Un protocollo a emisferi separati per l'osservazione morfologica e l'estrazione combinata di RNA e proteine nelle regioni cerebrali murine

Sommario

Questo protocollo prevede la dissezione di cervelli murini. Un emisfero viene utilizzato per la colorazione morfologica, l'altro per l'estrazione di RNA e proteine. Questa strategia riduce il consumo di animali, rispetta i principi delle 3R e minimizza la variabilità inter-individuale.

Abstract

Nella ricerca neuroscientifica quotidiana, le colorazioni morfologiche e i saggi molecolari per acidi nucleici/proteine richiedono tipicamente animali sperimentali separati, il che aumenta l'uso di animali ed è in contrasto con il principio di benessere animale delle 3R. Questo protocollo stabilisce un flusso di lavoro per l'allocazione del tessuto cerebrale murino che consente analisi morfologiche e molecolari accoppiate a partire da un singolo animale. Dopo la perfusione transcardiale con soluzione salina allo 0,9%, il cervello viene diviso in due emisferi. Un emisfero viene fissato in paraformaldeide al 4% per immunohistochimica e immunofluorescenza; sezioni conservate in una soluzione di saccarosio-etilene glicole-polivinilpirrolidone (PVP) mantengono una qualità di colorazione affidabile fino a sette anni. L'emisfero controlaterale viene criopreservato a -80 °C per l'estrazione combinata di RNA e proteine, con rese sufficienti per analisi successive di qPCR e Western Blot. Testato su campioni di corteccia entorinale del peso di 9–10 mg, questo metodo produce rese di RNA e proteine inferiori rispetto all'estrazione separata di RNA o proteine singolarmente, ma le biomolecole recuperate rimangono adeguate per il rilevamento molecolare. Questo flusso di lavoro riduce il consumo di animali ed elimina le differenze inter-individuali tra analisi morfologiche e molecolari accoppiate. Fornisce un metodo praticabile di preparazione del tessuto per il profilo multidimensionale di specifiche sottoregioni cerebrali murine.

Introduzione

La ricerca nel campo delle neuroscienze si è notevolmente ampliata negli ultimi decenni, svelando meccanismi chiave che regolano la fisiologia cerebrale umana, l'insorgenza delle malattie neurologiche e lo sviluppo di terapie. I modelli animali rimangono indispensabili per l'indagine neuroscientifica, fornendo piattaforme controllabili e riproducibili per esplorare lo sviluppo neurale, la funzione fisiologica e i processi patologici. La manipolazione sperimentale e l'osservazione istologica nei soggetti murini consentono ai ricercatori di caratterizzare il segnale neuronale, la formazione dei circuiti neurali e le associazioni tra attività neurale e comportamento. Parallelamente ai progressi tecnici, l'etica sperimentale sugli animali è diventata una questione centrale. I principi delle 3R (Sostituzione, Riduzione e Perfezionamento) sono oggi standard globalmente accettati per tutti gli studi sugli animali^1,2, richiedendo ai ricercatori di minimizzare l'uso degli animali pur mantenendo risultati sperimentali affidabili.

Strumenti innovativi come i sistemi di knockout condizionale permettono una manipolazione genetica precisa all'interno di subregioni distinte del cervello murino³. Questi progressi hanno stimolato ricerche approfondite su compartimenti cerebrali a microscala, come l'area CA1, CA3 e il giro dentato (DG) dell'ippocampo, che regolano l'apprendimento, la memoria e l'umore⁴. La decodifica delle funzioni di alto livello di queste piccole regioni cerebrali richiede misurazioni coordinate a livello morfologico, trascrizionale e proteico. Purtroppo, il loro scarso volume di tessuto crea notevoli ostacoli tecnici per il rilevamento multiparametrico parallelo.

La colorazione morfologica, la quantificazione dell'RNA e il rilevamento immunologico delle proteine sono tre analisi fondamentali di routine nelle neuroscienze. I tradizionali disegni sperimentali richiedono tre cohorti distinte di animali murini per completare questi tre tipi di analisi. Questa pratica aumenta notevolmente il numero di animali utilizzati e introduce una considerevole variabilità biologica inter-individuale, riducendo così la comparabilità tra i dati istologici e molecolari. Un protocollo unificato che consenta di ottenere segnali morfologici e molecolari abbinati da un singolo animale risolverebbe efficacemente questi due limiti critici, migliorando nel contempo l'aderenza al principio di Riduzione delle 3R.

Qui riportiamo un protocollo riproducibile di separazione emisferica per tessuto cerebrale murino. Dopo perfusione sistemica con soluzione salina, l'intero cervello viene diviso in due emisferi: un emisfero viene fissato per esami morfologici, mentre l'emisfero controlaterale viene crioconservato per l'estrazione simultanea di RNA e proteine. I tessuti fissati e conservati in un buffer protettivo contenente saccarosio, etilene glicole e polivinilpirrolidone (PVP) mantengono segnali di marcatura stabili e di alta qualità per immunohistochimica e immunofluorescenza fino a sette anni. Abbiamo validato questo metodo utilizzando campioni di piccole dimensioni (9–10 mg) della corteccia entorinale, un tessuto più leggero rispetto a regioni comunemente studiate come l'ippocampo e la corteccia prefrontale. Il rilevamento efficace di questo campione tissutale ridotto indica che anche subregioni cerebrali più piccole, come l'ipotalamo e l'amigdala, sono compatibili con questo flusso di lavoro. Sebbene il protocollo produca concentrazioni di RNA e proteine inferiori rispetto a kit di estrazione specializzati monouso, le biomolecole isolate possiedono una qualità adeguata per analisi standard a valle come qPCR e immunoblotting occidentale. Questo flusso di lavoro riduce il consumo di animali ed elimina le differenze interindividuali tra analisi morfologiche e molecolari accoppiate. Fornisce un metodo praticabile di preparazione del tessuto per il profilo multidimensionale di subregioni discrete del cervello murino.

Protocollo

Dichiarazione di etica

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Medica di Dalian (Numero di approvazione AEE18026 per gli esperimenti sui ratti e Numero AEE24261 per gli esperimenti sui topi), Repubblica Popolare Cinese. Tutti i protocolli sperimentali sono stati attuati in conformità con le linee guida etiche per gli animali da laboratorio e hanno pienamente rispettato i principi delle 3R (Riduzione, Sostituzione e Perfezionamento) per la sperimentazione animale. Durante l'intero processo sperimentale, sono state adottate misure rigorose per alleviare efficacemente il dolore e lo stress negli animali. Nel contempo, il numero di animali utilizzati è stato limitato alla quantità minima necessaria per garantire l'affidabilità e la validità dei risultati dell'analisi statistica. Consultare la Tabella dei Materiali per un elenco completo dei reagenti, materiali di consumo e strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione dell'animale sperimentale e intervento chirurgico di perfusione transcardiale

1. Anestesia e preparazione pre-operatoria
   1. Utilizzare ratti maschi adulti di ceppo Sprague-Dawley o topi C57BL/6 di grado SPF (specific-pathogen-free) per questo protocollo. Mantenere gli animali in un ambiente a temperatura controllata (22 ± 2 °C) con un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire cibo sterile e acqua ad libitum.
   2. Somministrare pentobarbital sodico agli animali mediante iniezione intraperitoneale a una dose di 80 mg/kg nei ratti o 50 mg/kg nei topi per indurre l'anestesia (vedere Figura 1).
2. Procedura di perfusione transcardiale
   1. Fissare gli animali anestetizzati in posizione supina su un tavolo chirurgico.
   2. Aprire chirurgicamente la parete addominale lungo la linea mediana, dal processo xifode alla sinfisi pubica, usando forbici dritte. Tagliare bilateralmente la parete toracica laterale per esporre completamente il cuore.
   3. Perfondere l’animale con soluzione fisiologica 0,9% fredda in ghiaccio a un flusso costante: 100–150 mL in 10–15 min per i ratti e 20–30 mL in 5–8 min per i topi.
3. Prelevamento del cervello e separazione degli emisferi
   1. Decapitare gli animali con forbici chirurgiche di grandi dimensioni al termine della perfusione. Incidere il cuoio capelluto lungo la linea mediana per esporre il cranio.
   2. Utilizzare una spatola sterile per sollevare delicatamente il cervello dalla cavità cranica. Trasferire rapidamente l’intero cervello in una piastra di Petri sterile posta su ghiaccio.
   3. Utilizzare una lametta sterile e priva di RNasi per dividere simmetricamente il cervello negli emisferi sinistro e destro lungo la sutura sagittale.
   4. Trasferire immediatamente l'emisfero sinistro in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% fredda in ghiaccio per la fissazione. Trasferire l'emisfero destro in un tubo criogenico sterile privo di RNasi, congelarlo rapidamente in azoto liquido e conservarlo a -80 °C fino all'estrazione di RNA e proteine.

2. Fissazione, sezionamento e conservazione a lungo termine del tessuto cerebrale

1. Fissaggio e disidratazione
   1. Immergere completamente l'emisfero sinistro in una soluzione al 4% di paraformaldeide e fissare il tessuto a 4 °C per 24 h. Al termine della fissazione, trasferire l'emisfero cerebrale in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente soluzione al 30% di saccarosio e disidratare il tessuto a 4 °C.
   2. Sostituire la soluzione al 30% di saccarosio ogni 24 h fino a quando il tessuto cerebrale affonda sul fondo del tubo.
2. Preparazione delle sezioni criogeniche
   1. Rimuovere l'emisfero cerebrale disidratato dalla soluzione di saccarosio ed eliminare delicatamente il liquido in eccesso con carta filtrante sterile.
   2. Montare l'emisfero cerebrale sulla piattaforma del criostato utilizzando il mezzo di inclusione a temperatura ottimale per il taglio (OCT).
   3. Tagliare sezioni cerebrali coronali seriali con uno spessore di 30 µm utilizzando un criostato. Raccogliere sezioni consecutive in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS 0,01 M sterile.
3. Conservazione a lungo termine delle sezioni cerebrali
   1. Preparare in anticipo la soluzione crioprotettiva per la conservazione delle fette cerebrali: aggiungere 2 g di PVP400, 60 g di saccarosio e 60 mL di etilene glicole a 100 mL di PBS 0,01 M. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione di tutti i componenti e conservarla a 4 °C fino all'uso.

3. Estrazione dell'RNA con TRIzol

1. Omoscissione dei tessuti e separazione delle fasi
   1. Omosciare il tessuto corticale entorinale in 1 mL di reagente TRIzol utilizzando un omogeneizzatore ultrafine e incubare l'omogenato sul ghiaccio per 15 min. Centrifugare a 8.000 × g per 5 min a 4 °C.
   2. Aggiungere 200 µL di cloroformio e vortexare per 10 s. Centrifugare a 5.600 × g per 15 min a 4 °C. Trasferire quindi la fase acquosa superiore in una provetta priva di RNasi. Aggiungere 500 µL di isopropanolo e incubare a -20 °C per tutta la notte per precipitare l'RNA. Centrifugare nuovamente.
2. Precipitazione dell'RNA, lavaggio e valutazione della qualità
   1. Eliminare il soprannatante e lavare il pellet di RNA con 1 mL di etanolo al 75%. Centrifugare a 5.600 × g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il soprannatante, asciugare il pellet all'aria per 10 min e risospendere l'RNA in 20 µL di acqua trattata con DEPC per 10 min.
   2. Misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA (A₂₆₀/A₂₈₀) mediante spettrofotometro. Conservare l'RNA a -80 °C fino all'analisi successiva.

4. Estrazione delle proteine totali con il kit Minute

1. Lisi dei tessuti e omogeneizzazione
   1. Raffreddare in precedenza la colonna spin e il tubo di raccolta ponendoli sul ghiaccio. Omogeneizzare il tessuto in 100 µL di buffer per la lisi cellulare utilizzando un omogeneizzatore ultrafine. Risciacquare l'omogeneizzatore con ulteriori 100 µL di buffer per la lisi cellulare e unire i lisati.
2. Recupero e quantificazione delle proteine
   1. Trasferire l'omogeneato nella colonna spin e incubare per 2 min a temperatura ambiente.
   2. Centrifugare a 11.000–14.300 × g per 2 min.
   3. Posizionare immediatamente il tubo di raccolta sul ghiaccio dopo la centrifugazione e scartare la colonna spin. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio BCA.

5. Estrazione simultanea di RNA e proteine dal cervello entorinale (9–10 mg)

1. Preparazione pre-sperimentale e preparazione dei reagenti
   1. Utilizzare il kit per il DNA/RNA/proteine per tutti i passaggi di estrazione. Utilizzare esclusivamente materiali monouso certificati privi di RNasi e DNasi (vedere Figura 2).
   2. Preparare il buffer di lisi immediatamente prima dell'uso: aggiungere il cocktail inibitore delle proteasi al buffer di lisi fornito con il kit in una diluizione 1:100.
2. Lisi del tessuto e separazione delle fasi
   1. Rimuovere l'emisfero cerebrale destro congelato dal congelatore a -80 °C e posizionarlo sul ghiaccio. Utilizzare un punch sterile privo di RNasi per raccogliere 9–10 mg di tessuto dalla regione cerebrale bersaglio.
   2. Omogeneizzare completamente il tessuto sul ghiaccio utilizzando un omogeneizzatore tissutale elettrico fino a quando non rimangono frammenti visibili di tessuto. Incubare l'omogenato sul ghiaccio per 10 minuti per garantire una lisi completa.
   3. Aggiungere 200 µL del reagente di separazione fornito con il kit all'omogenato. Vortexare vigorosamente il tubo per 30 secondi e incubarlo a temperatura ambiente per 3 minuti. Centrifugare il tubo a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere una completa separazione delle fasi.
3. Purificazione e eluizione dell'RNA
   1. Raccogliere con attenzione la fase acquosa superiore utilizzando una punta da pipetta priva di RNasi. Trasferire la fase acquosa raccolta in un nuovo tubo da 1,5 mL privo di RNasi. Aggiungere un volume uguale di etanolo al 100% alla fase acquosa raccolta e mescolare.
   2. Trasferire 700 µL della miscela nella colonna di purificazione dell'RNA fornita con il kit. Centrifugare la colonna a 5.600 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.
   3. Aggiungere 500 µL del buffer di lavaggio RNA 1 fornito con il kit alla colonna. Centrifugare la colonna a 5.600 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.
   4. Aggiungere quindi 500 µL del buffer di lavaggio RNA 2 fornito con il kit alla colonna e centrifugare nuovamente. Centrifugare la colonna vuota a 8.000 × g per 2 minuti a temperatura ambiente per rimuovere completamente l'etanolo residuo dalla membrana della colonna.
   5. Trasferire la colonna in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL privo di RNasi. Aggiungere direttamente al centro della membrana della colonna 30–50 µL di acqua priva di RNasi (pre-riscaldata a 60 °C). Incubare la colonna a temperatura ambiente per 2 minuti. Centrifugare la colonna a 8.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente per eluire l'RNA.
4. Precipitazione e solubilizzazione delle proteine
   1. Aggiungere 750 µL di isopropanolo alla fase organica e all'interfase rimanenti nel tubo originale dopo aver rimosso la fase acquosa per l'estrazione dell'RNA. Incubare la miscela a -20 °C per 30 minuti per precipitare le proteine.
   2. Centrifugare il tubo a 8.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere il soprannatante e mantenere intatto il pellet proteico sul fondo del tubo.
   3. Aggiungere 1 mL di etanolo al 95% al pellet proteico. Vortexare brevemente il tubo per lavare il pellet. Centrifugare il tubo a 8.000 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il soprannatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio altre due volte.
   4. Lasciare asciugare il pellet proteico all'aria a temperatura ambiente per 5–10 minuti fino a quando il pellet diventa traslucido e non è visibile alcun residuo di etanolo.
   5. Aggiungere 50–100 µL di soluzione di SDS al 5–10% al pellet essiccato. Vortexare vigorosamente il tubo per 1 minuto e incubarlo sul ghiaccio per 10 minuti per sciogliere completamente la proteina. Centrifugare il tubo a 8.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il soprannatante come estratto proteico finale.

6. Colorazione immunohistochemica (IHC)

1. Pre-trattamento delle sezioni e inattivazione degli enzimi endogeni
   1. Rimuovere le sezioni cerebrali dal congelatore a -20 °C dove sono conservate in soluzione crioprotettiva. Utilizzare un ago di vetro per trasferire le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lavare le sezioni per tre volte con PBS 0,01 M, 5 minuti per ogni lavaggio, a temperatura ambiente su un agitatore.
   3. Incubare le sezioni con un inibitore di perossidasi contenente perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti a temperatura ambiente, al fine di inattivare l'attività di perossidasi endogena. Ripetere le operazioni di lavaggio dopo il blocco.
2. Permeabilizzazione e blocco non specifico
   1. Incubare le sezioni in Triton X-100 al 0,5% per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore, per permeabilizzare la membrana cellulare. Ripetere le operazioni di lavaggio.
   2. Incubare le sezioni in albumina sierica bovina al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da un'ulteriore incubazione con un inibitore della colorazione non specifica per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Incubazione con anticorpi primari e secondari
   1. Diluire gli anticorpi primari in soluzione di BSA all'1% alle seguenti diluizioni ottimizzate: doublecortin (DCX, 1:4000), antigene nucleare neuronale (NeuN, 1:3000), molecola adattatrice legante calcio ionizzato 1 (Iba-1, 1:2000) e proteina acida fibrillare gliale (GFAP, 1:2000).
   2. Aggiungere 200 µL di soluzione di anticorpo primario diluito in ogni pozzetto, assicurandosi che le sezioni siano completamente immerse.
   3. Aggiungere 200 µL di anticorpo secondario marcato con biotina in ogni pozzetto. Incubare le sezioni a temperatura ambiente per 30 minuti.
   4. Lavare le sezioni per tre volte con PBS 0,01 M, 5 minuti per ogni lavaggio. Aggiungere 300 µL di coniugato streptavidina-perossidasi in ogni pozzetto. Incubare le sezioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere le operazioni di lavaggio dopo l'incubazione.
4. Sviluppo cromogenico con 3,3′-diaminobenzidina (DAB) e montaggio con coprioggetti
   1. Aggiungere 200 µL di soluzione lavorativa di DAB in ogni pozzetto. Monitorare la reazione cromogenica al microscopio ottico.
   2. Montare le sezioni su vetrini rivestiti con gelatina utilizzando un ago di vetro. Far asciugare completamente i vetrini a temperatura ambiente.
   3. Disidratare i vetrini mediante una serie di etanoli a concentrazione crescente (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% etanolo, 5 minuti ciascuno), seguita da due passaggi di chiarificazione in xilene, 5 minuti ciascuno.

7. Colorazione mediante immunofluorescenza (IF)

1. Pretrattamento e permeabilizzazione delle sezioni
   1. Rimuovere le sezioni cerebrali dal conservante crioprotettivo a -20 °C. Trasferire le sezioni in una piastra a 24 pozzetti contenente PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lavare le sezioni tre volte con PBS 0,01 M, 5 min per ogni lavaggio, a temperatura ambiente su agitatore.
   3. Incubare le sezioni in Triton X-100 al 0,5% per 30 min a temperatura ambiente su agitatore.
   4. Lavare le sezioni tre volte con PBS 0,01 M, 10 min per ogni lavaggio, dopo la permeabilizzazione.
2. Bloccaggio e incubazione con anticorpo primario
   1. Incubare le sezioni in una soluzione di bloccaggio contenente BSA al 4% e un inibitore della colorazione non specifica per 1 h a temperatura ambiente in una camera umidificata.
   2. Aspirare la soluzione di bloccaggio. Diluire gli anticorpi primari in soluzione di BSA all'1% alle concentrazioni ottimizzate e aggiungere 300 µL della soluzione diluita di anticorpo primario in ogni pozzetto. Incubare le sezioni tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata e protetta dalla luce.
3. Incubazione con anticorpo secondario
   1. Riportare le sezioni a temperatura ambiente per 1 h al buio il giorno successivo. Recuperare la soluzione di anticorpo primario e lavare le sezioni tre volte con PBS 0,01 M, 10 min per ogni lavaggio, su agitatore al buio.
   2. Diluire gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo in soluzione di BSA all'1% alla diluizione raccomandata dal produttore. Aggiungere 300 µL della soluzione di anticorpo secondario in ogni pozzetto. Incubare le sezioni a temperatura ambiente per 1–2 h al buio.
   3. Lavare le sezioni cinque volte con PBS 0,01 M, 5 min per ogni lavaggio, al buio.

8. Analisi di PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)

1. Rimozione dell'RNA gDNA e trascrizione inversa
   1. Eseguire la trascrizione inversa per sintetizzare il cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa, con 1 µg di RNA totale per sistema di reazione da 20 µL. Utilizzare il programma termociclico raccomandato dal produttore: 25 °C per 5 min, 50 °C per 15 min, 85 °C per 5 min, mantenere a 4 °C.
   2. Diluire il cDNA sintetizzato 1:5 con acqua priva di RNasi. Conservare il cDNA a -20 °C fino all'amplificazione mediante qPCR.
2. Preparazione del sistema qPCR e amplificazione
   1. Preparare il sistema di reazione qPCR sul ghiaccio in una cappa PCR dedicata priva di RNasi. Il sistema di reazione da 20 µL comprende: 10 µL di qPCR Master Mix, 0,4 µL di primer forward (10 µM), 0,4 µL di primer reverse (10 µM), 2 µL di template di cDNA diluito, 7,2 µL di acqua priva di RNasi.
   2. Eseguire l'amplificazione mediante qPCR utilizzando il seguente programma: 95 °C per 30 s di denaturazione iniziale; 40 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s; seguiti da analisi della curva di dissociazione da 60 °C a 95 °C, con incrementi di 0,5 °C ogni 5 s.

9. Immunoblotting

1. Quantificazione delle proteine e preparazione del campione
   1. Diluire gli estratti proteici a concentrazioni uguali utilizzando una soluzione di SDS al 5–10%, in base ai risultati del saggio BCA.
2. Elettroforesi SDS-PAGE e trasferimento delle proteine
   1. Preparare un gel separatore al 10% SDS-PAGE e un gel di sovrapposizione al 5% secondo le protocolli standard di biologia molecolare.
   2. Caricare 20 µg di proteina totale per pozzetto nel gel. Per esperimenti di caricamento in gradiente, caricare 15 µg, 30 µg e 45 µg di proteina per pozzetto.
   3. Eseguire l'elettroforesi a 80 V per 30 minuti fino a quando il marcatore proteico entra nel gel separatore, quindi aumentare la tensione a 120 V per 60–90 minuti fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel.
   4. Assemblare il sandwich di trasferimento nell'ordine seguente (dal catodo all'anodo): spugna, carta filtro, gel, membrana PVDF, carta filtro e spugna. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria tra il gel e la membrana.
   5. Eseguire il trasferimento umido a 300 mA di corrente costante per 90 minuti in un bagno di ghiaccio.
3. Bloccaggio della membrana e incubazione con gli anticorpi
   1. Risciacquare brevemente la membrana PVDF con buffer TBST al termine del trasferimento. Incubare la membrana in BSA al 5% per 2 ore a temperatura ambiente su agitatore per bloccare i siti di legame non specifici.
   2. Diluire gli anticorpi primari nella soluzione di BSA al 5% alle concentrazioni ottimizzate. Incubare la membrana con la soluzione di anticorpi primari tutta la notte a 4 °C su agitatore.
   3. Lavare la membrana tre volte con buffer TBST, 10 minuti per ogni lavaggio, su agitatore il giorno successivo.
   4. Diluire l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) nella soluzione di latte scremato al 5% alla diluizione raccomandata dal produttore. Incubare la membrana con la soluzione di anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente su agitatore.
   5. Lavare la membrana tre volte con buffer TBST, 10 minuti per ogni lavaggio, dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario. Incubare la membrana con la soluzione del substrato ECL per 1–2 minuti al buio.

Risultati

Valutazione della concentrazione di RNA, elettroforesi su gel di agarosio e qPCR

Come mostrato, l'RNA totale e le proteine sono stati co-estratti da campioni di corteccia entorinale (9–10 mg) utilizzando il kit per DNA/RNA/proteine. Campioni paralleli processati con TRIzol (RNA) o con il kit di estrazione proteica sono stati utilizzati come controlli. Il protocollo ha prodotto 235 ± 12 ng µL⁻¹ di RNA, il 36 % in meno rispetto al metodo con TRIzol (p < 0,05) (Figura 3A). Tuttavia, i gel di agarosio hanno rivelato bande nitide di rRNA 28S e 18S e segnali di 5S, indicando un RNA integro (Figura 3B). La qPCR per CD86, IL-1β, TNF-α e IL-6 ha prodotto curve di dissociazione singole e simmetriche (Figura 3C); sono stati osservati valori di Ct più bassi nel gruppo (Figura 3D); tuttavia, ulteriori studi, inclusi analisi sull'integrità dell'RNA, sono necessari per determinare se queste differenze riflettano una qualità superiore dell'RNA o una maggiore efficienza di estrazione. Sebbene il rendimento di RNA fosse inferiore rispetto a quello ottenuto con l'estrazione mediante TRIzol, bande distinte di rRNA 28S e 18S e curve di amplificazione specifiche in qPCR hanno indicato che l'RNA estratto era di qualità sufficiente per analisi qPCR successive.

Valutazione della concentrazione proteica, SDS-PAGE e analisi di Western blot

In linea con i dati sull'RNA, il protocollo di estrazione doppia ha prodotto concentrazioni totali di proteine più basse rispetto al kit per proteine (p < 0,05). Tuttavia, i blot di Western hanno rivelato bande immunoreattive nettamente più intense per ogni bersaglio analizzato (Figura 4A). In accordo con i risultati della quantificazione dell'RNA, il protocollo di co-estrazione RNA–proteina recupera meno proteina totale rispetto al kit proteico dedicato monoscopo, come osservabile mediante colorazione CBB delle proteine totali (Figura 4B–C). La proteina di controllo β-Tubulina ha mostrato bande chiare e stabili con entrambi i metodi di estrazione, con intensità del segnale comparabile. La proteina ULK a bassa abbondanza è stata anch'essa rilevata con successo nei campioni co-estratti. In particolare, i segnali delle bande di PSD-95, p-ERK e p-NFκB p65 sono risultati nettamente più intensi nel gruppo di co-estrazione rispetto al kit di estrazione proteica singola. Un caricamento seriale di proteine da 15 µg a 45 µg ha generato gradienti di bande dose-dipendenti per tutti i bersagli rilevati in entrambi i gruppi. Nel complesso, sebbene il rendimento totale di proteina ottenuto con il flusso di lavoro di estrazione doppia sia inferiore, la qualità della proteina è sufficiente per l'analisi standard mediante Western blot e le prestazioni complessive di rilevamento non sono inferiori a quelle dei tradizionali kit di estrazione proteica singola.

Immunohistochemica e immunofluorescenza

L'immunoeistochimica su sezioni cerebrali conservate per 0,5–7 anni ha rivelato un marcaggio robusto di neuroni nuovi DCX⁺, cellule secretorie AVP⁺ e neuroni MAP2/NeuN⁺ con morfologia e fibre intatte (Figura 5A). L'immunofluorescenza su sezioni di 5–7 anni ha mostrato chiaramente astrociti GFAP⁺, microglia Iba-1⁺ e neuroni attivati FosB⁺ (Figura 5B). Sezioni rappresentative conservate per 0,5–sette anni hanno mantenuto segnali immunoeistochimici e di immunofluorescenza rilevabili nelle condizioni testate. Pertanto, la soluzione di conservazione mantiene l'integrità del tessuto e l'antigenicità, consentendo una conservazione a lungo termine affidabile.

Figura 1: Flusso di lavoro integrato per la separazione emisferica per l'analisi morfologica e molecolare del cervello. Questo schema illustra l'intera sequenza sperimentale, inclusa la perfusione transcardiaca con soluzione salina nei roditori, la bisezione mediana del cervello intero isolato, la fissazione e la preparazione di sezioni crio per l'emisfero sinistro per la colorazione IHC/IF, e la criopreservazione dell'emisfero controlaterale per l'estrazione simultanea successiva di RNA e proteine, analisi di qPCR e Western blot. Tutte le illustrazioni dei topi sono state originariamente generate da Jimeng AI. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro per l'estrazione simultanea di RNA e proteine da tessuto cerebrale di roditore congelato. Lo schema mostra i passaggi sequenziali che comprendono il prelievo del tessuto bersaglio da emisferi congelati, la lisi del tessuto e la separazione in tre fasi, la purificazione e l'eluzione dell'RNA per qPCR, nonché la precipitazione, il lavaggio e la solubilizzazione delle proteine per preparare i campioni da analizzare mediante Western blot. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Valutazione del rendimento dell'RNA, dell'integrità dell'RNA e della compatibilità con la qPCR utilizzando campioni microscopici di corteccia entorinale di ratto. (A) Concentrazioni di RNA quantificate ottenute tramite kit di co-estrazione rispetto al metodo TRIzol (media ± SEM). (B) Elettroforesi su gel di agarosio che mostra bande intatte di rRNA 28S e 18S da entrambi i gruppi di estrazione. (C) Curve di fusione singole che confermano l'amplificazione specifica dei geni infiammatori target e di GAPDH come gene di riferimento. (D) Valori di Ct dei geni infiammatori rilevati con identico input di RNA nei due metodi di estrazione. *p < 0,05, **p < 0,01 rispetto al gruppo TRIzol. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Valutazione mediante immunoblot delle proteine ottenute con il protocollo di coestrazione RNA/proteina. (A) Carico graduale di proteine (15/30/45 µg) che mostra segnali delle bande dipendenti dalla dose per proteine sinaptiche e di segnalazione. (B) Rilevamento della proteina ULK1 ad alto peso molecolare con colorazione totale delle proteine mediante CBB come riferimento di caricamento. (C) Confronto mediante immunoblot con caricamento equimolare delle proteine bersaglio tra due flussi di estrazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Colorazione immunohistochimica e immunofluorescente di sezioni cerebrali libere conservate per 0,5–7 anni. (A) Micrografie ottenute mediante colorazione immunohistochimica in campo chiaro, acquisite con ingrandimenti 200× e 400×. Le colorazioni per DCX e AVP sono state eseguite su campioni di tessuto murino, mentre quelle per MAP2 e NeuN su campioni di tessuto ratto. (B) Immagini rappresentative di immunofluorescenza ottenute da campioni di tessuto ratto. GFAP etichetta gli astrociti, IBA-1 etichetta la microglia e FOSB indica l'attività neuronale. Tutti gli esperimenti di colorazione immunofluorescente mostrati in questo pannello sono stati condotti utilizzando campioni di ratto per valutare l'espressione dei marcatori neuronali e la localizzazione cellulare, micrografie acquisite con ingrandimento 200×.  Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Nella ricerca murina, le analisi morfologiche e i saggi su acidi nucleici/proteine richiedono spesso campioni animali separati a causa delle diverse procedure di preparazione. Ciò aumenta l'utilizzo di animali e introduce una variabilità biologica inter-individuale, che può ridurre la comparabilità tra i dati istologici e molecolari. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro che permette di ottenere dati istologici e molecolari dallo stesso animale.

Il design centrale di questo protocollo è l'assegnazione emisferica del tessuto cerebrale dopo perfusione transcardiaca con soluzione salina allo 0,9%^5,6. Un emisfero viene fissato in paraformaldeide al 4% per immunohistochimica e immunofluorescenza, mentre l'emisfero controlaterale viene conservato a −80 °C per successiva coestrazione di RNA e proteine, qPCR e analisi mediante Western blot. Tuttavia, le variabili selezionate potrebbero non essere completamente confrontabili tra i due emisferi cerebrali. È stato documentato un lateralizzazione strutturale e funzionale nei cervelli di roditori e tali differenze emisferiche potrebbero introdurre variabilità quando le analisi vengono effettuate su lati opposti^7,8. Pertanto, i ricercatori dovrebbero selezionare in modo coerente il tessuto dallo stesso emisfero cerebrale in base ai propri obiettivi di ricerca.

Un vantaggio notevole di questo metodo è la conservazione a lungo termine di sezioni cerebrali fissate e flottanti. Dopo la disidratazione con saccarosio al 30%, sezioni coronali di 30 µm vengono immagazzinate in una soluzione di conservazione contenente saccarosio, glicole etilenico e PVP. Studi precedenti hanno dimostrato che le soluzioni crioprotettive a base di saccarosio–glicole etilenico–PVP contribuiscono a preservare la morfologia del tessuto e l'antigenicità durante la conservazione a lungo termine^9,10. Tuttavia, pochi studi hanno valutato durate di conservazione che si estendono per diversi anni. I dati del nostro laboratorio ampliano questi risultati: sezioni rappresentative conservate fino a sette anni hanno mantenuto segnali immunohistochimici e di immunofluorescenza rilevabili nelle condizioni testate. Queste osservazioni confermano la fattibilità della conservazione di sezioni cerebrali flottanti per diversi anni, a fini di analisi retrospettive e di esperimenti di follow-up.

È degno di nota che questo flusso di lavoro offre un ulteriore vantaggio chiave grazie all'estrazione congiunta di RNA e proteine da un singolo emisfero cerebrale congelato. Sebbene questo protocollo di co-estrazione produca quantità leggermente inferiori di RNA e proteine rispetto ai metodi convenzionali di estrazione monobersaglio, i biomateriali ottenuti sono comunque sufficienti per un'analisi robusta mediante qPCR e immunoblotting. In modo cruciale, la co-estrazione permette di quantificare l'abbondanza di trascritti e proteine a partire dagli stessi campioni tissutali, eliminando la variabilità biologica derivante dall'elaborazione separata di diversi campioni e consentendo un profilo molecolare integrato altamente coerente^11,12. Inoltre, questo approccio richiede soltanto una piccola massa tissutale di circa 9–10 mg, rendendolo particolarmente adatto per analisi di sottopopolazioni cerebrali discrete e specifiche di regione, in cui la disponibilità del campione è limitata.

Nonostante questi significativi vantaggi, questo metodo presenta anche alcune limitazioni che meritano di essere riconosciute. In primo luogo, i rendimenti relativamente bassi di RNA e proteine potrebbero limitarne l'applicabilità in esperimenti che richiedono grandi quantità di acidi nucleici o proteine, come la purificazione su larga scala di proteine o il sequenziamento profondo dell'RNA. In secondo luogo, sebbene la conservazione a lungo termine dei campioni in sezione sia efficace fino a sette anni, può comunque verificarsi un graduale degrado di alcuni antigeni o acidi nucleici labili nel tempo, il che potrebbe compromettere l'intensità della colorazione o la sensibilità della rilevazione molecolare. In terzo luogo, il metodo è attualmente ottimizzato per tessuto cerebrale murino e potrebbe richiedere modifiche per essere applicato ad altri tessuti o modelli animali alternativi, poiché la composizione e le caratteristiche strutturali del tessuto variano tra specie e organi. Infine, l'SDS al 5–10% potrebbe interferire con la spettrometria di massa, i saggi di attività enzimatica, gli studi sulle interazioni proteina-proteina^13,14 e altre applicazioni sensibili all'SDS. Potrebbero quindi essere necessarie ulteriori procedure di rimozione del detergente o di scambio del tampone.

In conclusione, questo flusso di lavoro di allocazione emisferica consente analisi morfologiche e molecolari accoppiate provenienti dallo stesso animale, riducendo l'utilizzo di animali e la variabilità inter-individuale. Questo flusso di lavoro si rivela utile in studi che richiedono analisi istologiche e molecolari accoppiate, specialmente quando la disponibilità di tessuto è limitata. La capacità di conservazione a lungo termine delle sezioni potrebbe inoltre facilitare analisi retrospettive e l'archiviazione standardizzata dei campioni, mentre l'uso di piccoli campioni di regioni cerebrali favorisce indagini specifiche per regione. I suoi principali limiti includono rese più basse di RNA e proteine, una potenziale asimmetria emisferica, la limitazione al tessuto cerebrale murino e una compatibilità limitata con applicazioni sensibili agli SDS. Studi futuri dovrebbero ottimizzare il recupero di biomolecole, validare il flusso di lavoro in altri tessuti e specie e valutare la stabilità a lungo termine di ulteriori bersagli molecolari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi microcentrifuga RNase-free da 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Raccolta di biopsie tissutali e frazioni per l'estrazione di RNA/proteine.
Tubi conici da 15 mL per centrifuga	Biofil	CFT010150	Fissazione, disidratazione con saccarosio e conservazione di soluzioni.
Piastre per colture cellulari a 24 pozzetti	NEST	702001	Raccolta, colorazione e conservazione a lungo termine di sezioni cerebrali in sospensione libera.
Soluzione di saccarosio al 30%	Preparata in laboratorio	N/A	Crioprotezione degli emisferi cerebrali fissati prima della criosezionatura.
Soluzione di paraformaldeide al 4%	Biosharp	BL539A	Fissazione per immersione dell'emisfero cerebrale destinato all'analisi morfologica.
Tampone di caricamento proteico 5×	Beyotime Biotechnology	DL101	Preparazione dei campioni proteici per SDS-PAGE.
Agarosio	Solarbio	Cat: A8201	Valutazione dell'integrità dell'RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Anticorpo anti-doublecortin	Abcam	ab18723	Anticorpo primario per immunohistochimica della doublecortin.
Anticorpo anti-ERK	Beyotime	AB2014	Anticorpo primario per Western blotting di ERK totale.
Anticorpo anti-GFAP	Abcam	ab10062	Anticorpo primario per immunofluorescenza della proteina acida fibrillare gliale.
Anticorpo anti-Iba1	Wako	NCNP24	Anticorpo primario per immunofluorescenza della molecola 1 di adattatore legante il calcio ionizzato.
Anticorpo anti-NeuN	Millipore	A60	Anticorpo primario per la colorazione dell'antigene nucleare neuronale.
Anticorpo anti-NF-κB p65	HUABIO	ET1603-12	Anticorpo primario per Western blotting di NF-κB p65.
Anticorpo anti-ERK fosforilato	Beyotime	ET1610-13	Anticorpo primario per Western blotting di ERK fosforilato.
Anticorpo anti-PSD95	HUABIO	ET1602-20	Anticorpo primario per Western blotting di PSD95.
Anticorpo anti-ULK1	HUABIO	ET1704-63	Anticorpo primario per Western blotting di ULK1.
Anticorpo anti-β-tubulina	ABclonal	AC021	Anticorpo primario di controllo di caricamento per Western blotting.
Mezzo di montaggio antifade per fluorescenza	Beyotime	P0126-5	Mezzo di montaggio per sezioni colorate con immunofluorescenza.
Kit di rilevamento biotina-streptavidina perossidasi	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sistema di rilevamento secondario per immunohistochimica DAB.
Albumina sierica bovina	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Tampone di bloccaggio per immunocolorazione e Western blotting.
Topi C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	Topi C57BL/6 di 4 settimane	Animali sperimentali per la raccolta di tessuto cerebrale murino, se inclusi.
Sistema di imaging chemiluminescente	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Rilevamento dei segnali chemiluminescenti del Western blot.
Microscopio confocale a scansione laser	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Acquisizione delle immagini per sezioni di immunofluorescenza.
Soluzione di conservazione crioprotettiva	Preparata in laboratorio	N/A	Conservazione a lungo termine di sezioni cerebrali in sospensione libera a −20 °C.
Criostato	Leica	CM1950	Preparazione di sezioni cerebrali coronali da 30 μm.
Kit substrato cromogeno DAB	Sigma	SLBP7387V	Sviluppo cromogeno per immunohistochimica.
Soluzione di colorazione nucleare con DAPI	Coolaber	SL7100	Controcolorazione nucleare per immunofluorescenza.
Microscopio ottico digitale	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Modello NE910+FL-900	Monitoraggio dello sviluppo DAB e acquisizione di immagini di sezioni colorate in campo chiaro.
DNasi I	Vazyme	R223-01	Rimozione del DNA genomico residuo prima della trascrizione inversa.
Donkey anti-rabbit IgG, coniugato con 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Anticorpo secondario fluorescente per immunofluorescenza.
Donkey anti-rabbit IgG, coniugato con 594	Abcam	ab150076	Anticorpo secondario fluorescente per immunofluorescenza.
Kit E.Z.N.A. DNA/RNA/Proteina	Omega Bio-Tek	D3892-01
Alimentatore per elettroforesi	Bio-Rad	1645050	Alimentazione per elettroforesi su gel di agarosio e SDS-PAGE.
Glicole etilenico	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Componente della soluzione di conservazione crioprotettiva.
Sistema di imaging per gel	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Acquisizione di immagini di gel di agarosio per la valutazione della qualità dell'RNA.
Vetrini in vetro rivestiti con gelatina	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Montaggio di sezioni cerebrali in sospensione libera colorate con DAB.
Software di analisi delle immagini	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Analisi densitometrica delle bande del Western blot e elaborazione delle immagini.
Isopropanolo	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Precipitazione delle proteine dalla frazione organica/interfase.
Microcentrifuga refrigerata	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Centrifugazione durante l'estrazione di RNA/proteine e i passaggi di lavaggio.
Kit Minute Protein Extraction	Invent	MS-026
Mezzo di montaggio in balsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Applicazione del coprioggetti su sezioni colorate con DAB e disidratate.
Mezzo di inclusione OCT	Sakura	4583	Mezzo di inclusione per la criosezionatura di emisferi cerebrali fissati.
Piastre o tubi ottici per qPCR	Axygen	PCR-0208-C	Recipienti per l'amplificazione qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	Sigillatura di piastre multipozzetto per la conservazione a lungo termine di sezioni.
Pentobarbital sodico	Hualan Bio	57-33-0	Agente anestetico prima della perfusione transcardiale.
Piatti di Petri	Biosharp	BS-90-D	Manipolazione del cervello su ghiaccio e separazione degli emisferi.
Reagente di estrazione RNA fenolo/guanidinio	Sparklade	AC0101-B	Reagente di confronto per esperimenti di controllo di estrazione dell'RNA.
Cocktail inibitore di fosfatasi	APExBIO	K1015-100	Preservazione della fosforilazione durante l'estrazione proteica.
Soluzione salina tamponata al fosfato	Biosharp	BL601A	Tampone di lavaggio, solvente per soluzioni di saccarosio e solvente crioprotettivo.
Membrana in fluoruro di polivinilidene	Millipore	IPVH08100	Membrana per il trasferimento nel Western blot.
Polivinilpirrolidone K40	Sigma	9003-39-8	Componente della soluzione di conservazione crioprotettiva.
Cocktail inibitore di proteasi	Beyotime	P1045	Prevenzione della degradazione proteica durante la lisi tissutale.
Kit di estrazione proteica	Invent	MS-026	Kit di confronto per esperimenti di controllo di estrazione proteica totale.
Sistema di PCR in tempo reale	Amolarray	MA6000	Amplificazione qPCR e analisi della curva di denaturazione.
Dodecilsolfato di sodio	BioFroxx	3250GR500	Scioglimento del pellet proteico e preparazione del campione per SDS-PAGE.
Lame da rasoio sterili	Biosharp	BS-RB-11	Separazione degli emisferi e taglio del tessuto su ghiaccio.
Coniugato streptavidina-perossidasi	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reagente di amplificazione/rilevamento del segnale per immunohistochimica DAB.
Saccarosio	Hushi	57-50-1	Soluzione crioprotettiva e soluzione di conservazione crioprotettiva.
Master mix qPCR SYBR	Vazyme	Q711-02	Amplificazione qPCR.
Apparecchio di trasferimento	Bio-Rad	1703930	Trasferimento umido delle proteine dal gel SDS-PAGE alla membrana.
Soluzione salina tamponata al Tris con Tween 20	Preparata in laboratorio	N/A	Tampone di lavaggio della membrana per Western blot.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilizzazione delle sezioni cerebrali per immunocolorazione.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Kit di rilevamento UltraSensitive SP per immunohistochimica (per anticorpi primari di topo/coniglio)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorpo secondario/reagente di rilevamento per immunohistochimica DAB.
Ratto Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, maschio	Animali sperimentali per la raccolta di tessuto cerebrale di ratto, se inclusi.
Xilene	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Chiarificazione di vetrini colorati con DAB prima dell'applicazione del coprioggetti.
Mezzo di montaggio in balsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Applicazione del coprioggetti su sezioni colorate con DAB e disidratate.
Coniugato streptavidina-perossidasi	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reagente di amplificazione/rilevamento del segnale per immunohistochimica DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilizzazione delle sezioni cerebrali per immunocolorazione.
Kit di rilevamento UltraSensitive SP per immunohistochimica (per anticorpi primari di topo/coniglio)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticorpo secondario/reagente di rilevamento per immunohistochimica DAB.
Xilene	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Chiarificazione di vetrini colorati con DAB prima dell'applicazione del coprioggetti.