Ibridazione multiplex fluorescente in situ di tessuti craniofacciali in via di sviluppo in campioni di topo FFPE

Summary

L'ibridazione convenzionale in situ fatica a visualizzare l'mRNA nei tessuti craniofacciali a causa dell'architettura complessa, dell'alto background, della limitata specificità della sonda e della sensibilità. Questo protocollo descrive un metodo multiplex di ibridazione in situ con RNA fluorescente per la rilevazione sensibile e specifica di più bersagli di mRNA nei tessuti craniofaciali embrionali di topo FFPE, superando le limitazioni precedenti.

Abstract

Lo sviluppo craniofacciale dipende dall'attività coordinata di diverse popolazioni cellulari specializzate che interagiscono all'interno di architetture tissutali intricate per formare e mantenere la struttura e la funzione tessutale normale. Comprendere come queste cellule comunicano tra loro e con il loro microambiente locale è essenziale per definire i meccanismi molecolari che regolano la loro formazione e omeostasi. La compromessa di questi processi può portare a condizioni craniofacciali congenite, tra cui agenesia dentale, palatoschisi e labbro leporino, sia da soli che come parte di disturbi sindromici. Sebbene tecniche quantitative come la RT-PCR offrano alta sensibilità e gamma dinamica, richiedono l'estrazione di RNA da tessuti omogeneizzati, causando una perdita di contesto spaziale e cellulare, una limitazione particolarmente critica per i tessuti craniofacciali eterogenei, dove l'origine cellulare dei trascrivi non può essere risolta. L'ibridazione multiplex con RNA fluorescente in situ supera questa limitazione consentendo la rilevazione sensibile e specifica di più trascritti di mRNA mantenendo l'architettura tissutale. Questo approccio avanzato consente una localizzazione precisa dell'espressione genica a livello cellulare, fornendo preziose informazioni sulla regolazione spaziale dei processi di sviluppo e dei meccanismi delle malattie nella biologia craniofacciale.

Introduction

La reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) è il punto di riferimento per l'analisi dell'espressione genica grazie alla sua elevata sensibilità e all'ampia gamma dinamica; tuttavia, richiede RNA estratto da tessuti omogeneizzati, causando la perdita di contesto spaziale^{e cellulare 1}. Questa limitazione è particolarmente problematica per tessuti eterogenei come i tessuti craniofaciali durante lo sviluppo embrionale, dove la fonte cellulare dei trascrizioni rilevati non può essere risolta. L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH), una tecnica pionieristica nel 1968 da Joseph Gall e Mary Lou Pardue, supera questa limitazione permettendo la localizzazione dell'espressione dell'mRNA all'interno dell'architettura tissutale^{intatta 2}. Tuttavia, l'RNA ISH convenzionale è tecnicamente impegnativa e fortemente dipendente dalla fissazione ottimale dei tessuti e dalla preparazione del campione per preservare l'integrità^{dell'RNA 3}. Queste difficoltà sono aggravate nei tessuti altamente calcificati, che richiedono procedure di decalcificazione che spesso coinvolgono sostanze chimiche aggressive o processi prolungati, portando alla degradazione dell'RNA. Di conseguenza, l'RNA ISH nei tessuti craniofacciali, che comprendono complesse miscele di tipi cellulari, richiede un'attenta ottimizzazione e competenze tecniche, richiede molto tempo e comporta un rischio sostanziale di colorazione subottimale. La sfida nel visualizzare l'espressione dell'mRNA è ancora più evidente nei tessuti dentali, che possiedono una struttura e una composizione altamente complesse. I denti sono composti da componenti mineralizzati come smalto, dentina, cemento e osso circostante, insieme a tessuti più molli come la polpa e il legamento parodontale. Questi tessuti sono popolati da una vasta gamma di tipi cellulari che svolgono ruoli cruciali nello sviluppo dei denti⁴. Queste caratteristiche richiedono un'attenta standardizzazione per garantire un rilevamento affidabile del segnale. Di conseguenza, il protocollo descritto è particolarmente adatto per indagare l'espressione genica durante le fasi di sviluppo e postnatale della formazione dei denti.

Esistono tecniche multiple basate su ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per la rilevazione spaziale dell'RNA, tra cui RNA amplificato basato su sonda^FISH 5,6,7,8,9, ibridazione a catena di reazione ^{FISH 6}, RNA a singola molecola^{FISH 10}, amplificazione del segnale tramite reazione di scambio^{FISH 5} e piattaforme FISH altamente multiplexate come MERFISH¹¹ e^{seqFISH 12.13}. Tra questi, l'RNA fluorescente multiplex^{ISH 7,8,9} è ampiamente utilizzato per la sua elevata sensibilità nel rilevare una singola molecola di RNA derivante dal design a doppia Z-sonda, in cui due sonde adiacenti devono ibridarsi con la sequenza target per avviare l'amplificazione del segnale. Questo design di doppio riconoscimento migliora notevolmente la specificità e riduce il segnale fuori bersaglio. Il metodo supporta la rilevazione multiplex di 2–4 bersagli (espandibili fino a 12 o più bersagli usando tecniche simili), preserva la morfologia tissutale ed è compatibile con tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE^)7,8,9, freschi congelati e calcificati selezionati, rendendolo adatto a campioni complessi come quelli riscontrati nello sviluppo craniofacciale e dentale. Il metodo è standardizzato, riproducibile, supportato da librerie di sonde ben consolidate e ampiamente validato, garantendo risultati accessibili e affidabili in vari laboratori.

L'RNA fluorescente multiplex ISH impiega più sonde che mirano a regioni distinte dello stesso trascrito, combinate con un'amplificazione del segnale potenziata, permettendo una rilevazione altamente sensibile e specifica anche per mRNA a bassa abbondanza o parzialmente^{degradati 14,15}. Mentre l'RNA fluorescente multiplex è stato applicato con successo a campioni ossei^{decalcificati 16}, e il suo utilizzo in tessuti craniofaciali complessi è stato precedentemente^{segnalato 7,8,9}; tuttavia, non è ancora stato riportato un protocollo dettagliato passo dopo passo che descriva la sua applicazione in questo contesto.

Le strutture craniofacciali comprendono architetture tissutali intricate con diversi tipi cellulari, tra cui osteoblasti, osteoclasti, osteociti, ameloblasti, odontoblasti, fibroblasti, cellule staminali, cellule immunitarie, vascolarizzazione e neuroni sensoriali, le cui interazioni spazialmente coordinate sono essenziali per la formazione, la funzione, la rigenerazione e la protezione^{immunologica dei tessuti 4}. Lo studio delle espressioni geniche localizzate in questi tessuti è quindi fondamentale, e l'ISH di RNA fluorescente multiplex rappresenta un approccio leader per tali analisi.

In questo studio, abbiamo descritto come l'RNA fluorescente multiplex ISH basato su sonde e tecnologie di RNAscope possa essere applicato allo studio di tessuti craniofaciali complessi (Figura 1). Inoltre, abbiamo stabilito un flusso di lavoro ottimizzato per la sezionazione FFPE che preserva l'integrità dell'RNA e consente un'analisi dell'espressione genica di alta qualità e risolta spazialmente.

Protocol

Tutte le procedure animali sono state approvate dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (IACUC), secondo il Protocollo di Studio sugli Animali #24-031.

1. Accoppiamento temporizzato e raccolta di tessuti embrionali

1. Organizza gli accoppiamenti programmati.
   1. Abbina un maschio sano e fertile un Mus musculus e una femmina nel tardo pomeriggio. La mattina seguente, controlla la presenza di un tappo vaginale. Designa il giorno in cui un tappo viene osservato come giorno embrionale (E) 0,5.
2. Eutanasia la femmina incinta.
   1. Nella fase di sviluppo desiderata, si sopporta l'eutanasia della femmina di topo incinta tramite inalazione di CO₂ seguita da una lussazione cervicale, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
   2. Posiziona il topo sulla schiena su una superficie sterile assorbente. Disinfettare l'area addominale con il 70% di etanolo lungo il sito dell'incisione previsto.
3. Espone e isola le corna uterine.
   1. Effettuare un'incisione addominale mediana con forbici chirurgiche sterili, poi aprire la parete peritoneale con forbici microchirurgiche per esporre le corna uterine.
   2. Usa le pinze smussate per esteriorizzare delicatamente la catena uterina. Rilascia il tessuto uterino lungo il miometrio e taglia l'ovidotto e l'attacco mediano del corno uterino per isolare gli embrioni.
4. Trasferire embrioni interi.
   1. Trasferire immediatamente la catena uterina contenente embrioni in una piastra di Petri da 10 cm contenente PBS 1× freddo e sterile (pH 7,4).
5. Dissezionare i singoli embrioni.
   1. Separare con cura ogni embrione dalle membrane uterine, amniotiche e corioniche circostanti.
   2. Trasferire gli embrioni puliti in una ciotola fresca da 10 cm contenente PBS freddo e sterile.
6. Dissezionare teste embrionali di topo.
   1. Utilizzando una lama chirurgica sterile, sezionare le teste e sciacquare quelle dissezionate una volta in PBS gelato prima di ulteriori lavorazioni.
      NOTA: Raccogliere e dissezionare i topi neonatali nella fase di sviluppo desiderata secondo il protocollo animale.

2. Fissazione e lavorazione dei tessuti

1. Sistemare il fazzoletto.
   1. Immergi immediatamente il tessuto dissezionato in formalina tamponata al 10% di neutro e fissa durante la notte a temperatura ambiente su uno shaker.
      NOTA: La corretta conservazione dell'RNA è cruciale per il successo delle analisi di ibridazione in situ. Numerosi studi hanno dimostrato che l'approccio standard—fissare campioni di tessuto in formalina tamponata neutra al 10% per durate che vanno da 6 a 48 ore, a seconda della dimensione e dell'età specifiche del tessuto—produce risultati affidabili per la conservazione^dell'RNA 16,17,18,19. Per le fasi embrionali precedenti (E12.5 e inferiori), la penetrazione del fissativo è rapida e il tempo di fissazione dovrebbe essere ridotto di conseguenza per evitare una sovrafissazione. Dal giorno embrionale 17,5 (E17,5) in poi, così come nei campioni postnatali, la penetrazione del fissativo può essere meno efficiente a causa della presenza di pelle sulla testa, che funge da barriera fisica. Pertanto, la pelle deve essere rimossa dall'intera testa per consentire una penetrazione efficiente della soluzione di fissazione. La decalcificazione può essere effettuata in 0,5 M EDTA (pH 8,0) contenente formaldeide privo di metanolo allo 0,5% a 4 °^{C 7}. La durata della decalcificazione può essere monitorata tramite una rapida microTAC e può essere regolata in base al grado di mineralizzazione e al tipo di tessuto specifico; per embrioni di E18,5, 24–48 ore sono solitamente sufficienti.
2. Risciacqua e processa il tessuto.
   1. Rimuovi il fissativo e risciacqua i campioni con PBS. Trasferire il tessuto al 70% di etanolo e conservare a 4 °C fino a ulteriori lavorazioni (1–4 settimane)²⁰. Esegui disidratazione, pulizia e infiltrazione di paraffina utilizzando un processore automatico di tessuti secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Il protocollo tipico di lavorazione dei tessuti è il seguente: etanolo al 70% per 30 minuti, seguito dal 95% etanolo per 30 minuti (2 volte) e 100% etanolo per 30 minuti (3 volte) per la disidratazione; pulizia nello xilene per 1 ora (3 volte), e successivamente infiltrazione con cera di paraffina a 60 °C per 1 ora (3 volte) prima di inserirsi nei blocchi tissutali di paraffina.
3. Infila il tessuto.
   1. Immergere le teste nella paraffina e orientare i campioni nel piano coronale o sagittale, a seconda dei requisiti sperimentali.
   2. Trasferisci i blocchi incorporati su una piastra fredda a blocchi di paraffina per permettere alla cera di indurirsi per circa 30 minuti, con il timing regolato secondo necessità in base alla dimensione del blocco.
4. Conserva i blocchi FFPE.
   1. Lascia che la paraffina si solidifichi completamente. Estrai i blocchi dagli stampi, mettili in contenitori ermetiche etichettati o sacchetti zip-lock, e conservati a 4 °C fino a quando non sono pronti per la sezione.
      NOTA: I blocchi FFPE con RNA ben conservato possono essere conservati per diversi anni prima della sezione senza compromettere l'integrità dei tessuti.

3. Elaborazione del tessuto FFPE per multiplex ISH a RNA fluorescente

1. Prepara uno spazio di lavoro senza RNase.
   1. Disinfettare tutte le superfici di lavoro e gli strumenti con il 70% di etanolo. Trattare superfici, strumenti e guanti con una soluzione decontaminante per RNasi per minimizzare la degradazione dell'RNA.
   2. Installa il microtomo e installa una nuova lama. Imposta l'angolo di spazio libero a 10°. Trattare pinzette e spazzole con una soluzione decontaminante RNase prima dell'uso.
      NOTA: Usa sempre una lama nuova per la sezionazione e ottenere fette di tessuto precise. L'angolo della lama influisce in modo significativo sulla qualità della sezione, sull'integrità dei tessuti, sull'uniformità dello spessore e sulla conservazione delle caratteristiche morfologiche.
2. Prepara il bagno d'acqua.
   1. Riempi un bagno d'acqua a galleggiamento con acqua ultrapura di qualità da laboratorio.
   2. Regolare la temperatura tra 40 e 43 °C secondo necessità, a seconda dello stadio embrionale e delle caratteristiche tissutali.
3. Rifila e monta il blocco FFPE.
   1. Taglia l'eccesso di paraffina intorno al tessuto incorporato. Raffreddare il blocco FFPE sul ghiaccio e montarlo sullo stadio freddo del microtomo.
4. Taglia alla zona di interesse.
   1. Allineare la faccia del blocco di paraffina con la lama del microtomo e rifilare a 12 μm di passi fino a quando la regione di interesse (ad esempio, quella adiacente al molare o al dente incisivo) appare nelle sezioni coronali.
   2. Riposizionare il blocco e la lama secondo necessità per sezioni coronali o sagittali simmetriche e correttamente orientate a tutta la testa.
5. Taglia il tessuto in sezioni.
   1. Una volta raggiunta la regione di interesse, tagliare sezioni da 5–7 μm. Fai galleggiare le sezioni sul bagno d'acqua per permettere un rilassamento e appiattimento delicato prima di trasferirle sugli scivoli.
6. Monta e asciuga le sezioni.
   1. Montare le sezioni su vetrine in vetro caricate positivamente. Esaminare le vetrine al microscopio lucico per confermare la corretta orientazione e integrità dei tessuti.
   2. Asciugare i vetri su un riscaldatore a 40 °C durante la notte prima di eseguire il test multiplex ISH sull'RNA fluorescente.

4. Giorno 1: Deparaffinizzazione e reidratazione

1. Cuocere le diapositive.
   1. Cuocere le vetrine con sezioni di FFPE per 1 ora a 60 °C.
      NOTA: Se il vetrino non viene usato immediatamente, conservarlo non cotto a temperatura ambiente (RT) con i disidratanti per 1–4 settimane. Una conservazione prolungata può portare alla degradazione dell'RNA.
2. Bilancia le vetrine.
   1. Lascia che il tessuto FFPE si equilibri a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti.
3. Deparafinizza e reidrata le sezioni.
   1. Immergi i vetri in xilene o in un sostituto di xilene con una delicata agitazione per 5–10 minuti a RT. Ripeti questo passaggio una volta per assicurarti la completa rimozione della paraffina.
      NOTA: Il lavoro con lo xilene deve essere effettuato in una cappa chimica. Se viene utilizzato un sostituto dello xilene a bassa tossicità, può essere impiegato al di fuori della cappa chimica.
   2. Trasferire i vetri al 100% etanolo e incubare per 2 minuti a RT. Ripeti una volta per rimuovere il residuo dello xilene. Reidrata le sezioni al 70% di etanolo per 2 minuti.
   3. Risciacqua le sezioni 3 volte con PBS. Poi aggiungi una goccia di PBS sufficiente a coprire completamente le sezioni e procedi immediatamente al passo successivo.

5. ISH multiplex di RNA fluorescente su sezioni di tessuto FFPE

NOTA: Questo studio ha seguito le istruzioni del produttore per l'esecuzione del multiplex ISH di RNA fluorescente su sezioni di tessuto FFPE utilizzando la tecnologia^{RNAscope 21}.

1. Giorno 1: Pretrattamento e ibridazione con sonda
   1. Disegna una barriera idrofobica.
      1. Usando una barriera, disegna una barriera idrofoba attorno a ogni sezione di tessuto. Lascia asciugare le lame all'aria per circa 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
      2. Assicurati che le sezioni di tessuto rimangano sempre coperte da PBS per evitare l'asciugatura.
         NOTA: Usa una salvietta senza pelucchi (lenziera) per asciugare il vetrino intorno al tessuto mantenendo il tessuto idratato. Assicurati che l'inchiostro barriera non entri in contatto con la sezione del tessuto.
   2. Esegui il pretrattamento.
      1. Applica il reagente di pretrattamento personalizzato per coprire completamente ogni sezione. Incubare i vetrini per 30 minuti a 40 °C in una camera umidificata inserita in un forno ibrido.
         NOTA: Per tutti i reagenti forniti in flaconi contagocce, aggiungere gocce sufficienti per coprire completamente la sezione all'interno della barriera. Assicurati che tutti i reagenti siano portati al RT prima dell'uso.
   3. Sciacquare le sezioni.
      1. Risciacqua le sezioni più volte con PBS, poi incuba in PBS fresco per 2 minuti a tempo di respiro.
         NOTA: Usa una pipetta di trasferimento da 5 mL per lavare ogni vetrino individualmente con PBS. Durante i 2 minuti di lavaggio, assicurati che le sezioni rimangano completamente coperte con PBS.
   4. Spegne l'attività endogena della perossidasi.
      1. Applicare perossido di idrogeno al 3% su ogni sezione e incubare a RT per 10 minuti per bloccare l'attività della perossidasi endogena.
   5. Ripeti il lavaggio.
      1. Lava le vetrine in PBS per 2 minuti a RT. Ripeti due volte.
   6. Preparate le sonde.
      1. Preriscaldare le sonde a 40 °C per 10 minuti. Lascia raffreddare le sonde in RT prima di usarle.
   7. Prepara la miscela della sonda.
      1. La sonda C1 è fornita come soluzione funzionante 1×; Usa questo direttamente.
      2. Al contrario, le sonde C2, C3 e C4 sono fornite come concentrati al 50×; diluire queste sonde con la soluzione della sonda C1. Se la sonda C1 non viene utilizzata, diluire le sonde C2, C3 e/o C4 con il diluente fornito dal produttore.
   8. Ibrida le sonde.
      1. Applicare 30–40 μL di miscela di sonda su ogni sezione di tessuto, assicurando una copertura completa. Incubare i vetri per 2 ore a 40 °C in una camera umidificata nel forno di ibridazione.
         NOTA: Durante l'apprendimento della tecnica RNAscope, si raccomanda di includere sia sonde di controllo negative che positive durante i test. Questo approccio aiuta a convalidare il test e a confermare la qualità della procedura. Una possibile limitazione di cui essere consapevoli è che alcune sonde di controllo positivo fornite dal produttore potrebbero non essere espresse nel tessuto di interesse. Per affrontare questo problema, possono essere utilizzate sonde specifiche per tipo di cellula. Ad esempio, Col1a1 è un controllo positivo affidabile per i tessuti connettivi. La colorazione per Col1a1 (o un altro gene con espressione nota alta) può essere eseguita come primo passo per valutare la conservazione dell'RNA e la morfologia tissutale nei campioni. Una volta raggiunta la padronanza della tecnica, i controlli negativi vengono tipicamente eseguiti elaborando vetrine senza sonde, ma trattandole con tutte le altre soluzioni. Questo metodo fornisce informazioni critiche riguardo al segnale di fondo in tutti i canali di rilevamento. Il kit standard Multiplex V2 consente la colorazione e l'imaging simultaneo di fino a quattro diverse sonde. Quando i livelli di espressione genica sono stati stabiliti tramite studi trascritomici precedenti, è consigliabile assegnare geni con bassa espressione ai canali Cy5 e Cy7. I geni fortemente espressi dovrebbero essere inseriti nei canali GFP e RFP per una rilevazione ottimale. Nei casi in cui nessuna delle sonde prende di mira geni con alta espressione, il canale GFP dovrebbe rimanere inutilizzato. Questo permette al canale GFP di servire come riferimento per la sottrazione di fondo dal canale RFP, migliorando la precisione del rilevamento del segnale per bersagli a bassa espressione.
   9. Risciacquo con il tampone di lavaggio.
      NOTA: Il buffer di lavaggio disponibile commercialmente al 20× è stato diluito a 1× con acqua priva di RNase prima dell'uso.
      1. Lava le slide per 2 minuti a RT nel 1× Wash Buffer fornito con il kit. Ripeti due volte.
   10. Incubare in un tampone 5x salino-citrato di sodio (SSC).
       NOTA: Il tampone SSC 20× disponibile in commercio (3 M NaCl, 0,3 M citrato di sodio, pH 7,0) è stato diluito al 5× con acqua priva di RNasi prima dell'uso.
       1. Dopo il lavaggio, incubare le sezioni durante la notte in un buffer SSC 5× a RT.
2. Giorno 2: Amplificazione del segnale, marcatura fluorescente e montaggio
   1. Lava le vetrine.
      1. Lava le vetri in 1× Wash Buffer per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). Ripeti due volte.
   2. Esegui i passaggi di amplificazione.
      1. Applicare il reagente Amplification 1 su ogni sezione e incubare per 30 minuti a 40 °C in una camera umidificata.
      2. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      3. Applica il reagente Amplification 2 e incuba per 30 minuti a 40 °C.
      4. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      5. Applica il reagente di amplificazione 3 e incuba per 15 minuti a 40 °C.
         NOTA: Tutti e tre i passaggi di amplificazione sono necessari indipendentemente dai canali (sonde) che vengono sviluppati.
      6. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
   3. Sviluppa la perossidasi del ravano (HRP) e il fluoroforo.
      1. Calcola il volume di fluoroforio necessario (generalmente 100–200 μL per vetrina) e diluisce le scorte di fluorofori opali.
         NOTA: L'intervallo di diluizione raccomandato per il fluoroforio è 1:300–1:1500. In questi esperimenti, Opal Polaris 780 (reagente fluoroforo) è stato diluito 1:500 in diluente anticorpale, e tutti gli altri coloranti sono stati diluiti 1:1000 in buffer TSA. Minimizza l'esposizione alla luce sulle vedute ogni volta che è possibile.
      2. Applicare il reagente HRP-C1 e incubare per 15 minuti a 40 °C.
      3. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      4. Applicare 30–40 μL di colorante opale (ad esempio, Opal 570 o Opal 690) su ogni sezione. Incubare per 30 minuti a 40 °C.
      5. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      6. Applica il Bloccante HRP e incuba per 15 minuti a 40 °C.
      7. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      8. Applicare reagente HRP-C2 o HRP-C3 e incubare a 40 °C per 15 minuti.
      9. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      10. Applicare 30–40 μL del secondo colorante opale e incubare per 30 minuti a 40 °C.
      11. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      12. Applica il Bloccante HRP e incuba per 15 minuti a 40 °C.
      13. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      14. Applicare reagente HRP-C3 o HRP-C4 e incubare per 15 minuti a 40 °C.
      15. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
   4. Eseguire amplificazione del segnale tiramidico-digoxigenina (TSA-DIG) e marcatura con fluorofori (se applicabile).
      1. Applicare 30–40 μL di reagente TSA-DIG diluito per sezione e incubare per 30 minuti a RT.
      2. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      3. Applica il reagente bloccante e incuba per 15 minuti a 40 °C.
      4. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
      5. Applicare 30–40 μL di reagente fluoroforico diluito e incubare per 30 minuti a 40 °C.
      6. Risciacqua due volte in 1× Wash Buffer per 2 minuti a RT.
   5. Esegui la controcolorazione e il montaggio.
      1. Applicare 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e incubare per 5 minuti a RT al buio.
      2. Risciacqua DAPI e monta prontamente le sezioni usando un anti-sfaccettatura, applica delicatamente il coperchio e evita di intrappolare bolle d'aria. Scegli una misura di copertura che corrisponda adeguatamente alla copertura del tessuto.
      3. Asciuga i vetri per 2 ore a RT al buio, poi tieni i vetri a 4 °C per conservarli a lungo termine.
         NOTA: La fluorescenza può essere preservata fino a un anno se conservata a 4 °C al buio con un adeguato montaggio anti-sfaccettamento.
   6. Esegui l'imaging.
      1. Eseguire l'imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza multicanale con illuminazione LED e filtri per la separazione spettrale (Figura 2A). Utilizzare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione come segue: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) e Cy7 (747/773 nm). Filtri specifici minimizzano le sovrapposizioni spettrali e distinguono segnali blu, verde, arancioni, rossi e nel vicino infrarosso.
      2. Acquisire tutte le immagini utilizzando le stesse impostazioni di esposizione e illuminazione tra i campioni, garantendo coerenza e consentendo un'analisi comparativa affidabile.

Results

Utilizzando il protocollo descritto (Figura 1), dimostriamo la rilevazione di trascrizioni ISH di mRNA fluorescenti multiplex su una testa intera di topo fotografiata su una piattaforma di microscopio Zeiss (Figura 2B). Le viste specifiche delle immagini possono essere selezionate usando la scheda laterale (scatola gialla), mentre più canali possono essere visualizzati simultaneamente usando la scheda canale (riquadro rosso). Lu...

Discussion

L'ibridazione in situ è stata uno strumento fondamentale per lo studio dell'espressione genica per oltre quattro decenni ed è stata continuamente perfezionata. Tuttavia, gli approcci ISH convenzionali sono spesso limitati da bassa sensibilità, alto segnale di fondo e procedure lunghe e laboriose. Questi vincoli ne hanno limitato l'applicazione più ampia, in particolare nei tessuti craniofaciali complessi dove una risoluzione spaziale precisa e il rilevamento di trascritti a bass...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  per eseguire lavaggi durante il flusso di lavoro
20 e volte; SSC	Thermo Fischer	J60839. K2	Usa per rendere l'1´ Buffer di lavaggio
Tubi conici da 50 mL (Ambion) senza RNAsi	Thermo Fischer	AM12502	Usare per conservare campioni in diverse soluzioni
Oscillatore orbitale avanzato	VWR	6683-470	Da usare per scuotere i tessuti in soluzione di fissazione durante l'incubazione
Alcol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Usalo per pulire e disinfettare tutto lo spazio di lavoro
Diluente degli anticorpi	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluente per TSA-DIG
Processore automatico di tessuti a vuoto	Leica Biosystems	ASP300S	Uso per eliminare, disidratazione, reidratazione e infiltrazione di cera dei campioni
Spessore vetro di copertura 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Utilizzo per il montaggio di slide nel flusso di lavoro Visium HD
Reagente di pretrattamento personalizzato	ACD, Bio-Techne	300040	Ottimizzare la permeabilizzazione dei tessuti e l'accessibilità dei bersagli
EDTA	Millipore Sigma	03690	Uso per decalcificare tessuti mineralizzati
Etanolo al 100%	Gruppo AeroBase	6505001050000	Da usare per rimuovere la xilina e reidratare i campioni durante la lavorazione
Bagno d'acqua HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Usare per far galleggiare le sezioni a 40-43 °C; C per rimuovere le rughe dalle sezioni FFPE
Carta umidificante HybEZ	ACD, Bio-Techne	310015	Da usare all'interno del forno HybEZ per mantenere l'umidità e prevenire che le sezioni di tessuto si secchino durante l'ibridazione
Forno, teglia e griglia HybEZ	ACD, Bio-Techne	310011, 310012, 310014	Da usare per fornire temperatura, umidità e una corretta posizione delle slide durante le fasi di ibridazione e incubazione
Penna barriera idrofobica ImmEdge	Laboratorio Vettoriale	H-4000	Utilizzare per tracciare confini idrofobi sulle vetrine per confinare i reagenti alla sezione tissutale durante le procedure di colorazione.
Lame usa e getta a profilo basso DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Usare per sezionare i blocchi FFPE
Formalina tamponata neutra 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Usato per sistemare i tessuti
PACCHETTO DI REAGENTI OPAL 520	Akoya Biosciences, Inc.	FP1487001KT	Amplificare e rilevare segnali di RNA bersaglio con marcatura fluorescente.
PACCHETTO DI REAGENTI OPAL 570	Akoya Biosciences, Inc.	FP1488001KT	Amplificare e rilevare segnali di RNA bersaglio con marcatura fluorescente.
PACCHETTO DI REAGENTI OPAL 620	Akoya Biosciences, Inc.	FP1495001KT	Amplificare e rilevare segnali di RNA bersaglio con marcatura fluorescente.
PACCHETTO DI REAGENTI OPAL 690	Akoya Biosciences, Inc.	FP1497001KT	Amplificare e rilevare segnali di RNA bersaglio con marcatura fluorescente.
Pacchetto Reagenti Opal Polaris 780	Akoya Biosciences, Inc.	FP1501001KT	Amplificare e rilevare segnali di RNA bersaglio con marcatura fluorescente.
Diamante Prolong	Thermo Fischer	P36970	Un mezzo di montaggio antifade per preservare i segnali fluorescenti e proteggere il segnale RNAscope durante l'imaging
RNAscope 4-Plex Kit Accessorio UI SPECIFICA	ACD, Bio-Techne	323120	Materiali aggiuntivi utilizzati con il saggio RNAscope Multiplex Fluorescent v2
RNAscope DAPI	ACD, Bio-Techne	320858	Una colorazione nucleare fluorescente utilizzata negli saggi RNAscope per visualizzare i nuclei cellulari
Kit di reagenti fluorescenti multiplex RNAscope v2	ACD, Bio-Techne	323100	Per eseguire l'ibridazione multiplex fluorescente in situ
RNAscope Multiplex TSA Buffer	ACD, Bio-Techne	322810	Un tampone utilizzato nell'RNAscope per diluire coloranti opali
Reagenti tampone a lavaggio RNAscope	ACD, Bio-Techne	310091	Usalo per lavare le sezioni di tessuto sui vetri durante il test
Soluzione di decontaminazione RNase RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Uso per pulire e rimuovere RNase
Microtomo rotatorio semi-automatizzato	Leica Biosystems	RM2245	Usa per sezionare i blocchi FFPE come riportato nelle linee guida.
Slide Brite	Scienza della microscopia elettronica	23401-01	Per il passaggio di deparaffinizzazione prima del processamento dell'RNAscope.
Scaldalleve con copertura	Premiere	XH2004	Utilizzo per l'incubazione di vetri a diverse temperature
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Uso per collegare sezioni per Vsium HD
Paraplasto Chirurgico	Leica Biosystems	39601006	Uso per effettuare l'infiltrazione dei tessuti e l'inserimento dei tessuti
Coltura tissutale DISH 100 X 20 MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Uso per raccogliere e dissezionare campioni in 1´ PBS
Xylene	Fisher Scientific	6.81001E+12	Usato come agente detergente per rimuovere l'alcol e rendere i tessuti trasparenti