L'agopuntura del cuoio capelluto combinata con l'esercizio induce l'attivazione di PI3K/akt e migliora la plasticità sinaptica nei ratti spastici post-ictus

Sommario

Questo studio mira a indagare gli effetti dell'agopuntura del cuoio capelluto combinata con l'esercizio sulla plasticità sinaptica della corteccia motoria in un modello ratto di spasticità post-ictus dell'arto e a esplorare l'associazione tra l'attività della via PI3K/Akt e gli effetti terapeutici.

Abstract

I trattamenti efficaci per la spasticità post-ictus (PSS) restano limitati e il meccanismo con cui l'agopuntura del cuoio capelluto combinata con l'esercizio fisico (SAE) allevia la PSS non è ancora completamente compreso. Questo studio ha indagato gli effetti della SAE nei ratti con PSS ed ha esplorato se la SAE regola la plasticità sinaptica attraverso la via PI3K/Akt. È stato stabilito un modello di ratto con occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO), e i ratti sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi: Blank, Sham, MCAO, SAE e Baclofen. Tutti gli interventi sono stati somministrati per 7 giorni consecutivi. Sono state quindi valutate la funzione neurologica, il volume dell'infarto cerebrale, l'istopatologia, l'ultrastruttura sinaptica e l'espressione proteica correlata. Rispetto al gruppo MCAO, l'SAE ha migliorato i deficit neurologici, ridotto l'ipertonia muscolare, diminuito il volume dell'infarto, alleviato il danno neuronale, aumentato il numero di sinapsi e migliorato la morfologia sinaptica. SAE ha inoltre aumentato il controllo delle proteine neurotrofiche derivate dalla linea cellulare gliale (GDNF), PI3K fosforilata (p-PI3K), Akt fosforilata (p-AKT) e proteine sinaptiche, tra cui sinaptofisina (SYN), proteina della densità postsinaptica 95 (PSD-95) e proteina associata alla crescita 43 (GAP-43). La colorazione immunofluorescenza ha ulteriormente suggerito una maggiore espressione di SYN e p-Akt nella corteccia motoria dopo il trattamento SAE. Questi risultati suggeriscono che la SAE potrebbe essere correlata all'attivazione della segnalazione PI3K/Akt tramite la regolazione all'alto della GDNF, migliorando così la plasticità sinaptica e alleviando i sintomi della PSS. Questo studio ha indagato gli effetti della SAE nei ratti con PSS ed ha esplorato la possibile associazione tra intervento SAE, attività delle vie PI3K/Akt e plasticità sinaptica.

Introduzione

L'infarto cerebrale rimane una delle principali cause di morte e disabilità a livello mondiale. Ischemia e ipossia danneggiano i neuroni, interrompono l'equilibrio eccitazione-inibizione nei circuiti motori e portano a disfunzioni^{motorie 1}. La spasticità post-ictus si manifesta in aumento del tono muscolare e ridotta mobilità articolare, che compromette le attività quotidiane e aumenta il carico per il^{caregiver 2}. Sebbene agenti antispastici come il baclofen possano fornire un sollievo temporaneo dei sintomi, l'uso prolungato può portare a tolleranza al farmaco e effetti avversi, e non ripristina la funzione neurale^{compromessa 3}. La riabilitazione motoria convenzionale è inoltre limitata da un aumento lento del beneficio e dalla durata prolungata del trattamento. Pertanto, sono urgentemente necessarie strategie terapeutiche più sicure ed efficaci, e i meccanismi sottostanti richiedono ulteriori indagini. La neuroplasticità è un meccanismo centrale del recupero funzionale post-ictus e coinvolge il rimodellamento sinaptico, la rigenerazione assonale e la sopravvivenza^{neuronale 4}. Dopo un ictus ischemico, i neuroni nel nucleo dell'infarto subiscono una morte rapida, mentre le risposte infiammatorie locali aggravano il danno tissutale nella penumbra ischemica; Insieme, questi processi causano lesioni^{cerebrali 5,6}. La plasticità sinaptica, componente chiave della neuroplasticità, può essere valutata da proteine correlate alla sinapsi, inclusi marcatori presinaptici come la sinaptofisina (SYN) e la proteina associata alla crescita 43 (GAP-43), così come la proteina della densità postsinaptica 95 (PSD-95)^7,8,9.

I fattori neurotrofici forniscono una base molecolare per la plasticità sinaptica. Il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF) è particolarmente importante perché promuove la sopravvivenza e la riparazione neuronale, sopprime l'infiammazione e migliora il microambiente^{sinaptico 10}. Legandosi al recettore Ret, il GDNF può attivare la segnalazione PI3K/^{Akt 11}. La cascata PI3K/Akt è una via principale a favore della sopravvivenza nel sistema nervoso, e la sua attivazione inibisce l'apoptosi mentre supporta la sintesi proteica necessaria per il rimodellamento^{sinaptico 12,13}. L'agopuntura del cuoio capelluto combinata con l'esercizio fisico (SAE) è una strategia di riabilitazione integrativa che combina la stimolazione dell'agopuntura del cuoio capelluto con l'allenamento motorio attivo. L'obiettivo generale di questo metodo è modulare contemporaneamente l'attività neurale centrale e promuovere il recupero motorio legato al compito, riducendo così l'ipertonia muscolare e migliorando i risultati funzionali dopo l'ictus. La SAE è ampiamente utilizzata in Cina per il trattamento della spasticità post-ictus (PSS). La motivazione di questo approccio combinato è che l'agopuntura del cuoio capelluto può modulare l'eccitabilità corticale e la perfusione cerebrale, mentre la terapia dell'esercizio fisico fornisce un allenamento motorio dipendente dall'attività che promuove il recupero funzionale e il rimodellamento sinaptico. Rispetto alla sola terapia dell'esercizio, le evidenze cliniche precedenti hanno dimostrato che l'agopuntura del cuoio capelluto nei punti del cuoio capelluto combinata con la terapia da esercizio riduce ulteriormente la spasticità degli arti e migliora la funzione motoria e le attività della vita quotidiana nei pazienti con spasmo post-ictus^{dell'arto 14}.

Una recente revisione sistematica e meta-analisi ha inoltre suggerito che l'agopuntura del cuoio capelluto in stile movimento o interventi concomitanti di agopuntura-esercizio offrono miglioramenti maggiori nella spasticità, nella funzione motoria, nell'equilibrio e nelle attività della vita quotidiana rispetto agli interventi monocomponenti o sequenziali, supportando il potenziale vantaggio della neuromodulazione concomitante e dell'allenamento^{motorio 15}. Studi preclinici hanno dimostrato che i protocolli di agopuntura del cuoio capelluto in stile SAE o in stile movimento correlato possono migliorare il flusso sanguigno cerebrale e attenuare la spasticità attraverso la riattivazione spinale KCC2 mediata dal recettore^{5-HT₂A 16,17}. Uno studio recente suggerisce inoltre che l'agopuntura promuove la neuroplasticità tramite la segnalazione PI3K/^{Akt 18}. Pertanto, l'SAE può essere particolarmente adatta in contesti sperimentali e clinici in cui la modulazione della plasticità neurale post-ictus, il recupero motorio e la riduzione della spasticità sono obiettivi terapeutici chiave. Tuttavia, la possibile associazione tra SAE, segnalazione GDNF/PI3K/Akt e plasticità sinaptica nell'alleviamento del PSS rimane poco compresa. Il presente studio ha stabilito un modello di PSS su ratto per valutare gli effetti della SAE su deficit neurologici e spasticità muscolare, e per caratterizzare i cambiamenti nell'espressione del GDNF, nell'attività della via PI3K/Akt e nelle proteine correlate alla plasticità sinaptica dopo l'intervento. Questo studio potrebbe fornire prove sperimentali per determinare se la SAE sia una strategia riabilitativa appropriata per la PSS e per chiarire il suo potenziale meccanismo d'azione.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Approvazione n. 20251038) e sono state condotte in conformità con le linee guida Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0) nonché con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono mostrati nella Tabella dei Materiali.

Procedure sperimentali
Animali sperimentali e raggruppamento
Ottanta maschi maschi specifici di Sprague–Dawley (SPF) (220–250 g) sono stati acquistati dalla Hongda Animal Breeding Farm (Distretto di Kuancheng, Changchun, Cina). Gli animali venivano ospitati presso il Centro Sperimentale per Animali dell'Università di Medicina Cinese di Changchun in condizioni controllate di 22–25 °C, umidità relativa del 50–60% e un ciclo di 12 ore di luce/oscurità, con libero accesso a cibo e acqua. Dopo 1 settimana di acclimatazione, i ratti sono stati assegnati casualmente a un gruppo vuoto (n = 12), un gruppo Sham (n = 12) e un gruppo modello-riserva (n = 56). Il gruppo blank è stato incluso come controllo normale e non trattato per fornire valori di base per la performance comportamentale, le caratteristiche istopatologiche e l'espressione dei marcatori molecolari nei ratti sani. Il gruppo Sham ha subito la stessa anestesia ed esposizione chirurgica del gruppo MCAO, tranne che non è stata eseguita l'occlusione arteriosa; Pertanto, questo gruppo fungeva da controllo per i potenziali effetti dell'anestesia e della manipolazione chirurgica. L'inclusione sia dei gruppi Blank che di Sham ha permesso di distinguere gli effetti della lesione ischemica da quelli relativi alla procedura chirurgica stessa.

Il gruppo modello-riserva fu sottoposto a modellazione MCAO. I primi 3 giorni dopo l'intervento sono stati definiti come periodo di induzione del modello. Durante questo periodo, 8 ratti su 56 morirono, corrispondente a un tasso di mortalità del 14,29%, e 12 ratti furono esclusi perché la modellizzazione non ebbe successo. I restanti 36 ratti con successo nell'istituzione del modello sono stati assegnati casualmente, utilizzando una tabella dei numeri casuali, ai gruppi MCAO, SAE e Baclofen, con 12 ratti in ciascun gruppo. Gli interventi di gruppo erano i seguenti: (I) Gruppo bianco: solo alimentazione di routine, senza intervento. (II) Gruppo fittizio: esposizione chirurgica dell'arteria carotide comune, delle arterie carotide interne ed esterne, e del nervo vago, senza legatura o inserimento di filamenti. (III) Gruppo MCAO: MCAO è stato stabilito sotto anestesia intraperitoneale con pentobarbital sodio al 3%, senza trattamento successivo. (IV) Gruppo SAE: dopo una modellazione e validazione MCAO di successo, i ratti hanno ricevuto agopuntura del cuoio capelluto combinata con esercizio fisico. L'anestesia per inalazione di isoflurano all'1,5%–2,0% è stata utilizzata solo durante la breve fase di inserimento dell'ago. L'addestramento sul tapis roulant è stato avviato solo dopo il pieno recupero della coscienza e il recupero della capacità di camminare spontaneamente. L'agopuntura è stata eseguita a GV20 e bilaterale EX-HN1. Gli aghi venivano inseriti fino a una profondità di 1 mm e mantenuti durante il periodo di addestramento sul tapis roulant. Il periodo standardizzato di 30 minuti per la ritenzione/addestramento con il ferro è stato definito come il periodo di addestramento sul tapis roulant e consisteva in 6 m/min per 10 minuti, seguiti da 12 m/min per 20 minuti con inclinazione 0°. L'intervento è stato somministrato una volta al giorno per 7 giorni consecutivi. (V) Gruppo Baclofene: dopo una modellazione e validazione MCAO riuscite, i ratti hanno ricevuto baclofene tramite gavage intragastrico a 0,4 mg/kg una volta al giorno per 7 giorni consecutivi.

Istituzione del modello MCAO
Il modello MCAO del ratto è stato stabilito utilizzando un metodo modificato del filamento^{intraluminale 19}. Dopo 12 ore di digiuno e privazione d'acqua, i ratti sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 3% e posizionati in posizione supina. Dopo la disinfezione cutanea, è stata realizzata un'incisione cervicale mediana per esporre l'arteria carotide comune destra (CCA) e i nervi e i muscoli adiacenti. L'arteria carotide esterna (ECA) è stata identificata e legata, mentre l'arteria carotide interna (ICA) è stata isolata. Sono state posizionate delle legature all'ICA e CCA prossimali, e la CCA distale è stata temporaneamente clampata. È stata quindi eseguita una piccola arteriotomia nel CCA prossimale alla pinza. Un filamento di nylon da 0,26 mm fu inserito e avanzato di 18–20 mm attraverso l'ICA per occludere l'origine dell'arteria cerebrale media. L'ICA e il CCA sono stati successivamente legati e l'incisione è stata suturata. Dopo l'intervento, i ratti venivano tenuti al caldo durante il recupero e ricevevano un'iniezione intraperitoneale di penicillina (40.000 U) per prevenire infezioni. Nel gruppo Sham è stata eseguita solo l'esposizione vascolare, senza inserimento di filamento; la chiusura della ferita e le cure post-operatorie erano identiche a quelle del gruppo MCAO. L'istituzione con successo del modello è stata definita come un punteggio Zea Longa ≥ 2 3 giorni dopo l'intervento¹⁹ e un punteggio modificato della Scala Ashworth (MAS) del tono muscolare ≥ Grado^{1 20}.

Metodi di intervntion
L'agopuntura al cuoio capelluto si combina con l'intervento di esercizio fisico
Studi precedenti mostrano che nei ratti MCAO i deficit neurologici raggiungono il picco al terzo giorno e rimangono elevati entro 10 giorni dall'intervento, mentre la resistenza muscolare periferica aumenta progressivamente dal giorno 6 al giorno^{9 del 21}. Pertanto, il trattamento è stato avviato al terzo giorno post-operatorio e proseguito una volta al giorno per 7 giorni consecutivi al minimizzare l'impatto del recupero spontaneo. Prima della modellazione, i ratti assegnati al gruppo SAE hanno seguito 3 giorni di addestramento su tapis roulant adattivo a 5 m/min per 10 min/giorno²². Questo addestramento adattivo veniva utilizzato per familiarizzare i ratti con la corsa sul tapis roulant e per ridurre la probabilità di lottare, cadere, rifiutarsi di correre o fermarsi durante il periodo formale di intervento. Durante l'addestramento adattivo e l'intervento formale, gli eventi anomali legati al tapis roulant sono stati definiti come lotta persistente, cadute dalla corsia di corsa, rifiuto di correre per più di 1 minuto o fermarsi per più di 1 minuto durante l'allenamento sul tapis roulant. Questi eventi sono stati registrati nei registri sperimentali quando sono stati osservati. Esitazioni brevi o fermate temporane non portavano all'esclusione se si poteva riprendere la corsa sul tapis roulant dopo un leggero stimolo. I dati venivano esclusi solo se un animale non riusciva a completare la sessione giornaliera assegnata sul tapis roulant a causa di cadute ripetute, rifiuto persistente di correre o grave disagio. Dopo la validazione del modello con successo al terzo giorno, l'intervento SAE è stato somministrato una volta al giorno per 7 giorni consecutivi.

Per ogni sessione di trattamento, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano dall'1,5%–2,0%. L'anestesia è stata interrotta immediatamente dopo l'inserimento dell'ago. Nella pratica sperimentale, i ratti riacquistavano tipicamente piena coscienza entro circa 1–2 minuti dall'astinenza dell'isoflurano. L'addestramento sul tapis roulant non è stato iniziato mentre i ratti erano anestetizzati. I punti di agopuntura sono stati individuati da agopuntori animali esperti secondo la Nomenclatura e la Localizzazione dei Punti di Agopuntura Comuni negli Animali Sperimentali pubblicata dall'Associazione Cinese di Agopuntura-Moxibustion nel 2020. GV20 è stato definito come il punto medio della linea che collega le fontanelli anteriori e posteriori sulla linea mediana cranica. I punti bilaterali EX-HN1 erano posizionati lateralmente di 2 mm rispetto a GV20. Aghi usa e getta di 0,25 mm × 13 mm venivano inseriti verticalmente fino a una profondità di 1 mm e mantenuti durante il periodo standardizzato di addestramento su tapis roulant di 30 minuti. Gli aghi venivano fissati con nastro medico traspirante per evitare lo spostamento e la penetrazione del cranio veniva esclusa tramite palpazione per garantire la coerenza procedurale. La posizione dell'ago e la fissazione del nastro venivano controllate prima dell'allenamento sul tapis roulant, durante brevi pause se si verificavano comportamenti di corsa anomali e immediatamente dopo il completamento dell'addestramento. Inoltre, la posizione dell'ago veniva controllata visivamente ogni 5 minuti durante l'addestramento sul tapis roulant, indipendentemente dal comportamento animale. Lo spostamento dell'ago era definito come allentamento visibile, cambiamento dell'angolo dell'ago, ritiro parziale o completo spostamento durante la corsa sul tapis roulant. Se si verificava un leggero allentamento senza perdita della posizione dell'ago, il nastro veniva delicatamente rinforzato mentre il tapis roulant veniva brevemente fermato. Se un ago veniva parzialmente ritirato o completamente spostato, l'ago non veniva reinserito durante quella sessione; Il ratto completò l'addestramento rimanente sul tapis roulant senza ulteriori manipolazioni con l'ago, e l'evento fu documentato nel registro sperimentale. Gli animali non sono stati esclusi solo a causa di un singolo evento di spostamento di ago, a meno che l'evento non sia stato accompagnato da un'impossibilità di completare l'addestramento sul tapis roulant o da segni di grave disagio.

Il periodo standardizzato di 30 minuti di ritenzione/addestramento con aghi iniziava quando il ratto iniziava a correre sul tapis roulant dopo il completo recupero dall'anestesia isoflurano e terminava immediatamente dopo il completamento dell'addestramento sul tapis roulant, quando gli aghi venivano rimossi. Il breve intervallo di recupero dopo la sospensione dell'isoflurano non è stato incluso nel periodo di addestramento standardizzato di 30 minuti. Poiché gli aghi venivano inseriti prima del recupero, il tempo fisico effettivo di permanenza era circa 1–2 minuti più lungo rispetto al periodo di allenamento sul tapis roulant di 30 minuti. Questa definizione è stata applicata in modo coerente a tutti i ratti del gruppo SAE. Un ratto era considerato sufficientemente guarito per iniziare l'addestramento sul tapis roulant quando erano soddisfatti i seguenti criteri: piena recuperazione della coscienza, capacità di stare in piedi in modo indipendente, capacità di camminare con fermezza su una superficie piana e risposta normale a una stimolazione esterna delicata. Questi criteri venivano controllati prima di essere messi sul tapis roulant.

Durante la ritenzione degli aghi, i ratti hanno eseguito esercizi sul tapis roulant a inclinazione 0°: 6 m/min per 10 minuti, seguiti da 12 m/min per 20 minuti. Non è stato utilizzato scosso elettrico in nessun momento dello studio. Se un ratto smetteva di correre o si rifiutava di correre per più di 1 minuto durante l'addestramento formale, veniva utilizzata una stimolazione uditiva gentile e non avversiva, come un leggero tocco sulla parete del tapis roulant, per incoraggiare il movimento. L'uso di tale stimolo, così come eventuali difficoltà, cadute, arresti, rifiuti di correre o spostamenti dell'ago, sono stati documentati nel registro sperimentale quando osservati. Questi eventi sono stati monitorati descrittivamente e documentati nel registro sperimentale quando osservati. L'intensità dell'esercizio è stata adeguata in modo completo sulla base dei protocolli precedentemente riportati che combinavano agopuntura del cuoio capelluto con allenamento su tapis^{roulant 16,23}. L'intervento SAE è stato somministrato una volta al giorno per 7 giorni consecutivi (Figura 1A).

Intervento con baclofeno
Dopo la validazione del modello con successo, i ratti del gruppo Baclofene hanno ricevuto una soluzione di baclofene tramite gavage intragastrico a una dose di 0,4 mg/kg. Il farmaco veniva somministrato una volta al giorno alle 9:00 per 7 giorni consecutivi.

Risultato medio
Osservazione generale
Le condizioni generali venivano monitorate quotidianamente in tutti i gruppi, inclusi peso corporeo, stato mentale, assunzione di cibo e acqua, e attività spontanea.

Valutazione della funzione neurologica e del tono muscolare
I deficit neurologici e la spasticità degli arti sono stati valutati nei giorni 1, 3, 5 e 7 dopo la validazione del modello utilizzando il punteggio Zea Longa, il rilevamento neurologico modificato (mNSS) e la scala di Ashworth modificata. Tutte le valutazioni comportamentali in tutti i momenti sono state condotte indipendentemente da due ricercatori che sono stati ciechi sull'allocazione dei gruppi durante tutto il periodo di osservazione. Sono mostrati criteri di punteggio dettagliati (Tabelle 1–3).

Determinazione del volume dell'infarto cerebrale
Il volume dell'infarto cerebrale è stato valutato utilizzando la colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Dopo 7 giorni di intervento, tre ratti di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente e soppressi con overdose intraperitoneale di pentobarbital sodico, seguita da una rapida decapitazione per la raccolta dell'intero cervello. I cervelli venivano prima congelati a −20 °C e poi tagliati in sezioni coronali spesse 2 mm. Le sezioni sono state incubate in una soluzione TTC al 2% a 37 °C per 30 minuti al buio, poi fissate durante la notte in paraformaldeide al 4% a 4 °C. Il giorno seguente, tutte le sezioni furono fotografate con una fotocamera digitale. Il tessuto cerebrale normale era colorato di rosso scuro, mentre il tessuto infartto appariva bianco pallido. Le aree dell'infarcto sono state quantificate con ImageJ, e il volume dell'infarto è stato espresso come percentuale usando la formula:

Volume dell'infarto (%) = area dell'infarto / area totale della sezione cerebrale X 100%.   (1)

Esame istopatologico del tessuto cerebrale
Colorazione di ematossilina–eosina (HE)
La colorazione di ematossilina ed eosina è stata utilizzata per valutare i cambiamenti istopatologici nella corteccia peri-infarcta. Dopo 7 giorni di intervento, i ratti sono stati soppressi per overdose intraperitoneale di pentobarbital sodico. È stata quindi eseguita una rapida perfusione transcardica con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 0,01 M per rimuovere il sangue, seguita da 250 mL di paraformaldeide fredda al 4% (4 °C) per la fissazione. Sono stati raccolti cervelli interi e il tessuto corticale peri-infartito è stato isolato e fissato al 4% di paraformaldeide a 4 °C per 24 ore. I tessuti erano incorporati nella paraffina e sezionati coronalmente a 5 μm. Le sezioni venivano montate su slide, cotte a 60 °C per 30 minuti e deparafinizzate in xilene I–III (10 minuti ciascuna). Successivamente veniva eseguita la colorazione HE, seguita da disidratazione e pulizia del prodotto. Infine, le sezioni venivano coperte con balsamo neutro e le immagini venivano acquisite con un microscopio luminoso Nikon.

Colorazione Nissl
La colorazione con Nissl è stata utilizzata per valutare la sopravvivenza neuronale e la densità corporea di Nissl nella regione peri-infartita. Dopo 7 giorni di intervento, i ratti sono stati soppressi e perfusi transcardicamente con 0,01 M PBS (37 °C), seguiti da 250 mL di paraformaldeide al 4% (4 °C). Sono stati rimossi interi cervelli e i tessuti corticali peri-infarti e controlaterali sono stati dissezionati e fissati durante la notte con paraformaldeide al 4% a 4 °C. Dopo l'immersione della paraffina, furono preparate sezioni da 5 μm. Le sezioni sono state deparafinizzate in xilene per 10 minuti, reidratate tramite una serie di soluzioni etanoliche gradate (95%, 90%, 80%, 70% e 50%; 5 minuti per ogni concentrazione), e colorate con soluzione di lavoro Nissl per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo un breve risciacquo con acqua distillata, le sezioni venivano disidratate con etanolo classificato, pulite nello xilene per 2 minuti e infine montate con coperture. Le immagini venivano catturate e analizzate al microscopio ottico.

Analisi del Western blot sull'espressione proteica
Il Western blotting è stato eseguito per valutare le proteine coinvolte nella segnalazione PI3K/Akt e nella plasticità sinaptica. Dopo 7 giorni di intervento, i ratti sono stati eutanasiati con un'overdose di pentobarbital sodico, e è stato raccolto tessuto della corteccia motoria peri-infarcto. I tessuti sono stati completamente omogeneizzati con il tampone di lisi a radioimmunoprecipitazione (RIPA) su ghiaccio e centrifugati a 1610 × g a 4 °C per 30 minuti per estrarre la proteina totale. La concentrazione proteica è stata quantificata utilizzando un kit commerciale di analisi proteica con acido bicinconinico (BCA). Quantità uguali di proteine (50 μg per corsia) sono state separate tramite elettroforesi in gel di dodecil solfato di sodio-poliacrilamide (SDS-PAGE) e trasferite elettricamente alle membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF). Le membrane sono state bloccate con una soluzione di albumina sirica al 5% (BSA) per 1 ora a temperatura ambiente per eliminare il legame aspecifico, quindi incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Dopo tre cicli di lavaggio con soluzione salina Tris-buffer con Tween-20 (TBST), le membrane sono state incubate con anticorpi secondari (rapporto di diluizione 1:1000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando la chemiluminescenza potenziata (ECL), e l'intensità della banda è stata quantificata con ImageJ. L'espressione relativa della proteina è stata calcolata come il rapporto tra la proteina target e il controllo interno. Gli anticorpi primari erano i seguenti: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), fosfo-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), fosfo-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) e GDNF (1:1000).

Osservazione dell'ultrastruttura sinaptica
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per valutare il numero di sinapsi e l'integrità strutturale. Dopo 7 giorni di intervento, i ratti sono stati anestetizzati e perfusi transcardicamente con un fissativo misto contenente il 4% di paraformaldeide e il 2,5% di glutaraldeide. Blocchi corticali peri-infartiti (1 mm × 1 mm × 1 mm) sono stati raccolti e fissati nel glutaraldeide al 2,5% per 2 ore, seguiti da post-fissazione con tetrossido di osmio all'1% per 1 ora. I campioni sono stati poi processati con disidratazione con etanolo graduato, incastramento in resina epossidica, sezioni ultrasottili (spessore 50 nm) e doppia colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo. L'ultrastruttura sinaptica è stata esaminata utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione. Le immagini sono state acquisite a 8.000× per la valutazione strutturale e le sinapsi sono state contate a 5.000×. Tre campi neuropil casuali per gruppo sono stati analizzati per calcolare il numero medio di sinapsi e i dati sono stati confrontati utilizzando ANOVA unidirezionale.

Saggio di doppia marcatura per immunofluorescenza
È stata eseguita una colorazione con doppia marcatura immunofluorescenza per valutare l'espressione e la distribuzione di SYN e p-Akt nella corteccia peri-infarcta. Dopo 7 giorni di intervento, i ratti sono stati eutanasiati tramite overdose intraperitoneale di pentobarbital sodico, e il tessuto corticale peri-infarto è stato rapidamente dissezionato. I campioni sono stati fissati nel paraformaldeide al 4% per 24 ore, incorporati in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e tagliati in sezioni spesse 10 μm. Le sezioni sono state asciugate all'aria a temperatura ambiente per 1 ora e lavate tre volte con il tampone TBST per rimuovere il residuo di composto OCT. Le sezioni sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,3% per 20 minuti a temperatura ambiente, sciacquate con PBS e bloccate con soluzione al 5% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente. In condizioni di buio, le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari anti-SYN del coniglio (diluizione 1:200) e anti-p-Akt del coniglio (diluizione 1:200). Il giorno successivo, le sezioni sono state lavate tre volte con PBS e incubate al buio con anticorpi secondari (diluizione 1:400) per 50 minuti a temperatura ambiente. Dopo altri sei lavaggi con tampone TBST, i nuclei cellulari sono stati controcolorati con una soluzione operativa 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti a temperatura ambiente. Le immagini sono state acquisite con impostazioni identiche di esposizione e sfondo utilizzando un microscopio a fluorescenza. Sono state utilizzate immagini rappresentative per valutare i modelli di espressione di SYN e p-Akt nella corteccia motoria tra i gruppi.

Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism 10.1.2 e IBM SPSS Statistics 25. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). I dati comportamentali raccolti in più momenti, inclusi il punteggio Zea Longa, il Neurological Severity Score modificato e la scala di Ashworth modificata, sono stati analizzati utilizzando un ANOVA a due vie con misure ripetute a due vie con il gruppo come fattore tra i soggetti e il tempo come fattore all'interno dei soggetti. Quando sono stati rilevati effetti principali o interazioni significative, il test di confronto multiplo di Sidack è stato utilizzato per l'analisi post hoc. Altri dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronti multipli di Sidack per i confronti post hoc. Un p. < a due code di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Nei grafici a barre, la significatività statistica è indicata da asterischi come definito nelle legname corrispondenti.

Risultati

La SAE migliora la funzione neurologica e riduce la spasticità muscolare nei ratti PSS
Gli effetti terapeutici della SAE sulla disfunzione comportamentale nei ratti con spasticità post-ictus sono stati valutati utilizzando il punteggio Zea Longa, il Neurological Severity Score modificato e la scala di Ashworth modificata nei giorni 1, 3, 5 e 7 dopo la validazione del modello (n = 12 per gruppo). Il punteggio Zea Longa e l'mNSS sono stati utilizzati per valutare i defi...

Discussione

Studi clinici precedenti hanno dimostrato che l'agopuntura del cuoio capelluto combinata con l'esercizio fisico può alleviare i sintomi spastici nei pazienti con spasticità post-ictus, migliorando al contempo la funzione motoria e le attività della vita quotidiana (ADL^)14,24. Questi risultati ne confermano il valore clinico. Il presente studio ha inoltre confermato il beneficio terapeutico della SAE in un modello ratto utilizzand...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor