Un modello di enterocolite accelerata da Piroxicam in topi knockout con interleucina-10 per studiare alterazioni metaboliche indotte dall'infiammazione

Sommario

Questo protocollo utilizza piroxicam per accelerare lo sviluppo della colite nel modello murino knockout con interleucina (IL-10). Il protocollo garantisce la sincronizzazione della colite, risultando in risultati rigorosi e riproducibili indipendentemente dal sesso, dalla tensione di fondo o dalle condizioni del vivario. Serve come modello utile per studiare le alterazioni metaboliche durante l'infiammazione intestinale.

Abstract

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è un disturbo infiammatorio cronico del tratto digestivo che colpisce oltre 10 milioni di persone in tutto il mondo. Sebbene ricerche sostanziali si siano concentrate sui meccanismi immunologici e sulle conseguenze alla base della IBD, si sa meno su come l'infiammazione mucosa contribuisca alla disregolazione metabolica, inclusa la perdita di peso e la riduzione dell'appetito. Qui, gli autori descrivono un modello murino di enterocolite accelerata da piroxicam in topi con interleucina-10-knockout (IL-10-KO) per studiare la disregolazione metabolica indotta dall'infiammazione. I topi IL-10-KO sono noti per sviluppare enterocolite spontanea e una maggiore suscettibilità all'enterocolite scatenata da infezioni o farmaci. Tuttavia, condizioni di vivario e background di ceppo sono state segnalate come fattori di confusione nello sviluppo della colite in questo modello. Il Piroxicam, un farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS), è stato dimostrato di scatenare o accelerare l'enterocolite nei modelli animali aumentando l'esposizione mucosa ai batteri luminali. In questo protocollo, maschi e femmine di topi IL-10-KO sono stati nutriti con una dieta fortificata con piroxicam al posto di una dieta alimentare regolare. L'apporto alimentare e il peso corporeo sono stati misurati quotidianamente per riflettere alterazioni metaboliche dell'intero corpo, insieme a manifestazioni cliniche di enterocolite come diarrea e sanguinamento rettale. Il protocollo è efficiente e riproducibile, inducendo enterocolite simultaneamente in più topi e consente la valutazione della disregolazione metabolica in un modello di malattia infiammatoria intestinale. Ulteriori studi che utilizzano questo protocollo potrebbero indagare gli effetti dell'enterocolite su altri componenti della disregolazione metabolica, come il dispendio energetico e la composizione corporea, rivelando connessioni più ampie tra la malattia infiammatoria intestinale e il metabolismo dell'ospite.

Introduzione

Il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, conosciute collettivamente come malattia infiammatoria intestinale (IBD), sono disturbi autoimmuni cronici del tratto gastrointestinale caratterizzati da infiammazione mucosa con manifestazioni cliniche che includono dolore addominale, perdita di peso, ematochezia e diarrea. La MII colpisce milioni di individui in tutto il mondo, con la più alta prevalenza nelle società^{occidentalizzate 1}. Negli Stati Uniti, si stima che oltre 3 milioni di persone siano^{colpite 2,3}, con un aumento dell'incidenza e della prevalenza, in particolare tra bambini e giovani ^4,5.

I meccanismi esatti alla base della patogenesi dell'IBD restano incompletamente compresi, ma si ritiene ampiamente che la malattia derivi da una risposta immunitaria esagerata al microbiota intestinale negli individui geneticamente suscettibili. Le citochine che modulano le risposte infiammatorie svolgono ruoli fondamentali nel mantenimento dell'omeostasi intestinale e nello sviluppo della IBD. Tra queste, l'interleucina-10 (IL-10) è una citochina antinfiammatoria ben studiata che aiuta a mantenere l'omeostasi immunologica nell'uomo regolando sia i bracci innati che adattivi della risposta^{immunitaria 6,7}. In particolare, polimorfismi in IL-10 e nel suo recettore (IL-10RA/B) sono stati identificati in neonati con IBD A ESORDIO MOLTO PRECOCE (VEO-IBD), che si manifestano classicamente con malattia perianale nei primi mesi di^vita. Questa associazione è ulteriormente supportata dal sequenziamento su larga scala dell'esoma di pazienti adulti con morbo di Crohn, che ha identificato l'IL-10RA come un luogo di suscettibilità alla malattia nella^{IBD non monogenica 9}. Inoltre, è stata descritta in pazienti con VEO-IBD un percorso non genetico che coinvolge anticorpi neutralizzanti IL-10, sottolineando ulteriormente l'importanza di questo percorso nel mantenimento dell'omeostasi immunitaria^{mucosa 10}.

Basandosi su studi umani che implicano l'IL-10 nella IBD, sono stati sviluppati topi interleuchina-10-knockout (IL-10-KO) come modello per studiare il ruolo dell'IL-10 nella IBD. I topi IL-10-KO sono noti per sviluppare enterocolite spontanea con una risposta Th1 esagerata di CD4+ agli stimoli, tipicamente a partire dalle 8 alle 12 settimane di¹¹ anni. Tuttavia, lo sviluppo di enterocolite spontanea nei topi IL-10-KO può essere imprevedibile in assenza di un agente^accelerante 12,13,14, a seconda del ceppo genetico, della composizione microbiota e delle condizioni ^{abitative 15,16}. L'uso di un protocollo affidabile per indurre la colite è fondamentale affinché il modello IL-10-KO sia praticamente utile. Studi precedenti hanno utilizzato farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) come il piroxicam per indurre l'enterocolite nei topi IL-10-KO^17,18. Tuttavia, questi studi si sono concentrati principalmente sulle alterazioni immunologiche, con relativamente poca attenzione agli effetti dell'enterocolite sul metabolismo o sul ruolo del sesso nella gravità della^{colite 19}. Gli autori qui descrivere l'uso di una dieta fortificata con piroxicam per indurre l'enterocolite nei topi IL-10-KO e caratterizzano la disregolazione metabolica e le risposte infiammatorie mucose in questo modello utilizzando sia topi maschi che femmine. Questo protocollo misura il peso corporeo e l'assunzione alimentare per riflettere alterazioni metaboliche dell'intero corpo, così come manifestazioni cliniche della colite e cambiamenti istologici e trascrittomici che riflettono l'infiammazione mucosa. Questo modello efficiente e riproducibile fornisce uno strumento prezioso per indagare la connessione tra IBD e metabolismo dell'ospite.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il University of Texas Southwestern Medical Center, in conformità con la "Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio" [Numero di Approvazione: 2017-102011]. L'eutanasia è stata effettuata secondo le linee guida istituzionali. Non è stata necessaria l'anestesia per le procedure eseguite. I dettagli specifici dei materiali sono descritti nella Tabella dei Materiali.

1. Stabilimento del modello di enterocolite accelerata con piroxicam nei topi IL-10-KO

1. Mantenere topi IL-10-KO in una struttura specifica priva di patogeni (SPF) durante un ciclo di luce di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.
2. Ospitano singolarmente topi di 7–8 settimane, di età e sesso abbinati, in gabbie microisolatore. Permettere ai topi di abituarsi a un singolo alloggio e alla gestione quotidiana per almeno una settimana prima dell'inizio dell'esperimento.
   NOTA: Assicurati che il peso corporeo sia >20 g per i maschi o >17 g per le femmine, e che i topi siano privi di ferite da combattimento.
3. Assegnare i topi a un gruppo sperimentale e a un gruppo di controllo. Per il gruppo sperimentale, sostituire il cibo standard con cibo fortificato con piroxicam. Per il gruppo di controllo, fornire cibo standard fresco. Aggiungi 50 g di chow a ogni hopper della gabbia.
   NOTA: Assegna almeno cinque topi per sesso a ciascun gruppo. Il cibo fortificato con piroxicam (200 ppm) è stato preparato da Teklad utilizzando piroxicam fornito dagli investigatori per la produzione di una dieta personalizzata per animali da laboratorio. Per minimizzare la variabilità da lotto a lotto, si raccomanda che tutti gli animali all'interno di un dato esperimento ricevano cibo dallo stesso lotto di produzione. Quando possibile, lo stesso lotto dovrebbe essere utilizzato anche in esperimenti per migliorare la riproducibilità.

2. Monitoraggio del peso corporeo e del comportamento alimentare

1. Utilizzando una bilancia analitica, registra il peso corporeo di ogni topo. Pesa ogni topo singolarmente alla stessa ora ogni giorno, ogni giorno per 7 giorni consecutivi. Riporta il peso corporeo giornaliero come percentuale del peso di base al giorno 0 (impostato al 100%).
   NOTA: Una perdita di peso superiore al 20% indica uno stress eccessivo e un rischio di morte imminente. I topi dovrebbero essere soppressi se questa soglia viene raggiunta.
2. Utilizzando una bilancia analitica, registra il peso iniziale del cibo fortificato con piroxicam e quello standard in ogni gabbia.
3. Poi, misura il cibo rimanente in ogni hopper a gabbia alla stessa ora ogni giorno, ogni giorno per 7 giorni consecutivi.
4. Calcola il consumo giornaliero di chow sottraendo il peso giornaliero del cibo residuo del giorno precedente.
   NOTA: Controlla regolarmente la quantità di cibo e ricarica se è sotto i 10 g. La palatabilità del cibo piroxicam non influenza l'assunzione e dovrebbe assomigliare molto a quella del cibo standard.

3. Monitoraggio dell'attività della malattia

1. Nei giorni 0 e 7, ispezionare visivamente i pellet fecali di singoli topi e determinare la presenza di sangue nelle feci.
2. Se non si vede sangue, esegui un test del sangue occulto fecale spalmando un pellet sulla scheda di test, poi aggiungi il reagente di sviluppatore fornito. Risultati del punteggio secondo la Tabella 1.
3. Nei giorni 0 e 7, ispezionare visivamente i pellet fecali appena evacuati per valutare la consistenza delle feci. Usa le pinze piatte per aiutare a determinare la coerenza. Risultati del punteggio secondo la Tabella 1.
4. Nei giorni 0 e 7, determinare il grado di prolasso rettale ispezionando la regione perianale. Risultati del punteggio secondo la Tabella 1.
5. Misura il peso corporeo come descritto sopra. Risultati del punteggio secondo la Tabella 1.
   NOTA: La valutazione dell'indice di attività della malattia (DAI) deve essere eseguita in modo cieco dallo stesso ricercatore durante tutto l'esperimento per garantire coerenza, minimizzare il bias dell'osservatore e migliorare l'affidabilità della valutazione.

4. Prelievo di tessuto colonico

1. Eutanasiare i topi tramite asfissia da CO 2 e lussazione cervicale come riportato^{altrove 20}.
2. Posiziona il topo in posizione supina e spruzza etanolo al 70% sull'addome ventrale.
3. Solleva la pelle con le pinze e usa forbici chirurgiche per tagliare lungo la linea mediana. Esponi la cavità peritoneale e localizza il colon.
4. Esponi il colon e il ceco usando una dissezione contundente. Rimuovere il colon in blocco, inclusi il ceco e il bracciale anale.
5. Posiziona il colon su una superficie piatta e rimuovi qualsiasi tessuto connettivo.
6. Misura e registra la lunghezza dei due coloni.
7. Dopo aver misurato la lunghezza del colon, rimuovere il ceco tagliando alla giunzione ceco-colonica.
8. Prepara una siringa da 10 mL riempita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con un ago a punta sferica riutilizzabile in acciaio da 22 gauge attaccato. Infila l'ago nel colon e risciacqua il contenuto intestinale.
9. Inserire il colon sciacquato in una piastra di Petri contenente PBS e risciacquare per rimuovere i residui. Una volta liberato, usalo per i test a valle.

5. Analisi istologica

1. Appoggia il colon piatto su un vetrino di vetro. Usa le pinze per avvolgere il tessuto attorno a sé, partendo dall'estremità distale, per formare un "rotolo svizzero". In questo modo, l'estremità distal/anale rimarrà nel rotolo interno con le regioni più prossimali che si estendono fino al rotolo esterno.
2. Usando un ago calibro 27, fissa il colon arrotolato per mantenere il rullo e inseriscilo in una cassetta di tessuto a incastramento.
3. Per fissare i tessuti, immergere le cassette in una soluzione di formalina tamponata al 10% per 16 ore a 4 °C.
   ATTENZIONE: Il 10% di formalina è dannosa se a contatto con la pelle e può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Maneggia con cautela con guanti protettivi e occhiali scientifici. La formalina residua deve essere smaltita correttamente seguendo le linee guida istituzionali.
4. Dopo la fissazione della formalina, processare i tessuti per l'incassamento in paraffina e sezionarli per il montaggio su vetrine di vetro.
   NOTA: I campioni devono essere inviati a un laboratorio di istologia con le attrezzature necessarie per la lavorazione delle cassette tissutali in paraffina, sezionamento a scorrimento, montaggio di vetrine e colorazione di ematossilina ed eosina.
5. Lama del tessuto colorato con ematossilina ed eosina (HE), secondo i protocolli^{stabiliti 21}.
6. Utilizzando il sistema di punteggio istologico descritto nella Tabella 2, valuta le seguenti caratteristiche istologiche in ciascuna sezione: danni tissutali dovuti all'enterocolite, infiltrazione di cellule infiammatorie della lamina propria e percentuale di area coinvolta. Combina i punteggi in ogni sezione per generare un punteggio totale (Tabella 2).
   Punteggio totale = Coinvolgimento × caratteristiche (danno tissutale) + Coinvolgimento × caratteristiche (infiltrazione cellulare infiammatoria della lamina propria) (1)
7. Immagini istopatologiche rappresentative del danno tissutale e dell'infiltrazione cellulare si trovano nella pubblicazione di Erben et^{al 22}.
   NOTA: La valutazione istologica dovrebbe essere effettuata in modo cieco, preferibilmente da un patologo qualificato, per garantire coerenza e affidabilità della valutazione.

6. Colorazione immunofluorescente di tessuto fissato in formalina e paraffina

1. Posiziona i vetri in una griglia per vedute e in un asciugacapelli a 55 °C per 1 ora per fondere la paraffina.
2. Metti i vetri in una griglieria per la tintura e immergi sequencialmente il portaoggetti per 3 minuti in barattoli di tintura con xilene. Ripeti questo passaggio in 3 occasioni.
3. Immergi la griglietta per la tintura per 3 minuti in barattoli con etanolo al 100%. Ripeti questo passaggio in 3 occasioni.
4. Immergi la griglia per la tintura per 3 minuti nel barattolo con etanolo al 95%.
5. Immergi la griglia per la tintura per 3 minuti nel barattolo con etanolo all'80%.
6. Immergi la griglieria per 5 minuti in barattoli di tinta con acqua deionizzata (DI).
   NOTA: Tutti i passaggi precedenti devono essere eseguiti in una cappa ventilata a causa dei fumi di xilene. Maneggia con cautela con guanti protettivi e occhiali scientifici. Lo xilene residuo deve essere smaltito correttamente in conformità con le linee guida istituzionali.
7. Trasferire i vetrini su una griglia per vetri e immergerli in un barattolo di colorazione con una soluzione di recupero citrato a 1×.
8. Metti il barattolo di tintura nel supporto del piatto di tintura.
9. Metti il supporto per le tinte nella pentola a pressione.
10. Cuoci per 15 minuti in una pentola a pressione.
11. Recupera le lamelle dalla pentola a pressione e lasciale raffreddare alla temperatura ambiente.
12. Incubare vetri con tampone bloccante da 300 μL (siero di capra al 3,5% diluito in PBS) per 1 ora in una camera umidificata. Assicurati che il tessuto sia completamente coperto dal buffer bloccante.
13. Esporre i vetri a 300 μL di anticorpo primario diluito in tampone bloccante per 16 ore a 4 °C, all'interno di una camera umidificata. Assicurati che il tessuto sia completamente coperto dall'anticorpo primario. È stato utilizzato il seguente anticorpo primario: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    NOTA: Le diluizioni degli anticorpi saranno specifiche per il reagente e devono seguire le raccomandazioni del fornitore.
14. Risciacquare i slide immergendoli in serie in PBS per 5 minuti in 3 occasioni in un barattolo per le macchie.
15. Esporre i vetrini a 300 μL di un anticorpo secondario fluorescente diluito in un tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente, in una camera umidificata. Assicurati che il tessuto sia completamente coperto dall'anticorpo secondario. È stato utilizzato il seguente anticorpo secondario fluorescente: anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (diluizione 1:150).
    NOTA: Da questo momento in poi, i vetrini dovrebbero essere protetti dalla luce per prevenire il fotosbiancamento dei fluorofori. Le diluizioni degli anticorpi secondari saranno specifiche per reagenti e dovranno seguire le raccomandazioni del fornitore.
16. Risciacquare i slide immergendoli in serie in PBS per 5 minuti in 3 occasioni in un barattolo per le macchie.
17. Espone i vetrini alla colorazione nucleare immergendoli in una soluzione Hoechst diluita 1:5000 in PBS per 20 minuti in un barattolo di colorazione.
18. Risciacquare i slide immergendoli in serie in PBS per 5 minuti in 3 occasioni in un barattolo per le macchie.
19. Rimuovere con cura qualsiasi PBS dai vetri usando un fazzoletto non abrasivo. Aggiungi 50 μL di mezzo antifade per montaggio e un coperchio.

7. Estrazione di RNA

1. Congela bruscamente l'intero colon o un frammento nell'azoto liquido e poi conserva a -80 °C. In alternativa, immergi in 1,5 mL di soluzione conservatrice RNALater e conserva secondo le istruzioni del produttore.
2. Scongelare il colon precedentemente congelato e posizionarlo su una superficie piana. Disturba e omogeneizza il tessuto con un omogeneizzatore portatile.
3. Isola l'RNA usando il kit, seguendo le istruzioni del produttore.
4. Misura la concentrazione di RNA usando uno spettrofotometro. Rapporti_{A 260}/_{A 280} > 1,8 e_{A 260}/_{A 230} di 2,0–2,2 indicano una purezza accettabile dell'RNA.
5. Procedi con la trascrizione inversa, seguita da qPCR con colorante intercalante verde SYBR.
6. Analizza i risultati utilizzando la piattaforma di quantificazione o uno strumento simile.

Risultati

Maschi e femmine di topi IL-10-KO sviluppano enterocolite dopo una breve esposizione a una dieta fortificata con piroxicam (Figura 1A–E). Al secondo giorno, i topi esposti al piroxicam hanno mostrato una perdita di peso statisticamente significativamente maggiore rispetto ai loro controlli abituali alimentati con cibo dello stesso sesso, e una perdita di peso comparabile è stata osservata tra i sessi (Figura 1B). L'assunzione giornaliera apparente di cibo è rimasta invariata durante l'esposizione al piroxicam e lo sviluppo dell'enterocolite e si è somigliata all'assunzione del cibo standard, indicando che la perdita di peso in questo modello non è principalmente dovuta a una riduzione dell'assunzione, ma piuttosto ad altri fattori che promuovono il dispendio metabolico (Figura 1C).

Per approfondire la progressione dell'infiammazione intestinale, l'attività della malattia è stata valutata tramite un punteggio combinato di perdita di peso, sangue nelle feci, consistenza delle feci e grado di prolasso rettale. L'indice di attività della malattia modificata (DAI) è stato valutato al punto di partenza e al giorno 7; i punteggi del giorno 7 sono mostrati nella Figura 1D. Inoltre, lo sviluppo dell'enterocolite osservato nei topi esposti al piroxicam è stato associato a una forte tendenza all'aumento della mortalità, anche se questa differenza non è stata statisticamente significativa (p = 0,12; Figura 1E). In questo modello, la mortalità precoce è secondaria rispetto al raggiungimento di obiettivi umani da parte dei topi (perdita di peso > 20%) e colpisce preferenzialmente i maschi (Figura 1E). Se la mortalità è un punto di riferimento sperimentale ambito, si può considerare un numero maggiore di animali sperimentali rispetto a quelli qui utilizzati. In questo studio, gli autori hanno utilizzato il numero minimo di animali necessario per ottenere potenza statistica attraverso il completamento dello studio, tenendo conto della mortalità attesa.

L'accorciamento del colon è una caratteristica associata alla gravità della colite nei modelli murini. Al raccolto, sia maschi che femmine di topi IL-10-KO alimentati con piroxicam avevano colon più corti rispetto a quelli alimentati con cibo normale (Figure 2A–B). Alla valutazione istologica, i colon del gruppo alimentato con piroxicam hanno mostrato danni epiteliali e aumento dell'infiltrazione delle cellule immunitarie, cambiamenti associati alla colite (Figura 2C). Questi risultati si sono tradotti in un punteggio istologico più alto (Figura 2D). Inoltre, sono stati valutati i livelli trascrizionali di citochine pro-infiammatorie coinvolte nei modelli umani di IBD e murini di colite^. In accordo con i precedenti rapporti, i colon di topi alimentati con piroxicam con IL-10-KO hanno mostrato una significativa regolazione al rialzo delle citochine pro-infiammatorie a livello del trascripto (Figura 3A–D). Da notare che questo cambiamento trascrizionale non è stato osservato nei topi IL-10-KO che ricevevano cibo regolare o nei topi WT che ricevevano dieta fortificata con piroxicam, indicando che la firma trascrizionale era guidata da una combinazione di carenza di IL-10 e piroxicam, piuttosto che da uno dei due fattori da solo. Infine, gli autori hanno confermato che la firma trascrizionale osservata nel colon dai topi trattati con piroxicam era associata a un aumento della colorazione della calprotectina nella mucosa del colon (Figura 3E)^24,25.

Figura 1: Enterocolite accelerata da Piroxicam nei topi IL-10-KO. (A) Panoramica schematica del protocollo sperimentale. (B) Peso corporeo, (C) assunzione di alimenti, (D) indice di attività malattica (DAI) giorno 7, (E) curva di sopravvivenza nei maschi di 8 settimane e femmine di 8 settimane IL-10-KO che ricevono una dieta fortificata con piroxicam o una dieta regolare. Controllo maschile: n = 5, piroxicam maschile: n = 5, controllo femminile: n = 6, piroxicam femminile: n = 6 in (B), (C) e (D). Controllo maschile: n = 6, piroxicam maschile: n = 10, controllo femminile: n = 6, piroxicam femminile: n = 7 in (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 confrontando a coppie tra maschi (asterischi superiori) e femmine (asterischi inferiori) in (B). Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un test t non accoppiato a due code in (B), (C) e (D), e un test log-rank in (E). Sono rappresentati valori medi e barre di errore che rappresentano l'errore standard della media (SEM). Nei grafici a barre, le misurazioni individuali sono rappresentate da grafici di jitter. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Accorciamento del colon e valutazione istologica. (A) Campioni rappresentativi di colon di topi maschi e femmine di 8 settimane di interleucina-10-knockout (IL-10-KO) che ricevono una dieta con piroxicam (in alto) o una dieta regolare (in basso) per 7 giorni. Barra della scala = 1 cm. (B) Lunghezza dei colon al giorno 7 (controllo maschile: n = 5, piroxicam maschile: n = 5, controllo femminile: n = 6, piroxicam femminile: n = 6). (C) Immagini rappresentative del colon colorato con HE. Barra della bilancia = 100 μm. (D) Punteggio istologico al giorno 7. Test t a due code non accoppiate in (B) e (D). Sono raffigurati valori medi e barre di errore che rappresentano il SEM. Nei grafici a barre, le misurazioni individuali sono rappresentate da grafici di jitter. Non significativo (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 rispetto a coppie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cambiamenti infiammatori nell'enterocolite accelerata da piroxicam. Risultati quantitativi RT-PCR di (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b e (D) Ifng nel tessuto colonico di maschi di 8 settimane di maschi di tipo selvatico (WT) e interleucina-10-knockout (IL-10-KO) al momento del prelievo. Per i pannelli A–D, WT piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO controllo n = 3. (E) Colorazione rappresentativa di immunofluorescenza con calprotectina del tessuto colonico di topi IL-10-KO di 8 settimane al momento del prelievo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un test t a due code senza coppia. Sono rappresentati valori medi e barre di errore che rappresentano l'errore standard della media (SEM). Nei grafici a barre, le misurazioni individuali sono rappresentate da grafici di jitter. Barra di scala in (E) = 200 μm. Non significativi (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 rispetto a coppie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dominio	Punteggio
Peso	0 – Invariato
	1 – Perdita dell'1–5%
	2 – Perdita 6–10%
	3 – Perdita 11–20%
	4 – ; Perdita superiore al 20%
Consistenza delle feci	0 – Normale ;
	1 - Morbido ma formato
	2 – Feci molli (non acquose)
	4 – Diarrea (feci liquide)
Sanguinamento	0 – Nessuno
	2 – Feci ematoocculte positive
	3 – Sangue visibile sulle feci
	4 – Sanguinamento macchinoso per il retto
Prolasso rettale	0 – Assente
	1 – Presente
Punteggio totale	Punteggio totale: somma di (punteggi di dominio) per ciascun dominio

Tabella 1: Punteggio di attività della malattia (DAI). Un sistema di punteggio per determinare l'attività della malattia in base alla perdita di peso, alla consistenza delle feci, al sangue nelle feci e al prolasso rettale. Adattato da Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Danni tissutali					Infiltrazione delle cellule infiammatorie della lamina propria
Caratteristiche		Coinvolgimento			Caratteristiche		Coinvolgimento
0	Nessuna	1	1–25% della superficie		0	Rara	1	1–25% della superficie
1	Rara ;	2	26–50% della superficie		1	Aumentato, alcuni neutrofili	2	26–50% della superficie
2	Erosioni mucose e ulcerazioni	3	51–75% della superficie		2	Presenza submucosa di cluster cellulari infiammatori	3	51–75% della superficie
3	Danni estesi in profondità nella parete intestinale	4	76–100% della superficie		3	Infiltrazioni di cellule transmurali	4	76–100% della superficie

Tabella 2: Sistema di punteggio istologico. Sistema di punteggio per determinare i cambiamenti istologici e i danni. Adattato da Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Discussione

La malattia infiammatoria intestinale è un disturbo poligenico complesso in cui i modelli preclinici sono strumenti preziosi per analizzare le vie che contribuiscono alla patogenesi della IBD e sviluppare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche. Attualmente, molti modelli preclinici per IBD si basano sull'esposizione chimica, come il dextrano solfato di sodio (DSS), l'oxazolone e l'acido trinitrobenzene solfonico (TNBS), grazie alla loro facilità d'uso. Sono disponibili anche modelli genetici che sviluppano colite spontanea. Tra questi, il modello IL-10-KO è particolarmente prezioso perché le variazioni genetiche nella via IL-10 sono note per causare infiammazione intestinale negli esseri umani, e i topi IL-10-KO sviluppano enterocolite cronica spontanea che ricorda una malattia umana. Tuttavia, una delle principali limitazioni di questo modello è la sua incapacità di spiegare la variabilità fenotipica. Sebbene l'enterocolite si sviluppi spontaneamente, il suo insorgenza può variare a seconda del background dello stirpe e delle condizioni del vivario²⁷.

Combinando l'esposizione chimica con un modello genetico, il protocollo descritto qui fornisce un modello murino affidabile e riproducibile della colite sperimentale. L'enterocolite si accelera nei topi IL-10-KO tramite piroxicam, con l'insorgenza della malattia entro 7 giorni dopo l'esposizione a una dieta arricchita con piroxicam. Questo protocollo consente la sincronizzazione dello sviluppo della colite. Il modello riproduce caratteristiche osservate in altri modelli murini comunemente usati di colite, tra cui perdita di peso, sangue nelle feci, diarrea, accorciamento del colon, danni istologici e cambiamenti trascrizionali. Inoltre, questo modello è riproducibile nel ceppo ampiamente utilizzato C57Bl/6J, che facilita l'interrogazione di ulteriori difetti genici associati all'IBD grazie alla relativa facilità di generare topi con mutazioni aggiuntive in questo ceppo.

Il modello descritto qui fornisce uno strumento utile per studiare i cambiamenti metabolici durante l'infiammazione intestinale. In questo modello, i topi esposti al piroxicam che sviluppano enterocolite accelerata continuano ad alimentarsi normalmente senza una significativa diminuzione dell'assunzione giornaliera. Ciò indica che la perdita di peso in questo modello non è dovuta a alimentazione compromessa, ma piuttosto a fattori aggiuntivi. Sono necessari ulteriori studi per determinare se questi risultati siano dovuti a un aumento del dispendio calorico dovuto a infiammazione, a una perdita calorica eccessiva tramite diarrea o a una termogenesi compromessa. Inoltre, maschi e femmine di topi mostrano schemi simili di gravità della malattia, un risultato che contrasta con le osservazioni precedenti effettuate sui modelli IL-10-KO e^DSS 28,29,30.

Ci sono diversi passaggi importanti di risoluzione dei problemi per garantire la riproducibilità di questo modello. Innanzitutto, i topi dovrebbero essere abituati alla maneggiatura e alle osservazioni quotidiane per una settimana prima dell'esposizione al piroxicam. Questo previene la perdita di peso legata allo stress. In secondo luogo, le gabbie dovrebbero contenere non più di tre topi, e solo i topi ospitati armoniosamente dovrebbero essere inclusi nell'esperimento. I topi che mostrano comportamenti di lotta o ferite da combattimento sono più suscettibili allo sviluppo della colite e possono soccombere prima del^{raccolto 31,32}. In terzo luogo, se si vuole monitorare l'assunzione di cibo durante tutto l'esperimento, i topi dovrebbero essere ospitati individualmente per consentire una misurazione accurata del consumo di cibo. Inoltre, solo grandi pellet alimentari intatti dovrebbero essere posizionati nelle tramogge per evitare che si sbriciolino nella letteria, il che potrebbe influire sulle misurazioni. I metodi per quantificare l'assunzione di cibo descritti qui sono in linea con le linee guida sul consumo di cibo per^{roditori pubblicate 33}. Infine, i cambiamenti nella gabbia dovrebbero essere evitati durante l'esperimento, poiché cambiamenti ambientali improvvisi potrebbero ridurre l'assunzione di cibo per 1–2 giorni, in particolare nei topi giovani.

Questo protocollo presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, la valutazione delle alterazioni metaboliche è limitata al peso corporeo e all'assunzione di cibo, mentre altre misure del metabolismo sistemico, come il rapporto di scambio respiratorio (RER), il consumo energetico e l'attività fisica, non sono state valutate. Inoltre, i meccanismi alla base della perdita di peso non sono stati indagati; Pertanto, i contributi relativi di riduzione dell'apporto alimentare, alterazione del dispendio energetico, malassorbimento e altri fattori associati all'infiammazione intestinale restano poco chiari. In secondo luogo, solo il tessuto colonico è stato raccolto e analizzato, mentre altri organi coinvolti nella regolazione metabolica, tra cui tessuto adiposo, fegato e muscolo scheletrico, non sono stati esaminati. In terzo luogo, questo protocollo è stato sviluppato utilizzando topi C57BL/6 IL-10-KO, che possono mostrare una diversa suscettibilità alla colite rispetto ad altri background genetici. Nonostante queste limitazioni, il protocollo può essere facilmente adattato per incorporare un ulteriore fenotipaggio metabolico e l'analisi dei tessuti extraintestinali, permettendo di indagare i meccanismi alla base della perdita di peso nonché la relazione tra infiammazione intestinale e alterazioni metaboliche^{sistemiche 34}, o la valutazione di nuovi nanomateriali antinfiammatori³⁵. Inoltre, l'approccio dovrebbe essere applicabile ad altri ceppi di topi IL-10-KO, anche se sono necessari ulteriori studi di validazione.

In sintesi, gli autori riportano un protocollo efficiente e riproducibile che induce simultaneamente enterocolite in più topi IL-10-KO e consente la valutazione del comportamento alimentare. Sono necessari ulteriori studi per indagare gli effetti dell'enterocolite sulla spesa energetica e sulla composizione corporea in questo modello, rivelando così connessioni più ampie tra IBD e metabolismo dell'ospite.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon