Articolo metodologico

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

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DOI:

10.3791/71449

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31 luglio 2026

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1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

In questo articolo

Sommario

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Abstract

Gli editor CRISPR, inclusi nucleasi, editor di basi e editor principali, possono correggere efficacemente varianti genetiche causatrici di malattie o disturbare i geni bersaglio. Gli esiti di editing sono comunemente valutati in cellule primarie coltivate, cellule derivate dal paziente o linee cellulari ingegnerizzate per studiare l'impatto della variazione genetica o come primo passo prima di avviare studi sugli animali o traduzione clinica. La somministrazione di editori come mRNA insieme a RNA guida sintetici nelle cellule dei mammiferi può migliorare l'efficienza di editing rispetto agli approcci basati su plasmidi e prevenire problemi come l'integrazione del DNA o l'editing off-target derivanti da un'espressione sostenuta. Questo articolo presenta un flusso di lavoro per preparare mRNA per editor genomica tramite trascrizione in vitro (IVT), includendo co-transcrizione di caping e nucleotidi modificati chimicamente, mRNA editor elettroporato e RNA guida in fibroblasti umani primari, cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o linee cellulari linfoblastoidi (LCL), e quantificare i risultati dell'editing tramite sequenziamento mirato con ampliconi su una piattaforma Illumina seguita da un'analisi con CRISPResso2. Questo flusso di lavoro consente il benchmarking quantitativo di RNA guida, parametri di elettroporazione e varianti degli editor, e supporta applicazioni a valle tra cui clonazione a singola cellula, saghi fenotipici, studi preclinici su animali e sviluppo terapeutico.

Introduzione

L'editing genomico efficiente nelle cellule primarie dei mammiferi supporta la generazione di modelli genetici e la valutazione preclinica delle strategie terapeutiche candidate. I recenti progressi nelle tecnologie basate su CRISPR, tra cui il base editing e il prime editing, permettono modifiche precise ai nucleotidi senza introdurre rotture a doppio filamento del DNA, migliorando così la purezza degli esiti di editing 1,2. Queste tecnologie sono state applicate con successo nella modellazione delle malattie e negli studi terapeutici di editing genomico, incluse strategie per correggere varianti che portano alla malattiafalciforme 3 e alla fibrosicistica 4.

Una strategia particolarmente efficace per fornire componenti di editing genomico alle cellule dei mammiferi è l'elettroporazione dell'mRNA trascritto in vitro (IVT) che codifica l'enzima di editing combinata con RNA guida sintetici (gRNA). La somministrazione di mRNA consente un'espressione transitoria degli editori genomici, minimizzando l'attività prolungata delle nucleasi e riducendo la probabilità di eventi di editing fuori bersaglio. I progressi nella tecnologia IVT hanno migliorato l'efficienza, la resa e la qualità della sintesi dell'mRNA 4,5,6. I modelli di DNA plasmidico e i modelli di DNA derivati dalla PCR sono entrambi comunemente utilizzati per la trascrizione in vitro e presentano vantaggi e limitazioni distinti. In questo protocollo, i template generati da PCR sono preferiti per evitare problemi associati alla propagazione di lunghi traguardi poly(A) nei plasmidi, che sono soggetti a ricombinazione e variabilità della lunghezza. Tuttavia, l'uso di template PCR come descritto in questo protocollo richiede un costoso primer inverso che ospita la coda poli(A) a 120 nucleotidi, e la PCR può essere più soggetta a errori rispetto alla propagazione batterica dei plasmidi per sequenze non codificate nei primer. In alternativa, fornitori commerciali come Elegen e 4basebio possono fornire template di DNA ad alta fedeltà, offrendo un'opzione affidabile, seppur più costosa, per generare template di trascrizione.

Un design attento dell'RNA guida è un altro componente fondamentale per esperimenti di editing genomica di successo. Sono stati sviluppati diversi strumenti computazionali per aiutare i ricercatori a identificare sequenze di gRNA ottimali basate sull'efficienza prevista sul bersaglio e sull'attività minima fuori bersaglio. Le piattaforme più utilizzate includono CHOPCHOP e CRISPOR, che permettono l'identificazione di sequenze guida compatibili con i requisiti del motivo adiacente al protospaziore (PAM) degli enzimi Cas e forniscono metriche di punteggio per dare priorità a guide candidate con alta attività prevista especificità 7,8. I principi fondamentali e le migliori pratiche per la progettazione di RNA guida sono stati ampiamente descritti nella letteraturaCRISPR 9,10,11,12,13.

L'elettroporazione è comunemente utilizzata per somministrare reagenti di editing genomico alle cellule dei mammiferi perché può raggiungere un'elevata efficienza di somministrazione in tipi cellulari tipicamente resistenti agli approcci di trasfezione a base di lipidi. L'elettroporazione permeabilizza transitoriamente la membrana cellulare, permettendo agli acidi nucleici esogeni come mRNA e gRNA di entrare nel citoplasma. Sono stati sviluppati protocolli di elettroporazione ottimizzati per molteplici tipi di cellule di mammiferi, incluse cellule primarie, fibroblasti, linee cellulari linfoblastoidi e cellule staminali pluripotentiindotte 14. Piattaforme commerciali di elettroporazione come i sistemi Lonza 4D e Amax offrono programmi e reagenti specifici per tipo di cellula, progettati per migliorare l'efficienza della consegna mantenendo la vitalità cellulare. Sistemi di elettroporazione ad alta produttività come la piattaforma Amax 96-well Shuttle consentono ulteriormente esperimenti di editing genomico scalabili in molteplici condizioni sperimentali. Il sistema di elettroporazione al neon è anch'esso comunemente utilizzato, ma non è il fulcro di questo protocollo.

Dopo la consegna dei componenti di editing genomico, gli esiti di editing vengono tipicamente valutati utilizzando il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) della regione genomica che circonda il sito di editing. Le librerie di sequenziamento sono generate tramite amplificazione PCR del locus target, seguita da indicizzazione e sequenziamento ad alta produttività. Le letture di sequenziamento risultanti vengono analizzate utilizzando pipeline bioinformatiche specializzate progettate per esperimenti di editing genomico. In questo protocollo, i risultati dell'editing vengono quantificati utilizzando CRISPResso2, una piattaforma computazionale ampiamente utilizzata che consente un'analisi dettagliata degli esiti di editing genomico a partire dai datidi sequenziamento 15. CRISPResso2 allinea le letture di sequenziamento a una sequenza di riferimento e quantifica i risultati di montaggio, inclusa l'efficienza complessiva di montaggio, le frequenze di inserimento-delezione (indel), sostituzioni precise di nucleotidi e distribuzioni di editing nella regione target. Il software fornisce anche visualizzazioni grafiche e riassunti statistici che facilitano il confronto tra condizioni sperimentali e l'ottimizzazione dei parametri di montaggio.

Insieme, l'integrazione della produzione di mRNA IVT di alta qualità, la consegna ottimizzata tramite elettroporazione e l'analisi del sequenziamento ad alta risoluzione forniscono un flusso di lavoro robusto per valutare le strategie di editing genomico nelle cellule coltivate (Figura 1). Questo approccio consente un'ottimizzazione iterativa dell'efficienza di editing, della specificità e dei parametri sperimentali prima di avanzare le strategie di editing genomica verso studi in vivo e potenziali applicazioni terapeutiche.

Protocollo

Dichiarazione etica:
Tutte le procedure che coinvolgevano linee cellulari di origine umana venivano eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e i protocolli approvati.

1. Generare un template lineare di DNA usando PCR

Attenzione: Eseguire tutti i passaggi dell'RNA utilizzando consumabili e superfici di lavoro senza RNasi. Considera gli editor mRNA elencati e le loro diverse varianti nella selezione dell'editor appropriato per la modifica genomica prevista (Tabella 1).

  1. Assemblare la reazione PCR sul DNA plasmidico estratto dai batteri utilizzando un miniprep o un kit midiprep. Utilizzare 20 ng di DNA plasmidico per ogni reazione PCR a 50 μL con l'enzima NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, assemblando la PCR come descritto nella Tabella 2.
    1. Usa un primer frontale che corregga il promotore T7 inattivo sul plasmide, impedendo così la trascrizione circolare.
    2. Utilizzare un primer inverso che introduce una coda poly(A)₁₂₀ a 120 nt per supportare una trascrizione efficiente e la stabilità dell'mRNA.
    3. Utilizzare N1-metil-pseudouridina al posto dell'uracilo e includere CleanCap AG per migliorare la traduzione dell'mRNA e ridurre l'attivazione immunitaria innata 1,2,3,4 (Figura 1).
      NOTA: Sono disponibili altri analoghi nucleotidici e reagenti di tapping, ma questi hanno costantemente mostrato un'elevata attività nell'editing del genoma degli mRNA. La consegna basata su nanoparticelle è un'alternativa adatta ma non viene discussa in questo protocollo.
  2. Amplificare la sequenza di codifica dell'editor tramite PCR per 30 cicli usando primer che introducono un promotore T7 funzionale a monte della regione di codifica e una sequenza poly(A) a valle (Tabella 2 e Tabella 3).
    NOTA: La sequenza nucleotidica del modello IVT è sottolineata nella tabella 4.
  3. Verifica e purifica il prodotto PCR
    1. Fai lavorare 5 μL del prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% in un tampone TE a 180 V per 30 minuti. Confermare la presenza di una singola banda a circa 4000-6500 bp (a seconda dell'editor trascritto) prima di procedere con la purificazione del prodotto PCR.
    2. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di pulizia PCR (Table of Materials).
      NOTA: Se si osservano più bande o scarsa qualità del prodotto PCR, ottimizzare le condizioni di termociclo (Tabella 5 – Tabella di risoluzione dei problemi).
    3. Quantifica il DNA purificato utilizzando un test fluorometrico di dsDNA. Per l'analisi del dsDNA Qubit, preparare il mix master tampon-tintura combinando 796 μL della soluzione di lavoro Qubit ad alta sensibilità con 4 μL di colorante, entrambi forniti nel kit.
    4. In tubi separati, miscela 198 μL del master mix tampone con 2 μL dello standard a bassa concentrazione S1, dello standard ad alta concentrazione S2 e il campione. Inserire ogni standard e campione come richiesto dallo strumento fluorometro Qubit per misurare la concentrazione dello stock.
      NOTA: Se i campioni sono al di fuori dell'intervallo di analisi, potrebbe essere necessario preparare diluizioni.

2. Trascrivere l'mRNA

  1. Preparare la reazione IVT sul ghiaccio utilizzando la polimerasi di RNA T7, NTP, un analogo di cappuccio per la co-trascrittione di co-trascrittione, e N1-metil-pseudouridina trifosfato come sostituto dell'uridina per ridurre l'attivazione immunitariainnata 1˒5˒6.
  2. Prepara la miscela di reazione IVT secondo la Tabella 4. Usa la sequenza di template annotata fornita nella Tabella 4. Assemblare ogni reazione di trascrizione in un volume finale di 40 μL.
  3. Preparare 5–10 tubi di reazione per generare sufficiente mRNA per più esperimenti. Ogni reazione da 40 μL genera circa 100 μg di mRNA. Con 1 μg di mRNA usato per l'elettroporazione di prime editing e 3 μg di mRNA per l'elettroporazione di base editing, questo è sufficiente per ~33–100 elettroporazioni.
  4. Trascrivi l'RNA
    1. Mescola accuratamente la reazione IVT tramite pipetta. Incubare la reazione a 37 °C per 2 ore.
  5. Purifica l'RNA
    1. Trasferire in un tubo da 1,5 mL e aggiungere una soluzione di cloruro di litio (LiCl) di 7,5 M alla reazione IVT a un volume pari a metà del volume totale della reazione per ottenere una concentrazione finale di LiCl di 2,5 M. Per una reazione IVT da 40 μL, si aggiungono 20 μL di 7,5 M LiCl. Mescola accuratamente con una pipettatura delicata.
    2. Incubare la reazione a -20 °C per 30 minuti. Centrifuga il campione a 16.000 × g a 4 °C per 15 minuti.
    3. Rimuovi il surnadante con una pipetta e scartalo. Lava il pellet con 1mL di etanolo al 70% a 4 °C. Non è necessario disturbare il pellet. Centrifugare a 16.000 × g a 4 °C per 5 minuti.
    4. Rimuovi completamente l'etanolo e lascia asciugare il pellet all'aria per 1-2 minuti in un armadietto di biosicurezza senza RNasi. Non asciugare troppo i pellet altrimenti può essere difficile da risollevare.
  6. Risospendere e quantificare l'RNA
    1. Risospendere l'RNA in acqua priva di nucleasi. Inizialmente risospendere ogni reazione in 50 μL di acqua priva di nucleasi e diluire ulteriormente dopo aver misurato la concentrazione di RNA. Quantifica l'RNA utilizzando un saggio fluorometrico sull'RNA come il nanodrop.
      Punto di pausa: Dopo la quantificazione dell'RNA e l'aliquotazione, conservare le aliquote dell'mRNA a -80 °C fino all'elettroporazione. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento; Scongelare ogni aliquota solo una volta prima dell'uso.
    2. Confermare che la resa di mRNA purificata sia di circa 100-400 μg per reazione IVT da 40 μL. Diluire l'mRNA a 2 μg·μL-1 con acqua priva di nucleasi prima di aliquotare. Conserva le aliquote a −80 °C.
      NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prepara aliquote monouso e getta il materiale scongelato inutilizzato. Preparare 12,5 μL di aliquote in strisce PCR per 8–20 elettroporazioni per aliquota.
  7. Valutare l'integrità dell'RNA
    1. Valutare la dimensione e l'integrità dell'RNA tramite elettroforesi su gel di agarosio o elettroforesi automatica (Figura 2)
    2. Prepara un gel di agarosio allo 0,8% contenente oro SYBR diluito 10.000. Utilizzare una scala a RNA monofilamento, come il NEB ssRNA Marker.
    3. Denatura l'mRNA usando 2 coloranti di carico in gel di RNA e riscalda i campioni a 65 °C per 10 minuti prima di caricarli sul gel.
    4. Confermare che l'mRNA appare come banda predominante a circa 4000-6500 nt, a seconda dell'editor trascritto, con sbavorazioni minime o prodotti a basso peso molecolare. Scartare i campioni di RNA che mostrano una notevole degradazione, sfumatura o molteplici bande inaspettate.

3. Progettazione e preparazione di RNA guida

NOTA: Identificare le sequenze di motivo adiacente al protospaziale (PAM) all'interno del locus genomico target e selezionare RNA guida compatibili con l'editor scelto e la modifica genomica prevista. Piattaforme di progettazione di RNA guida come CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling e VectorBuilder possono essere utilizzate per dare priorità agli RNA guida con attività e specificità favorevolipreviste 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Identificare i siti PAM all'interno del locus genomico target compatibili con la variante nucleasi selezionata, incluse le varianti compatibili con NGN, utilizzando strumenti di progettazione di RNA guida.
  2. Seleziona RNA guida con alta attività prevista sul bersaglio e bassa attività off-target prevista. Conferma la finestra di modifica per l'RNA guida.
  3. Per applicazioni di editing base o prime editing, seleziona RNA guida che posizionano il montaggio previsto all'interno della finestra di attività ottimale dell'editor selezionato.
  4. Ordine sgRNA o pegRNA contenente analoghi di basi 2'-O-metilo per i primi 3 e gli ultimi 3 nucleotidi, oltre a un collegamento 3' fosforotioato tra le prime 3 e le ultime 2 basi delle guide.
  5. Risospendere gli RNA guida in acqua priva di nucleasi o in tamponamento TE (100μM). Preparare aliquote da 5 μL e conservare le aliquote a −80 °C. Al momento dell'utilizzo, si scongela e diluisce in un tampone di elettroporazione prima dell'elettroporazione.

4. Preparazione della coltura cellulare

NOTA: Valutare l'integrità cellulare tramite microscopia e saggi di vitalità prima dell'elettroporazione.

  1. Coltura di fibroblasti primari o cellule HEK293T in DMEM integrati con FBS al 10%, 4,5 g· L-1 glucosio, GlutaMAX e 110 mg· L-1 piruvato di sodio. Placca le cellule su fiaschette T75 sterili (superficie TC) con una confluenza del 20% per fiaschetta. Mantieni le cellule tra i passaggi 1-20. Dividere le celle all'80% di confluenza e usare le celle al 70-80% di confluenza per l'elettroporazione.
  2. Coltura di cellule staminali pluripotenti in mezzi mTeSR Plus. Placca le cellule su fiaschette T75 sterili rivestite con Geltrex con confluenza del 20% per fiaschetta. Cambia il substrato quotidianamente e mantieni le cellule tra i passaggi 1-20. Aggiungi il cocktail CEPT al supporto per le 24 ore successive a ogni passaggio. Dividere le celle all'80% di confluenza e usare le celle al 70-80% di confluenza per l'elettroporazione.
  3. Mantenere le celle a 37 °C con il 5% di CO₂ fino a raggiungere la densità adeguata per l'elettroporazione, tipicamente 70%–80% di confluenza.
  4. Rimuovere il substrato quando le cellule sono a un numero e confluenza appropriati per l'elettroporazione.
  5. Aggiungere l'enzima TrypLE Express alle cellule (1 mL per una fiaschetta T75) e incubare a 37 °C per 5 minuti. Spettate delicatamente le cellule contro la fiaschetta per ottenere una sospensione a singola cellula. Fermare la dissociazione aggiungendo 3 mL di materiale per la coltura cellulare e confermare l'assenza di grandi grumi cellulari prima di contare.
  6. Granulare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti, lavare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) da 15 mL, e centrifugare nuovamente le cellule.
  7. Valutare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un saggio di vitalità automatico come il Nucleocounter NC-3000 con Soluzione 13. Combinare 11,4 μL di cellule con 0,6 μL di Soluzione 13 prima della misurazione sul Nucleocontatore. Procedere con l'elettroporazione solo quando la vitalità della cella è almeno all'85%, e scartare o ripreparare i campioni al di sotto di questa soglia.
  8. Risospendere le cellule a una densità di circa 0,5 × 106–2 × 106 celle·mL-1 in DPBS. Contare le cellule e valutare la vitalità utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare.
  9. Procedere solo se la vitalità della cellula è ≥ 85%.
  10. Risospendere le celle nel buffer di elettroporazione. Risospendere 2 × 105 celle in 5 μL di tampone di elettroporazione fredda per ogni reazione.
  11. Preparare il tampone di elettroporazione con la soluzione supplementare secondo le istruzioni del produttore immediatamente prima dell'uso e mantenere il tampone sul ghiaccio.
  12. Mantieni le celle fredde e procedi tempestivamente. Tieni le celle sul ghiaccio e procedi immediatamente all'impianto di elettroporazione.

5. Elettroporazione

NOTA: Preparare il carico di montaggio in tubi a striscia PCR per facilitare il pipetting multicanale. Dopo l'elettroporazione, risospendere le cellule nel mezzo integrato con cocktail CEPT per aumentare la sopravvivenzacellulare 12.

  1. Prepara il carico di RNA.
    1. Preparare il carico di RNA sul ghiaccio combinando l'mRNA editor e l'RNA/i guida in un buffer di elettroporazione.
    2. Per editori di basi e nucleasi, preparare una soluzione finale di elettroporazione contenente 1,5 μL (3 μg) di mRNA, 0,5 μL (50 pmol) di RNA guida e 15 μL di tampone di elettroporazione per campione.
    3. Per i prime editor, preparare una soluzione di elettroporazione finale contenente 0,5 μL (1 μg) di mRNA, 1,5 μL (150 pmol) di RNA guida e 15 μL di tampone di elettroporazione per campione.
    4. Preparare le soluzioni di carico RNA come un mix master 1,2× per compensare la perdita di volume durante il trasferimento e la gestione del campione. Ottimizzare i volumi e i rapporti dei reagenti per ogni sito target e variante dell'editor secondo necessità.
  2. Distribuire le celle, il carico ed elettroporare.
    1. Aggiungere 5 μL della sospensione della cella a ciascun pozzo di elettroporazione.
    2. Aggiungere 17 μL di carico di RNA in un tampone di elettroporazione a 5 μL di celle. Mescola la sospensione pipettando due volte.
      Attenzione: procedere rapidamente dopo aver combinato le cellule e il carico di RNA perché le RNasi secrete dalle cellule possono degradare rapidamente l'mRNA editore. Completare l'elettroporazione entro 2 minuti dopo aver miscelato le cellule e il carico di RNA.
    3. Esegui il programma di elettroporazione ottimizzato per il tipo di cella selezionato (Tabella 6; Figura 2; Figura 3).
      1. Per fibroblasti cutanei umani primari o cellule HEK293T, si utilizza il sistema di elettroporazione Lonza 4D con SF tamponante. Aggiungi 200.000 cellule per reazione a una cuvetta di elettroporazione da 20 μL. Esegui il programma CM-130. Aggiungi immediatamente 80 μL di DMEM preriscaldato + 10% FBS, 4,5 g· L-1 glucosio, 4 mM di L-glutamine e 110 mg· L-1 piruvato di sodio. Recuperare le cellule per 10 minuti prima di diluirle in piastre da 96 o 24 pozzi.
      2. Per le cellule staminali pluripotenti, si utilizza il sistema di elettroporazione Lonza 4D con tampone P3. Aggiungere 200.000 celle per reazione a una cuvetta di elettroporazione da 20 μL. Esegui il programma DN-100. Aggiungi immediatamente 80 μL di mezzo mTeSR Plus preriscaldato. Recuperare le cellule per 10 minuti prima di diluirle in piastre a 24 pozzi.
    4. Esamina le cellule ogni giorno dopo la placcatura per monitorare la salute e il recupero cellulare.

6. Estrazione del DNA genomico

NOTA: Assicurarsi che il DNA genomico sia di qualità sufficiente e privo di inibitori prima dell'amplificazione PCR, poiché la qualità del DNA può influenzare la preparazione della libreria di sequenziamento e la quantificazione accurata degli esiti di editinggenomica 9,10,11.

  1. Lava e raccogli le cellule.
    1. Raccogli le celle 2-3 giorni dopo l'elettroporazione. Lavare le cellule una volta con DPBS e procedere immediatamente all'estrazione del DNA genomico.
    2. Prepara il tampone di lisi incompleto combinando 10 mL di 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 mL di soluzione di dodecilsolfato di sodio (SDS) al 10% (wt/vol) e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 1 L. Conserva il tampone di lisi incompleto a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
    3. Preparare un tampone di lisi completo aggiungendo la proteinasi K a una diluizione 1:1.000 (vol/vol) a un'aliquota di tampone di lisi incompleta. Aggiungi il buffer completo di lisi alle cellule per avviare la lisi. Aggiungere 40 μL di buffer di lisi completo a ciascun pozzo contenente circa 80.000 celle in una piastra da 96 pozzi. Non fare pipette su e giù perché potrebbe causare perdita di campioni.
  2. Digerisci i campioni.
    1. Incubare i campioni a 37 °C per 60 minuti per completare la lisi cellulare e la digestione della proteinasi K.
  3. Inattivare la proteinasi K.
    1. Trasferire i lisati su tubi PCR o su una piastra PCR a 96 pozzi. Incubare i campioni a 80 °C per 30 minuti per inattivare la proteinasi K.
  4. Conserva i lisati.

Punto di pausa: conservare i lisati a −20 °C fino all'amplificazione per PCR.

7. Sequenziamento miro degli amplicon per l'analisi di editing

NOTA: Pool i prodotti PCR in quantità equimolari prima del sequenziamento. Circa 10.000 letture di sequenziamento per campione sono generalmente sufficienti per quantificare i risultati dell'editing genomico in massa.

  1. Progetta primer specifici per il loco per generare ampliconi di circa 300 pb, coprendo almeno 25 pbb, a monte e 25 pb, a valle del sito di modifica (Tabella 7).
  2. Amplificare il locus genomico target eseguendo la PCR1 secondo le condizioni fornite nella Tabella 8, Tabella 9.
  3. Aggiungi indici campionari unici tramite PCR usando il prodotto PCR1 come template, come con gli primer mostrati nella scheda "Esempio di primer di indicizzazione PCR" nella Tabella 7 . Utilizzare le condizioni PCR come mostrato nella scheda 2 della Tabella 8 e nella Tabella 9.
  4. Eseguire i prodotti PCR1 e PCR2 su un gel di agarosio all'1,5% per confermare la presenza di bande singole nelle dimensioni previste.
  5. Mettere in comune i prodotti PCR2 in quantità equimolari. Pulisci la libreria PCR2 in pool utilizzando il rapporto perla/campione AMPure XP di 0,65:1 secondo le istruzioni del produttore. Eludi la libreria purificata in 30 μL di acqua priva di nucleasi e confermi la rimozione dei dimeri adattatori tramite elettroforesi su gel prima del sequenziamento.
  6. Quantifica la libreria aggregata finale utilizzando un saggio fluorometrico dsDNA. Valutare la distribuzione delle dimensioni dei frammenti tramite elettroforesi capillare.
  7. Sequenzia le librerie usando letture single-end da 300 cicli su uno strumento Illumina MiSeq. Dilui la libreria aggregata finale a 4 nM. Combinare 5 μL della libreria aggregata da 4 nM con 5 μL di 0,1 M NaOH e pipetta per mescolare. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare, poi aggiungere 990 μL di tampone HT raffreddato fornito dal kit MiSeq per neutralizzare la soluzione e diluire a 20 pM. Picco del controllo PhiX del 15%. Carica la libreria su una cartuccia Illumina MiSeq ed esegui sequenzie single-end a 300 cicli utilizzando le impostazioni standard del produttore. Punta a generare circa 30.000 letture per campione, anche se 10.000 letture per campione sono sufficienti per l'analisidi editing 12. Il sequenziamento MiSeq può essere effettuato su base per campione in alcune aziende come Genewiz o Quintara.

8. Analisi degli esiti di editing genomico

Nota: L'analisi CRISPResso2 consente la quantificazione dell'efficienza complessiva di montaggio, delle frequenze di conversione dei nucleotidi e delle frequenze di inserimento/delezione (indel), e può essere utilizzata per caratterizzare i risultati di editing in condizionisperimentali 15.

  1. Demultiplex i dati di sequenziamento e organizza i file FASTQ in base al locus genomico e alle condizioni sperimentali.
  2. Installa CRISPResso2 secondo le istruzioni fornite nel repository Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Esegui l'analisi batch di CRISPResso2 utilizzando batch.txt file che specificano i file FASTQ di input e i parametri di analisi (esempi forniti nella Tabella 7). Imposta il punteggio minimo di qualità di lettura a 30. Imposta la larghezza della finestra "w" a 20. Se si utilizzano editor di basi di citosina, alcuni indels possono essere centrati attorno ai nucleotidi modificati in base oltre che al sito nick. In tal caso, regola il centro finestra "wc" a -10 invece del centro predefinito nel sito del nick per catturare al meglio questi indel.
  4. Estrarre output quantitativi, come le frequenze di conversione dei nucleotidi, le frequenze di inserimento/delezione (indel) e (se applicabile) le frequenze HDR o di montaggio a numero primo, dai file di output riassuntivi appropriati. Questi si trovano tipicamente in file chiamati "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" e "Nucleotide_percentage_summary.txt", che possono essere aperti in Microsoft Excel o in altri software di editing di fogli di calcolo.
  5. Esporta i valori di editing quantitativo per il grafico a valle e l'interpretazione dei dati, come nelle Figure 3-4. Utilizzare i file "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" (come mostrato nella Figura 5) per valutare gli esiti dell'editing allelic.

Risultati

L'utilizzo di un editor efficiente con un sito di test facilmente accessibile, come l'editor di base ABE8e con il sito di controllo HEK3, può spesso portare a efficienze di editing superiori al 90% se il sistema di distribuzione è adatto alle celle utilizzate nell'esperimento. Possono verificarsi minori efficienze di editing se ci sono problemi con l'mRNA dell'editor, l'RNA guida, il sito target o le condizioni di consegna che rendono il montaggio meno adatto. L'uso di varianti Cas9 che accedono a sequenze PAM più versatili ma le legano meno strettamente o il targeting degli editor a nucleotidi fuori dalla loro finestra di montaggio ideale, può ridurre l'efficienza di montaggio. Gli mRNA editor generati da IVT di successo appaiono tipicamente come una singola banda predominante con stopping minimo o prodotti di degradazione a basso peso molecolare, indicando un'elevata integrità del trascritto adatta all'elettroporazione a valle (Figura 2).

Dopo l'elettroporazione dell'mRNA editor e degli RNA guida sintetici, la maggior parte delle cellule si riprende entro 24–48 ore e mantiene la morfologia tipica con programmi di elettroporazione adeguati (Figura 3–4). Le condizioni di elettroporazione dovrebbero essere adattate al tipo specifico di cella, poiché diversi buffer possono produrre risultati marcatamente differenti. Il Lonza Knowledge Center online formula raccomandazioni per codici tampone ed elettroporazione per tipi cellulari comuni, e Lonza offre kit di ottimizzazione separati per linee cellulari e celle primarie. Il confronto empirico dei buffer può aiutare a identificare condizioni ottimali per una consegna efficiente. Programmi inadeguati possono portare a nessuna consegna o possono essere altamente tossici per le cellule (perdendo oltre il 50% o impedendo la continuazione del ciclo cellulare). Esperimenti di ottimizzazione rappresentativa hanno dimostrato differenze sostanziali negli esiti di editing tra le condizioni di elettroporazione, con alcuni programmi che hanno prodotto elevate efficienze di editing mentre altri hanno prodotto una modifica minima, evidenziando l'importanza dell'ottimizzazione empirica per ciascun tipo di cellula (Figura 3–4).

Attraverso iPSC, fibroblasti e LCL, il sequenziamento mirato degli ampliconi seguito dall'analisi CRISPResso2 viene utilizzato per quantificare l'efficienza di editing e i sottoprodotti (Figura 4). Qui è mostrata l'editing delle basi adenine del locus di test HEK3 (Figura 4), che ha portato alle conversioni nucleotidiche previste con basse frequenze indel nei campioni analizzati. L'analisi CRISPResso2 consente la visualizzazione degli alleli modificati e non modificati nel locus del bersaglio e facilita la quantificazione delle conversioni nucleotidiche previste, delle frequenze indel e di altri sottoprodotti di montaggio, fornendo una valutazione completa degli esiti di editing (Figura 5). L'efficienza di montaggio viene quantificata misurando la frequenza di questa precisa sostituzione di singolo nucleotide nel sito bersaglio. Il locus HEK3 è utilizzato come locus modello grazie al suo profilo di montaggio ben caratterizzato e alla riproducibilità attraverso sistemi sperimentali, permettendo una valutazione robusta delle prestazioni di editing di base in condizioni diverse. Raccomandiamo di testare questa guida come controllo positivo nelle cellule umane quando si ottimizzano nuove procedure di editing. Il montaggio delle basi è tipicamente arricchito per conversioni nucleotidiche previste con basse frequenze indel, mentre il montaggio prime produce una miscela di modifiche precise e sottoprodotti a bassafrequenza 3,12. Le efficienze di editing variavano a seconda delle condizioni, con evidenti differenze osservate tra tipi cellulari e programmi di elettroporazione (Figura 3-4). Queste variazioni probabilmente riflettono differenze nell'assorbimento cellulare, nella vitalità e nell'attività di riparazione del DNA, così come l'influenza dei parametri di elettroporazione sull'efficienza della somministrazione. Collettivamente, questi risultati evidenziano l'importanza di ottimizzare specifiche per tipo cellulare le impostazioni di elettroporazione per ottenere risultati di editing coerenti e massimi.

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Figura 1. Preparazione dell'mRNA editor tramite trascrizione in vitro.
Panoramica schematica della generazione degli mRNA dell'editor. (Passo 1) Preparazione del template plasmidico contenente la sequenza di codifica dell'editor e il promotore T7. (Passo 2) Amplificazione PCR per generare un template lineare di DNA. (Passo 3) Trascrizione in vitro utilizzando la polimerasi di RNA T7 per sintetizzare mRNA cappato. (Passo 4) Purificazione dell'mRNA per rimuovere DNA modello, enzimi e nucleotidi liberi. L'mRNA tappato risultante è adatto per la consegna a valle nelle cellule dei mammiferi tramite elettroporazione o nanoparticella lipidica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Esempio di immagine di elettroforesi su gel di mRNA 
Immagine elettroforesi di tre mRNA editor genomica eseguita su un gel di agarosio all'1% utilizzando la colorazione d'oro SYBR. La scala degli ssRNA proveniente dal NEB è mostrata a sinistra con i marcatori di dimensione indicati dalla loro lunghezza. La mancanza di sbaveramenti sostanziali o di bande piccole indica che questi mRNA sono di qualità adeguata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Ottimizzazione delle condizioni di elettroporazione per l'editing genomico nelle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). 
Vengono mostrate le efficienze di montaggio ottenute in diverse condizioni di elettroporazione negli iPSC. Le celle venivano elettroporate utilizzando molteplici buffer e combinazioni di programmi, inclusi il buffer CB-150 P4, il buffer CD-118 P3, il buffer DN-100 P3, il buffer DC-100 P3, tutti sul dispositivo di nucleofezione Lonza 4D. Il montaggio è stato valutato utilizzando il dispositivo di elettroporazione al neon con parametri (1600 V, 20 ms, 1 impulso). L'efficienza del montaggio è stata quantificata tramite un'analisi sequenziata mirata del loco modificato. N=1 per campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Ottimizzazione delle condizioni di elettroporazione per l'editing genomico nei fibroblasti.
Efficienza di editing dopo l'elettroporazione utilizzando diversi programmi di nucleofezione. I fibroblasti sono stati elettroporati utilizzando più programmi Lonza Nucleofector (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 e FF-113), e i risultati del montaggio sono stati quantificati tramite sequenziamento mirato. I risultati sono mostrati per due repliche (P2, P3). È incluso un controllo negativo senza consegna da parte dell'editor. Il confronto dei codici di elettroporazione evidenzia le differenze nell'efficienza di montaggio tra i contesti di elettroporazione, consentendo l'identificazione dei parametri ottimali per l'editing del genoma dei fibroblasti. N=1 per campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Caratterizzazione dei risultati di editing genomico al loco target. 
Output della tabella di frequenza allerica da CRISPResso2, che mostra l'abbondanza relativa degli alleli modificati e non modificati che circondano la regione target dello sgRNA, determinata da un'analisi di sequenziamento ad alta produttività dopo la modifica. Le annotazioni rosse indicano la finestra di editing della base e il polimorfismo eterozigote preesistente presente nella linea cellulare utilizzata. La sequenza dello spaziatore dell'RNA guida è sottolineata in grigio. La "posizione di clivagatura prevista" mostrata da una linea tratteggiata è spostata rispetto alla tipica posizione "PAM meno 3" per SpCas9 a causa della modifica del "wc" del centro della finestra nel nostro file batch di analisi (esempio nella Tabella 8). Questo in realtà non sposta la vera posizione prevista della scissione, ma l'output viene mostrato in questo modo per indicare che gli indel che circondano la linea tratteggiata all'interno di una finestra di 20 nucleotidi verranno valutati, catturando sia gli indel centrati sul vero sito di incisione sia quelli centrati sui nucleotidi desordati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Editori e sequenze utilizzate in questo studio 
Colonna 1: Editor del genoma disponibili su AddGene per la trascrizione in vitro. Nomi e ID Addgene per plasmidi disponibili che sono adatti alla trascrizione in vitro come descritto in questo protocollo. Colonna 2: Sequenze degli spaziatori di RNA guida utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2. Reagenti PCR per l'amplificazione del modello plasmide dell'mRNA.
L'elenco dei reagenti e dei componenti di reazione utilizzati per l'amplificazione PCR del modello plasmidico per generare DNA lineare per applicazioni a valle, nonché la sequenza degli innesco di trascrizione diretta e inversa. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3. Condizioni di cicli PCR per l'amplificazione del modello mRNA. 
Questa tabella elenca le condizioni di termociclo utilizzate per l'amplificazione PCR del modello di mRNA dal DNA plasmidico prima delle applicazioni a valle. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4. Reagenti utilizzati per reazioni in vitro . Trascrizione (IVT). 
Questa tabella elenca i reagenti e i componenti di reazione utilizzati per la trascrizione in vitro per sintetizzare l'mRNA dell'editor dal template lineare del DNA. Una sequenza modello di esempio (ABE8e) è mostrata con elementi codificati a colori. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5. Guida alla risoluzione dei problemi per i passaggi chiave nel flusso di lavoro di editing genomico. 
Questa tabella riassume le problematiche tecniche comuni che possono sorgere durante la preparazione dell'mRNA dell'editor tramite trascrizione in vitro (IVT) e analisi del sequenziamento MiSeq. Per ogni fase del flusso di lavoro, vengono forniti potenziali problemi, cause possibili e soluzioni raccomandate per ottimizzare l'efficienza del montaggio e garantire un rilevamento accurato dei risultati del montaggio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6. Programmi ottimali di elettroporazione per diversi tipi cellulari di mammiferi. 
Questa tabella elenca i codici di programma di elettroporazione e le condizioni del buffer utilizzati per la consegna efficiente dell'mRNA editor e per guidare gli RNA nei diversi tipi cellulari dei mammiferi. I parametri di elettroporazione elencati sono stati testati per identificare condizioni che massimizzano l'efficienza dell'editing genomico mantenendo la vitalità cellulare. Lo stesso programma potrebbe non funzionare per ogni linea cellulare o fonte di cellule primarie, quindi si raccomandano alternative da questa lista se inizialmente non ha successo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 7. Parametri di analisi CRISPResso2 per la quantificazione degli esiti di editing genomico. 
La prima scheda elenca un esempio del design del primer HTS1 utilizzato per l'amplificazione del locus bersaglio. La seconda scheda fornisce un esempio dei manual di indicizzazione utilizzati durante la preparazione della libreria. La terza scheda illustra un esempio dell'organizzazione di indicizzazione utilizzata per assegnare indici unici a ciascun campione durante la sequenza. La quarta scheda contiene un esempio di file batch di input per l'analisi CRISPResso2, mentre la quinta scheda fornisce un ulteriore esempio di file batch di input per l'analisi CRISPResso2. Si noti che il "wc" del centro della finestra è adattato per gli editor di basi per facilitare la rilevazione degli indel centrati sulle basi desaminate oltre che su quelli centrati sul sito di taglio o taglio della nucleasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 8. Reagenti PCR1 (Tab 1) e PCR2 (Tab 2) per la preparazione della libreria MiSeq.
Questa tabella elenca i reagenti e i componenti di reazione utilizzati nella Tabella 1 (PCR1) per amplificare i loci genomici target e nella Scheda 2 (PCR2) per incorporare sequenze indicizzate specifiche per campione e adattatori di sequenziamento Illumina, generando librerie pronte per il sequenziamento per l'analisi MiSeq. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 9. Le condizioni di ciclo PCR1 (Tab 1) e PCR2 (Tab 2) per la preparazione della libreria MiSeq.

Questa tabella elenca le condizioni di termociclo utilizzate nella Tabella 1 (PCR1) per amplificare le regioni genomiche target e nella Scheda 2 (PCR2) per incorporare sequenze indicizzate specifiche per campione e adattatori di sequenziamento Illumina, generando librerie pronte per il sequenziamento per l'analisi MiSeq. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro per l'editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi utilizzando l'elettroporazione di mRNA editor e RNA guida sintetici. La somministrazione come mRNA tende a garantire un editing più efficiente rispetto alla consegna dei plasmidi, e l'mRNA tende a essere più semplice e coerente tra i lotti rispetto alla proteina editor o ribonucleoproteina. Quando le forme di mRNA e ribonucleoproteine degli editori di basi sono state confrontate direttamente in alcuni lavori precedenti, l'mRNA ha prodotto una migliore efficienzadi editing 3. Rispetto ai metodi di somministrazione di plasmidi o virali, la somministrazione basata su mRNA consente un'espressione transitoria e un rischio ridotto di integrazione genomica, anche se può richiedere ottimizzazione per diversi tipi cellulari. Oltre a una minore efficienza di montaggio, l'uso del DNA plasmidico per l'editing genomico comporta un rischio di integrazione casuale nel genoma delle cellule target e può aumentare il rischio di editing off-target a causa dell'espressione prolungata dell'editor. La combinazione di sequenziamento mirato con ampliconi e CRISPResso2 consente la quantificazione standardizzata dell'efficienza di montaggio e la caratterizzazione di eventuali esitiallelici 3.

Diversi fattori sono fondamentali per il successo. I passaggi critici di questo protocollo includono il mantenimento dell'integrità dell'RNA attraverso una rigida gestione senza RNasi, la selezione degli RNA guida ottimali e l'ottimizzazione attenta delle condizioni di elettroporazione per ciascun tipo cellulare. L'integrità dell'RNA e un attento controllo della RNasi influenzano fortemente i risultati, e guidare la selezione dell'RNA rimane un determinante primario dell'efficienza e dei profili dei sottoprodotti. Le impostazioni di elettroporazione richiedono un'ottimizzazione empirica per tipo cellulare e alcuni programmi che offrono un alto montaggio possono anche causare tossicità. Se si osserva una bassa efficienza di montaggio, si dovrebbe considerare l'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione, della qualità dell'RNA o della progettazione guida dell'RNA. Se si verifica una tossicità eccessiva, ridurre la forza di elettroporazione o l'apporto di RNA può migliorare la vitalità cellulare. Strategie di ottimizzazione aggiuntive includono il test di buffer di elettroporazione alternativi e programmi personalizzati per il tipo di cellula bersaglio o modifiche alle concentrazioni di RNA che modificano o guidano. Questo flusso di lavoro fornisce una piattaforma pratica per confrontare i benchmark degli editor e produrre cellule modificate prima del clonaggio a valle di singole cellule, fenotipaggio, studi in vivo o sviluppo traslazionale. Questo flusso di lavoro è ampiamente applicabile per valutare strategie di editing genomico nelle cellule primarie, consentendo un confronto sistematico delle modalità di editing tra contesti genomici e tipi cellulari. Supporta la modellazione della malattia attraverso l'introduzione o la correzione di varianti clinicamente rilevanti, nonché l'interrogazione funzionale degli elementi regolatori codificanti e non codificanti. Inoltre, fornisce una piattaforma per ottimizzare gli approcci di editing terapeutico, inclusa la valutazione dell'efficienza nel miraglio, dell'attività fuori obiettivo e della durabilità del montaggio. Il flusso di lavoro può anche essere utilizzato per selezionare e dare priorità a RNA guida e sistemi di editing, valutare strategie di somministrazione e testare varianti specifiche per paziente in un quadro di medicina di precisione. Collettivamente, funge da ponte versatile tra la biologia genomica di base, la ricerca traslazionale e lo sviluppo preclinico. Un limite di questo metodo è che l'efficienza dell'elettroporazione e la vitalità delle celle possono variare sostanzialmente tra i tipi cellulari, richiedendo un'ottimizzazione empirica. Inoltre, gli esiti di editing possono dipendere dal design e dalla purezza dell'RNA guida, e dall'accessibilità del locus bersaglio, il che può limitare la riproducibilità tra diversi sistemi sperimentali. Nonostante questi limiti, un'attenta ottimizzazione dei parametri sperimentali e della progettazione delle guide può mitigare la variabilità, consentendo un'applicazione affidabile e riproducibile di questo approccio in diversi sistemi cellulari.

Dichiarazioni

N.W. ed E.V.B. hanno depositato domande di brevetto su tecnologie di editing genomico tramite la Johns Hopkins University. G.A.N. ha depositato domande di brevetto relative alle tecnologie di editing genomico tramite il Broad Institute e la Johns Hopkins University.

Contributo dell'autore:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. e G.A.N. hanno ciascuno redatto sezioni separate del testo. M.V. ha assemblato e modificato il testo finale seguito da modifiche da parte di tutti gli autori.

Ringraziamenti

Ringraziamo Beatriz Olalla Sastre per le discussioni utili relative a questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato dal premio Big Beat Challenge della British Heart Foundation assegnato a CureHeart (riferimento premio n. BBC/F/21/220106), la Cystic Fibrosis Foundation (premio NEWBY23XX0) e i National Institutes of Health degli Stati Uniti (R00HL163805 e DP2OD038783 a G.A.N.). J.N.W. riconosce il sostegno della NIH Grant No. T32 GM148383.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reazione
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul di soluzione cellulare e 0,4167 μL di soluzione DAPI 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantità: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reazione
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

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Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor
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