Questo protocollo descrive un metodo di imaging cellulare vitale in time-lapse per visualizzare la fagocitosi mediata da macrofagi dipendente da anticorpi di cellule tumorali del seno triplo negative marcate con proteina verde fluorescente, utilizzando macrofagi derivati da cellule mononucleate del sangue periferico e un microscopio automatizzato.
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Articolo metodologico
Imaging time-lapse della fagocitosi di cellule di cancro al seno triplo negativo marcate con proteina fluorescente verde da parte di macrofagi guidata da anticorpi
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La fagocitosi cellulare dipendente dagli anticorpi è un meccanismo chiave attraverso il quale i macrofagi inglobano cellule tumorali opsonizzate con anticorpi. Questo protocollo descrive un metodo di imaging in tempo reale su cellule vive per visualizzare la fagocitosi mediata da macrofagi dipendente da anticorpi nei confronti di cellule di carcinoma mammario triplo negativo che esprimono la proteina verde fluorescente e il marcatore CD24. I macrofagi sono ottenuti da cellule mononucleate del sangue periferico umano, differenziati con fattore stimolante le colonie di macrofagi e polarizzati mediante interferone gamma e lipopolisaccaride per generare un fenotipo pro-infiammatorio. Le cellule tumorali vengono opsonizzate con un anticorpo monoclonale anti-CD24 prima della co-coltura con i macrofagi, in un rapporto definito tra cellule effettrici e bersaglio. Gli eventi fagocitici vengono registrati nell'arco di 16 h mediante un microscopio automatizzato dotato di controllo ambientale per mantenere condizioni fisiologiche. L'imaging viene eseguito utilizzando canali in campo chiaro e in fluorescenza, consentendo l'identificazione delle cellule tumorali e il monitoraggio del loro inglobamento da parte dei macrofagi. Immagini rappresentative in time-lapse mostrano l'inglobamento progressivo delle cellule tumorali fluorescenti nel tempo. Per consentire una valutazione quantitativa, viene eseguito un saggio parallelo a punto terminale in condizioni di co-coltura identiche, nel quale le cellule tumorali non internalizzate vengono rimosse prima dell'imaging, permettendo una misurazione accurata degli eventi fagocitici. Questo metodo fornisce un approccio standardizzato e riproducibile per visualizzare in vitro la fagocitosi mediata da anticorpi nei macrofagi. In modo importante, l'integrazione dell'imaging in time-lapse con la quantificazione a punto terminale consente una valutazione complementare della cinetica e dell'entità della fagocitosi. Questo protocollo supporta la valutazione di anticorpi terapeutici e di immunoterapie antitumorali dirette ai macrofagi in un contesto in vitro controllato.
Introduzione
Il cancro al seno è la neoplasia più frequentemente diagnosticata tra le donne in tutto il mondo, con circa 2,3 milioni di nuovi casi ogni anno1. La malattia è clinicamente eterogenea e viene classificata in almeno quattro sottotipi molecolari principali in base allo stato dei recettori ormonali—recettore per gli estrogeni (ER) e recettore per il progesterone (PR)—e all'espressione dell'oncogene del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2)2. I tumori del tipo luminal A esprimono ER e/o PR senza sovraespressione di HER2 (ER/PR+ e HER2−); i tumori del tipo luminal B esprimono contemporaneamente ER/PR e HER2 (ER/PR+ e HER2+); i tumori HER2+ sono caratterizzati da un'elevata espressione di HER2 indipendentemente dallo stato dei recettori ormonali; infine, il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) non esprime nessuno dei tre marcatori (ER−, PR− e HER2−)2,3. Tra questi sottotipi, il TNBC rappresenta la forma clinicamente più difficile da trattare e costituisce circa il 15–20% di tutti i tumori mammari. I pazienti affetti da TNBC presentano il decorso della malattia più aggressivo, con prognosi peggiore e minore sopravvivenza globale a 5 anni, a causa della scarsa risposta alla chemioterapia convenzionale e dell'assenza di terapie mirate efficaci3,4. Inoltre, il TNBC mostra una spiccata tendenza alle metastasi viscerali, in particolare ai polmoni entro 5 anni dalla diagnosi, e i pazienti con TNBC avanzato o metastatico (mTNBC) hanno una sopravvivenza mediana che raramente supera i 2 anni5,6. Queste statistiche evidenziano la necessità urgente e insoddisfatta di nuove strategie terapeutiche per il TNBC.
L'ambiente tumorale (TME) svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro al seno e nell'evasione immunitaria. I macrofagi associati al tumore sono tra le cellule immunitarie più abbondanti all'interno del TME e sono stati recentemente riconosciuti come mediatori critici dell'immunità innata anti-tumorale7,8,9. Sebbene storicamente i macrofagi tumorali (TAM) siano stati suddivisi in stati pro-infiammatori "M1" e pro-tumorali "M2", questo modello binario non riesce a cogliere l'effettiva eterogeneità dei macrofagi. Al contrario, i TAM occupano uno spettro funzionale dinamico, che evolve in risposta ai diversi segnali biochimici presenti nel TME. In questo complesso contesto, le cellule tumorali alterano attivamente l'attività dei macrofagi attraverso varie strategie di evasione immunitaria, in particolare la sovraespressione di segnali "non mangiarmi". L'asse CD47/SIRPα è stato il primo checkpoint immunitario innato identificato in questo contesto6,10 e, più di recente, il CD24 si è rivelato un nuovo e potente segnale antifagocitico11,12. Il CD24 è una piccola glicoproteina di tipo mucina, fortemente glicosilata, ancorata alla membrana cellulare tramite un legame glicosilfosfatidilinositolo13. In condizioni fisiologiche, è espresso in diverse linee cellulari immunitarie, ma viene spesso sovraespresso nei tumori solidi, inclusi i tumori del seno, ovarico, pancreatico e colorettale14. Sulle cellule tumorali, il CD24 si lega al recettore inibitorio sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) espresso sui macrofagi. Questa interazione induce la fosforilazione dei domini del motivo inibitorio basato su tirosina dell'immunorecettore (ITIM) nella coda citoplasmatica del Siglec-10, attivando le fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che sopprimono il segnale fagocitico a valle11. È stato dimostrato che il blocco dell'interazione CD24/Siglec-10 mediante anticorpo monoclonale aumenta in modo significativo la fagocitosi da parte dei macrofagi di tumori umani esprimenti CD24. Il nostro recente studio ha inoltre mostrato che l'eliminazione genica di CD24a in cellule tumorali del seno aumenta la loro suscettibilità alla fagocitosi da parte dei macrofagi in un modello murino di carcinoma mammario triplo negativo9.
La fagocitosi mediata da cellule e da anticorpi (ADCP) è un meccanismo fondamentale attraverso il quale gli anticorpi indirizzano i macrofagi alla fagocitosi delle cellule tumorali15,16. Dopo essersi legati agli antigeni espressi dalle cellule tumorali, la regione Fc dell'anticorpo interagisce con i recettori Fcγ (FcγRs) presenti sui macrofagi, innescando cascate di segnalazione intracellulari che portano al riarrangiamento del citoscheletro, alla formazione della coppa fagocitica e all'inglobamento della cellula bersaglio17.
In questo studio, abbiamo sviluppato e validato un protocollo di imaging in tempo reale su cellule vive per misurare la fagocitosi mediata da anticorpi di cellule tumorali del seno da parte di macrofagi. Il metodo utilizza macrofagi derivati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di donatori umani sani, differenziati con il fattore di stimolazione delle colonie dei macrofagi (M-CSF) e successivamente stimolati con lipopolisaccaride (LPS) e interferone gamma (IFN-γ). L'analisi mediante citometria a flusso ha confermato l'upregolazione di CD80 all'interno della popolazione CD11b⁺ dopo la stimolazione (Figura 1), supportando il fenotipo classico di attivazione. Questo stato di attivazione conferisce una robusta capacità di fagocitosi mediata da anticorpi, rendendolo particolarmente adatto alla valutazione della fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP). Le cellule tumorali del seno positive per CD24, marcate con GFP, fungono da cellule bersaglio e vengono opsonizzate con un anticorpo monoclonale terapeutico anti-CD24 prima della co-coltura. Gli eventi fagocitici vengono registrati per un periodo di 16 h mediante un microscopio automatizzato in condizioni ambientali controllate. Per consentire una valutazione quantitativa in parallelo con una visualizzazione dinamica, viene eseguito un saggio endpoint separato in condizioni di co-coltura identiche, permettendo una misurazione rigorosa della fagocitosi dopo la rimozione delle cellule bersaglio non internalizzate. Questo protocollo fornisce una piattaforma standardizzata, riproducibile e ricca di informazioni visive per valutare l'ADCP mediata da un anticorpo anti-CD24. In particolare, l'integrazione dell'imaging in time-lapse con una strategia complementare di quantificazione basata su endpoint consente la valutazione simultanea della cinetica e dell'entità della fagocitosi. Il metodo può essere adattato per indagare altri bersagli immunoterapici diretti ai macrofagi. Questo protocollo è particolarmente indicato per valutare l'ADCP mediata da anticorpi monoclonali terapeutici diretti contro antigeni di superficie sulle cellule tumorali. È adatto per lo screening comparativo di anticorpi candidati, la caratterizzazione dose-risposta e studi meccanicistici sull'interazione Fc–FcγR, inclusi gli effetti del blocco dei segnali "non mangiarmi" (ad esempio, CD47–SIRPα). Poiché il saggio utilizza macrofagi umani primari, è anche appropriato per studi traslazionali che richiedono la valutazione della variabilità tra donatore e donatore prima dello sviluppo clinico.
Figura 1. Generazione e validazione mediante citometria a flusso di macrofagi stimolati con IFN-γ/LPS ottenuti da cellule mononucleate del sangue periferico. Pannello superiore: le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono isolate da donatori sani mediante centrifugazione su gradiente di densità utilizzando soluzione di Ficoll a 400 × g per 30 min a 20°C, con tutti i reagenti pre-equilibrati a 20°C ± 2°C. Le PBMC isolate vengono coltivate nel mezzo ImmunoCult-SF integrato con 100 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) per 7 giorni per indurre la differenziazione in macrofagi (giorno 0–7), con aggiunta di mezzo al giorno 5. Al giorno 8, i macrofagi differenziati vengono stimolati con 100 ng/mL di IFN-γ e 1 µg/mL di LPS per 48 h (giorno 8–10). Le cellule vengono quindi sottoposte ad analisi mediante citometria a flusso. Pannello inferiore: analisi citometrica dei macrofagi. Le cellule sono state marcate con un pannello di superficie costituito da CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5, seguito dall'aggiunta di DAPI prima dell'acquisizione per escludere le cellule morte. Strategia di gating: le cellule sono state innanzitutto selezionate in base alla vitalità (DAPI⁻), quindi identificate come CD11b⁺ in un grafico CD11b-FITC versus FSC-A per confermare l'identità macrofagica. Gli eventi vitali CD11b⁺ sono stati successivamente analizzati in un grafico a dispersione CD80 versus CD206 per confermare la popolazione CD80⁺CD206⁻ indotta dalla stimolazione con IFN-γ/LPS. A destra: grafico a dispersione rappresentativo di CD11b-FITC versus FSC-A che mostra come il 99,8% delle cellule selezionate fosse CD11b⁺, confermando l'identità macrofagica. A sinistra: la maggior parte delle cellule CD11b⁺ rientrava nel quadrante CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), indicando il previsto fenotipo pro-infiammatorio nelle condizioni di stimolazione applicate. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Gli utenti dovrebbero considerare diversi limiti nell'applicare questa tecnica. In primo luogo, la variabilità tra donatori nei macrofagi derivati da PBMC può introdurre una varianza sostanziale nell'output fagocitico, e si raccomanda di utilizzare più donatori (n ≥ 3), riportando i dati individuali di ciascun donatore insieme ai risultati raggruppati. In secondo luogo, il formato di co-coltura in 2D non riproduce il microambiente tumorale, e i risultati dovrebbero essere convalidati in modelli tridimensionali o in vivo prima di trarre conclusioni cliniche. In terzo luogo, la finestra di imaging di 16 ore cattura eventi fagocitici precoci ma non riflette processi a lungo termine come la presentazione dell'antigene o l'attivazione immunitaria secondaria. Pertanto, l'uso combinato di imaging in tempo reale e quantificazione al termine dell'esperimento fornisce un quadro complementare che migliora sia l'interpretabilità che la riproducibilità delle misurazioni di ADCP.
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Protocollo
Questo protocollo prevede l'uso di macrofagi primari derivati da campioni di sangue di donatori sani. La raccolta e la lavorazione dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Etico (IRB) della China Medical University.
1. Preparazione di macrofagi derivati da PBMC
NOTA: Eseguire tutte le procedure che coinvolgono sangue umano previa approvazione del comitato etico istituzionale (ad esempio, CMUH IRB). Ottenere il consenso informato da donatori sani prima della raccolta del sangue.
ATTENZIONE: manipolare tutti i prodotti derivati dal sangue umano in condizioni di Livello di Sicurezza Biologica 2, adottando precauzioni universali.
- Prelevamento del sangue
- Prelevare sangue intero da un donatore sano in provette vacutainer da 10 mL rivestite con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Diluizione del sangue
- Diluire il sangue intero in rapporto 1:1 con soluzione salina tamponata al fosfato fredda (PBS; priva di Ca2⁺ e Mg2⁺) (ad esempio, 10 mL di sangue + 10 mL di PBS).
- Mescolare capovolgendo da tre a cinque volte.
NOTA: Mantenere il PBS in ghiaccio prima dell'uso. La bassa temperatura aiuta a preservare la vitalità cellulare durante l'elaborazione.
- Stratificazione su gradiente di densità
- Stratificare con attenzione il sangue diluito sopra il Ficoll–Paque PLUS in rapporto volumetrico 2:1 (v/v) in una provetta conica (ad esempio, 8 mL di sangue su 4 mL di Ficoll in una provetta da 15 mL, oppure 30 mL su 15 mL in una provetta da 50 mL).
- Portare sia il sangue diluito che il Ficoll–Paque PLUS alla temperatura di 20°C ± 2°C prima della stratificazione.
- Prelevare il Ficoll–Paque PLUS dallo stoccaggio a 4°C almeno 30 minuti prima dell'uso, oppure riscaldarlo brevemente in un bagno termostatato a 20°C ± 2°C.
- Non utilizzare reagenti freddi, poiché la densità del Ficoll è calibrata per 20°C ± 2°C e deviazioni comprometterebbero l'efficienza della separazione e il rendimento dei PBMC.
NOTA: Inclinare la provetta a un angolo di 45° e pipettare lentamente il sangue lungo la parete per mantenere un'interfaccia netta. Non disturbare lo strato di Ficoll.
- Centrifugazione
- Centrifugare a 400 × g per 30 minuti a 20°C con freno disattivato (Figura 1).
NOTA: L'uso del freno altererebbe il gradiente di densità e ridurrebbe il rendimento dei PBMC.
- Centrifugare a 400 × g per 30 minuti a 20°C con freno disattivato (Figura 1).
- Recupero dei PBMC
- Aspirare con attenzione solo lo strato del buffy coat (l'interfaccia biancastro tra il plasma e lo strato di Ficoll), senza disturbare il plasma sovrastante né lo strato di Ficoll sottostante, utilizzando una pipetta serologica.
- Trasferire lo strato raccolto in una nuova provetta conica da 50 mL.
- Lavaggio dei PBMC
- Aggiungere PBS fino a raggiungere un volume totale di 25 mL in una provetta conica da 50 mL.
- Utilizzare una provetta da 50 mL per garantire una corretta centrifugazione e bilanciamento.
- Centrifugare a 300 × g per 10 minuti.
- Lisi dei globuli rossi
- Eliminare il soprannatante.
- Risospendere il pellet in 5 mL di tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC) pipettando delicatamente su e giù con una pipetta serologica fino a completa dispersione del pellet e alla scomparsa di grumi visibili.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
ATTENZIONE: È necessaria una dispersione completa per garantire una lisi uniforme; tuttavia, evitare pipettaggi vigorosi o l'uso del vortex, che potrebbero danneggiare i PBMC. Non superare i 5 minuti di incubazione con il tampone per la lisi dei globuli rossi, poiché un'esposizione prolungata potrebbe compromettere la vitalità dei PBMC.
- Formazione del pellet dei PBMC
- Centrifugare a 500 × g per 5 minuti per formare il pellet dei PBMC e rimuovere i detriti derivanti dalla lisi dei globuli rossi.
- Risospensione finale
- Eliminare il soprannatante.
- Risospendere il pellet in 5 mL di mezzo ImmunoCult-SF per macrofagi.
NOTA: In condizioni standard, 10 mL di sangue intero producono tipicamente da 1,5 a 2,0 × 107 PBMC.
2. Differenziamento dei macrofagi (giorni 0–7)
NOTA: utilizzare piastre di Petri non trattate per colture di tessuti (TC) per selezionare macrofagi differenziati derivati da monociti mediante adesione. I linfociti non aderenti verranno rimossi con lavaggi successivi durante la coltura.
- Giorno 0: Semina delle cellule
- Eseguire il conteggio cellulare e seminare 1 × 107 PBMC in una piastra di Petri da 10 cm non trattata per coltura cellulare (non-TC).
- Portare il volume totale a 10 mL utilizzando mezzo ImmunoCult-SF per macrofagi integrato con 100 ng/mL di M-CSF (preparato aggiungendo direttamente la soluzione madre di M-CSF al mezzo completo immediatamente prima dell'uso e mescolando con inversioni delicate).
NOTA: Il protocollo può essere scalato proporzionalmente in base alle variazioni del rendimento di PBMC del donatore, utilizzando come riferimento una densità di semina di partenza pari a 1 × 106 cellule/mL.
- Incubazione e monitoraggio
- Incubare a 37°C con 5% di CO₂ in un incubatore umidificato.
- Monitorare quotidianamente la formazione di aggregati di monociti in sospensione e la comparsa di cellule aderenti.
NOTA: Durante la differenziazione, i monociti aumenteranno gradualmente di dimensione e formeranno aggregati. Alcuni monociti inizieranno ad aderire alla piastra. In questa fase non è richiesto alcun intervento.
- Giorno 5: Supplementazione del mezzo
- Aggiungere delicatamente 5 mL di mezzo fresco ImmunoCult-SF per macrofagi integrato con 100 ng/mL di M-CSF alla piastra, avendo cura di non disturbare i macrofagi aderenti.
- Proseguire la coltura per ulteriori 2 giorni (fino al Giorno 7).
ATTENZIONE: Aggiungere il mezzo fresco delicatamente lungo il bordo della piastra per evitare di disturbare i macrofagi aderenti, poiché un'interruzione meccanica potrebbe compromettere l'efficienza della differenziazione e il rendimento cellulare.
NOTA: Evitare di sostituire completamente il mezzo per preservare i fattori autocrini/paracrini che supportano la differenziazione dei macrofagi.
- Giorno 7: Valutazione morfologica
- Esaminare l'efficienza della differenziazione dei macrofagi al microscopio invertito.
- Le cellule aderenti mostrano una morfologia tipica dei macrofagi: di grandi dimensioni, appiattite e con forma irregolare, dotate di pseudopodi visibili.
- Al giorno 7 dovrebbero essere visibili macrofagi ben differenziati.
ATTENZIONE: La valutazione morfologica al giorno 7 rappresenta un prerequisito fondamentale per la successiva validazione mediante citometria a flusso. I macrofagi ben differenziati devono essere chiaramente visibili al microscopio, e una percentuale elevata di cellule aderenti con morfologia macrofagica riflette una maggiore efficienza di differenziazione (una confluenza di circa il 70% di macrofagi aderenti con morfologia caratteristica è considerata indicativa di una differenziazione riuscita). Le colture che mostrano scarsa adesione, cellule prevalentemente arrotondate o una differenziazione morfologica scadente difficilmente forniranno risultati affidabili in citometria a flusso e non dovrebbero procedere con stimolazione e marcatura.
3. Polarizzazione dei macrofagi (giorni 8–10)
- Raccolta e chiarifica del mezzo condizionato
- Al giorno 8, aspirare con attenzione i 15 mL di mezzo dalla piastra di coltura senza disturbare i macrofagi aderenti e trasferirli in un tubo conico sterile da 50 mL.
- Centrifugare il mezzo raccolto a 400 × g per 5 minuti per formare un pellet di detriti cellulari.
- Conservare il sopranatante chiarificato per il passaggio successivo.
- Stimolazione con interferone gamma (IFN-γ) e lipopolisaccaride (LPS)
- Trasferire i 15 mL di sopranatante chiarificato in un nuovo tubo sterile e aggiungere 100 ng/mL di IFN-γ e 1 µg/mL di LPS.
- Mescolare accuratamente aspirando e dispensando delicatamente con una pipetta (5–10 volte) per garantire una distribuzione uniforme delle citochine senza introdurre bolle.
- Riportare l'intero volume di 15 mL di mezzo arricchito con citochine nella piastra di coltura originale, pipettando delicatamente lungo la parete interna per evitare di disturbare i macrofagi aderenti.
- Incubare a 37°C con 5% di CO₂ per 48 ore (dal giorno 8 al giorno 10).
NOTA: Utilizzare mezzo condizionato (vecchio) per preservare i fattori autocrini/paracrini. Questa combinazione di IFN-γ e LPS viene impiegata per polarizzare i macrofagi verso un fenotipo pro-infiammatorio. Nelle condizioni di stimolazione con IFN-γ (100 ng/mL) e LPS (1 µg/mL) utilizzate in questo protocollo, i macrofagi mostrano cambiamenti morfologici caratteristici, inclusi lamellipodi allungati compatibili con uno stato attivato pro-infiammatorio, nonché espressione di CD11b e CD80.
ATTENZIONE: Manipolare il LPS seguendo adeguate procedure di sicurezza di laboratorio, poiché si tratta di un endotossina bioattiva che può causare risposte infiammatorie in caso di esposizione.
4. Conferma dei marcatori del fenotipo infiammatorio dei macrofagi stimolati con IFN-γ e LPS mediante citometria a flusso
- Raccolta delle cellule
- Raccogliere un sottoinsieme di macrofagi polarizzati al Giorno 10 per l'analisi fenotipica.
- Aggiungere 10 mM EDTA in PBS e incubare per 10–15 min a 37°C.
- Staccare le cellule mediante pipettaggio delicato.
NOTA: Prolungare l'incubazione con EDTA per ulteriori 30 min a 37°C se le cellule rimangono aderenti, quindi ripetere il pipettaggio delicato. Evitare pipettaggio vigoroso o raschiatura meccanica per preservare la vitalità cellulare e l'integrità dei marcatori di superficie.
- Preparazione della colorazione con anticorpi
- Colorare le cellule con anticorpi coniugati a fluorocromo contro CD11b (marcatore di linea pan-macrofagico), CD80 (marcatore infiammatorio) e CD206 (marcatore anti-infiammatorio utilizzato come marcatore negativo per l'esclusione nell'identificazione del fenotipo infiammatorio).
- Procedura di colorazione
- Trasferire 5 × 105 macrofagi staccati in un tubo per citometria a flusso contenente 100 µL di PBS freddo.
- Aggiungere gli anticorpi CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5 a una concentrazione finale di 1 µg/mL ciascuno.
- Mescolare la sospensione cellulare mediante pipettaggio delicato.
- Incubare i campioni sul ghiaccio per 1 h, protetti dalla luce.
- Centrifugare i campioni a 300 × g per 1 min a 4°C.
- Aspirare con attenzione il soprannatante.
- Aggiungere 0,5 mL di PBS freddo per lavare il pellet cellulare.
- Centrifugare i campioni a 300 × g per 1 min a 4°C.
- Eliminare il soprannatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 µL di PBS freddo.
- Aggiungere DAPI a una concentrazione finale di 1 µg/mL.
NOTA: Includere controlli isotipici appropriati e un colorante per la vitalità (ad es. DAPI o Viobility 405/452 Fixable Dye).
- Analisi mediante citometria a flusso
- Acquisire i campioni colorati utilizzando un citometro a flusso.
- Confermare l'espressione di CD11b e CD80 nella popolazione di macrofagi.
- Procedere al saggio di fagocitosi solo dopo aver confermato l'espressione dei marcatori compatibile con un fenotipo infiammatorio.
- Acquisizione e configurazione della citometria a flusso
- Configurazione dello strumento
- Configurare il citometro a flusso utilizzando i seguenti canali: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) e PerCP-Cy5.5 (CD206).
- Impostare il parametro di acquisizione per raccogliere 10.000 eventi per campione all'interno del gate genitore definito.
- Calibrazione della soglia e del guadagno
- Aprire quattro diagrammi a dispersione che mostrano FSC sull'asse x e un canale fluoroforo sull'asse y.
- Preparare cellule colorate con anticorpi di controllo isotipico corrispondenti a ciascun fluoroforo.
- Acquisire i campioni di controllo isotipico.
- Regolare il guadagno per ciascun canale in modo da posizionare la popolazione di controllo isotipico al di sotto di 101 sulla scala logaritmica.
- Utilizzare questa soglia per definire i livelli di segnale di fondo.
NOTA: Utilizzare un intervallo di scala logaritmica compreso tra 101 e 101·5 per stabilire una separazione affidabile tra segnale di fondo e segnale specifico.
- Compensazione
- Aggiungere una goccia di perle di compensazione in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere l'anticorpo coniugato al fluoroforo corrispondente a una concentrazione finale di 1 µg/mL.
- Incubare per 30 min sul ghiaccio, protetti dalla luce.
- Centrifugare a 400 × g per 1 min.
- Eliminare il soprannatante.
- Risospenderle le perle in 200 µL di PBS freddo.
- Acquisire i controlli monocromatici.
- Applicare la compensazione spettrale per correggere l'overlap dei fluorofori.
- Strategia di gating
- Selezione delle cellule vitali
- Visualizzare Pacific Blue/V450 (DAPI) sull'asse y e FSC sull'asse x.
- Applicare un gate sugli eventi DAPI-negativi (al di sotto di 101) per selezionare le cellule vitali.
- Identificazione dei macrofagi
- Impostare la popolazione di cellule vitali come gate genitore.
- Visualizzare FITC (CD11b) sull'asse y e FSC sull'asse x.
- Applicare un gate sugli eventi CD11b⁺ (al di sopra di 101).
- Identificazione del fenotipo infiammatorio
- Impostare la popolazione CD11b⁺ come gate genitore.
- Visualizzare PE (CD80) sull'asse y e PerCP-Cy5.5 (CD206) sull'asse x.
- Applicare un gating a quadranti a 101.5 su entrambi gli assi.
- Identificare le cellule CD80⁺CD206⁻ nel quadrante in alto a sinistra (Q1).
- Selezione delle cellule vitali
- Configurazione dello strumento
- Criteri di accettazione
- Confermare che ≥90% delle cellule all'interno del gate genitore CD11b⁺ siano CD80⁺CD206⁻.
- Procedere al saggio di fagocitosi solo quando viene raggiunta questa soglia.
- Ripetere l'isolamento dei PBMC, la differenziazione con M-CSF e la stimolazione con IFN-γ/LPS se i campioni non soddisfano questo criterio.
5. Saggio di fagocitosi mediata da anticorpi
NOTA: verificare un'espressione stabile di GFP nelle cellule tumorali prima dell'allestimento del saggio. Confermare l'espressione di CD24 sulle cellule bersaglio prima del saggio. Utilizzare cellule tumorali con una positività al CD24 compresa tra il 50% e il 100% per ottenere prestazioni ottimali. Le cellule MDA-MB-468 utilizzate in questo protocollo mostrano una positività al CD24 del 100%.
- Seeding dei macrofagi
- Sezionare i macrofagi stimolati con IFN-γ e LPS, come validato nel Passaggio 4, a 2 × 105 cellule per pozzetto in una piastra da coltura cellulare a 24 pozzetti.
- Incubare la piastra a 37°C in condizioni statiche con 5% di CO₂ per 12–16 h per consentire l'adesione cellulare (Figura 2A).
NOTA: Assicurarsi di un'adesione solida dei macrofagi prima di procedere. I macrofagi scarsamente aderenti potrebbero staccarsi durante l'acquisizione delle immagini e alterare i risultati.
- Preparazione delle cellule tumorali
- Coltivare cellule di carcinoma mammario CD24-positive etichettate con GFP (MDA-MB-468) fino a una confluenza del 70%–80%.
- Aspirare il mezzo di coltura.
- Lavare il monostrato cellulare una volta con PBS.
- Distacco delle cellule tumorali
- Aggiungere 10 mM di EDTA in PBS alla piastra di coltura.
- Incubare le cellule a 37°C per 5–10 min.
- Staccare le cellule mediante pipettaggio delicato per ottenere un completo rilascio cellulare.
NOTA: Evitare l'uso di tripsina per il distacco cellulare. La digestione enzimatica potrebbe scindere CD24 dalla superficie cellulare e compromettere il legame con l'anticorpo.
- Raccolta e conteggio delle cellule tumorali
- Raccogliere le cellule distaccate in un tubo da centrifuga.
- Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 min.
- Eliminare il soprannatante.
- Risospendere il pellet cellulare in mezzo RPMI completo .
- Contare le cellule vitali.
- Opsonizzazione con anticorpi delle cellule tumorali
- Risospenderle a una densità di 2 × 105 cellule/mL in 0,5 mL di mezzo RPMI completo .
- Aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-CD24 a una concentrazione finale di 1 µg/mL.
- Mescolare la sospensione cellulare mediante pipettaggio delicato per garantire una distribuzione uniforme dell'anticorpo.
- Incubare le cellule a 37°C per 30 min in condizioni statiche.
NOTA: Includere un controllo con IgG di tipo isotopico alla stessa concentrazione come controllo negativo per la fagocitosi dipendente dagli anticorpi.
- Preparazione per la co-coltura
- Non lavare le cellule dopo l'opsonizzazione.
- Procedere direttamente alla co-coltura per mantenere il rivestimento di anticorpi sulla superficie cellulare.
- Impostazione della co-coltura
- Aggiungere 1 × 105 cellule tumorali del carcinoma mammario opsonizzate con anticorpi ed etichettate con GFP in ogni pozzetto contenente macrofagi.
- Mantenere un rapporto effettore:bersaglio di 2:1.
NOTA: Regolare il rapporto effettore:bersaglio in base al disegno sperimentale. Utilizzare rapporti macrofagi:cellule tumorali più elevati rispetto al rapporto 2:1 descritto (ad esempio, 3:1 o 5:1) per aumentare la frequenza di contatto tra cellule e potenziare il rilevamento degli eventi fagocitici.
Figura 2. Imaging a intervalli di tempo della fagocitosi cellulare mediata da anticorpi. (A) Panoramica schematica del sistema di co-coltura e dell’impostazione per l’imaging a intervalli di tempo. I parametri di acquisizione includevano un intervallo di 10 min per una durata totale di acquisizione di 16 h (97 fotogrammi), utilizzando un obiettivo 10× con contrasto di fase e canali GFP. (B) Immagini rappresentative a intervalli di tempo da 1 h a 16 h che mostrano eventi fagocitici caratterizzati dall’internalizzazione di cellule tumorali GFP-positive da parte dei macrofagi nel tempo. Cerchi tratteggiati gialli evidenziano eventi fagocitici rappresentativi. Nel canale del contrasto di fase, le cellule tumorali inglobate appaiono come strutture intracellulari brillanti all’interno del citoplasma del macrofago (frecce bianche). Nel canale GFP, la fluorescenza localizzata all’interno dei macrofagi conferma l’internalizzazione. (C) Viste ingrandite di eventi fagocitici rappresentativi a 0, 1, 4 e 16 h, che illustrano il processo sequenziale di inglobamento mediato da macrofagi di cellule tumorali marcate con GFP. La sequenza di immagini è stata selezionata come rappresentativa sulla base di una chiara visualizzazione degli eventi fagocitici mediati da macrofagi. Le frecce bianche indicano macrofagi che interagiscono con e internalizzano le cellule bersaglio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
6. Imaging in time-lapse (sistema automatizzato per l'imaging di cellule vive)
NOTA: configurare il protocollo di imaging utilizzando un sistema automatizzato per l'imaging di cellule vive Lionheart e il software Gen5 per l'imaging automatizzato di cellule vive prima del saggio. Seguire un'adeguata formazione prima di utilizzare il sistema di imaging per garantire un'installazione accurata, prestazioni ottimali e un uso sicuro.
- Preparazione dello strumento
- Accendere il sistema di imaging, il modulo di controllo ambientale e la fornitura di gas CO₂ almeno 1 ora prima dell’imaging.
- Aprire il pannello Controllo dell’ambiente nel software di imaging cellulare automatizzato in tempo reale.
- Impostare la temperatura a 37°C e il CO₂ al 5%.
- Verificare che la temperatura della camera si stabilizzi entro ± 0,2°C e il CO₂ al 5,0% ± 0,1% prima di caricare la piastra.
- Configurazione della piastra
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti nella camera di imaging del sistema.
- Configurazione iniziale
- Aprire il Task Manager del software di imaging cellulare automatizzato in tempo reale.
- Selezionare [Modalità manuale imager].
- Fare clic su [Cattura ora] per inizializzare i parametri di imaging.
- Selezionare un obiettivo 10×.
- Selezionare "microplaca" come impostazione del filtro.
- Selezionare una piastra a 24 pozzetti dalla libreria piastre del software di imaging cellulare automatizzato in tempo reale.
- Messa a fuoco e configurazione dell’immagine
- Selezionare il canale Contrasto di fase.
- Selezionare un pozzetto rappresentativo (ad esempio, A1).
- Attivare l’autofocus prima dell’acquisizione in time-lapse.
- Acquisire un’immagine utilizzando l’icona della fotocamera.
- Verificare la morfologia cellulare e la qualità della messa a fuoco.
- Navigare verso [Processa/Analizza].
- Selezionare [Crea esperimento da un insieme di immagini] per configurare l’esperimento.
- Parametri di acquisizione in time-lapse
- Aprire il pannello delle impostazioni [Procedura].
- Impostare la temperatura a 37°C e il CO₂ al 5%.
- Sotto [Avvia cinetica], impostare la durata dell’esecuzione a 16:00:00.
- Impostare l’intervallo di imaging a 0:10:00.
- Impostare il numero totale di letture a 97.
- Utilizzare un intervallo di imaging di 10–15 min per bilanciare risoluzione temporale e fototossicità durante la cattura di eventi fagocitici precoci.
- Configurazione dei canali di imaging
- Impostare il Canale 1 su Contrasto di fase.
- Impostare il Canale 2 su GFP (Es 469/35, Em 525/39).
- Selezionare un obiettivo 10× per un campo visivo e una risoluzione ottimali.
- Impostare illuminazione, tempo di integrazione e guadagno su [Auto], oppure regolare manualmente.
- Utilizzare un tempo di esposizione tipico per GFP di 100–300 ms per evitare la saturazione del segnale.
- Applicare le stesse impostazioni di imaging a tutti i pozzetti.
- Configurazione delle posizioni di imaging
- Aprire il menu [Definisci beacon].
- Disattivare l’acquisizione in Z-stack.
- Disattivare l’acquisizione in mosaico.
- Eseguire l’imaging su un singolo piano focale.
- Definire manualmente le posizioni di imaging selezionando aree rappresentative e non sovrapposte all’interno di ciascun pozzetto utilizzando l’icona del microscopio.
- Mantenere identiche le posizioni di imaging in tutti i punti temporali.
- Selezionare almeno 4–6 campi visivi per pozzetto.
- Acquisizione in time-lapse
- Fare clic su [Play] per avviare l’imaging automatizzato in time-lapse.
- Esportazione e visualizzazione dei dati
- Aprire il file dell’esperimento salvato dopo l’acquisizione.
- Selezionare le posizioni di imaging.
- Esportare i dati in time-lapse in formato MP4.
- Aprire lo [Strumento di elaborazione].
- Applicare [Deconvoluzione dell’immagine] se necessario per migliorare la visualizzazione e identificare eventi rappresentativi di fagocitosi.
NOTA: Utilizzare l’imaging in time-lapse esclusivamente per una visualizzazione qualitativa. Cellule tumorali GFP-positive non fagocitate possono sovrapporsi o associarsi transitoriamente ai macrofagi, generando segnali falsi positivi. Eseguire un’analisi quantitativa mediante un saggio endpoint separato.
7. Quantificazione Finale della Fagocitosi
- Rimozione delle cellule non internalizzate
- Eseguire il saggio in condizioni di co-coltura identiche.
- Terminare l'esperimento a 4 h.
- Rimuovere il mezzo di coltura.
- Aggiungere 10 mM EDTA in PBS.
- Incubare a 37°C per 5 min.
- Lavare delicatamente con PBS per rimuovere le cellule positive per GFP non internalizzate.
- Aggiungere mezzo fresco per macrofagi.
- Acquisizione delle immagini per la quantificazione
- Acquisire immagini utilizzando i canali a contrasto di fase e GFP.
- Acquisire almeno 4–6 campi per pozzetto.
- Analizzare un minimo di tre pozzetti per condizione.
- Definizione degli eventi fagocitici
- Identificare i macrofagi contenenti segnali positivi per GFP completamente racchiusi all'interno del contorno cellulare.
- Analisi delle immagini
- Aprire le immagini nel software ImageJ.
- Utilizzare il plugin Cell Counter.
- Contare il numero totale di macrofagi.
- Contare i macrofagi contenenti cellule positive per GFP internalizzate.
- Calcolo dell'indice di fagocitosi
- Calcolare:
- Eseguire l'analisi in maniera cieca.
- Ripetere l'analisi in almeno tre esperimenti indipendenti.
- Calcolare:
- Presentazione dei dati
- Presentare immagini rappresentative in time-lapse in ordine cronologico (Figura 2B e Figura 2C).
- Presentare immagini rappresentative del punto finale (Figura 3A e Figura 3B).
Figura 3. Quantificazione della fagocitosi macrofagica mediata da anticorpi mediante analisi a punto finale. (A) Immagini rappresentative in contrasto di fase e di fluorescenza GFP di macrofagi co-coltivati con cellule tumorali del seno marcate con GFP per 4 h, seguite dalla rimozione delle cellule non ingerite mediante trattamento con EDTA. I canali in contrasto di fase e GFP sono stati sovrapposti per identificare i macrofagi e le cellule GFP-positive internalizzate. I macrofagi (contatore 0) e i macrofagi GFP-positivi che hanno effettuato l'ingestione (contatore 1) sono stati enumerati utilizzando il plugin Cell Counter in ImageJ. Nella condizione controllo IgG non sono stati osservati eventi fagocitici, mentre il trattamento con anticorpo monoclonale anti-CD24 ha determinato segnali GFP-positivi intracellulari evidenti all'interno dei macrofagi, indicativi di una fagocitosi attiva. Barra della scala = 200 µm. (B) Quantificazione dell'indice di fagocitosi, definito come la percentuale di macrofagi contenenti cellule GFP-positive internalizzate rispetto alla popolazione totale di macrofagi. L'anticorpo monoclonale anti-CD24 ha aumentato significativamente l'indice di fagocitosi rispetto al controllo IgG (0,00 ± 0,00% vs. 18,76 ± 4,01%, media ± DS; n = 6 campi per gruppo; ***p < 0,001, test t non appaiato di Welch). I dati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Risultati
La corretta generazione e polarizzazione di macrofagi da PBMC è stata confermata mediante valutazione morfologica e analisi di citometria a flusso (Figura 1). I PBMC isolati mediante centrifugazione su gradiente di densità sono stati coltivati in un mezzo integrato con M-CSF, ottenendo cellule aderenti con morfologia tipica dei macrofagi entro il Giorno 7. Dopo stimolazione con IFN-γ e LPS, le cellule hanno mostrato un fenotipo compatibile con l'attivazione nelle condizioni applicate. L'anal...
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Discussione
Diversi passaggi di questo protocollo sono fondamentali per ottenere risultati affidabili e riproducibili. In primo luogo, la qualità e la purezza dell'isolamento dei PBMC influenzano direttamente il rendimento dei macrofagi e l'efficienza della differenziazione. Un'accurata stratificazione del sangue diluito sul gradiente di Ficoll e una centrifugazione con freno disattivato sono essenziali per preservare l'interfaccia del buffy coat. Un'insufficiente lisi dei globuli rossi o un'incubazione eccessiva con il buffer lisic...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University, nell'ambito del programma Featured Areas Research Center Program nel quadro del progetto Higher Education Sprout Project del Ministero dell'Istruzione (MOE) a Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).
Ringraziamo il Centro di Biologia del Cancro e Terapie di Precisione per aver fornito finanziamenti e supporto accademico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione madre di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,5 M | Sigma-Aldrich (o equivalente) | E7889 (o equivalente) | Utilizzato per preparare una soluzione lavorativa di EDTA 10 mM in PBS per il distacco cellulare |
| piastre per coltura cellulare a 24 pozzetti (trattate per coltura cellulare) | Corning (o equivalente) | 3524 | Utilizzato per la coltura congiunta di macrofagi e cellule tumorali durante il saggio di fagocitosi |
| Anticorpo anti-CD206 umano (citometria a flusso) | BioLegend (o equivalente) | 321122 (o equivalente) | Marcatore per il fenotipo macrofagico alternativo |
| Anticorpo monoclonale anti-umano CD24 | Thermo Fisher Scientific (o equivalente) | MA1-91384 (o equivalente) | Utilizzato per opsonizzare le cellule tumorali a fini di fagocitosi dipendente dagli anticorpi |
| Sistema automatizzato di imaging in tempo reale su cellule vive con camera di controllo ambientale (ad esempio, Lionheart FX) | Agilent Technologies (o equivalente) | Microscopio automatico BioTek Lionheart FX | Consente l'acquisizione di immagini a lungo termine in time-lapse in condizioni di temperatura controllata e 2 condizioni |
| Software di imaging per l'acquisizione automatizzata di cellule vive (ad es. Gen5) | Agilent Technologies (o equivalente) | N/A | Utilizzato per l'acquisizione e l'analisi di dati di imaging in time-lapse |
| Centrifuga (rotore a cestello oscillante) | Thermo Fisher Scientific (o equivalente) | Multifuge X4R Pro con rotore TX-1000 (o equivalente) | Utilizzato per l'isolamento dei PBMC e i passaggi di lavaggio cellulare |
| 2 incubatrice (37°C, 5% 2) | Thermo Fisher Scientific (o equivalente) | Forma a calore diretto 2 Incubatrice (o equivalente) | Mantiene le condizioni fisiologiche per la coltura cellulare |
| 2 alimentazione di gas con regolatore | Agilent Technologies (o equivalente) | N/A | Materiali 2 per il controllo ambientale di incubatore e sistema di imaging |
| Tubi conici (15 mL e 50 mL) | Corning (o equivalente) | 352070 (o equivalente) | Utilizzato per l'isolamento, il lavaggio e le fasi di centrifugazione dei PBMC |
| Tubi per prelievo del sangue rivestiti con EDTA (vacutainer) | BD Biosciences (o equivalente) | 367863 (o equivalente) | Utilizzato per la raccolta di campioni di sangue intero da donatori |
| Ficoll-Paque PLUS | Cytiva (o equivalente) | 17144003 (o equivalente) | Mezzo a gradiente di densità per l'isolamento di PBMC |
| Citometro a flusso (ad esempio, FACSCanto II) | BD Biosciences (o equivalente) | BD FACSCanto II | Utilizzato per l'analisi fenotipica dei macrofagi |
| Microsferette di compensazione (citometria a flusso) | Biolegend (o equivalente) | 424602 | Utilizzato per controlli di compensazione a singolo colore |
| anticorpo FITC anti-CD11b umano (citometria a flusso) | BioLegend (o equivalente) | 101205 (o equivalente) | Marcatore utilizzato per identificare i macrofagi |
| anticorpo PE anti-umano CD80 (citometria a flusso) | BioLegend (o equivalente) | 375410 (o equivalente) | Marcatore associato al fenotipo di macrofago attivato |
| Linea cellulare di carcinoma mammario esprimente GFP (MDA-MB-468) | ATCC (o equivalente) | HTB-132 (o equivalente) | Cellule bersaglio utilizzate nel saggio di fagocitosi; la GFP consente la visualizzazione |
| Mezzo macrofagico ImmunoCult-SF | STEMCELL Technologies (o equivalente) | 10961 (o equivalente) | Mezzo privo di siero utilizzato per la differenziazione dei macrofagi |
| Dulbecco’Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM) | Thermo Fisher Scientific (o equivalente) | 12100046 | Utilizzato per la coltura e la risospensione delle cellule tumorali |
| Anticorpo di controllo per isotipo (IgG) | Bio X Cell (o equivalente) | BE0297 (o equivalente) | Controllo negativo per il saggio di fagocitosi dipendente dagli anticorpi |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Sigma-Aldrich (o equivalente) | L2630 (o equivalente) | Stimolo utilizzato per attivare i macrofagi in combinazione con IFN-γ |
| Interferone gamma umano ricombinante (IFN-γ) | STEMCELL Technologies (o equivalente) | 78020 (o equivalente) | Citochina utilizzata per l'attivazione dei macrofagi |
| Fattore stimolante le colonie di macrofagi umano ricombinante (M-CSF) | STEMCELL Technologies (o equivalente) | 78057 (o equivalente) | Fattore di crescita utilizzato per la differenziazione dei macrofagi |
| Pipette di Pasteur o pipette sierologiche | Jetbiofil (o equivalente) | GSP010010 (o equivalente) | Utilizzato per la manipolazione di liquidi durante l'isolamento di PBMC e la coltura cellulare |
| PBS (Ca2+-/Mg2+-free | Thermo Fisher Scientific (o equivalente) | BP399-500 (o equivalente) | Buffer utilizzato per il lavaggio delle cellule e i passaggi di diluizione |
| Piastrine di Petri (100 mm, non–trattato per coltura tissutale | Corning (o equivalente) | 430591 | Utilizzato per la differenziazione dei macrofagi mediante selezione per adesione |
| Buffer per la lisi dei globuli rossi (RBC) | BioLegend (o equivalente) | 420301 (o equivalente) | Utilizzato per rimuovere i globuli rossi durante l'isolamento dei PBMC |
| Colorante Viobility 405/452 fissabile | Miltenyi Biotec (o equivalente) | 130-130-404 (o equivalente) | Utilizzato per valutare la vitalità cellulare durante l'analisi mediante citometria a flusso |
| DAPI | Sigma-Aldrich (o equivalente) | D9542 (o equivalente) | Utilizzato per l'esclusione delle cellule morte in citometria a flusso |
Riferimenti
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