Articolo metodologico

Un modello traduzionale di maialino pretermine per la sepsi neonatale

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DOI:

10.3791/71456

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10 luglio 2026

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1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I modelli di sepsi batterica nei neonati preterm sono essenziali, tuttavia i modelli esistenti di roditori non hanno rilevanza clinica. Un modello altamente traslazionale di sepsi neonatale è stato sviluppato utilizzando maialini predefiniti infettati da Staphylococcus epidermides vivente.

Abstract

I neonati prematuri sono particolarmente vulnerabili alle infezioni batteriche che possono rapidamente evolvere fino a una sepsi potenzialmente letale, uno stato di eccessiva infiammazione e disfunzione degli organi. Per indagare i meccanismi della malattia e promuovere lo sviluppo terapeutico, sono fondamentalmente necessari modelli traslazionali animali robusti che replichino la complessa fisiopatologia e la presentazione clinica della sepsi neonatale. Questo protocollo presenta un modello clinicamente rilevante di sepsi neonatale prematuro, indotta tramite infusione intra-arteriosa di Staphylococcus epidermide viva poco dopo la nascita o al terzo giorno postnatale. I maialini vengono partoriti al 90% della gestazione tramite cesareo e vengono curati in condizioni di terapia intensiva neonatale. Questi includono incubatori a controllo di temperatura e ossigeno e un catetere arterioso ombelicale residente, che consente la somministrazione di nutrizione parenterale e campionamenti di sangue seriali. Dopo l'infezione da S. epidermidis, i maialini vengono monitorati per 24–48 ore. L'incidenza e la gravità della sepsi possono essere modulate dalla dose di batteri e dall'apporto di glucosio parenterale. Un aumento della fornitura di glucosio parenterale accelera le risposte immunitarie pro-infiammatorie, portando a un deterioramento clinico. La sepsi letale e gli endpoint umani sono definiti dai parametri gasogasici arteriosi (pH ≤ 7,1) combinati con segni clinici di compromissione emodinamica come letargia, decolorazione cutanea e tachipnea. Questo modello offre una piattaforma unica per esplorare come il metabolismo energetico e gli interventi immunomodulatori influenzino la pulizia batterica, l'infiammazione sistemica e il danno tissutale durante un'infezione neonatale. Ha un potenziale significativo per informare strategie cliniche per la prevenzione e il trattamento della sepsi neonatale.

Introduzione

L'infezione neonatale è una delle principali cause di mortalità e morbilità a lungo termine a livello mondiale, in particolare tra i neonati pretermini, ma anche tra i neonati a termine con basso peso alla nascita o complicazioniperinatali 1,2. La diagnosi precoce rimane difficile a causa di segni clinici aspecifici, risposte immunitarie immature e altamente variabili e mancanza di biomarcatori sensibili e specifici in grado di distinguere infezione da infiammazione noninfettiva 3,4. Di conseguenza, i clinici spesso iniziano una terapia antibiotica empirica a largo spettro, spesso prima della conferma microbiologica, contribuendo all'uso eccessivo di antibiotici, alla perturbazione della colonizzazione microbica nella prima fase della vita e allo sviluppo di resistenzaantimicrobica 5.

La sepsi neonatale è una condizione potenzialmente letale causata da una risposta dell'ospite disregolata all'infezione che porta a disfunzioniorganiche 4. Sebbene infezione e sepsi rappresentino entità biologiche e cliniche distinte, i termini sono spesso usati in modo intercambiabile nella letteratura neonatologica. Clinicamente, la sepsi neonatale è comunemente classificata come sepsi ad esordio precoce o tardivo (EOS, LOS), che si verifica rispettivamente prima o dopo 72 ore di vita. L'EOS è tipicamente causata da patogeni trasferiti durante il parto, come Escherichia coli o Streptococco di gruppo B. Al contrario, la LOS si manifesta frequentemente con sintomi aspecifici, può essere negativa alla coltura ed è associata a fattori di rischio come procedure invasive, nutrizione parenterale e ricovero prolungato. Gli organismi causanti più comuni includono gli stafilococchi coagulasi negativi, in particolare Staphylococcus epidermidis, così come i batteri Gram-negativi, anche se si verificano anche infezioni fungine epolimicrobiche 1,2,6. Indipendentemente dall'eziologia, le infezioni neonatali possono convergere in un fenotipo comune disepsi 1,2. È importante sottolineare che i neonati pretermine mostrano immaturità dello sviluppo sia dell'immunità innata che adattativa, insieme a riserve metaboliche limitate, che possono influire sulla reattivitàall'infezione 7.

I progressi nella diagnosi e nel trattamento sono stati ostacolati dalle limitazioni dei sistemi sperimentali esistenti. Gli approcci in vitro permettono studi meccanicistici sulle vie immunitarie ma non riescono a catturare la fisiologia integrata delle risposte immunitarie complesse. I modelli di roditori, pur essendo preziosi per studi genetici e molecolari sulle risposte immunitarie neonatali, differiscono sostanzialmente dagli esseri umani per ontogenesi immunitaria, metabolismo e dimensione 8,9. La gestione clinica della sepsi è difficile da studiare in questi modelli a causa delle limitate opportunità di monitoraggio intensivo, campionamenti ripetuti di sangue e test di cure di supporto o terapeutiche clinicamente realistiche.

I modelli animali di grandi dimensioni, in particolare i maialini neonati prematuri, offrono un approccio complementare potente. I maiali condividono strette somiglianze anatomiche, fisiologiche e immunologiche con gli esseri umani, incluse popolazioni cellulari immunitarie comparabili, segnalazione dei recettori per riconoscimento di pattern e regolazionemetabolica 10,11,12,13,14. È importante notare che i maiali sono ampiamente utilizzati come modelli per la sepsiadulta 13,15. La scala fisica dei maiali consente l'uso di strumenti clinicamente rilevanti, monitoraggio fisiologico continuo, biocampionamento ripetuto e interventi di terapia intensiva standardizzati come nutrizione parenterale, terapia fluidica, antibiotici e supporto respiratorio. L'infezione sperimentale può essere studiata anche nel contesto dell'immaturità dello sviluppo, permettendo di indagare le traiettorie della malattia, le risposte dell'ospite e gli effetti del trattamento in condizioni che ricordano molto la pratica clinica.

Questo articolo descrive un modello standardizzato di sepsi neonatale nei maialini pretermini, progettato come piattaforma traslazionale flessibile. Il modello consente l'induzione controllata di un'infezione batterica sistemica e la valutazione longitudinale delle risposte cliniche, immunologiche e metaboliche, che possono essere utilizzate per esplorare la fisiopatologia della sepsi neonatale e per valutare l'efficacia di nuovi interventi preventivi e terapeutici.

Protocollo

Tutte le procedure dettagliate sono state condotte in conformità con la direttiva UE 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e approvate dall'Ispettorato Danese degli Esperimenti Animali (numero di licenza: 2020-15-0201-00520).

1. Procedure legate al parto

  1. Eseguire cesareo elettivo per partorire maialini preterm al 90% della gestazione (giorni gestazionali 106–107).
    1. Ottieni una scrofa gravida (Landrace × Large White, terza o quarta parità) da un allevamento commerciale Specifico Patogeno Libero.
      NOTA: La scrofa deve essere impregnata tramite inseminazione artificiale (× Duroc) per garantire che il giorno esatto del concepimento sia noto.
    2. Fai digiunare la scrofa durante la notte (minimo 12 ore) con accesso ad libitum all'acqua prima dell'intervento. Indurre sedazione tramite iniezione intramuscolare di un cocktail contenente atropina (2 mL per scrofa), butorfanolo (2 mL/100 kg peso corporeo; 10 mg/mL) e Zoletil 50 Vet (3,3 mL/100 kg peso corporeo; tiletamina 25/mL e zolazepam 25 mg/mL).
    3. Una volta sedato, inserire un catetere nella vena auricolare e indurre l'anestesia generale con propofol (10 mg/mL), titolata fino a raggiungere la perdita del riflesso palpebrale e del tono mascellare.
    4. Eseguire l'intubazione endotracheale con laringoscopia diretta per assicurare le vie aeree. Mantieni un piano chirurgico di anestesia per tutta la durata del cesareo utilizzando isoflurano vaporizzato somministrato al 100% di ossigeno (1–2 L/min) tramite un vaporizzatore calibrato.
    5. Iniziare al 5% e mantenere tra 1,5 e 2,5%, titolando la concentrazione alla dose effettiva minima in base alla frequenza cardiaca e alla saturazione periferica di ossigeno.
      NOTA: Se si verifica l'apnea, avviare la ventilazione meccanica per garantire un'adeguata ossigenazione.
    6. Posiziona la scrofa in posizione di posizione laterale destra. Esegui una preparazione asettica del sito chirurgico. Somministrare un volume totale di 120 mL di lidocaina (10 mg/mL) tramite infiltrazione sottocutanea e intramuscolare lungo la linea di incisione del fianco sinistro prevista.
    7. Eseguire una laparotomia sul fianco sinistro usando un bisturi per esporre ed esterinervare le corna uterine. Incisci le corna uterali lungo la curvatura maggiore per far nascere singoli maialini.
    8. Prima di tranziare il cordone ombelicale, mungelo 2–3 volte verso il maialino per aumentare la concentrazione di emoglobina e le riserve di ferro. Posizionare una pinza all'ombelico etichettata da A–Z attorno al cordone ombelicale insieme a garze per prevenire il sanguinamento, e trasettare il cordone.
    9. Immediatamente dopo il parto, mettere ogni maialino in un sacchetto di polietile, lasciando la testa esposta. La sacca minimizza la perdita di calore, riducendo così il rischio di ipotermia.
    10. Somministrare un volume fisso di 0,1 mL di doxapram (20 mg/mL) e 0,1 mL di flumazenil (0,1 mg/mL) intramuscolare nel collo. Doxapram stimola la respirazione spontanea, mentre il flumazenil, un antagonista delle benzodiazepine, inverte parzialmente l'anestesia trasferita dalla scrofa durante il cesareo.
    11. Trasferire i maialini in un'unità di terapia intensiva neonatale.
  2. Rianimazione, randomizzazione e cateterismo
    1. Pesa e determina il sesso di ogni maialino al momento del trasferimento in terapia intensiva neonatale.
    2. Per i maialini che non riescono a respirare spontaneamente, si effettua la rianimazione individuale. Ripeti le dosi di doxapram e/o flumazenil e fornisci ventilazione a pressione positiva secondo necessità per stabilizzare la respirazione.
    3. Una volta che i porcellini sono fisiologicamente stabili e ancora anestetizzati dall'anestesia trasferita maternamente, si utilizza la tecnica asettica per inserire un catetere arterioso ombelicale (tubo di alimentazione PVC 4 Fr) in una delle arterie del cordone ombelicale tranceto. Avanza la punta del catetere verso l'aorta dorsale. Fissare il catetere alla pelle con punti di sutura e collegarlo a una linea di infusione per fornire nutrimento parenterale.
      NOTA: Nel maiale prematuro, la somministrazione intra-arteriosa è lo standard stabilito sulla vena ombelicale per evitare una possibile necrosi epatica dovuta all'alto rischio di disposizionamento della punta del catetere all'interno del parenchima epatico piuttosto che del dottovenoso 21.
    4. Stratifica i maialini per peso alla nascita e sesso e assegnali casualmente ai gruppi di trattamento.
  3. Condizioni abitative
    1. Ospita ogni maialino singolarmente in un incubatore riscaldato e imbottito con ventilazione controllata.
    2. Fornire ossigeno supplementare (1–2 L/min) fino a 12 ore dopo la nascita per prevenire l'ipossia.
    3. Monitorare la temperatura rettale durante le prime 12 ore dopo la nascita. Regolare le condizioni di riscaldamento secondo necessità per mantenere una temperatura del nucleo di 38–39 °C (obiettivo: 38,5 °C).
      NOTA: È previsto un breve periodo di ipotermia immediatamente dopo la nascita e durante il posizionamento del catetere.

2. Immunizzazione passiva tramite infusione di plasma

NOTA: Poiché i maiali non trasferiscono immunoglobuline transplacentari, prevedi un'immunizzazione passiva parziale per esperimenti della durata superiore a 24 ore per prevenire infezioni spontanee.

  1. Raccogliere il sangue materno dalla scrofa dopo il cesareo in un contenitore sterile rivestito di eparina. Centrifugare il sangue in tubi Falcon sterili a 4 °C, 2500 × g, per 10 minuti, e ripetere una volta. Dopo la separazione, raccogliere con cura il plasma in nuovi tubi Falcon sterili e conservarlo a 4 °C fino all'uso.
  2. Entro 12 ore dalla nascita, somministrare il plasma a una dose di 8 mL/kg come infusione intraarteriosa continua di 30 minuti utilizzando una pompa per infusione.

3. Induzione dell'infezione sperimentale

NOTA: L'infezione sperimentale può essere indotta 3–4 ore dopo la nascita o al terzo giorno postnatale.

  1. Preparazione della sospensione batterica
    1. Scongelare la fiala di stock di S. epidermidis congelata (WT-1457, 15–25% glicerolo) a temperatura ambiente. Vortice brevemente (2–3 s) per ottenere una sospensione omogenea.
      NOTA: Secondo la classificazione dei gruppi di rischio per agenti infettivi, S. epidermidis è classificato come microrganismo del Gruppo di Rischio 1 dell'OMS. I microrganismi del Gruppo di Rischio 1 dell'OMS difficilmente causano malattie umane e non richiedono considerazioni particolari.
    2. Prepara una coltura notturna inoculando 20 mL di brodo di infusione cardiaca cerebrale (BHI) con 5 μL del stock di S. epidermidis scongelato in una fiaschetta Erlenmeyer sterile da 100 mL. Incubare a 37 °C con scuotimento orbitale a 180 giri/min per ~16 ore, permettendo alla coltura di raggiungere la fase stazionaria. Includere il controllo del brodo BHI non inoculato in condizioni identiche per verificare la sterilità del medio.
    3. Prepara una nuova coltura inoculando 20 mL di brodo BHI con 200 μL di coltura notturna (diluizione 1:100) in una fiaschetta Erlenmeyer sterile da 100 mL. Preparare colture sufficienti per infettare tutti i maialini (vedi i calcoli nei passaggi 3.1.4 – 3.1.6). Incubare a 37 °C con scuotere orbitali a 180 giri/min per 2,5 ore, fino a quando i batteri raggiungono la fase di crescita logaritmica iniziale (Figura supplementare 1A).
    4. Stimare il volume totale di coltura necessario per infettare tutti i maialini in base alla dose target titolata, al peso corporeo medio, al numero di maialini e alla densità di coltura.
    5. Si suppone che la coltura raggiunga una densità ottica a 600 nm (OD) di ≥1 (Figura supplementare 1B) dopo l'incubazione di 2,5 ore e si utilizza un tasso di conversione stabilito di OD di 1 = 3 × 10 unità formanti colonia (CFU)/mL di 8 colonie.
    6. Includere il 15% di volume extra per compensare le perdite di gestazione. Calcola il volume stimato della coltura usando la formula:
      Stima V = [Dose target (CFU/kg BW) × BW) × BW × N × 1,15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      dove:
      VStima = volume totale di coltura stimato richiesto (mL)
      BW = peso corporeo medio del maialino (kg)
      N = numero totale di maialini
    7. Dopo l'incubazione, si determina il diametro del campo della coltura. Diluire il campione secondo necessità per mantenere le letture all'interno dell'intervallo lineare dello spettrofotometro.
    8. Calcola il volume finale di coltura necessario per raggiungere la concentrazione target di CFU utilizzando la formula:
      VFinale = OD1 · V stima / OD misurata (2)
      dove:
      Vfinale = volume finale di coltura richiesto (mL)
    9. Trasferire il VFinal calcolato in tubi Falcon da 50 mL e centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    10. Scartate con cura il soprandanante.
    11. Risospendere il pellet batterico in 3 x Vfinale di soluzione salina sterile allo 0,9% per prepararsi all'somministrazione intra-arteriosa (3 mL/kg di peso corporeo in 3 minuti). Assicurati che la soluzione sia priva di aggregati.
    12. Prepara siringhe da infusione da 50 mL con la sospensione batterica.
    13. Prepara una siringa separata da 50 mL con soluzione salina sterile allo 0,9% per i controlli non infetti.
  2. Procedura di infezione
    1. Somministrare la sospensione batterica o la soluzione salina sterile a ciascun maialino attraverso il catetere arterioso ombelicale utilizzando una pompa d'infusione impostata per somministrare la dose target in 3 minuti. Mantenere un intervallo di 5 minuti tra un maialeno consecutivo.
    2. Immediatamente dopo l'infezione, iniziare l'infusione continua di nutrizione parenterale per lavare il catetere e garantire la somministrazione dell'intera dose.
    3. Conferma la dose conservando la sospensione batterica a 4 °C. Successivamente, questo può essere diluito e placcato su piastre di agar sanguigno per determinare la densità batterica (vedi passo 8)

4. Nutrizione parenterale

  1. Fornire nutrizione parenterale totale (TPN) ai maialini per tutta la durata dell'esperimento. Ad esempio, si utilizza una borsa TPN umana a tre camere, come Kabiven 1900 kcal, modificata per soddisfare i requisiti di macronutrienti dei maialini neonati.
  2. Prepara la soluzione nutrizionale parenterale in condizioni sterili.
    1. Rimuovi 300 mL dalla camera del glucosio.
    2. Rimuovi 70 mL dalla camera lipidica.
    3. Aggiungi 155 mL di glucosio al 50% nella camera del glucosio.
    4. Aggiungi 214 mL di Vamin alla camera del glucosio.
    5. Aggiungi 150 mL di acqua sterile nella camera del glucosio.
    6. Aggiungi 0,1 mL di eparina (5000 IE/mL) alla camera del glucosio.
    7. Mescola accuratamente il contenuto di tutte e tre le camere.
      NOTA: Questo porta a una soluzione nutrizionale parenterale con la composizione dei macronutrienti mostrata nella Tabella 1. Utilizzare questa formulazione come dieta di controllo standard nella valutazione degli effetti di regimi nutrizionali alternativi sulle risposte alle infezioni.
    8. Conserva la nutrizione parenterale a 4 °C fino all'uso. Prepara la soluzione a lotti e non usarla oltre 48 ore dopo la preparazione.
      NOTA: Il modello può essere modificato per valutare gli effetti dell'alimentazione enterale e della stimolazione intestinale adattando i maialini con sondi orogastrici per l'alimentazione.
  3. Somministrazione della nutrizione parenterale
    1. Riempire siringhe sterili da 50 mL con nutrizione parenterale e infondere continuamente attraverso il catetere intraarterioso utilizzando una pompa d'infusione.
    2. Imposta la velocità di infusione a 6 mL/kg/h. Pesi i maialini ogni giorno e regola la dose in base al peso corporeo aggiornato.
      NOTA: Per studi a lungo termine, se si osserva edema periferico (sovraidratazione), ridurre la velocità di infusione a 4 mL/kg/h.
    3. Monitora regolarmente le pompe di infusione per assicurarti che le siringhe non si esauriscano. Riempi le siringhe se necessario.

5. Monitoraggio clinico

  1. Valuta regolarmente i maialini durante lo studio per determinare se è necessaria un'azione. Dopo l'infusione batterica, gli animali dovrebbero essere monitorati ogni 1–2 ore da personale esperto fino all'eutanasia pianificata.
    NOTA: Il deterioramento clinico, ovvero la progressione dall'assenza di sintomi a endpoint umani, può verificarsi rapidamente, entro 30–60 minuti.
    1. Osserva i sintomi legati alla respirazione, tra cui tachipnea, difficoltà respiratoria, cianosi e respirazione agonale.
      NOTA: Nei casi di ipossia (saturazione di ossigeno < 80%), l'apporto di ossigeno dovrebbe essere avviato/aumentato.
    2. Osserva sintomi legati alla circolazione, tra cui decolorazione, estremità fredde, tempo prolungato di ricarica capillare, tachicardia e bradicardia.
    3. Osserva i sintomi legati all'attività, tra cui letargia, incapacità di stare in piedi o camminare (rilevante dal terzo giorno postnatale in poi) e reattività agli stimoli dolorosi.
    4. Osserva sintomi legati alla coagulazione, come ecchimosi o sanguinamento petechiale nella pelle. Applicare una pressione delicata sulle aree scolorite; Se il rossore non sbianca, classifica il ritrovamento come sanguinamento cutaneo.
  2. Se vengono osservati sintomi clinici, eseguire misurazioni di gasoplastie ematiche per valutare pH, lattato, saturazione di ossigeno e pressione parziale di anidride carbonica rispetto ai valori basali (vedi passo 6.3).
    NOTA: Il monitoraggio clinico continuo (ad esempio, della pressione sanguigna, della frequenza cardiaca e della frequenza respiratoria) può essere utilizzato, ma non è impiegata di routine in questi esperimenti.

6. Prelievo di sangue

NOTA: Il prelievo longitudinale del sangue può essere effettuato nei maialini tramite catetere intra-arterioso o con puntura giugulare venosa. Il volume sanguigno totale campionato non dovrebbe superare il 7,5% del volume sanguigno totale stimato (~7% del peso corporeo). Tutte le procedure di prelievo del sangue devono rispettare le linee guida etiche locali.

  1. Prelievo di sangue per catetere intraarterioso
    1. Con mani pulite e guantate, accedi con attenzione alla porta del catetere. Disinfetta il sito di accesso con etanolo prima dell'apertura. Evita la contaminazione della linea di infusione.
    2. Preleva almeno 2 mL di sangue e mettilo da parte, poiché questo volume potrebbe essere contaminato da nutrizione parenterale dalla linea di infusione. Mantieni la sterilità del campione prelevato.
    3. Raccogli il volume sanguigno richiesto per l'analisi. Ad esempio, il sangue per le analisi ematologiche deve essere raccolto in tubi rivestiti di EDTA, mentre i campioni per le analisi gasodinamiche devono essere prelevati utilizzando siringhe rivestite di eparina.
    4. Dopo il prelievo, reinfondere i 2 mL di sangue prelevati inizialmente nel maialino e ricollegare con cura il catetere alla linea di infusione parenterale.
  2. Prelievo di sangue da puntura giugulare
    1. Rimuovi il maialino dall'incubatrice e mettilo in posizione dorsale sdraiale per esporre la zona del collo. Immobilizza il maialino per impedire i movimenti e permettere un accesso sicuro alla vena giugulare.
      NOTA: La puntura venosa giugulare è associata a potenziali rischi, tra cui emorragie, formazione di ematomi e compromissione delle vie aeree. La decisione di eseguire questa procedura dovrebbe essere valutata attentamente rispetto all'importanza scientifica degli esiti.
    2. Identificare la posizione anatomica approssimativa della vena giugulare e disinfettare il sito della puntura con etanolo.
    3. Esegui la puntura giugulare venosa utilizzando un sistema Vacutainer e raccogli il volume sanguigno richiesto. Ad esempio, raccogliere 0,2 mL di sangue e conservare il campione a 4 °C fino alla formazione batterica.
    4. Applicare pressione sul sito della venipuntura fino a raggiungere l'emostasi. Poi riporta il maialino nell'incubatrice.
    5. Continua a monitorare il maialino per eventuali segni di esanguinamento rinnovato. Se si verifica un'emorragia significativa, si sopporta il maialino. Monitora anche la formazione di ematomi sottocutanei o emorragie interne che potrebbero compromettere le vie aeree.
  3. Misurazioni della gasometria nel sangue
    1. Ispeziona il campione di sangue nella siringa eparinizzata per eventuali bolle d'aria. Se sono presenti bolle, espellile o spostale delicatamente battendo la siringa per evitare di alterare le misurazioni dei gas.
    2. Trasporta il campione all'analizzatore di gas ematico e segui le istruzioni del produttore. Assicurati che il campione venga processato tempestivamente per mantenere l'accuratezza.

7. Criteri per la sepsi e obiettivi umani

  1. Eutanasiare i maialini una volta raggiunti parametri umani predefiniti indicatori di sepsi.
    NOTA: Per altre patologie o lesioni iatrogeniche, si riferisce alle linee guida etiche locali per gli endpoint umani.
    1. Usa il pH del sangue come principale indicatore della sepsi e come principale punto di riferimento umano. Eutanasia subito i maialini con pH ≤ 7,1. Per i maialini con pH ematico ≤ 7,2, ripetere le misurazioni della gasoplastica ogni 15–30 minuti e monitorare gli endpoint secondari umani.
    2. Come endpoint umanitari secondari, si sopporta l'eutanasia dei maialini indipendentemente dal pH del sangue in caso di manifestazione di coagulazione intravascolare disseminata, inclusa eccimosi o sanguinamento petechiale, arresto respiratorio, letargia profonda e/o mancanza di risposta agli stimoli dolorosi (confermata dall'assenza di riflesso di astinenza dopo una leggera strettezza dello spazio interdigitale con le pinze anatomiche).
  2. Anestesiare il maialino tramite iniezione intramuscolare di una miscela a base di Zoletile (0,1 mL/kg).
    NOTA: Ricostituire una fiala di Zoletil 50 Vet (tiletamina 125 mg, zolazepam 125 mg) a 10 mL usando 6,25 mL di xilazina (20 mg/mL), 1,25 mL di ketamina (100 mg/mL) e 2,5 mL di butorfanolo (10 mg/mL). Le concentrazioni finali sono di 12,5 mg/mL ciascuna di tiletamina, zolazepam, xilazina, ketamina e 2,5 mg/mL butorfanolo.
  3. Confermare una profondità adeguata dell'anestesia assenza di riflesso di astinenza in risposta a uno stimolo doloroso (vedi passo 7.1.2).
  4. Eseguire l'eutanasia tramite iniezione intracardiaca di un'overdose di pentobarbital sodio (3 mL/kg; 400 mg/mL).
    NOTA: Un prelievo di sangue intracardiaco può essere effettuato prima dell'eutanasia utilizzando un sistema Vacutainer.

8. Placcatura batterica e quantificazione

  1. Quantificare la densità batterica del sangue utilizzando campioni di puntura giugulare raccolti durante l'esperimento e campioni di puntura cardiaca raccolti durante l'eutanasia.
    NOTA: Non utilizzare sangue prelevato dal catetere arterioso, poiché potrebbe contenere batteri residui dall'infezione sperimentale iniziale, che potrebbero confondere le quantificazioni.
    1. Prepara una piastra di agar di sangue di pecora per ogni campione di sangue, segna i quadranti 0, -1, -2 e -3 sul fondo e etichetta la targa con l'ID dell'animale e il momento della data.
    2. Utilizzando 50 μL di sangue da ciascun campione, preparare diluizioni 10 volte di 10-1, 10-2 e 10-3 in 450 μL di PBS sterile in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Segnare ogni piastra con tre gocce da 20 μL della corrispondente diluizione nel quadrante assegnato, distanziando le gocce per evitare il contatto o il trasferimento e prevenendo l'aerosolizzazione.
    4. Incubare i piatti durante la notte a 37 °C, poi conservare i piatti a 4 °C fino al conteggio.
    5. Contare tutte le colonie batteriche nella diluizione contenente circa 10 colonie per macchia. Includere solo colonie di S. epidermidis, tipicamente bianche, circolari e dai bordi lisci. Ispezionare e registrare attentamente eventuali colonie con morfologia alterata, poiché queste potrebbero indicare contaminazione, ad esempio da campionamento. Calcola CFU/mL usando la seguente equazione:
      (CFU/mL) = [(conteggio delle colonie · fattore di diluizione)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

Risultati

Un esperimento dose-risposta è stato condotto su maialini pretermine allevati fino al quinto giorno postnatale (Figura 1). Al terzo giorno postnatale, i maialini hanno ricevuto un'infusione di una bassa dose di S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), una dose elevata di S. epidermidis (5 × 109 CFU/kg, n = 9), oppure soluzione salina come controllo (n = 3), e sono stati monitorati per 44 ore.

Dopo l'infusione di S. epidermidis , il carico batterico ematico è rimasto più alto durante il periodo di follow-up di 44 ore nei maialini che hanno ricevuto la dose elevata rispetto al gruppo a bassa dose (Figura 2A, P < 0,05). Solo i maialini del gruppo ad alta dose (3/9) svilupparono sepsi, con esordio che si verificava circa 12–15 ore dopo l'infezione (Figura 2B). In linea con ciò, i maialini che ricevevano la dose elevata di S. epidermidis mostravano un pH sanguigno più basso a 12 ore (Figura 2C, P < 0,001), accompagnato da un marcato aumento della pressione parziale di anidride carbonica (pCO₂) (Figura 2D, P < 0,01), rispetto al gruppo a bassa dose.

Durante la fase acuta di infezione (6 ore), entrambi i gruppi infetti hanno mostrato un eccesso di base inferiore e livelli di lattato più elevati rispetto ai controlli salini, con variazioni più pronunciate che sono persistite fino a 12 ore nel gruppo ad alta dose di S. epidermidis (Figura 2E, F, P < 0,01 – 0,05). I livelli di glucosio nel sangue non differivano tra i gruppi (Figura 2G).

A 6 ore, entrambi i gruppi infetti hanno mostrato anche una robusta deplezione dei neutrofili nel sangue rispetto ai controlli non infetti (Figura 3A, entrambi P< 0,001). Più avanti nel corso dell'infezione, è stato osservato un rifornimento di neutrofili in entrambi i gruppi infetti, ma maggiore nel gruppo a bassa dose di S. epidermidis (Figura 3A, P < 0,05). Entrambi i gruppi infetti svilupparono trombocitopenia durante l'esperimento; tuttavia, il conteggio dei trombociti è diminuito prima e in modo più marcato nel gruppo a dosi elevate di S. epidermidis rispetto sia al gruppo a bassa dose sia ai controlli non infetti (Figura 3B, P < 0,01–0,05). I livelli plasmatici, di TNF-α, IL-6 e IL-10 erano elevati in entrambi i gruppi infetti a 6 e 12 ore dopo l'infezione rispetto ai controlli (Figura 3C, P < 0,001–0,05). A 24 ore, i livelli plasmici di TNF-α e IL-10 sono rimasti elevati solo nel gruppo ad alta dose di S. epidermide rispetto ai controlli non infetti (P < 0,05), mentre entro 44 ore solo i livelli di TNF-α sono rimasti elevati (P < 0,05).

All'eutanasia, quando i maialini raggiungevano i limiti umani o venivano eutanasiati al momento previsto di 44 ore dopo l'infezione, venivano misurati i livelli plasmamici di reagenti in fase acuta negativi e marcatori di lesione agli organi (Figura 4A–G). Tra questi, solo il colesterolo (un reagente di fase acuta negativo) è stato significativamente più basso nei maialini infettati con l'alta dose di S. epidermidis rispetto al gruppo a bassa dose (Figura 4B, P < 0,05). I livelli medi di marcatori di lesione epatica, inclusi alanina aminotransferasi e aspartato aminotransferasi, così come marcatori di lesione renale come creatinina e azoto ureico nel sangue, erano numericamente più alti nel gruppo ad alta dose di S. epidermidis rispetto ai controlli non infetti (Figura 4D–G).

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Figura 1: Disegno sperimentale. I maialini pretermine sono stati partoriti tramite cesareo al 90% della gestazione. Al terzo giorno postnatale, i maialini hanno ricevuto un'infusione intra-arteriosa di S. epidermidis vivo a 109 o 5 × 109 CFU/kg, oppure soluzione salina come controllo. Dopo l'infezione, i maialini sono stati monitorati per 44 ore, con prelievi di sangue longitudinali effettuati in momenti temporali definiti. Figura creata con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Carico batterico nel sangue, sopravvivenza e parametri gasostatici nei maialini pretermine dopo infusione arteriolosa con soluzione salina (CON) o infezione da S. epidermidis, viva. (A) Densità di S. epidermidis nei campioni di sangue raccolti 6, 24 e 44 ore dopo l'infezione. (B) Curve di sopravvivenza che indicano il tempo fino al punto finale umano o all'eutanasia programmata a 44 ore dall'infezione. (C–G) Parametri gasografici arteriosi a 0, 6, 12, 24 e 44 ore dopo l'infezione. I dati sono presentati come media ± SD. (A), curve di sopravvivenza (B) o grafici di punti violino, inclusi mediana (linea solida) e IQR (linee tratteggiate) (C–G). n = 9 per ogni gruppo infetto; n = 3 per il controllo non contaminato. I dati sono stati analizzati utilizzando un modello lineare a effetti misti che includeva interazioni di gruppo × tempo (A, C–G) o un modello di rischio proporzionale di Cox (B). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abbreviazioni; CON = controllo; pCO2 = pressione parziale diCO2; SE = S. epidermidis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Marcatori infiammatori circolanti nei maialini prematuri dopo infusione arteriosa con soluzione salina (CON) o infezione con S. epidermide vivo. (A, B) Conteggi circolanti di neutrofili e piastrine a 6, 12, 24 e 44 ore dopo l'infezione. (C) Livelli plasmici di TNF-α, IL-6 e IL-10 a 6, 12, 24 e 44 ore dopo l'infezione. I dati sono presentati come grafici di punti per violino, inclusi mediana (linea solida) e IQR (linee tratteggiate) (A–C). n = 9 per ogni gruppo infetto; n = 3 per il controllo non contaminato. I dati sono stati analizzati utilizzando un modello lineare a effetti misti che includeva interazioni di gruppo × tempo (A–C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abbreviazioni; CON = controllo; IL = interleucina; SE = S. epidermidis; TNF = fattore di necrosi tumorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Parametri biochimici plasmamici nei maialini preterme dopo infusione arteriosa con soluzione salina (CON) o infezione da S. epidermidis vivo (109 o 5 × 109 CFU/kg). (A–G) Livelli plasmici di albumina, colesterolo, ALP, ALAT, ASAT, creatinina e BUN al punto finale umano o all'eutanasia programmata 44 ore dopo l'infezione. I dati sono presentati come grafici a baffi che mostrano l'intervallo completo (da minimo a massimo) (A–G). I singoli dati in viola scuro indicano i maialini che hanno sviluppato sepsi. n = 9 per ogni gruppo infetto; n = 3 per il controllo non contaminato. I dati sono stati analizzati utilizzando un modello di regressione lineare multipla (A–G). *P < 0,05. Abbreviazioni; ALAT = alanina aminotransferasi; ALP = fosfatasi alcalina; ASAT = aspartato aminotransferasi; BUN = azoto ureico nel sangue; CON = controllo; SE = S. epidermidis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Importo totaleConcentrazione
Energia7762kJ3525kJ/L
Macronutrienti
Amminoacidi92g42g/L
Grasso66g30g/L
Glucosio221g100g/L
Micronutrienti
Na64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
Mg8MMOL4mmol/L
Ca4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
Cl93MMOL42mmol/L
Acetato78MMOL35mmol/L

Tabella 1: Composizione della nutrizione parenterale totale modificata. Le quantità e concentrazioni totali di energia, macronutrienti (amminoacidi, grassi e glucosio) e micronutrienti nella soluzione nutrizionale parenterale.

Figura supplementare 1: Cinetica della crescita di S. epidermidis WT-1457. I batteri sono stati coltivati in brodo di infusione cerebrale a 37 °C con tremori orbitali a 180 giri al minuto. La densità ottica è stata misurata a 600 nm nel tempo. I dati sono mostrati su scala logaritmica (A) e lineare (B) (n = 3 esperimenti indipendenti). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Un modello standardizzato di sepsi neonatale nei maialini pretermi è stato progettato per studiare un'infezione batterica sistemica in condizioni clinicamente rilevanti di immaturità neonatale. Il modello combina il controllo dell'età gestazionale, il supporto alla rianimazione e alla terapia intensiva, il momento dell'infezione e il campionamento longitudinale del sangue. Questo approccio mira a colmare il divario tra i sistemi sperimentali di roditori e quelli in vitro e la fisiologia complessa riscontrata nei neonati infetti. È importante sottolineare che questo modello è stato utilizzato per confermare l'associazione nota tra sesso, basso peso alla nascita ed età gestazionale, con la sensibilità alla sepsi osservata nei neonati pretermineumani 16,17,18.

I maiali sono un modello di grande rilevanza per la ricerca sulle infezioni grazie alle notevoli somiglianze con gli esseri umani nella funzione immunitaria e nella fisiologia. Componenti chiave del sistema immunitario innato, inclusi sottoinsiemi leucociti, segnalazione dei recettori per riconoscimento di pattern e risposte delle citochine, mostrano una stretta corrispondenza tra maiali e umani. Le principali differenze immunologiche tra i maialini neonati e gli esseri umani risiedono nelle risposte immunitarie adattative. Poiché non avviene trasferimento transplacentario di immunoglobulina G (IgG) durante la gestazione suina, i maialini neonati nascono ingenui a questoriguardo 19. Allo stesso modo, mentre le cellule B dei neonati non subiscono uno spostamento isoforme da IgM a IgG prima dei 3–6 mesi di età, le cellule B suine sono in grado di produrre risposte IgG poco dopola nascita 20.

In questo sistema modello, queste differenze vengono mitigate inducendo l'infezione poco dopo la nascita, prima che possano verificarsi risposte immunitarie adattative e fornendo immunoglobuline materne tramite trasfusione plasmatica. Questo approccio porta a livelli di IgG circolanti simili a quelli dei neonati molto prematuri soggetti a un trasferimento interrotto di IgG transplacentario a causa del partopretermine 17. Inoltre, la dimensione corporea relativamente grande alla nascita (~800 g) rafforza ulteriormente il modello, rispetto ai topi neonati (~3 g). Di conseguenza, influenze ambientali come temperatura, umidità e tensione dell'ossigeno somigliano maggiormente a quelle sperimentate dai neonati umani. Questa scala consente anche l'uso di apparecchiature di livello clinico, monitoraggio invasivo e modalità di assistenza di supporto, come l'accesso vascolare, il supporto respiratorio e il monitoraggio fisiologico continuo, che non sono fattibili nei modelli neonatali di roditori. In particolare, l'accesso vascolare per infusioni, come la nutrizione parenterale, nel modello del maiale pretermine avviene tramite un catetere arterioso ombelicale. Sebbene ciò contrasti con la via endovenosa standard utilizzata in neonatologia clinica, è necessaria dai vincoli anatomici dei maialini pretermini, dove i cateteri venali ombelicali raramente attraversano spontaneamente il dotto venoso e invece si malposizionano all'interno del parenchimaepatico 21. La consegna intra-arteriosa offre una via affidabile e riproducibile per l'infusione continua senza l'alto rischio di necrosi epatica associata a una dislocazione della vena ombelicale. Allo stesso modo, questo permette di prelevare il sangue arterioso per l'analisi dei gasometri.

L'infezione sistemica in questo modello è indotta dall'infusione intra-arteriosa di S. epidermides vivo, una delle principali cause di sepsi a insorgenza tardiva nelle unità di terapia intensivaneonatale 1,2. Tuttavia, un insieme diversificato di patogeni causa la sepsi neonatale, e gli stafilococchi coagulasi negativi, come S. epidermidis, sono anch'essi noti per causare infezioni meno gravi e un rischio di sepsi inferiore rispetto ad altri patogeni più virulenti, come E. coli 1,2. Sebbene il modello utilizzi un patogeno a bassa virulenza, il deterioramento clinico osservato, l'attivazione infiammatoria e l'instabilità fisiologica riflettono tutti caratteristiche chiave della sepsi neonatale. Il gruppo di controllo non infetto (n = 3) in questo studio funge da riferimento di base per dimostrare lo stato fisiologico dei maialini pretermini "sani" in condizioni di terapia intensiva identiche. Sebbene ciò comporti uno squilibrio di design, questi confronti sono pensati per rappresentare la risposta dell'ospite all'infezione. Come mostrato nella Figura 2, è stata osservata una chiara relazione dose-risposta con l'aumento delle dosi di S. epidermidis, coerente con i precedenti riscontri nei maialini infettati al giorno1 della vita 22. Solo i maialini che ricevevano la dose più alta di S. epidermidis si deterioravano fino agli estremi umani che richiedevano l'eutanasia. Tuttavia, entrambi i gruppi infetti svilupparono acidosi metabolica, mentre una componente respiratoria sostanziale (pCO₂ elevato) fu osservata solo nel gruppo ad alta dose di S. epidermidis. Analogamente, entrambi i gruppi hanno mostrato una marcata neutropenia a 6 ore dall'infezione, seguita da un reintegramento neutrofilo a 24 ore, maggiore nel gruppo a bassa dose. La trombocitopenia era presente anche in entrambi i gruppi, accompagnata da aumenti delle citochine plasmatiche e dei marcatori di lesione degli organi, con risposte più pronunciate nei maialini che ricevevano la dose più alta di S. epidermidis.

Nei maialini preterme, l'infezione da S. epidermidis al primo giorno postnatale induce gli stessi segni paraclinici di sepsi neonatale (acidosi metabolica, leucopenia, trombocitopenia, infiammazione), oltre a letargia, coagulopatia e consumo dicomplementi 17,22,23. L'infezione provoca anche disturbi sistemici nel metabolismo energetico, in particolare la riduzione della fosforilazione ossidativa mitocondriale, insieme a alterazioni nel proteoma e metaboloma plasmatico simili a quelle riportate nei pazienti con sepsineonatale 24,25,26. Inoltre, i maialini pretermine (90% di gestazione) hanno molte più probabilità di sviluppare la sepsi rispetto ai maialini nati a17 anni. La composizione nutrizionale influisce ulteriormente sulle risposte cliniche e immunologiche. La TPN a base di glucosio stimola il metabolismo glicolitico, che amplifica le risposte immunitarie pro-infiammatorie, compromettendo al contempo la tolleranza alla malattia nei tessutiperiferici 24,26. La combinazione di queste risposte è associata a lesioni organiche e a una progressione verso il fenotipo di sepsi27. La modulazione della composizione del TPN, sia riducendo il contenuto di glucosio sia sostituendo il glucosio con macronutrienti alternativi come galattosio, amminoacidi glucogeni o β-idrossibutirato28,29, attenua la risposta infiammatoria e preserva la tolleranza tissutale alle malattie. L'integrazione di glucosio elevata tramite TPN porta anche a iperglicemia (≈10–20 mM). Tuttavia, non è chiaro in che misura le risposte infiammatorie osservate legate alla glicolisi siano direttamente mediate da livelli elevati di glucosio nel sangue.

Le osservazioni sperimentali indicano differenze chiare nelle risposte cliniche a seconda del giorno postnatale dell'infezione. Sia il rischio di sviluppare la sepsi sia la gravità dei sintomi clinici sono più elevati quando l'infezione viene indotta poco dopo la nascita. L'induzione dell'infezione al terzo giorno postnatale porta a un fenotipo di sepsi più lieve con comportamenti di malattia, acidosi respiratoria e metabolica durante le prime 24 ore dopo l'induzione, seguita da un recupero clinico nonostante i marcatori elevati delle lesioni agli organi. I meccanismi alla base di queste differenze tra induzione precoce e tardiva sono attualmente sconosciuti e rappresentano un'area di indagine in corso. Tuttavia, l'omeostasi del glucosio dopo l'inizio della nutrizione parenterale migliora nei primi tre giorni postnatali nei maialini preterme, portando a una riduzione dell'iperglicemia nonostante un apporto simile di glucosio. In totale, variare il giorno postnatale dell'infezione e la fornitura di glucosio permette al modello di catturare caratteristiche sia di sepsi acuta grave che di sepsi potenzialmente letale, oppure di un fenotipo più lieve. Insieme, questi aggiustamenti permettono di testare interventi mirati adattati a fenotipi specifici di malattia. L'applicabilità clinica di questo modello potrebbe essere ulteriormente rafforzata allineandolo ai sistemi di punteggio neonatali consolidati legati alla sepsi, come il Sequential Organ Failure Assessment (nSOFA). Un sistema di punteggio basato su nSOFA in tempo reale non è stato implementato nello studio attuale a causa dell'inviabilità del monitoraggio continuo della pressione arteriosa e dei conteggi immediati delle piastrine necessari per il punteggio cardiovascolare ed ematologico. Futuri perfezionamenti del protocollo potrebbero incorporare un framework nSOFA adattato per categorizzare meglio la gravità della malattia.

Nonostante i suoi punti di forza traslazionali, questo modello presenta diverse limitazioni importanti. Questi esperimenti richiedono molte risorse, necessitando di strutture specializzate e personale altamente qualificato per eseguire il parto cesareo, la rianimazione neonatale, l'alloggio postnatale e la cura di porcellini prematuri. Gli esperimenti di infezione richiedono inoltre un monitoraggio continuo e pratico da parte di due o tre membri dello staff esperti per garantire il benessere animale e una raccolta affidabile dei dati, e il follow-up a lungo termine aumenta i costi. Rispetto ai modelli di roditori, la disponibilità di reagenti specifici per specie è più limitata, in particolare per immunoistochimica e citometria di flusso, anche se molti anticorpi umani possono essere utilizzati con successo dopo una validazione appropriata. Inoltre, la natura di allevamento esterno dei maiali comporta una notevole variazione biologica all'interno e tra cucciolate, rendendo necessari gruppi di dimensioni maggiori per rilevare differenze modeste nelle risposte infezionali. Sebbene questa variabilità aumenti la complessità sperimentale, riflette anche più da vicino l'eterogeneità osservata nelle popolazioni neonatali cliniche, aumentando così la rilevanza traslazionale del modello. In conclusione, questo protocollo convalidato per la sepsi neonatale sarà uno strumento utile per future indagini in neonatologia e per testare nuovi interventi preventivi e terapeutici.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal personale del gruppo di Pediatria Comparata dell'Università di Copenaghen e finanziato dalla Novo Nordisk Foundation (NNF23OC0085457 e NNF22OC0078747).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
 0.1–10 µL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 µL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 µL pipetteSartorius46886095
200 µL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 µL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 µL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

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