Articolo metodologico

Quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi

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DOI:

10.3791/71488

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28 agosto 2026

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la preparazione di piastre per diffusione facilitata da esametildisilossano (HMDS), seguita da misurazioni con elettrodo ionoselettivo per quantificare la massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti dei topi. Il metodo fornisce un approccio sensibile, basato su calibrazione, per valutare l'accumulo di fluoro in campioni biologici.

Abstract

La quantificazione dei livelli di fluoro nei tessuti biologici è essenziale per comprendere l'esposizione, il metabolismo e la tossicità del fluoro. Questo protocollo descrive un metodo sensibile e riproducibile per misurare la massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti, mediante diffusione facilitata da esametildisilossano (HMDS) seguita da analisi con elettrodo selettivo per ioni (ISE). Campioni biologici, inclusi siero, osso femorale e incisivi mandibolari, vengono raccolti da topi esposti a trattamenti controllati di fluoro. I campioni ossei e dentali vengono calcinati, macinati e idratati, mentre il siero viene processato direttamente. Ciascun campione viene trasferito in una capsula da diffusione contenente acqua ultrapura e sigillata con un coperchio rivestito di vaselina, sul quale sono presenti gocce di idrossido di sodio che fungono da trappole per il fluoro. L'iniezione di acido solforico saturo di HMDS inizia il rilascio e la diffusione del fluoro, consentendo agli ioni fluoruro liberati di essere catturati quantitativamente nelle trappole. Dopo una diffusione notturna, le gocce delle trappole per il fluoro vengono unite in un singolo campione, acidificate al range di pH richiesto e portate a un volume definito per la misurazione tramite ISE. Capsule di calibrazione preparate con masse note di fluoro generano una curva standard per la quantificazione, e campioni di controllo qualità verificano la stabilità dell'elettrodo. Risultati rappresentativi ottenuti da topi adolescenti e adulti esposti a 0 o 125 ppm di fluoro dimostrano la capacità del metodo di rilevare differenze dipendenti dall'età e dalla dose nei livelli di fluoro nel siero, nell'osso e nei denti. Questo protocollo fornisce un approccio solido, basato su calibrazione, per quantificare il fluoro in diverse matrici biologiche ed è particolarmente adatto a studi che indagano l'esposizione al fluoro, il deposito nei tessuti e gli esiti tossicologici in modelli murini. Un vantaggio fondamentale di questo metodo è la sua capacità di quantificare con precisione il fluoro in campioni estremamente piccoli, inclusi i 3–5 mg di residuo calcinato ottenuti dagli incisivi individuali del topo, poiché il processo di diffusione concentra tutto il fluoro rilasciato in un volume misurabile inferiore a 100 µL.

Introduzione

Il fluoruro è un anione presente in natura e un livello ottimale di fluoruro è efficace nella prevenzione delle carie dentali1,2,3,4,5. Negli Stati Uniti (U.S.), la fluorizzazione dell'acqua potabile a 0,7 ppm è stata attuata come strategia di salute pubblica per ridurre l'incidenza delle carie e promuovere la salute orale6. Tuttavia, l'ingestione prolungata di quantità eccessive di fluoruro può avere effetti avversi su diversi tessuti. Un'elevata esposizione al fluoruro altera la formazione dello smalto7,8,9, modifica la formazione ossea10 e compromette l'integrità scheletrica11.

A livello cellulare, l'esposizione al fluoruro induce diverse alterazioni metaboliche, tra cui lo stress ossidativo12, lo stress del reticolo endoplasmatico13, modificazioni epigenetiche che alterano l'espressione genica14 e l'apoptosi negli ameloblasti15,16,17,18. A livello globale, concentrazioni elevate di fluoro nelle acque sotterranee (>1,5 ppm) rappresentano un problema sanitario significativo. Un recente studio di modellizzazione predittiva ha stimato che circa 180 milioni di persone in tutto il mondo potrebbero essere colpite da un'esposizione eccessiva al fluoro, con il carico maggiore che si verifica in Asia e in Africa1. Oltre all'acqua potabile, l'esposizione al fluoro avviene anche attraverso alimenti (ad esempio, prodotti ittici; ~1,9 ppm), bevande (ad esempio, tè; 0,5–6 ppm19) e prodotti dentali come il dentifricio20 (1.000–1.500 ppm).

Comprendere l'esposizione al fluoro, il suo metabolismo e il deposito nei tessuti è quindi essenziale per valutare sia i benefici terapeutici sia le possibili conseguenze tossicologiche. La quantificazione accurata del fluoro in campioni biologici — inclusi urina, siero, osso e denti — rappresenta un componente fondamentale di questo ambito di studio. Tuttavia, la misurazione è analiticamente complessa a causa del comportamento chimico del fluoro e della sua elevata affinità per matrici ricche di calcio. Circa il 99% del fluoro presente nell'organismo si accumula in tessuti mineralizzati come osso e denti21. Per affrontare queste difficoltà, sono state sviluppate diverse tecniche analitiche, tra cui la potenziometria con elettrodo iono-selettivo (ISE), la cromatografia ionica, saggi colorimetrici, procedure titrimetriche e metodi basati su attivazione nucleare22. Tra queste, la tecnica di diffusione facilitata dall'esametildisilossano (HMDS) abbinata alla misurazione mediante elettrodo selettivo per il fluoro si è affermata come uno degli approcci più affidabili e diffusi per le matrici biologiche, grazie alla sua sensibilità, riproducibilità e compatibilità con svariati tipi di campione23,24,25,26,27,28,29.

Nonostante la disponibilità di diversi metodi analitici, ciascun approccio presenta limitazioni che possono restringerne l'uso nella ricerca sperimentale o clinica. La cromatografia ionica offre elevata sensibilità e selettività, ma richiede strumentazione specializzata e un'estesa preparazione del campione30,31. I saggi colorimetrici, come il metodo SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate), sono semplici ed economici, ma risultano suscettibili a interferenze dovute alla torbidezza e ai cromofori endogeni, il che ne limita l'affidabilità in campioni biologici complessi22,32,33. I metodi titrimetrici sono economici e diretti, ma mancano della sensibilità necessaria per la rilevazione di tracce di fluoro nella maggior parte dei campioni biologici34. Le tecniche basate su metodi nucleari o di attivazione offrono una sensibilità eccezionale, ma richiedono l'accesso a reattori o fonti di neutroni basati su acceleratori, risultando quindi impraticabili per un uso di routine in laboratorio35. Al contrario, la diffusione facilitata da HMDS seguita dalla misurazione mediante elettrodo selettivo per ioni (ISE) rappresenta un compromesso pratico tra sensibilità, costo e accessibilità, garantendo al contempo il completo rilascio del fluoro sia dai tessuti molli che da quelli mineralizzati. Questo approccio risulta particolarmente vantaggioso per studi su piccoli animali, in cui la disponibilità di tessuto è limitata e le strutture mineralizzate, come gli incisivi del topo, forniscono soltanto 3–5 mg di residuo incenerito per dente.

La capacità del metodo di diffusione–ISE di concentrare tutto il fluoruro rilasciato in un piccolo volume definito consente una quantificazione accurata anche in campioni estremamente ridotti. Ciò rende il metodo particolarmente adatto per studi tossicocinetici, esperimenti dose–risposta e indagini sul metabolismo del fluoruro durante le diverse fasi dello sviluppo. Piccoli roditori, in particolare topi C57BL/6J, sono stati ampiamente utilizzati come modelli animali per studiare gli effetti del fluoruro7,9,12,29,36 .

In questo protocollo, gli autori applicano la tecnica di diffusione facilitata da HMDS seguita dalla misurazione con elettrodo selettivo per il fluoruro per quantificare il fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti prelevati da topi esposti a una dose elevata di fluoruro (125 ppm) rispetto ai controlli non trattati. Gli autori confrontano inoltre l'accumulo di fluoruro in topi adolescenti (6 settimane all'inizio del trattamento) e maturi (18 settimane all'inizio del trattamento) per valutare le differenze dipendenti dall'età nel metabolismo del fluoruro e nel suo deposito nei tessuti. Gli incisivi mandibolari sono stati scelti come tessuto dentale rappresentativo poiché gli incisivi dei roditori erompono in modo continuo e raggiungono un equilibrio stazionario tra eruzione e usura occlusale all'incirca a 7 settimane di età. Questo modello di crescita continua fornisce un gradiente costante e accessibile di sviluppo dello smalto, rendendo gli incisivi murini un modello ampiamente utilizzato e ben validato per lo studio della formazione dello smalto e della fluorosi dentale.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della Nova Southeastern University (Protocollo n. 2023.02.MSuz1), accreditata dall'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento della Cura degli Animali da Laboratorio Internazionale (AAALAC). Tutti i lavori sugli animali hanno rispettato la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia degli animali. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali e preparazione e somministrazione di fluoruro di sodio in un modello murino

  1. Animali: Assegnare topi maschi C57BL/6J a due categorie di età: adolescenti, 6 settimane all'inizio del trattamento, e adulti, 18 settimane all'inizio del trattamento.
    1. Fornire a ciascun gruppo acqua deionizzata priva di fluoro (0 ppm F⁻) oppure acqua potabile addizionata con fluoruro di sodio (125 ppm F⁻) per un periodo di esposizione di 6 settimane.
    2. Includere cinque animali per ciascuna condizione di età e trattamento (N = 5/gruppo).
    3. Al termine del periodo di esposizione, raccogliere siero, femori e incisivi mandibolari, e preparare tutti i campioni raccolti per le analisi successive.
      ​NOTA: Campione: materiale processato come osso calcinato, dente calcinato e siero.
  2. Alloggio e dieta degli animali: allevare i topi in condizioni standard di laboratorio con accesso ad libitum a cibo e acqua.
    1. Fornire una dieta priva di fluoro a partire da una settimana prima del prelievo di denti, ossa e siero, per ridurre al minimo i livelli di fluoro di fondo.
  3. Acqua potabile con fluoruro di sodio
    1. Per preparare l'acqua potabile addizionata con fluoro, sciogliere fluoruro di sodio (NaF) in acqua deionizzata per raggiungere la concentrazione desiderata di fluoro (ad esempio, 125 ppm F⁻).
    2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a vuoto da 0,2 µm in una bottiglia autoclavata. Preparare una soluzione fresca ogni 2 giorni.
      ATTENZIONE: Il NaF è tossico se ingerito e può causare irritazione cutanea e oculare. Manipolare in cappa aspirante indossando camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza.
  4. Per l'acqua di controllo priva di fluoro, filtrare l'acqua deionizzata attraverso un filtro a vuoto da 0,2 µm in una bottiglia autoclavata. Preparare acqua fresca ogni 2 giorni.
  5. Fornire acqua potabile addizionata con fluoro o priva di fluoro ad libitum per la durata desiderata del trattamento. Monitorare i livelli di acqua giornalmente e sostituire le bottiglie ogni 2 giorni.
  6. Al termine del periodo di esposizione, eutanasia degli animali mediante inalazione di anidride carbonica (CO₂) seguita da decapitazione. Le procedure di eutanasia sono state eseguite in conformità con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali e sono state approvate come parte del protocollo IACUC istituzionale.
    ATTENZIONE: La CO2 è un asfissiante. Eseguire le operazioni in un'area ben ventilata e assicurarsi che la camera funzioni correttamente. Evitare l'esposizione diretta all'inalazione.

2. Preparazione del campione per la misurazione del fluoruro

  1. Prelievo del sangue
    1. Eutanasia i topi mediante inalazione di CO₂ e preleva immediatamente il sangue tramite puntura cardiaca terminale utilizzando una siringa tubercolinica da 1 mL. Trasferisci il sangue in provette microcentrifuga da 1,5 mL. Smaltisci tutti gli aghi e le siringhe usate in un contenitore istituzionale approvato per rifiuti taglienti.
      ATTENZIONE: Gli aghi delle siringhe sono affilati e possono causare lesioni da punta; maneggiali con cautela.
    2. Conserva il sangue per 30 min a temperatura ambiente, quindi centrifuga per 10 min a 2.000 × g.
    3. Trasferisci il sopranatante (siero) in una provetta microcentrifuga e conserva a −80 °C.
      ATTENZIONE: I congelatori ultra-bassi presentano rischi di congelamento. Indossa guanti isolanti quando maneggi le provette ed evita il contatto prolungato della pelle con superfici fredde.
  2. Ossa
    1. Estrazione dei femori: Dopo l'eutanasia, disseca le zampe posteriori alle articolazioni dell'anca.
    2. Rimuovi con attenzione tutti i tessuti molli dai femori. Lava i tessuti tre volte con acqua deionizzata. Conserva le ossa a -80 °C fino al successivo utilizzo. Smaltisci i tessuti molli rimossi e qualsiasi materiale contaminato nel flusso di rifiuti biologici istituzionale.
      NOTA: I tessuti possono essere fissati in paraformaldeide al 4% con saccarosio al 2% per 12–16 h per la conservazione a lungo termine in etanolo al 70%. Questa procedura di fissazione non altera l'accuratezza della successiva quantificazione del fluoruro.
    3. Lava accuratamente le ossa con acqua deionizzata. Asciuga l'eccesso di umidità con un tovagliolo di carta senza pelucchi.
    4. Trasferisci le ossa in provette microcentrifuga da 1,5 mL con i coperchi aperti per consentire l'evaporazione e posizionale in un forno di essiccazione a 60 °C per 12–16 h.
      ATTENZIONE: Il forno di essiccazione può causare ustioni. Utilizza guanti resistenti al calore quando maneggi i campioni.
    5. Incenerimento delle ossa: Trasferisci le ossa essiccate in crogioli di allumina. Posiziona i crogioli in un forno muffola e riscalda fino a 600 °C a un tasso di 150 °C/h, quindi mantieni la temperatura per 6 h. Attendi che il forno si raffreddi al di sotto di 200 °C prima di rimuovere i crogioli. Smaltisci eventuali frammenti residui di osso o materiali contaminati nel flusso di rifiuti biologici istituzionale.
      ATTENZIONE: Il forno muffola e i crogioli raggiungono temperature estreme, costituendo un grave rischio di ustioni. Attendi sempre che il forno si raffreddi prima di maneggiare i crogioli. Quando rimuovi i crogioli, indossa camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti resistenti al calore, e utilizza pinze lunghe per evitare il contatto diretto con superfici calde.
      PASSO CRITICO: Un incenerimento incompleto comprometterà le analisi successive. Verifica che il materiale osseo abbia raggiunto uno stato completamente ossidato prima di procedere; qualsiasi residuo di carbonio interferirà con le misurazioni successive.
      ​NOTA: L'osso correttamente incenerito dovrebbe apparire uniformemente grigio chiaro o bianco. Particelle più scure—soprattutto residui neri o simili a carbone—indicano una combustione incompleta. Se è presente discolorazione, prolunga la durata dell'incenerimento per consentire la completa rimozione del materiale organico.
    6. Conservazione delle ossa incenerite: Immediatamente dopo l'incenerimento, trasferisci le ossa in provette microcentrifuga da 1,5 mL. Sigilla le provette con Parafilm e conservale in un essiccatore sotto vuoto fino all'uso.
  3. Denti
    1. Estrazione degli incisivi mandibolari: Esegui un taglio orizzontale al livello dell'articolazione temporo-mandibolare per separare la mandibola dalla mascella.
    2. Esegui tagli mediano-sagittali per dividere sia la mascella che la mandibola in metà sinistra e destra.
    3. Lava i tessuti tre volte con acqua deionizzata ed estrai con attenzione gli incisivi mandibolari. Conserva gli incisivi estratti a -80 °C fino all'uso successivo. Smaltisci i tessuti molli estratti e qualsiasi materiale contaminato nel flusso di rifiuti biologici istituzionale.
      ATTENZIONE: Utilizza strumenti di dissezione affilati con cautela durante i tagli all'articolazione temporo-mandibolare e nel piano mediano-sagittale per evitare lesioni personali. Indossa dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
      NOTA: I tessuti possono essere fissati in paraformaldeide al 4% con saccarosio al 2% per 12–16 h per la conservazione a lungo termine in etanolo al 70%. Questa procedura di fissazione non altera l'accuratezza della successiva quantificazione del fluoruro.
    4. Preparazione dei denti per l'incenerimento: Lava accuratamente i denti con acqua deionizzata e posizionali in perossido di idrogeno (H₂O₂) al 1% per 12–16 h. Smaltisci le soluzioni di perossido di idrogeno usate come rifiuti chimici pericolosi.
    5. Lava nuovamente con acqua deionizzata, asciuga brevemente con un fazzoletto senza pelucchi e trasferisci in provette microcentrifuga da 1,5 mL con i coperchi aperti. Posiziona le provette in un forno di essiccazione a 60 °C per 12–16 h.
      ATTENZIONE: Il perossido di idrogeno è un ossidante e può causare irritazione cutanea e oculare. Maneggialo in una cappa aspirante indossando camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza. Evita il contatto con materiali infiammabili.
    6. Incenerimento dei denti: Trasferisci i denti essiccati in crogioli di allumina e inceneriscili in un forno muffola a una temperatura di permanenza di 600 °C per 20 h, utilizzando un tasso di salita di 150 °C/h.
    7. Rimuovi i crogioli solo dopo che il forno si è raffreddato al di sotto di 200 °C.
      ATTENZIONE: Il forno muffola e i crogioli raggiungono temperature estreme, costituendo un grave rischio di ustioni. Attendi che il forno si raffreddi al di sotto di 200 °C prima di maneggiare i crogioli. Quando rimuovi i crogioli, indossa camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti resistenti al calore, e utilizza pinze lunghe per evitare il contatto diretto con superfici calde.
      PASSO CRITICO: Assicurati di un'ossidazione completa; il residuo di carbonio interferirà con le analisi successive.
      NOTA: Il materiale dentale incenerito dovrebbe apparire uniformemente grigio chiaro o bianco. Ripeti l'incenerimento se residui neri sono ancora presenti.
    8. Conservazione del campione di denti inceneriti: Immediatamente dopo l'incenerimento, trasferisci i denti in provette microcentrifuga da 2 mL con fondo rotondo.
    9. Sigilla le provette con Parafilm e conservale in un essiccatore sotto vuoto fino all'uso.

3. Preparazione delle piastre per diffusione facilitata da HMDS

  1. Reagenti e materiale
    1. Acido solforico 6 N: Almeno due giorni prima della preparazione delle capsule di diffusione, preparare una soluzione madre di acido solforico 6 N.
      NOTA: Capsula di diffusione: Un contenitore sigillato progettato per creare un ambiente chiuso controllato in cui i componenti rilasciati da un materiale biologico processato possono essere catturati da una trappola chimica fissata al coperchio. La chiusura ermetica impedisce lo scambio con l'aria esterna e garantisce che gli analiti rilasciati siano indirizzati verso la trappola per successive misurazioni.
    2. Posizionare un becher di plastica da 1 L con un agitatore magnetico su un agitatore magnetico e aggiungere 416 mL di acqua ultrapura.
    3. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL, aggiungere lentamente 84 mL di H₂SO₄ 36 N all'acqua, continuando a mescolare. La soluzione si riscalderà; lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Smaltire qualsiasi soluzione di acido solforico inutilizzata o esausta come rifiuto chimico pericoloso attraverso il sistema istituzionale di smaltimento dei rifiuti chimici.
      ATTENZIONE: L'acido solforico è altamente corrosivo. Manipolarlo in una cappa aspirante indossando guanti resistenti agli acidi, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. In caso di contatto, risciacquare immediatamente con abbondante acqua.
    4. Acido solforico 6 N saturo con HMDS: Trasferire l'acido solforico 6 N in un imbuto separatore da 2 L e aggiungere 15 mL di esametildisilossano (HMDS).
    5. Assicurarsi che tappo e rubinetto siano ben chiusi, tenere l'imbuto separatore lateralmente e agitare vigorosamente finché non si vedono piccole goccioline di HMDS.
    6. Aprire il tappo per rilasciare il gas in formazione e ripetere il procedimento altre due volte.
    7. Lasciare il tappo leggermente aperto per diverse ore. Conservare l'imbuto separatore contenente l'acido solforico 6 N saturo con HMDS su un supporto all'interno della cappa aspirante. Smaltire l'acido solforico contenente HMDS e i materiali contaminati come rifiuti chimici pericolosi.
      ATTENZIONE: L'HMDS è infiammabile e tossico per inalazione. Manipolarlo in una cappa aspirante indossando camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Mantenere lontano da fonti di accensione.
    8. Idroxido di sodio 0,05 N: Sciogliere 1 g di pastiglie di NaOH in 25 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre 1 N.
    9. Mescolare 2 mL della soluzione madre di NaOH 1 N con 38 mL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di NaOH 0,05 N.
    10. Aliquotare la soluzione di NaOH 0,05 N in provette microcentrifuga da 1,5 mL per uso singolo, sigillare i coperchi con Parafilm e conservare le provette in un desiccante sotto vuoto per minimizzare l'assorbimento di CO₂. Smaltire le soluzioni di idrossido di sodio inutilizzate o esauste come rifiuti chimici pericolosi.
      ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è altamente caustico e può causare ustioni gravi. Indossare camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Manipolare le soluzioni con attenzione per evitare schizzi.
    11. Acido acetico 0,2 N: Aggiungere 575 µL di acido acetico glaciale in acqua ultrapura e portare a volume finale di 50 mL per preparare acido acetico 0,2 N. Smaltire le soluzioni di acido acetico come rifiuti chimici pericolosi.
      ATTENZIONE: L'acido acetico è corrosivo e può irritare la pelle, gli occhi e le vie respiratorie. Manipolarlo in una cappa chimica indossando camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza.
    12. Paraffina solida (petrolatum): Sciogliere circa 100 g di paraffina solida a 60 °C in un forno. Aspirare la paraffina liquida in siringhe da 10 mL e lasciarla raffreddare e solidificare. Le siringhe riempite di paraffina possono essere conservate a temperatura ambiente per diverse settimane.
    13. Piatto di Petri: Utilizzare piatti di Petri non trattati da 60 × 15 mm per preparare le capsule di diffusione.
    14. Creare un piccolo foro nel coperchio di un piatto di Petri utilizzando un ago da siringa caldo da 18 G.
    15. Applicare un sigillo continuo di paraffina solida sul bordo interno del coperchio utilizzando una siringa da 10 mL dotata di ago smussato da 14 G. Smaltire tutti gli aghi usati in un contenitore istituzionale approvato per rifiuti taglienti.
      ATTENZIONE: Gli aghi da siringa sono affilati e possono causare lesioni da punta. Manipolarli con cura e smaltirli in contenitori per rifiuti taglienti approvati. Quando si riscaldano gli aghi, indossare guanti resistenti al calore e protezioni per gli occhi per prevenire ustioni.
    16. Soluzioni madri di NaF per capsule di diffusione di calibrazione. Sciogliere 4,19 g di NaF in 1 L di acqua ultrapura per preparare una soluzione madre da 100 mM. Preparare soluzioni da 10 mM, 100 µM e 10 µM mediante diluizioni successive 1:10 della soluzione da 100 mM.
      NOTA: Una mole di NaF fornisce 19 g di F⁻; pertanto, 1 µL di NaF 10 µM contiene 0,19 ng di F⁻ e 1 µL di NaF 10 mM contiene 190 ng di F⁻.
      ​NOTA: Capsule di diffusione di calibrazione: Capsule di diffusione utilizzate specificamente per la calibrazione con una massa nota di ioni fluoruro (F¯).
  2. Preparazione delle capsule di diffusione specifiche per il campione
    1. Capsula di diffusione per siero: Pipettare 3 mL di acqua ultrapura nel fondo del piatto di Petri e aggiungere 75 µL di siero. Smaltire qualsiasi materiale contaminato dal siero nel flusso di rifiuti biologici istituzionali. Procedere con il passaggio 3.4.
    2. Capsula di diffusione per osso
      1. Macinazione della cenere ossea: Utilizzare una spatola micro per ridurre in polvere fine le ossa incinerite all'interno delle provette microcentrifuga da 1,5 mL. Procedere immediatamente con l'elaborazione della cenere ossea macinata. Smaltire i materiali monouso contaminati con cenere ossea nel flusso di rifiuti chimici istituzionali.
      2. Pesatura e idratazione della cenere ossea
        1. Posizionare il fondo vuoto del piatto di Petri sul piatto della bilancia analitica con una sensibilità di almeno 0,1 mg.
        2. Trasferire la cenere ossea macinata dalla provetta microcentrifuga da 2 mL in un piccolo contenitore di porcellana per minimizzare la carica elettrostatica e prevenire la dispersione della polvere.
        3. Utilizzando una spatola micro, aggiungere circa 5 mg di cenere ossea al contenitore e coprire immediatamente la polvere con 3 mL di acqua ultrapura prima di rimuovere il contenitore dalla bilancia analitica per evitare la dispersione della cenere.
        4. Registrare il peso esatto di ciascun campione di cenere ossea. Procedere con il passaggio 3.4.
    3. Capsula di diffusione per dente
      1. Macinazione dei denti inceneriti
        1. Trasferire gli incisivi inceneriti in provette microcentrifuga da 2 mL a fondo rotondo e aggiungere un'ago in acciaio inossidabile del diametro di 5 mm a ciascuna provetta. Chiudere le provette e sigillare i coperchi con Parafilm.
        2. Polverizzare gli incisivi inceneriti in un agitatore a sfera a 2.500 rpm per 10 s. Procedere immediatamente con l'elaborazione dei denti macinati.
      2. Pesatura e idratazione dei denti inceneriti
        1. Versare l'intero contenuto della provetta, compreso l'ago in acciaio inossidabile, nel fondo della capsula di diffusione posizionata sul piatto della bilancia analitica. Smaltire i materiali monouso contaminati con cenere dentale nel flusso di rifiuti chimici istituzionali.
        2. Rimuovere l'ago in acciaio inossidabile dal piatto e registrare il peso esatto della cenere dentale (tipicamente 3–4 mg per incisivo mandibolare).
        3. Aggiungere immediatamente 3 mL di acqua ultrapura per coprire la cenere dentale prima di rimuovere il piatto dalla bilancia per prevenire la dispersione della cenere causata da scariche elettrostatiche. Procedere con il passaggio 3.4.
  3. Capsule di diffusione per calibrazione e controllo qualità
    1. In parallelo alle capsule di diffusione per i campioni, preparare due serie di capsule di diffusione per una calibrazione a 5–6 punti e una serie identica di capsule di diffusione per il controllo qualità, inclusa una bianca.
      NOTA: Capsule di diffusione per controllo qualità: Preparate in modo identico alle capsule di diffusione per calibrazione, ma utilizzate periodicamente per verificare la stabilità dell'elettrodo e garantire prestazioni di misurazione costanti.
    2. Pipettare 3 mL di acqua ultrapura in ciascuna di 11 o 13 piatti di Petri e aggiungere la soluzione madre di NaF per coprire l'intervallo di massa atteso di F¯ nei campioni. Procedere con il passaggio 3.4. per completare l'assemblaggio della capsula di diffusione37.
  4. Completamento dell'assemblaggio della capsula di diffusione
    1. Per creare un deposito della trappola per fluoruro, aggiungere 50 µl di NaOH 0,05 N in tre gocce sulla superficie interna del coperchio del piatto di Petri, lontano dal bordo del coperchio.
      NOTA: Trappola per fluoruro (F¯ Trap): Un componente delle capsule di diffusione che cattura F¯, specificamente idrossido di sodio (NaOH).
    2. Rovesciare il coperchio senza disturbare le gocce di NaOH e sigillarlo saldamente al fondo del piatto con la paraffina solida.
    3. Per preparare una soluzione di acido solforico 3 N saturo con HMDS, mescolare volumi uguali di acido solforico 6 N saturo con HMDS e acqua ultrapura. Preparare fresca immediatamente prima dell'uso, poiché non può essere conservata.
    4. Iniettare 3 mL della soluzione di acido solforico 3 N saturo con HMDS preparata attraverso il foro nel coperchio nell'acqua sul fondo della capsula di diffusione utilizzando una siringa da 10 ml dotata di ago da 20 G. Prestare attenzione a non schizzare acido sulla superficie interna del coperchio durante l'inserimento o il ritiro dell'ago della siringa.
    5. Diffusione del fluoruro facilitata da HMDS: Sigillare immediatamente il foro di iniezione con una perla di paraffina solida che copra completamente l'apertura e posizionare le capsule di diffusione su un agitatore regolabile impostato su velocità lenta. Incubare tutta la notte a temperatura ambiente (Figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: Schema di una capsula per diffusione ossea per l'estrazione e il trattenimento del fluoruro. La Figura 1 illustra il disegno di una capsula per diffusione ossea assemblata in una piastra di Petri non trattata da 60 × 15 mm. Il coperchio presenta un piccolo foro per l'iniezione sigillato con una perlina di vaselina. Sulla superficie interna del coperchio, tre gocce di NaOH sono posizionate come trappole per ioni fluoruro (F⁻), sospese al coperchio durante la diffusione. Il coperchio è sigillato ermeticamente alla base della capsula mediante vaselina. Il fondo della piastra di Petri contiene acqua ultrapura, acido solforico saturo con esametildisilossano (HMDS) e cenere ossea, che insieme formano l'ambiente di reazione per il rilascio del fluoruro e il successivo trattenimento. Questa figura è stata creata dagli autori utilizzando Biorender ed è concessa in licenza secondo i termini della licenza CC BY. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Misurazione del fluoruro con un elettrodo iono-selettivo

  1. Configurare l'ISE
    1. Riempire l'elettrodo selettivo al fluoruro a doppio canale con la soluzione di riempimento appropriata, collegarlo al potenziometro e fissare l'elettrodo in un supporto per elettrodi.
    2. Posizionare una piastra di Petri non trattata su un supporto regolabile sotto la superficie sensibile dell'elettrodo, assicurandosi che la superficie sensibile sia parallela al fondo della piastra di Petri, e sollevare il piano del supporto regolabile in modo che la piastra di Petri sia quasi a contatto con l'elettrodo (Figura 2).
  2. Preparazione dei campioni per la misurazione
    NOTA: Campioni: Nel protocollo, si definiscono campioni soltanto i prodotti finali misurati con un elettrodo iono-selettivo (ISE), costituiti dalla trappola di F¯ dopo la diffusione, successivamente combinata con acido acetico e acqua. 
    1. Per regolare il pH del campione a 5, rimuovere la piastra di diffusione dal rocker e sollevare con attenzione il coperchio rompendo il sigillo di vaselina al termine del periodo di incubazione. Capovolgere il coperchio su una superficie piana, assicurandosi che le tre gocce della trappola di F¯ rimangano indisturbate.
    2. Aggiungere 15–20 µL di acido acetico 0,2 N a una goccia con una pipetta P20, quindi unire tutte e tre le gocce in un'unica goccia senza cambiare la punta della pipetta.
      NOTA: I campioni con alte concentrazioni di F¯ tendono ad avere un pH iniziale più basso e richiedono quindi una quantità minore di acido acetico 0,2 N per portare il pH a 5, rispetto ai campioni con minor contenuto di F¯. Poiché il volume residuo del campione dopo la registrazione del potenziale dell'elettrodo (passaggio 5.3) è minimo, utilizzare il campione residuo disponibile per verificare il pH mediante carta indicatrice.
    3. Per regolare il volume del campione, impostare una pipetta P100 a 75 µL, aspirare l'intero volume della trappola di F¯ senza introdurre aria e portare il campione esattamente a 75 µL utilizzando acqua ultra-pura.
    4. Eseguire questo passaggio con attenzione per garantire un volume preciso ai fini del calcolo della concentrazione di fluoruro. Mantenere il campione nella punta della pipetta e procedere immediatamente al passaggio 4.3.
  3. Misurazione dei campioni di esemplare, dei campioni di calibrazione e del controllo qualità
    1. Per misurare il potenziale dell'elettrodo del campione, dispensarlo tra la superficie sensibile dell'elettrodo selettivo al fluoruro e la piastra di Petri. Assicurarsi che l'intera superficie sensibile dell'elettrodo sia completamente immersa nel liquido, senza toccare direttamente la piastra di Petri. Attendere che il potenziometro si stabilizzi e registrare il potenziale (mV) visualizzato dall'ISE.
    2. Determinare la curva standard di calibrazione misurando in sequenza il primo set di standard di calibrazione, partendo dalla concentrazione più bassa di F¯ e procedendo verso quella più alta.
      1. Tracciare il potenziale dell'elettrodo (mV) in funzione del logaritmo di F¯ (ng) per costruire la curva di calibrazione (Figura 3). Applicare una regressione esponenziale per ottenere l'equazione della curva standard e il coefficiente di determinazione (R2). Accettare le curve di calibrazione solo se R2 è ≥ 0,99.
    3. Misurare ogni campione di esemplare e registrare il potenziale dell'elettrodo (mV).
    4. Per monitorare la stabilità dell'elettrodo e rilevare eventuali deriva del saggio, misurare i campioni di controllo qualità a intervalli durante ogni analisi.
      1. Confrontare direttamente i valori dei campioni di controllo qualità con quelli dei corrispondenti campioni di calibrazione e confermare un accordo entro circa il 5% per verificare la stabilità delle prestazioni dell'elettrodo nel tempo.
      2. Misurare periodicamente una piastra di diffusione vuota per confermare l'assenza di contaminazione da fluoruro durante la manipolazione e la diffusione del campione.
  4. Per calcolare la massa di F¯ (ng) in ciascun campione di esemplare, utilizzare l'equazione della curva standard. Successivamente, dividere questa massa per il volume (µL) di siero o per la massa (mg) della cenere ossea o dentale aggiunta alla piastra di diffusione.
    1. Esempio di calcolo della concentrazione di F¯ nella cenere ossea (ng/mg)
      1. Massa di cenere ossea aggiunta alla piastra di diffusione: 5,1 mg; Potenziale dell'elettrodo del campione di 75 µL: –31,6 mV
      2. Passaggio 1: Calcolare la massa di fluoruro utilizzando l'equazione di calibrazione
        1. Massa di F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Massa di F⁻ (ng) = 13.641 ng
      3. Passaggio 2: Calcolare la concentrazione di fluoruro nella cenere ossea
        1. Concentrazione di F⁻ =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. Concentrazione di F⁻ =  2.675 ng / mg (ppm)

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Figura 2: Schema del montaggio per la misurazione con elettrodo ionoselettivo. La Figura 2 illustra la configurazione utilizzata per le misurazioni degli ioni fluoruro mediante un elettrodo ionoselettivo (ISE) a doppio canale. Una piastra di Petri è posizionata su un supporto a croce mobile per consentire un’accurata regolazione della sua altezza rispetto all’elettrodo. L’ISE è collegato a un potenziometro ed è orientato in modo che la sua superficie sensibile sia parallela al piano della piastra di Petri, mantenendo una distanza di circa 1–2 mm. Una volta impostata la distanza, un piccolo volume di campione (75 µL) viene prelevato con pipetta e depositato nello spazio tra la superficie sensibile e la piastra di Petri, assicurando che il campione ricopra completamente l’area sensibile dell’elettrodo durante la misurazione. Questa figura è stata creata dagli autori utilizzando Biorender ed è concessa in licenza secondo i termini della licenza CC BY. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Curva di calibrazione e tabella di calibrazione corrispondente per la quantificazione della massa di ioni fluoruro nei campioni di dente. Pannello superiore: Esempio di curva di calibrazione utilizzata per determinare la massa di ioni fluoruro nei campioni di dente. L'asse x mostra il potenziale dell'elettrodo (mV, scala lineare), mentre l'asse y mostra la massa corrispondente di ioni fluoruro (ng F⁻, scala logaritmica). I punti di calibrazione misurati sono riportati come linea continua, mentre la regressione esponenziale interpolata è mostrata come linea tratteggiata. Un riquadro ingrandito riporta l'equazione della curva standard e il coefficiente di determinazione (R2 = 0.99). Pannello inferiore: Tabella contenente i valori numerici utilizzati per generare la curva di calibrazione. La prima riga elenca i cinque potenziali dell'elettrodo (mV) registrati per i campioni di calibrazione. La seconda riga riporta le masse corrispondenti di ioni fluoruro (ng F⁻) per ciascun campione di calibrazione. La terza riga elenca i volumi (µL) della soluzione madre di NaF 10 mM aggiunti alle capsule di diffusione per la calibrazione; questa massa aggiunta di ioni fluoruro equivale alla massa intrappolata in ciascun campione di calibrazione dopo la diffusione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Per dimostrare l'applicazione di questo protocollo nella misurazione delle concentrazioni di fluoro (F-) in materiali biologici, sono stati ottenuti campioni da sieri, ossa e incisivi mandibolari prelevati da topi sottoposti a trattamenti controllati di fluoruro. Topi maschi C57BL/6J sono stati assegnati a due categorie d'età, adolescenti (6 settimane) e adulti (18 settimane), e hanno ricevuto acqua deionizzata priva di fluoro (0 ppm F⁻) oppure acqua potabile addizionata con fluoruro di sodio (125 ppm F⁻) per un periodo di esposizione di 6 settimane. Ogni combinazione di età e trattamento includeva cinque animali. Al termine del periodo di esposizione, sono stati prelevati siero, femori e incisivi mandibolari, e i campioni sono stati preparati ed analizzati seguendo il protocollo descritto. Di seguito sono riassunte le concentrazioni rappresentative di fluoro misurate nel siero, nell'osso e nei denti.

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Figura 4: Concentrazioni di fluoro misurate nel siero, nell'osso femorale e negli incisivi mandibolari. Topi maschi C57BL/6J sono stati assegnati a due categorie d'età, adolescenti (6 settimane, barra vuota) e adulti (18 settimane, barra piena), e hanno ricevuto acqua deionizzata priva di fluoro (0 ppm F⁻) oppure acqua potabile addizionata con fluoruro di sodio (125 ppm F⁻) per un periodo di esposizione di 6 settimane. Al termine del periodo di esposizione, i livelli di fluoro sono stati misurati in (A) siero, (B) osso femorale e (C) incisivi mandibolari provenienti dagli stessi gruppi di trattamento. I valori nel siero al di sotto del limite di rilevazione (<0,02 ppm) sono stati riportati per visualizzazione ma esclusi dall'analisi statistica. I dati sono espressi come media ± DS. I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/gruppo). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Concentrazioni di fluoro nel siero
Nei gruppi di adolescenti e adulti trattati con 0 ppm di fluoro, le concentrazioni sieriche di fluoro erano al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo iono-selettivo (<0,02 ppm). Nei gruppi trattati con 125 ppm, il fluoro nel siero è aumentato a 0,3 ± 0,2 ppm nel gruppo degli adolescenti e a 0,7 ± 0,2 ppm nel gruppo degli adulti (p = 0,06). Il confronto tra il gruppo di adolescenti e quello di adulti trattati con 125 ppm è stato effettuato mediante un test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/gruppo). I gruppi trattati con 0 ppm sono stati esclusi dall'analisi statistica. (Figura 4A, Tabella 1).

Concentrazioni di fluoro nell'osso femorale
Nei gruppi trattati con 0 ppm, le concentrazioni di fluoro nel femore erano significativamente più basse negli animali adolescenti (292 ± 39 ppm) rispetto agli animali adulti (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Al contrario, nei gruppi trattati con 125 ppm, le concentrazioni di fluoro negli adolescenti (4.108 ± 482 ppm) erano significativamente più elevate rispetto agli animali adulti (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante il test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/gruppo). (Figura 4B, Tabella 1). Figura 5A mostra il rapporto di aumento delle concentrazioni di fluoro nel femore tra i trattamenti a 0 ppm e 125 ppm per ciascun gruppo d'età. Gli animali adolescenti hanno mostrato un aumento di 14 volte nei livelli di fluoro a 125 ppm, mentre i topi adulti hanno mostrato un aumento di 3 volte.

Concentrazioni di fluoro negli incisivi mandibolari
Nei gruppi 0 ppm, le concentrazioni di fluoro negli incisivi mandibolari erano significativamente più basse negli adolescenti (35 ± 4 ppm) rispetto agli animali adulti (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). Nei gruppi trattati con 125 ppm, le concentrazioni di fluoro negli incisivi aumentarono fino a 5641 ± 955 ppm negli adolescenti e a 4392 ± 1694 ppm negli animali adulti. I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante un test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/gruppo). (Figura 4C, Tabella 1). Sebbene le concentrazioni assolute di fluoro a 125 ppm non differissero in modo significativo tra i gruppi d'età, l'aumento rispetto al valore a 0 ppm fu significativamente maggiore negli adolescenti (incremento di 161 volte) rispetto ai topi adulti (incremento di 36 volte) (Figura 5B).

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Figura 5: Gli adolescenti mostrano un maggiore incremento multiplo nell'accumulo di fluoro nell'osso e negli incisivi rispetto ai topi adulti. Variazione multipla delle concentrazioni di fluoro passando da 0 ppm a un trattamento con 125 ppm di fluoro in topi adolescenti (barre vuote) e adulti (barre piene). (A) Osso femorale e (B) Incisivo mandibolare dagli stessi gruppi di trattamento. I dati sono espressi come media ± DS. I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante un test t non appaiato. * p < 0,05, (N = 5/gruppo). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

CampioneSieroFemoreIncisivo Mandibolare
Gruppo d'etàAdolescenteMaturaAdolescenteMaturaAdolescenteMatura
Gruppo di trattamento0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
Media< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
DSNA0.2NA0.239482556123955231694

Tabella 1: Misurazioni individuali di fluoro nel siero, nell'osso femorale e negli incisivi mandibolari. La Tabella 1 riporta le concentrazioni individuali di fluoro (ppm F⁻) misurate nel siero, nell'osso femorale e nei campioni di incisivo mandibolare di topi adolescenti e adulti esposti a 0 ppm oppure 125 ppm di fluoro. Per ogni tipo di tessuto, i dati sono presentati in colonne corrispondenti ai quattro gruppi sperimentali: adolescenti 0 ppm, adolescenti 125 ppm, adulti 0 ppm e adulti 125 ppm. Ogni colonna include i cinque valori individuali registrati (N = 5), seguiti dalla media calcolata e dalla deviazione standard (DS). Nel gruppo di adolescenti con 0 ppm nel siero, tutti i valori registrati erano al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo ionoselettivo (<0,02 ppm). La tabella fornisce i dati numerici grezzi alla base dei valori riassuntivi e dei confronti statistici mostrati in Figura 4.

Discussione

Le misurazioni del fluoruro sono state effettuate utilizzando un elettrodo ionoselettivo specifico per il fluoruro (ISE) contenente un fluoruro di lantanio (LaF₃membrana cristallina38,39. Questa membrana forma legami La–F altamente stabili, determinando una marcata preferenza per gli ioni fluoruro rispetto agli altri alogenuri. Secondo la letteratura elettrochimica consolidata e le specifiche del produttore, il LaF₃ la membrana presenta coefficienti di selettività molto bassi per il cloruro, indicando che gli ioni cloruro non producono un'interferenza misurabile nelle condizioni utilizzate in questo protocollo. Sebbene il cloruro sia naturalmente presente nei denti e nell'osso, la sua attività non influenza il potenziale dell'elettrodo, e il segnale registrato riflette specificamente l'attività del fluoruro. Il limite di rilevamento di 0,02 ppm corrisponde alla concentrazione minima quantificabile validata dal produttore per l'elettrodo selettivo al fluoruro Orion. Questo limite rappresenta la concentrazione più bassa di fluoruro alla quale l'elettrodo mantiene una risposta nernstiana stabile e una relazione lineare con la curva di calibrazione. Poiché il limite di rilevamento è definito dalle caratteristiche della membrana dell'elettrodo e validato dal produttore, non è stato necessario alcun ulteriore determinazione sperimentale per questo protocollo; tuttavia, per quanto riguarda l'estremo superiore della gamma di rilevamento, gli autori hanno osservato che masse di fluoruro superiori a circa 38.000 ng in un tubo da 50 µL La trappola di NaOH ha determinato una risposta elettrodica non lineare, indicando che la curva di calibrazione non è più affidabile a carichi di fluoruro molto elevati. Questa non linearità è probabilmente dovuta al superamento del range ottimale di forza ionica e di attività per l'elettrodo nelle condizioni sperimentali utilizzate, piuttosto che a un limite superiore intrinseco dell'ISE stesso. Per campioni che si prevede contengano masse di fluoro superiori a questa soglia, è consigliabile aumentare il volume della trappola di NaOH per mantenere le misurazioni entro il range dinamico lineare dell'elettrodo.

Questa considerazione dovrebbe essere presa in considerazione quando si applica il protocollo a campioni con contenuto di fluoro insolitamente elevato. Poiché il passaggio di diffusione consuma l'intero volume del campione, non è stato possibile eseguire misure duplicate né esperimenti di aggiunta e recupero sui campioni biologici. Per garantire accuratezza e precisione analitica, in ogni serie di misurazioni sono stati inclusi standard di controllo qualità (QC) contenenti concentrazioni note di fluoro. Questi standard QC sono stati processati e misurati esattamente come i campioni sperimentali. In tutte le serie di analisi, le concentrazioni di fluoro misurate negli standard QC sono risultate costantemente entro il 5% rispetto ai valori attesi. Per ogni serie di 10–20 campioni, sono stati preparati parallelamente due set indipendenti di 5–6 campioni di calibrazione, e una curva di calibrazione è stata registrata prima di ogni sessione di misurazione. L'intervallo di calibrazione è stato adattato per ogni analisi in modo da approssimare le masse attese di fluoro nei campioni, che dipendevano dal tipo di campione, dalla massa di materiale aggiunta alla capsula di diffusione e dal gruppo di trattamento e dall'età dell'animale. Per le misurazioni su siero, gli standard di calibrazione corrispondevano a concentrazioni di fluoro di circa 0,06–1,20 ppm nel campione. Per le misurazioni su osso e dente, gli standard di calibrazione corrispondevano a concentrazioni di fluoro di circa 19–7.600 ppm nel campione.

Questo protocollo fornisce un approccio sensibile e riproducibile per la quantificazione della massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti, mediante diffusione facilitata da esametildisilossano seguita da analisi con elettrodo selettivo per ioni. Il metodo cattura in modo affidabile il fluoruro rilasciato da diverse matrici biologiche e consente una valutazione quantitativa dell'accumulo di fluoruro dopo esposizione controllata. Risultati rappresentativi ottenuti da topi adolescenti e adulti mostrano chiare differenze dipendenti dall'età e dalla dose nel deposito di fluoruro nei diversi tessuti, evidenziando l'utilità di questo approccio nello studio del metabolismo e della tossicocinetica del fluoruro in vivo.

Un punto di forza fondamentale di questo protocollo è l'uso di piastre di diffusione che separano fisicamente la reazione di rilascio del fluoruro dall'ambiente di cattura del fluoruro. La progettazione sigillata con paraffina minimizza lo scambio con l'atmosfera e garantisce un'efficiente cattura degli ioni fluoruro liberati da goccioline di idrossido di sodio presenti sul coperchio. L'acido solforico saturo con HMDS fornisce una spinta forte e costante per il rilascio di fluoruro dai tessuti mineralizzati, inclusi strutture altamente calcificate come ossa e denti. La successiva misurazione mediante elettrodo selettivo per ioni, calibrata con standard abbinati per diffusione, consente una quantificazione accurata su un'ampia gamma dinamica. Un altro vantaggio di questo approccio è la capacità di quantificare il fluoruro in campioni biologici estremamente piccoli. I tessuti mineralizzati di topi, in particolare gli incisivi mandibolari, producono soltanto 3–5 mg di residuo incinerito per dente. I metodi analitici convenzionali spesso richiedono masse campionarie più elevate o contenuti maggiori di fluoruro per ottenere un rilevamento affidabile. Al contrario, la progettazione basata sulla diffusione concentra tutto il fluoruro rilasciato dall'intero campione in un volume ridotto e ben definito, permettendo una quantificazione accurata anche in campioni minuti con bassa massa assoluta di fluoruro. Questa caratteristica è particolarmente utile per studi che coinvolgono animali di piccole dimensioni, disponibilità limitata di tessuto o strutture mineralizzate microdissezionate.

Un limite principale di questo metodo è il limite di rilevamento dell'elettrodo selettivo per ioni (ISE) utilizzato in questo studio (0,02 ppm). I campioni di siero provenienti da animali di controllo privi di fluoruro sono spesso risultati al di sotto di questa soglia, impedendo la quantificazione di concentrazioni estremamente basse di fluoruro. Per misurare concentrazioni traccia pari o inferiori al limite di rilevamento, potrebbe essere necessario aumentare la massa o il volume del campione aggiunto alla capsula di diffusione, se disponibile, oppure ricorrere a tecniche analitiche alternative. Inoltre, il metodo richiede una diffusione notturna e un'attenta manipolazione di reagenti corrosivi, il che potrebbe limitare la produttività in studi ad alto volume. Sebbene l'ISE consenta una quantificazione sensibile del fluoruro totale, non è in grado di valutare la distribuzione spaziale all'interno dei tessuti. Approcci complementari, come la microscopia elettronica a scansione abbinata alla spettroscopia con raggi X a dispersione di energia (SEM-EDX) o l'emissione di raggi gamma indotta da particelle (PIGE), possono essere integrati per visualizzare e mappare la distribuzione del fluoruro da scala microscopica a macrosopica. Queste metodiche basate sull'imaging permettono di valutare l'accumulo localizzato di fluoruro nei tessuti mineralizzati o molli, integrando così le misurazioni effettuate con l'ISE e fornendo una valutazione più completa del contenuto di fluoruro nei tessuti.

Diversi fattori tecnici ricorrenti possono influenzare l'accuratezza e l'affidabilità della diffusione e della misurazione del fluoruro in questo protocollo, e le nostre osservazioni evidenziano come la preparazione della calibrazione, la sigillatura delle capsule per diffusione, il controllo del pH, le prestazioni dell'elettrodo e la manipolazione dei campioni influenzino complessivamente la qualità dei dati. Possibili cause di una curva di calibrazione non lineare (R2 < 0,99) o di letture di campioni tissutali al di fuori dell'intervallo atteso includono errori di calcolo del volume della soluzione madre di NaF aggiunta alla capsula di diffusione o errori di pipettaggio durante la preparazione degli standard di calibrazione. Azione consigliata: preparare almeno due set indipendenti di campioni di calibrazione per ogni analisi, in modo da avere un set di riserva nel caso in cui una curva di calibrazione cada al di fuori dell'intervallo atteso. Una sigillatura incompleta della capsula di diffusione può causare una perdita di fluoruro durante il processo di diffusione, producendo letture artificialmente basse. Questo si verifica tipicamente quando viene applicata una quantità insufficiente di vaselina sul bordo del coperchio della capsula di diffusione. Azione consigliata: applicare una quantità abbondante di vaselina intorno al bordo del coperchio della capsula di diffusione e premere con fermezza per garantire una sigillatura completa. Errori di pipettaggio durante l'aggiunta della soluzione di acido acetico alla trappola di NaOH possono spostare il pH del campione al di fuori dell'intervallo ottimale di pH 5,0, causando un recupero inaccurato del fluoruro. Azione consigliata: verificare il pH di ogni campione con carta indicatrice del pH e scartare qualsiasi campione con valore al di fuori del pH 5. I campioni di calibrazione possono inoltre cadere al di fuori dei limiti validi di registrazione dell'elettrodo selettivo al fluoruro. Concentrazioni inferiori a 0,02 ppm sono al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo. Azione consigliata: non utilizzare campioni di calibrazione contenenti meno di 0,02 ppm di fluoruro. Al contrario, campioni di calibrazione con concentrazioni di fluoruro eccessivamente elevate possono alterare la forza ionica della soluzione e produrre risposte non lineari dell'elettrodo. Azione consigliata: all'inizio del progetto, preparare soluzioni di calibrazione che coprano un ampio intervallo di concentrazione di fluoruro per determinare l'intervallo lineare di funzionamento dell'elettrodo specifico utilizzato. Se i campioni tissutali superano questo intervallo lineare, ridurre la massa del tessuto o aumentare il volume della trappola di NaOH e regolare di conseguenza il volume di acido acetico per mantenere il pH a 5. Difficoltà nel ottenere curve di calibrazione lineari nell'intervallo 0,02–1 ppm: una causa comune è l'invecchiamento dell'elettrodo. Elettrodi selettivi al fluoruro più vecchi perdono sensibilità a concentrazioni molto basse di fluoruro. Azione consigliata: sostituire l'elettrodo selettivo al fluoruro. Letture instabili del potenziometro (segnale che deriva o salta) si verificano tipicamente quando la superficie sensibile dell'elettrodo non è completamente immersa nella soluzione campione. Azione consigliata: abbassare l'elettrodo in modo che la superficie sensibile sia completamente coperta dal campione liquido.

Nel complesso, questo protocollo fornisce un approccio solido, basato sulla calibrazione, per la quantificazione del fluoro in diverse matrici biologiche ed è particolarmente adatto per studi volti a indagare l'esposizione al fluoro, il deposito nei tessuti e gli esiti tossicologici in modelli murini.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

La ricerca descritta in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) e dal National Institute of Dental and Craniofacial Research dei National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) e K02DE029531 (M.S.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido acetico, glacialeSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Crogioli in alluminaAdvalue Technology12 mm OD × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Bilancia analiticaVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Disintegratore a sferetteBenchmarkBeadBug 6—
Ago per siringa con punta smussataAmazonAgo industriale con punta smussata, 14 G × 0,5 polliciX001TT8KX1
Anidride carbonicaAirGas——
Cappa chimicaMott ManufacturingModello 7421040—
Saccarosio D(+)Thermo Scientific99,7% per biochimica177142500
Soluzione di riempimento per elettrodoThermo ScientificOrion IonPlus Filling Solution900061
Soluzione di alcol etilicoKoptec140 Proof2401
Congelatore, −80 °CThermo ScientificRevco RDE Series—
Guanti resistenti al caloreFisher ScientificBel-Art Clavies Biohazard Autoclave GlovesH13201
Esametildisilossano (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Perossido di idrogenoVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Elettrodo selettivo per ioniThermo ScientificOrion Fluoride ISE, doppio canale9609BNWP
Mixer magneticoVWR360 Stirrer—
Spatola microAmazonSpatola per incisione della cera #7A, in acciaio inossidabile—
MicrocentrifugaEppendorf5427R5404000131
Forno muffolaThermo ScientificThermolyne Small Benchtop Muffle Furnace, 1,3 L, FB1315MFB1315M
FornoBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Soluzione di paraformaldeide in PBSThermo Scientific4% Paraformaldeide in PBSJ19943-K2
Piastra di PetriVWR60 × 15 mm, non trattata25384-092
Paraffina solidaThermo ScientificParaffina solida, bianca, pura417090010
Carta indicatrice del pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10,092120,3
Piatto in porcellanaFisher ScientificCrogiolo Fisherbrand, 5 mL, 20 mm di altezza, forma altaFB-965-B
PotenziometroThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE Meter2115102
Stativo con morsettoVWRMorsetto anulare, 15 cm470104-526
Alimento per roditoriBio-ServF1515, AIN-76A, ½ pelletF1515
Sollevatore a forbiceAmazonSollevatore a forbice da laboratorio—
Imbuto separatoreFisher ScientificEisco, vetro borosilicato, 2 LS89285
Cloruro di sodioFisher ScientificCertificato ACS, cristallinoS271-1
Fluoruro di sodioFisher ScientificCertificato ACS, in polvereS299-100
Iodrato di sodioFisher ScientificPellets bianchiBP359-500
Sferette in acciaio inossidabileFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 pezziSI-CS05
Acido solforicoFisher ScientificGrado ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Application Solution940909
Desiccante sotto vuotoFisher ScientificBel-Art Space Saver Vacuum Desiccator, 10 polliciF42010-0000
Filtro sotto vuotoFisher ScientificFlow Bottle-Top Filter, PES, 90 mm, 0,2 µm597-4520
Rocker variabileMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Riferimenti

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