAGCCATGTGAAAGAGTCGATGGC
RIC8A100ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGCTCGATGACAGAGTACTGGTTG
p38 MAPK103TGTTCAAGGTCTCCCACAAGTGCAGCTCCCTTATGATCTG
CircPDE4B174GTCATTTTGCCGAACTCCCCATTATCATCTGCCGTCACTG

Tabella 1: Sequenze dei primer utilizzate per la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa. La tabella elenca i geni bersaglio, le dimensioni previste degli ampliconi e le sequenze dei primer forward e reverse nella direzione 5′ a 3′. Abbreviazioni: bp = paia di basi; circPDE4B = RNA circolare fosfodiesterasi 4B; MAPK = chinasi attivata da mitogeni; MMP-3 = metalloproteasi della matrice 3; MMP-13 = metalloproteasi della matrice 13; RIC8A = resistenza agli inibitori della colinesterasi 8A; SOX9 = fattore di trascrizione SRY-box 9.

Discussione

Questo studio ha valutato gli effetti terapeutici dell'acupotomia in un modello di coniglio di osteoartrite del ginocchio (KOA) e ha identificato un'associazione tra l'espressione di circPDE4B e l'asse di segnalazione della chinasi mitogen-attivata delle proteine p38 (MAPK) RIC8A/p38. L'acupotomia ha migliorato il gonfiore articolare e le alterazioni istopatologiche e ha modificato i marcatori infiammatori e quelli legati al metabolismo della cartilagine a livello sia trascrizionale che proteico.

La riduzione dell'interleuchina-1β, del fattore di necrosi tumorale-α e dell'interleuchina-6 dopo il trattamento con acupotomia è coerente con gli effetti immunomodulatori precedentemente riportati dell'acupotomia21. Queste citochine contribuiscono alla degenerazione della cartilagine promuovendo enzimi degradanti la matrice e inibendo la sintesi della matrice extracellulare22,24,25. Le riduzioni contemporanee della metalloproteina della matrice-3 (MMP-3) e della metalloproteina della matrice-13 (MMP-13) a livello di trascritto e proteico suggeriscono ulteriormente che l'acupotomia sopprime l'attività catabolica associata all'artrosi del ginocchio.

Un risultato notevole è stata l'associazione tra le variazioni indotte dall'acupotomia nell'espressione di circPDE4B e la modulazione della via RIC8A/p38 MAPK. L'attivazione anomala di questa via è associata a infiammazione, stress ossidativo e degradazione della matrice extracellulare. La riduzione dell'espressione di RIC8A e della fosforilazione di p38 MAPK dopo l'acupotomia suggerisce che il trattamento possa contribuire a ripristinare l'equilibrio del segnale all'interno di questa via. Le variazioni coordinate nei marcatori relativi a circPDE4B e alla via RIC8A/p38 MAPK sono coerenti con l'ipotesi che circPDE4B possa funzionare come una struttura molecolare di supporto, come precedentemente proposto26,27. Tuttavia, i risultati attuali sono di tipo correlativo e non dimostrano che circPDE4B medi gli effetti terapeutici dell'acupotomia. Sono necessari studi di perdita e di guadagno di funzione per determinare la causalità.

L'eventuale associazione tra acupotomia e regolazione dei circRNA rappresenta un aspetto importante di questo studio. È stato dimostrato che la stimolazione meccanica influisce sull'espressione dei circRNA in diversi tessuti28,29,30,31. Tuttavia, le evidenze dirette che collegano la stimolazione meccanica indotta dall'acupotomia alla regolazione di circRNA specifici della cartilagine articolare rimangono limitate. La variazione osservata nell'espressione relativa di circPDE4B dopo il trattamento potrebbe riflettere una risposta diretta alla stimolazione meccanica oppure una risposta indiretta alla riduzione dell'infiammazione. Studi futuri che combinino una stimolazione meccanica controllata con manipolazioni specifiche per i condrociti del circPDE4B aiuterebbero a distinguere tra queste due possibilità.

L'acupotomia e il celecoxib hanno prodotto tendenze simili in molti degli esiti misurati, nonostante i loro meccanismi d'azione distinti. Diverse spiegazioni possono giustificare questa convergenza. In primo luogo, entrambi i trattamenti potrebbero agire su percorsi comuni a valle, inclusi l'asse RIC8A/p38 MAPK e la segnalazione del fattore nucleare kappa B. In secondo luogo, le somiglianze osservate potrebbero riflettere caratteristiche comuni della protezione della cartilagine piuttosto che effetti specifici dei percorsi. In terzo luogo, i marcatori selezionati potrebbero rappresentare punti finali condivisi dell'infiammazione e del metabolismo della cartilagine e pertanto potrebbero non essere sufficienti a distinguere tra meccanismi distinti a monte. Un'efficacia simile non implica meccanismi identici, ma suggerisce che entrambi gli interventi possano influenzare componenti comuni della rete patologica dell'osteoartrite26,32,33. Approcci imparziali, come il profilo trascrittomico o proteomico, potrebbero aiutare a definire firme molecolari specifiche del trattamento.

Gli effetti comparabili dell'acupotomia e del celecoxib potrebbero avere anche una rilevanza clinica. L'acupotomia potrebbe offrire un'opzione terapeutica non farmacologica che affronta i fattori meccanici periarticolari, evitando alcuni effetti avversi associati all'uso cronico di farmaci. Tuttavia, questa interpretazione va affrontata con cautela, poiché il modello nel coniglio non riesce a cogliere appieno la complessità della OA umana. Sono necessari ulteriori studi traslazionali e clinici prima che questi risultati preclinici possano sostenere un'applicazione clinica più ampia.

Vanno riconosciute diverse limitazioni. Prima di tutto, l'associazione tra circPDE4B e l'asse RIC8A/p38 MAPK non è stata verificata mediante esperimenti di perdita o guadagno di funzione. In secondo luogo, il modello del coniglio e il periodo di trattamento di 4 settimane limitano le conclusioni riguardo alla malattia umana e agli esiti a lungo termine. In terzo luogo, i saggi molecolari hanno utilizzato sottogruppi relativamente ridotti di animali, il che potrebbe aver limitato il rilevamento di differenze sottili tra i gruppi. In quarto luogo, il pannello di marcatori selezionato potrebbe non distinguere meccanismi regolatori specifici del trattamento. Infine, le risposte simili all'acupotomia e al celecoxib richiedono ulteriori indagini per determinare se i due interventi agiscano attraverso percorsi convergenti o indipendenti.

Conclusione
L'acupotomia ha ridotto il gonfiore articolare, i livelli di citochine infiammatorie, la degenerazione della cartilagine e l'espressione dei marcatori catabolici in un modello murino di artrosi del ginocchio. Questi effetti sono stati associati a modifiche nell'espressione relativa di circPDE4B e alla modulazione dell'asse di segnalazione RIC8A/p38 MAPK. Poiché i risultati attuali sono di tipo correttivo, sono necessari ulteriori studi meccanicistici per determinare se circPDE4B media direttamente gli effetti terapeutici dell'acupotomia.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro descritto in questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (grant no. 81774436), dal Progetto di Trasformazione della Ricerca Clinica della Provincia di Anhui (grant no. 202427b10020136), dal Progetto di Ricerca Scientifica del Dipartimento dell'Istruzione della Provincia di Anhui (grant no. 2023AH050824), dal Programma di Ricerca Sanitaria dell'Anhui (grant no. AHWJ2023A30123) e dal Progetto di Ricerca sull'Innovazione e la Trasmissione dell'Associazione Anhui di Medicina Tradizionale Cinese (grant no. 2024ZYYXH153).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Perossido di idrogeno al 3%Fuzhou Maixin BiotechSP kit-A3Inibisce l'attività della perossidasi endogena durante l'immunohistochemica.
Paraformaldeide al 4%BiosharpBL539AFissa il tessuto cartilagineo prima della decalcificazione e della lavorazione istologica.
Acido aceticoMerckA6283Utilizzato per preparare acido cloridrico all'1% nel 70%
Cerotti adesiviZhejiang RenkangRK-8802Utilizzati dopo l'acupotomia.
Anticorpo anti-aggrecanoProteintech13880-1-APAnticorpo primario utilizzato per rilevare l'aggrecano negli estratti proteici della cartilagine.
Etilene anidroSinopharm Chemical Reagent10009228Utilizzato per la disidratazione del tessuto e la reidratazione delle sezioni durante la lavorazione istologica.
Kit per saggio proteico BCAThermo Fisher ScientificA55860Utilizzato per determinare la concentrazione proteica.
CelecoxibBiochempartnerBCP02156Trattamento farmacologico di riferimento somministrato per gavaggio orale.
CentrifugaAnhui Jiawen InstrumentsJW-3021HRUtilizzata per chiarificare lisati e omogeneati tissutali mediante separazione centrifuga.
CloroformioNanjing Reagent67-66-3Utilizzato per la separazione di fase durante l'estrazione totale di RNA.
Tampone citrato, pH 6,0ZSGB-BIOZLI-9065Utilizzato per il recupero degli antigeni indotto dal calore prima dell'immunohistochemica.
CriotubiNEST Biotechnology607001Utilizzati per lo stoccaggio di campioni congelati
Substrato DABFuzhou Maixin BiotechKit-5230Substrato cromogeno utilizzato per la visualizzazione dei segnali immunohistochemici marcati con HRP.
Acqua trattata con DEPCGeneray BiotechD1007Acqua priva di RNasi utilizzata per la solubilizzazione dell'RNA e procedure di biologia molecolare.
Ago da acupotomia monouso, 0,35 mm × 25 mmMa'anshan Bond Medical EquipmentGB3525RAgo-lama sterile utilizzato per le procedure di acupotomia e acupotomia fittizia.
EDTAbiosharpBL617AUtilizzato per preparare la soluzione di decalcificazione per tessuti contenenti cartilagine.
Substrato chemiluminescente potenziatoThermo 340958340958Utilizzato per visualizzare le bande del Western blot.
Soluzione di eosinaZhuhai BesoBA4022Colorazione di controcolorazione utilizzata nella colorazione ematossilina-eosina.
Soluzione di verde brillanteSolarbioG1371Colorazione di controcolorazione utilizzata nella colorazione Safranina O–Verde brillante.
Anticorpo anti-GAPDHZsbioTA-08Utilizzato come controllo di caricamento nel Western blot ma attualmente non elencato.
Sistema di imaging per gelShanghai Peiqing TechnologyJS-1070PAcquisisce immagini chemiluminescenti del Western blot.
Vetrini microscopici in vetroCITOTEST‌188105Utilizzati per montare le sezioni
Capra anti-topo IgG, coniugato con HRPZSGB-BIOZB-2305Anticorpo secondario coniugato con HRP per anticorpi primari di topo.
Capra anti-coniglio IgG, coniugato con HRPZSGB-BIOZB-2301Anticorpo secondario coniugato con HRP per anticorpi primari di coniglio.
Serum di capraZSGB-BIOZLI-9056Inibisce il legame non specifico degli anticorpi durante l'immunohistochemica.
GraphPad Prism, versione 10GraphPad SoftwareNon applicabileUtilizzato per l'analisi statistica e la preparazione dei grafici.
Soluzione di ematossilinaZhuhai BesoBA4041Colorante nucleare utilizzato per la colorazione ematossilina-eosina e la controcolorazione immunohistochemica.
OmogeneizzatoreWitegSGCR-5-553-722Omogeneizza il tessuto cartilagineo per saggi ELISA e molecolari.
Acido cloridricoMerck7607Utilizzato per preparare acido cloridrico all'1% nel 70%
Software Image LabBio-RadNon applicabileUtilizzato per l'analisi densitometrica delle bande del Western blot.
Image-Pro Plus, versione 6.0Media CyberneticsNon applicabileUtilizzato per l'analisi semiquantitativa dell'intensità della colorazione con Safranina O.
IsopropanoloSinopharm Chemical ReagentSCR40007960Utilizzato per precipitare l'RNA durante l'estrazione totale di RNA.
Microscopio otticoOlympusCX41Utilizzato per esaminare e acquisire immagini di sezioni cartilaginee colorate.
Marker medicoedding497985Utilizzato per marcare i punti di trattamento
MetanoloShanghai Suyi20180427Utilizzato per attivare la membrana PVDF
MicrotomoLeicaRM2016Taglia il tessuto in paraffina in sezioni da 5 µm.
Anticorpo anti-MMP-13Biossbs-0575RAnticorpo primario utilizzato per rilevare la metalloproteinasi della matrice-13.
Anticorpo anti-MMP-3Biossbs-43017RAnticorpo primario utilizzato per rilevare la metalloproteinasi della matrice-3.
Resina neutraWuxi JiangyuanZLI-9516Mezzo di montaggio utilizzato per la preparazione permanente di sezioni tissutali colorate.
Conigli Albini della Nuova Zelanda (maschi, 6 mesi di età, peso 2,0–2,5 kg)Nanjing Pukou District Laifu Breeding FarmSCXK (Su) 2024-0007Animali sperimentali utilizzati per la modellizzazione dell'artrosi del ginocchio e la valutazione del trattamento.
Lama di bisturi n. 23CaissonSCX08-100PCUtilizzata durante il prelievo del campione.
Latte in polvere scrematoGene9999SUtilizzato come reagente di blocco.
Anticorpo anti-p38 MAPKBiossbs-0637RAnticorpo primario utilizzato per rilevare la p38 MAPK totale.
ParaffinaThermo8330Utilizzata per l'inclusione del tessuto
PBSZSGB-BIOZLI-9062Utilizzato per l'omogeneizzazione del tessuto, il lavaggio e la preparazione dei reagenti.
PenicillinaJilin Huamu Animal Health ProductsNon applicabileUtilizzata post-operatoriamente a 40.000 U/kg/giorno
Pentobarbital sodicoBeijing Chemical Reagents61222Utilizzato per l'anestesia al 3%, 30 mg/kg.
Soluzione salina fosfato-tamponebeyotimeST448Utilizzata per l'omogeneizzazione del tessuto e il lavaggio durante l'immunohistochemica.
Soluzione salina fisiologicaservicevioG4702Utilizzata per preparare la sospensione di celecoxib
PMSFBeyotimeST506Inibitore delle proteasi aggiunto al tampone di lisi durante l'estrazione proteica.
Anticorpo anti-p-NF-κBSantasc-136548Anticorpo primario utilizzato per rilevare p-NF-κB nell'analisi immunohistochemica.
Anticorpo anti-p-p38 MAPKBiossbs-5476RAnticorpo primario utilizzato per rilevare la p38 MAPK fosforilata.
PrimeScript RT Reagent Kit con gDNA EraserTaKaRaRR047AUtilizzato per la rimozione del DNA genomico e la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA.
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Membrana utilizzata per il trasferimento proteico durante il Western blot.
Kit ELISA per IL-1β del coniglioJiyinmeiJYM0011RbQuantifica l'interleuchina-1β del coniglio nel campione analizzato.
Kit ELISA per IL-6 del coniglioJiyinmeiJYM0006RbQuantifica l'interleuchina-6 del coniglio nel campione analizzato.
Kit ELISA per TNF-α del coniglioJiyinmeiJYM0003RbQuantifica il fattore di necrosi tumorale-α del coniglio nel campione analizzato.
Sistema di PCR in tempo realeThermo Fisher ScientificPIKOREAL 96Esegue l'amplificazione PCR quantitativa basata sulla fluorescenza.
Anticorpo anti-RIC8ABiossbs-11355RAnticorpo primario utilizzato per rilevare RIC8A.
Tampone di lisi RIPABeyotimeP0013BEstrae le proteine totali dal tessuto cartilagineo.
Soluzione di Safranina OSolarbioG1371Colora i proteoglicani della cartilagine nell'istologia Safranina O–Verde brillante.
Reagenti SDS-PAGE o gel prontiSolarbioS8010Includono percentuale del gel o prodotto.
Anticorpo anti-SOX9Biossbs-4177RAnticorpo primario utilizzato per rilevare SOX9.
SpettrofotometroNanjing Wuyi TechnologyOD1000+Misura la concentrazione e la purezza dell'RNA.
Garza sterileZhendeV505463Utilizzata per la compressione dopo il ritiro dell'ago.
Master Mix SYBR GreenNovoproteinE096-01BReagente fluorescente utilizzato per la PCR quantitativa.
Soluzione salina tampone TrisSolarbioT8060Utilizzata per preparare il tampone di lavaggio e di blocco per il Western blot.
Reagente TRIzolLife Technologies15596018Reagente fenolo–guanidinio utilizzato per l'estrazione totale di RNA.
Tween 20SolarbioT8220Detergente non ionico aggiunto alle soluzioni di lavaggio di soluzione salina tampone Tris e soluzione salina fosfato-tampone.
Soluzione di ematossilina ferroica WeigertMerck1.15973Utilizzata nella colorazione Safranina O–Verde brillante.
XileneSinopharm Chemical Reagent10023428Utilizzato per la deparaffinizzazione e la chiarificazione del tessuto.

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Immunology and InfectionAcupotomyKnee OsteoarthritisCircular RNAcircPDE4BRIC8A p38 MAPK signaling pathway

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