Piattaforma bioanalitica ibrida 3D basata su colture cellulari per l'imaging ottico utilizzando spugne di fibroina di seta

Sommario

L'articolo descrive una metodologia semplice, accessibile e riproducibile per la produzione e la coltura di impalcatura in seta di cellule di cancro al seno 4T1-iRFP720 in condizioni di controllo del flusso, per supportare una coltura dinamica. La crescita e la migrazione cellulare sono state valutate come prova di concetto utilizzando uno strumento ottico di imaging in vivo come principale lettura non invasiva.

Abstract

Presentiamo una piattaforma ibrida bioanalitica innovativa progettata per la valutazione preclinica delle caratteristiche cellulari. Il sistema combina una coltura cellulare tridimensionale (3D) coltivata su una matrice extracellulare artificiale con una configurazione di array ispirata alla cromatografia. Le spugna, realizzate dalla proteina strutturale seta fibroina, servono sia come matrice extracellulare biomimetica sia come fase stazionaria. Le spugne di fibroina di seta sono state prodotte internamente utilizzando un processo a più fasi che prevedeva la rimozione delle proteine intrinseche della sericina dalle fibre di seta grezze, seguita da dissoluzione e dialisi per purificare la soluzione di fibroina, dissoluzione in solvente organico e successivamente colata su letto di sale per generare spugne a base di seta con porosità/pori controllati di 500–800 μm. Le linee cellulari geneticamente modificate per il cancro al seno 4T1-iRFP720 e 4T1-wt (controllo non fluorescente) sono state coltivate all'interno di impalcature di seta utilizzando un flusso continuo tramite una pompa, e la loro crescita cellulare e le caratteristiche sono state analizzate in modo non invasivo utilizzando tecniche di imaging ottico (strumento di imaging ottico in vivo ). Fondendo i principali vantaggi dei sistemi cromatografici (automatizzazione, riproducibilità) con la rilevanza biologica delle colture cellulari 3D avanzate, la piattaforma consente la modellazione in vitro dell'architettura e della morfologia simile ai tessuti, facilitando al contempo il monitoraggio del comportamento cellulare dinamico. Parallelamente, l'applicazione della tecnologia di imaging medico consente un monitoraggio in tempo reale e prolungato della migrazione e della crescita cellulare, tra gli altri fattori. Questo approccio offre un notevole potenziale per indagare comportamenti cellulari su scala macroscopica in un sistema di flusso simile a un laminare. Migliorando la rilevanza fisiologica dei modelli in vitro , questo metodo può aiutare a colmare il divario traslazionale negli studi in vivo ed è coerente con il quadro reduce, replace, refine (3R) per la sperimentazione sugli animali.

Introduzione

Nei tessuti viventi, la migrazione e la crescita cellulare avvengono all'interno di una matrice extracellulare (ECM) tridimensionale ed eterogenea, guidata da segnali biofisici e biochimici, come il flusso interstiziale di liquidi e le interazioni cellula-cellula. Questi fattori regolano la polarità cellulare, la meccanotrasduzione e il movimento coordinato, alla base di processi biologici chiave tra cui la riparazione dei tessuti e l'invasione del cancro 1,2,3,4.

Nonostante la loro importanza, la maggior parte degli saggi di migrazione in vitro, come i saghi scratch e quelli di Transwell, valuta il movimento di singole cellule su substrati piatti e statici. Pur essendo semplici ed economici, questi approcci 2D riproducono scarsamente le caratteristiche strutturali e dinamiche del microambiente in ^{vivo 5,6}. Questa limitazione diventa particolarmente critica nel contesto delle metastasi tumorali, dove le cellule tumorali migrano collettivamente attraverso matrici tissutali meccanicamente e chimicamente^{diverse 3,7,8}. Sebbene i saghi scratch 2D rimangono popolari in quanto facili da eseguire, non riflettono la complessità dell'ECM né gli effetti del flusso^{del fluido 6}. Gli approcci basati su Transwell forniscono letture quantitative, ma solo agli endpoint fissi, impedendo l'osservazione continua della^{migrazione 6,9}.

Studi recenti hanno dimostrato che il flusso interstiziale aumenta il potenziale metastatico, mentre la rigidità e la composizione della ECM promuovono la transizione epiteliale-mesenchimale e la migrazione^{collettiva 4,10}. Sistemi 3D più avanzati, come sferoidi e organoidi, approssimano meglio gli ambienti ECM nativi; tuttavia, il loro utilizzo è spesso limitato dalla variabilità, dalla limitata accessibilità sperimentale e dalle difficoltà nell'analisi^{standardizzata 11,12}. Le piattaforme microfluidiche offrono un controllo superiore sulle condizioni meccaniche e fluidiche, ma la loro dipendenza da metodi e attrezzature specializzate limita il loro uso^{diffuso 13}. Pertanto, ricreare questi segnali integrati in vitro in modo controllato, accessibile, non invasivo ed economico rimane una sfida importante ^5,14.

Per affrontare queste sfide e colmare il divario tra i saggi 2D convenzionali e i complessi modelli in vivo , abbiamo sviluppato una semplice piattaforma cellulare 3D abilitata a flusso basata su un impalcatura di seta fibroina a spugna. Il sistema impiega una spugna di seta con proprietà meccaniche accordabili come impalcatura simile a un ECM. La seta è stata scelta per la sua struttura porosa, che consente una perfusione delicata e supporta un flusso interstiziale fisiologicamente^{rilevante 15}. La sua biocompatibilità e l'uso consolidato nell'ingegneria biomedica e tissutale lo rendono un materiale adatto a questa applicazione. Una recente pubblicazione ha ulteriormente dimostrato il potenziale di sostenibilità ambientale e riciclaggio^{dell'impalcatura 16}. In un altro studio, abbiamo ulteriormente mostrato la loro adattabilità attraverso diverse modalità di imaging, come la tomografia a emissione di^{positroni 17}. Questo lavoro precedente ha costituito la base per la presente descrizione metodologica, in cui costruiamo lo stesso concetto di piattaforma in una configurazione semplificata basata sull'imaging ottico in vivo . Insieme, questi studi dimostrano il potenziale del sistema per la valutazione multimodale basata su imaging di costrutti tessuti ingegnerizzati e ne supportano l'uso come piattaforma sperimentale versatile per integrare colture in vitro e letture rilevanti in vivo tra diversi modelli di cellule tumorali.

Come prova di concetto, abbiamo coltivato cellule di cancro al seno 4T1 triplo negative marcate con iRFP720 all'interno dell'impalcatura sotto due condizioni di flusso a basso stress di taglio per cinque giorni. Il monitoraggio ottico in vivo non invasivo ha rivelato distinti schemi di crescita diretti al flusso e cambiamenti significativi nella dinamica delle popolazioni cellulari rispetto ai controlli statici. Enfatizzando la semplicità e la riproducibilità ingegneristica, questo modello fornisce un ponte pratico tra i saghi 2D e gli studi in vivo , permettendo ai ricercatori di esaminare, su scala macroscopica e non invasiva, le caratteristiche cellulari mediate dal flusso in un formato fisiologicamente rilevante ma accessibile. A differenza delle metodologie precedenti che spesso si basano su analisi distruttive degli endpoint o mancano di criteri standardizzati di seeding, questo protocollo introduce un quadro sistematico per ottimizzare la produzione di impalcature e, successivamente, il seeding e l'imaging delle cellule. Questo approccio migliora la robustezza sperimentale e offre una visione più completa e longitudinale della dinamica cellulare collettiva all'interno delle matrici 3D, rappresentando un significativo raffinamento rispetto ai metodi esistenti per il monitoraggio della crescita e della migrazione.

Protocollo

La prima sezione delinea la preparazione degli impalcature in fibroina di seta basandosi su lavori pubblicati^{precedenti 16}. Le sezioni successive descrivono l'ottimizzazione della densità di semina cellulare, l'integrazione del flusso e l'imaging ottico per il monitoraggio del movimento e della crescita cellulare. Questo studio ha utilizzato esclusivamente linee cellulari di cancro al seno murino consolidate (4T1-wt e 4T1-iRFP720) e non ha coinvolto partecipanti umani, campioni di pazienti, tessuti primari o animali vivi. In conformità con le linee guida istituzionali e nazionali, non era richiesta l'approvazione etica. Una panoramica schematica del flusso di lavoro è mostrata nella Figura 1.

1. Preparazione della spugna fibroina di seta

1. Pulizia e degommazione del bozzolo.
   1. Taglia i bozzoli del baco da seta Bombyx mori L. usando un bisturi di sicurezza.
   2. Rimuovere le larve ed estrarre lo strato più interno del bozzolo (strato compatto che circonda direttamente la cavità larvale) utilizzando un ago standard per sezionare.
   3. Riempi un becher con 1,6 L di acqua doppiamente distillata (ddH₂O).
   4. Aggiungi una barra magnetica per agitare e porta l'acqua a ebollizione mentre mescola; Copri il becher con carta stagnola per accelerare il riscaldamento e ridurre la perdita d'acqua.
   5. Aggiungi 3,4 g di Na₂CO₃ quando la temperatura dell'acqua raggiunge circa 70 °C.
   6. Quando la miscela inizia a bollire, inserisci 4 g di bozzoli preparati nella soluzione e mescola con una barra di vetro.
   7. Fai bollire i bozzoli per 30 minuti, mescolando con una barra di vetro ogni 10 minuti per garantire una corretta esposizione.
   8. Rimuovi la seta dalla soluzione e risciacquala più volte con acqua del rubinetto per rimuovere la sericina residua.
   9. Spremu l'acqua in eccesso e spargi le fibre di seta su una teglia di alluminio pronta.
   10. Asciuga le fibre di seta in forno preriscaldato a 50 °C fino a quando non sono completamente asciutte (circa 18 ore).
2. Scioglimento e dialisi
   1. Usa etanolo assoluto e_{CaCl 2} anidro per i passaggi successivi. La matrice di dissoluzione è composta da 1 parte di CaCl₂, 2 parti di etanolo e 8 parti di_{ddH 2}O. Il rapporto tra seta gommata secca e matrice di dissoluzione è 1:10 [a v/w].
   2. Pesa la seta essiccata e calcola di conseguenza le quantità corrette dei componenti per la matrice di dissoluzione.
   3. Riempi la quantità rispettiva di_{CaCl 2} in una fiaschetta a fondo rotondo dotata di una barra di agitazione.
   4. Misura la quantità necessaria di etanolo e_{ddH 2O}e combinali.
   5. Aggiungi la miscela etanolo-ddH₂O al CaCl₂ mentre mescola.
   6. Installa un apparecchio per il reflusso e riscalda la miscela a 100 °C in un bagno d'olio, lasciando che il CaCl₂ si scioglia e portando la miscela a ebollizione.
   7. Quando la miscela inizia a bollire, aggiungi la seta secca e scaldala sotto reflusso per 45 minuti.
   8. Prepara tubi di cellulosa per dialisi lunghi 15 cm da 3,5 kDa risciacquandoli più volte con acqua per reidratarli, poi fissa un'estremità avvolta attorno a una barra di vetro con una clip di sigillatura.
   9. Dopo l'ebollizione, trasferire la soluzione di seta calda nel tubo e sigillare l'estremità opposta con una pinza, lasciando uno spazio di 2–3 cm tra il liquido e la clip di sigillatura, senza alcun involucro d'aria.
   10. Metti il tubo di dialisi pieno in un becher da 2 L riempito con_{ddH 2}O e esegui la dialisi a temperatura ambiente per 72 ore, cambiando l'acqua due volte al giorno per garantire una purificazione efficace.
   11. Centrifuga la soluzione a 4500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   12. Versare delicatamente il surnazionante nei tubi della centrifuga senza disturbare il pellet e conservare i tubi a -20 °C.
       NOTA: Riempi i tubi della centrifuga fino a non più della metà della loro capacità e congelali in posizione orizzontale.
3. Liofilizzazione
   1. Preriscalda la pompa a vuoto per 20 minuti e aziona il liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore.
   2. Metti i tubi della centrifuga congelati, direttamente fuori dal congelatore, in una fiaschetta a fondo rotondo.
   3. Attacca la fiaschetta al liofilizzatore e liofilizza per 24 ore.
   4. Fino a un ulteriore utilizzo, conservare la fibroina di seta liofilizzata in un luogo asciutto a temperatura ambiente.
4. Gettamento con solventi e lisciviazione particolato
   1. Aggiungere la quantità richiesta di seta liofilizzata a 1,1,1,3,3,3-esafluoroisopropanolo (HFIP) in un contenitore per campioni di urina sotto una cappa per ottenere una soluzione al 16% [w/v] con un volume finale di 30 mL, e chiudere il contenitore con un coperchio.
      ATTENZIONE: L'HFIP è corrosivo e dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle; Maneggiare il solvente in una cappa fumaria indossando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, ed evitare il contatto con pelle, occhi e vapori. In caso di fuoriuscita, raccogli il liquido utilizzando materiali assorbenti e pulisci le aree interessate. Trasferire i materiali contaminati in contenitori designati per rifiuti pericolosi.
   2. Sigilla bene il contenitore e mettilo sullo shaker orbitale a 70 giri/min per 18 ore per permettere alla seta di sciogliersi.
   3. Setaccia NaCl usando diverse mesh e metti da parte la frazione di 500–800 μm.
   4. Riempire una piastra di Petri (9 cm di diametro, 8,5 cm di diametro inferiore) con 100 g di sale setacciato (frazione di 500–800 μm), ottenendo un'altezza di 1,2 cm. Assicurati che la superficie sia ben livellata.
   5. Versare delicatamente 25,5 mL della soluzione di seta preparata sul letto salino (porogeno per la formazione dei pori a spugna).
   6. Copri la piastra di Petri con il coperchio e posizionala su uno shaker orbitale per 10 minuti a 70 giri/min per un'infiltrazione uniforme della soluzione di seta nel letto di sale.
   7. Incubare la piastra di Petri a 37 °C per 1 ora con il coperchio chiuso; successivamente incubare la piastra di Petri scoperta a 37 °C per ulteriori 18 ore.
   8. Per indurre la formazione di fogli beta, immergi il composito di seta in un becher contenente metanolo per 20 minuti, poi estralo e asciugalo in forno a 50 °C (circa 1 ora).
      ATTENZIONE: Il metanolo è altamente tossico; maneggiare in una cappa mentre si indossa i DPI adeguati, evitando il contatto con la pelle ed esposizione al vapore. In caso di fuoriuscita, raccogli il liquido utilizzando materiali assorbenti e pulisci le aree interessate. Trasferire i materiali contaminati in contenitori designati per rifiuti tossici.
   9. Rimuovere il NaCl di porogeno immergendo il composito di seta in un becher contenente acqua tiepida del rubinetto per almeno 3 ore, con uno scambio d'acqua ogni 20–30 minuti finché il materiale non raggiunge una consistenza morbida e simile a una spugna, senza parti dure residue.
   10. Conservare la spugna di seta al 70% di etanolo per la disinfezione e la conservazione a breve termine a 4 °C.
       NOTA: Le soluzioni contenenti HFIP sono state raccolte come rifiuti solventi alogenati, mentre i rifiuti di metanolo sono stati smaltiti separatamente come rifiuti organici non alogenati secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza chimica. Per la decontaminazione post-utilizzo, contenitori e superfici di lavoro esposti a HFIP o metanolo sono stati risciacquati con un solvente compatibile e puliti con una soluzione detergente. I primi risciacqui e i consumabili contaminati sono stati raccolti come rifiuti chimici pericolosi.

2. Preparazione e bilanciamento dell'impalcatura di seta

1. Tagliare spugne di fibroina di seta utilizzando un punzone per biopsia di 6 mm di diametro per ottenere impalcature cilindriche di 6 mm di diametro e altezza 12 mm.
   NOTA: Gli impalcature preparate in seta fibroina possono essere conservati al 70% di etanolo a 4 °C fino a 4 mesi; Per una conservazione prolungata, si consiglia una sostituzione periodica con etanolo fresco. Gli impalcature equilibrate possono essere conservati in mezzo di coltura cellulare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Metti i campioni nei tubi centrifughe con etanolo al 70% per la disinfezione.
3. Esegui i passaggi successivi in un armadietto certificato per la sicurezza biologica per prevenire la contaminazione.
4. Aspira etanolo con una pipetta mentre premi la spugna con una pinzetta.
5. Posizionare le spugne in una piastra di Petri contenente 10–20 mL integrato con substrati Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 per immergerle completamente.
6. Scambia i media tre volte con un piccolo scuotimento tra uno scambio e l'altro.
7. Dopo il terzo lavaggio, aggiungi un substrato fresco, chiudi bene il coperchio e avvolgilo con pellicola di paraffina.
8. Conserva le spugne per almeno una settimana in frigorifero a 4 °C prima di usarle per la coltura cellulare. Durante questo periodo, si scambiano i media 4–5 volte.
   NOTA: Assicurarsi la completa rimozione dell'etanolo, poiché l'etanolo residuo è citotossico e compromette l'attacco e la vitalità cellulare.

3. Misurazione di background e ottimizzazione dell'imaging

1. Trasportare tubi di filtrazione otticamente trasparenti vuoti e tubi di filtrazione otticamente trasparenti contenenti impalcature di seta non seminate all'imaging ottico in vivo .
   NOTA: L'imaging è stato eseguito utilizzando un'imaging ottico in vivo in modalità epifluorescenza 2D.
2. Eseguire immagini su diverse coppie di filtri (eccitazione: 675 nm, 745 nm; emissione: 720 nm, 800 nm), tempi di esposizione (4–60 s), numeri di f-stop (1–8), campo visivo (13,5–22,5 cm) e livelli variabili della lampada (basso e alto).
3. Valutare l'autofluorescenza fotografando entrambe le piattaforme in condizioni identiche prima di utilizzare impalcature con seed cellulare.
4. Sostituire l'ingresso maschio Luer-lock con un connettore Luer-lock femmina a taglio per configurazioni solo di imaging, eliminando artefatti di autofluorescenza ad alta intensità dal connettore maschio Luer-lock. Se i materiali sono gli stessi per tutti gli esperimenti, questo passaggio è richiesto una sola volta.
    

4. Preparazione delle sospensioni cellulari e semina su impalcature di fibroina di seta

NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in un armadietto di sicurezza biologica in condizioni sterili, poiché queste procedure prevedono la maneggiamento di cellule vive e campioni contenenti cellule.

1. Monitorare regolarmente le cellule murine di cancro al seno triplo (4T1-wt) e 4T1-iRFP720 murine triple negative per la contaminazione e la stabilità dell'espressione di iRFP720.
2. Mantenere cellule murine triple negative di 4T1-wt e 4T1-iRFP720 in mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale al 10%, 1% L-glutamina e 1% penicillina/streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
3. Cellule del passaggio a circa l'80% di confluenza usando lo 0,25% di tripsina-EDTA, seguendo le procedure standard di coltura cellulare asettica.
4. Utilizzare numeri di passaggio identici e condizioni di coltura per le celle 4T1-wt e 4T1-iRFP720 per tutti gli esperimenti comparativi.
5. Preparare una densità di semina delle celle che varia da 5 × 10⁴ a 5 × 10⁷ cellule/mL (corrispondenti a un intervallo da 1 × 10⁴ a 1 ×^{10 7} celle per 200 μL). Preparare le seguenti concentrazioni per l'analisi di imaging per valutare l'intensità del segnale tra diverse densità cellulari e determinare la concentrazione ottimale: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ e 5 × 10⁷ cellule/mL.
6. Preparare le sospensioni corrispondenti di celle 4T1-wt allo stesso intervallo di concentrazione delle celle 4T1-iRFP720 per fungere da controlli non fluorescenti.
7. Posizionare impalcature individuali (preparate nella Sezione 2) in piastre di Petri sterili e non trattate.
   NOTA: Utilizzare piastre di Petri non trattate per minimizzare l'attacco cellulare alla superficie plastica e favorire l'attacco cellulare al patibolo di seta.
8. Rimuovere il materiale in eccesso da ogni impalcatura e dall'impalcatura usando una pipetta, facendo attenzione a non deformare la struttura.
9. Pipetta 200 μL della sospensione a celle appropriate direttamente sulla superficie superiore di ogni impalcatura, assicurando che l'intero volume venga assorbito nell'impalcatura.
10. Incubare impalcature per 4 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ senza disturbare le piattaforme per consentire l'attacco cellulare.
11. Dopo 4 ore, trasferire con cura ogni impalcatura con semi cellulari in un pozzo di una piastra a 24 pozzi contenente 1 mL di mezzo completo preriscaldato.
12. Incubare impalcature durante la notte (16–24 ore) a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.

5. Assemblaggio di piattaforme di calibrazione con frit

NOTA: Esegui tutti i passaggi di assemblaggio in un armadietto di sicurezza biologica usando guanti sterili, pinzette sterili e strumenti sterili.

1. Rimuovere impalcature di seta a seme cellulare dalle piastre a 24 pozzi utilizzando pinzette sterili, sostenendo delicatamente ogni impalcatura per evitare la compressione.
2. Inserire un impalcatura a seme cellulare nella parte inferiore di un tubo di estrazione in fase solida otticamente trasparente utilizzando una spinta sterile a colonna.
3. Posiziona una fritta sterile in polietilene direttamente sopra l'impalcatura usando la barra di spinta.
   NOTA: Utilizzare fritte di polietilene solo durante l'ottimizzazione del segnale, poiché la loro dimensione dei pori è minore del diametro della cellula e impedisce la migrazione cellulare o qualsiasi altro contatto cellula-cellula. Questo consente anche una separazione chiara del segnale, consentendo l'identificazione della concentrazione esatta delle celle corrispondente a ciascun segnale.
4. Ripetere la sequenza di impilamento, un impalcatura seguito da un fritto, finché non sono stati inseriti cinque impalcature a seme cellulare e cinque frit.
5. Chiudi il fondo del tubo di filtrazione con un connettore Luer-lock femmina sterile.
6. Chiudi la parte superiore del tubo di estrazione con un connettore Luer-lock maschio sterile.

6. Ottimizzazione del segnale tramite strumento di imaging ottico in vivo utilizzando piattaforme di calibrazione con frits (solo una volta per la validazione del sistema)

1. Trasportare piattaforme a seed cellulare per la calibrazione nella sala di imaging ottico in vivo all'interno di una scatola oscura a tenuta della luce per proteggere le cellule fluorescenti dal fotosbiancamento.
2. Preparare l'imaging ottico in vivo secondo la sicurezza istituzionale e le procedure operative.
3. Posizionare piattaforme assemblate e con cellule a seed sulla fase di imaging.
4. Acquisire immagini di epifluorescenza 2D usando eccitazione a 675 nm ed emissione a 720 nm e ottimizzare i parametri di immagine, inclusi tempo di esposizione, fattore di binning e numero f, per ottenere la massima intensità del segnale all'interno dell'intervallo di rilevamento lineare (vedi Figura Supplementare 1 e Figura Supplementare 2).
5. Includere almeno un tubo di estrazione otticamente trasparente contenente impalcature insediate con celle 4T1-wt a densità cellulari corrispondenti come controllo di riferimento non fluorescente.
6. Acquisire immagini per tutti i campioni utilizzando impostazioni di acquisizione identiche per consentire il confronto quantitativo dell'intensità di fluorescenza (vedi Figura Supplementare 3 e Figura Supplementare 4).
7. Quantificare i segnali di fluorescenza utilizzando software di analisi ottica in vivo e determinare la densità ottimale di semina delle cellule (ad esempio, 5 × 10⁶ celle per impalcatura) che fornisce il segnale massimo senza saturazione (vedi Figura Supplementare 5).
   NOTA: Le impostazioni finali del sistema di imaging ottico in vivo sono state selezionate sulla base di esperimenti di ottimizzazione per garantire l'acquisizione del segnale all'interno della gamma dinamica lineare del sistema, evitando la saturazione della capacità di scaffolding e mantenendo un rapporto segnale-sfondo stabile sia in condizioni sperimentali che di controllo. In base a impostazioni ottimizzate, sembra tutti i bioreattori sperimentali con 5 × 10⁶ celle/impalcatura. Eseguire l'imaging in modalità epifluorescenza 2D con le seguenti impostazioni: eccitazione: 675 nm (larghezza di banda 30 nm); Emissione: 720 nm (larghezza di banda 20 nm), tempo di esposizione: 10 s, fattore di contenimento: 8, numero f: 8.

7. Assemblaggio sperimentale della piattaforma (senza frits)

1. Dopo l'ottimizzazione del segnale, si seminano impalcature sperimentali con la densità cellulare ottimale determinata (cioè, 5 × 10⁶ cellule/200 μL, vedi sezione 4).
2. Assemblare la piattaforma sperimentale utilizzando un totale di cinque spugne di seta: un impalcatura a seme cellulare e quattro impalcature vuote senza fritte di polietilene per consentire la comunicazione cellulare.
3. Sigilla la parte superiore del tubo di filtrazione con un connettore maschio sterile Luer-lock.
4. Configurare il sistema di coltura per condizioni di cultura statiche o dinamiche
   1. Coltura statica: sigillare la porta inferiore con un connettore sterile femmina Luer-lock. Il sistema viene poi inserito in un tubo centrifuga con un coperchio ben adattato.
      NOTA: Poiché il Luer-lock maschio ha un'apertura, questa configurazione consente lo scambio di gas minimizzando il rischio di contaminazione. In questa configurazione, il supporto viene sostituito manualmente nella cappa una volta al giorno.
   2. Coltura dinamica: collegare la porta inferiore a tubi sterili e collegare la linea di ingresso al Luer-lock maschio sulla porta superiore per consentire la coltura per perfusione. Fornire e rimuovere continuamente il substrato utilizzando un sistema di pompa peristaltica (Figura Supplementare 6).

8. Cultura dinamica nella piattaforma

1. Inizia la disinfezione della pompa e dei tubi associati risciacquando con etanolo al 70% al massimo flusso per 10 minuti.
2. Risciacqua la pompa e il tubo con un mezzo completo sterile per almeno 10 minuti per rimuovere residui di etanolo. Sostituisci con un mezzo fresco e continua la perfusione per altri 10 minuti per garantire un completo equilibrio del sistema prima dell'uso.
   NOTA: Assicurati che tutti i componenti siano completamente pieni di mezzo e privi di bolle d'aria prima della semina delle celle.
3. Collega l'ingresso maschio Luer-lock (alto) del reattore assemblato alla linea di uscita della pompa utilizzando tubi sterili e connettori Luer-lock.
4. Collega l'ingresso della pompa a un serbatoio sterile contenente un mezzo completo.
5. Collegare l'uscita del reattore (in fondo) al serbatoio del mezzo per stabilire un circuito di perfusione a ricircicolazione. Questa configurazione consente una perfusione continua del mezzo attraverso l'impalcatura mantenendo un sistema ad anello chiuso.
   NOTA: In questo protocollo, la perfusione viene eseguita utilizzando una configurazione di ricircolazione, in cui il mezzo viene continuamente spostato tra il serbatoio e il reattore. Questo approccio minimizza il consumo di medi mantenendo un flusso continuo.
6. Imposta la portata desiderata sulla pompa per raggiungere la tensione di taglio nominale della parete (ad esempio, 1 dyn/^{cm 2} e 4 dyn/cm²), utilizzando il raggio interno del canale ( = 3 mm) basandosi sull'assunzione del flusso di^{Poiseuille 19}:
   
   dove τ è la tensione di taglio della parete (dyn/cm²), e Q è la portata volumetrica (cm³/s), è la viscosità del fluido del mezzo RPMI-1640 (0,958 × ^10-3 N·s/^{m 2} a 37 °C)²⁰. Sebbene il sistema effettivo contenga un'impalcatura di seta porosa e quindi si discosti da questa geometria idealizzata, i valori calcolati sono stati utilizzati come benchmark operativi standardizzati per consentire confronti riproducibili tra le condizioni di flusso. Le corrispondenti portate erano di 0,133 mL/min e 0,531 mL/min e venivano utilizzate come condizioni di perfusione per la coltura.
7. Avvia la perfusione e monitora il sistema per perdite, formazione di bolle e flusso stabile.
8. Iniziare la perfusione con inibitore della migrazione o un composto di prova (ad esempio, Cucurbitacina E (CuE) a 0,05 μmol/L nel mezzo completo) o senza (controllo) e mantenere l'intero impianto a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂ fino a cinque giorni. Pertanto, collegare l'ingresso della pompa a un serbatoio sterile contenente un mezzo completo inclusa la relativa base di prova, e avviare la pompa con impostazioni simili a quelle usate in precedenza.
   NOTA: Assicurarsi la completa rimozione dell'etanolo dalla pompa e dal tubo eseguendo i passaggi di lavaggio del mezzo definiti. Scartare la frazione iniziale del mezzo dopo il risciacquo prima di collegarlo ai reattori a seme cellulare e assicurarsi che il sistema sia completamente pieno di mezzo fresco e privo di bolle d'aria.

9. Imaging a fluorescenza della piattaforma sperimentale

1. Ferma la pompa, scollega tutti i tubi mantenendo condizioni sterili.
2. Sigilla il fondo del tubo SPE usando un connettore femmina Luer-lock, inserisci l'intero sistema in un tubo centrifuga sterile da 50 mL e chiudi saldamente il tubo.
3. Trasferire il sistema in un armadietto di biosicurezza per proseguire tutti i passaggi successivi. All'interno del cofano, sostituire il connettore maschio Luer-lock con un connettore femmina Luer-lock a corte per chiudere completamente il sistema.
4. Rimettere il sistema sigillato in un tubo centrifuga sterile da 50 mL e chiudere il tubo in modo sicuro per il trasporto.
   NOTA: A seconda delle condizioni di laboratorio, il flusso non deve essere interrotto per l'imaging quando il sistema è stretto. Tuttavia, ciò non era possibile nei contesti sperimentali forniti.
5. Trasportare i reattori sigillati nella sala del sistema di imaging ottico in vivo all'interno di una scatola oscura a tenuta della luce per proteggere le cellule fluorescenti dal fotosbiancamento.
6. Posizionare i reattori sul palco del sistema di imaging ottico in vivo nel supporto appropriato.
7. Acquisire immagini di epifluorescenza 2D utilizzando i parametri precedentemente ottimizzati (cioè eccitazione 675 nm, emissione 720 nm, tempo di esposizione 10 s, binning 8, numero f 8).
8. Includere 4T1-wt seeded, impalcatura non seedata e controlli vuoti del reattore per ogni sessione di imaging.
9. Quantificare i segnali di fluorescenza utilizzando analisi di imaging ottico in vivo .
10. Traccia i risultati quantitativi per i gruppi di controllo e trattamento e genera grafici comparativi per visualizzare l'effetto del composto di prova sull'esito misurato.

10. Analisi delle immagini della piattaforma sperimentale

1. Acquisire immagini di fluorescenza al Giorno 0, Giorno 3 e Giorno 5 e analizzarle utilizzando software di analisi delle immagini.
2. Per ogni immagine, esegui la calibrazione spaziale prima dell'analisi. Misura la lunghezza fisica nota della piattaforma sperimentale in pixel usando lo strumento linea, e inserisci la corrispondente distanza reale (85 mm) tramite Analizza > Set Scale per definire la conversione pixel-a-lunghezza.
3. Dopo la calibrazione, quantificare l'area fluorescente delineando manualmente la regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione a mano libera.
4. Per minimizzare il bias dell'utente, delineare i ROI utilizzando criteri visivi coerenti basati sull'intensità del segnale di fluorescenza rispetto allo sfondo. Eseguire tutte le analisi sotto le stesse impostazioni e, quando possibile, far eseguire l'analisi da un singolo operatore addestrato.
5. Identificare il segnale fluorescente come regioni luminose chiaramente distinguibili dallo sfondo scuro nelle immagini software di analisi ottica in vivo e utilizzare questi segnali per guidare una segmentazione manuale coerente.
6. Misura le regioni selezionate usando Analizza > Misura e registra i valori dell'area per ogni punto temporale. Ripeti questa procedura per tutte le immagini di tutti i gruppi sperimentali.
7. Normalizzare le misurazioni dell'area al corrispondente valore del Giorno 0 per ogni campione utilizzando software di fogli di calcolo per tenere conto delle differenze nella dimensione iniziale ed esprimere i risultati come variazione di piegatura rispetto alla linea di base (Giorno 0 = 1).

11. Analisi statistica

1. Esegui tutti gli esperimenti almeno in triplice.
2. Ripetere tutti gli esperimenti almeno tre volte (n = 3), determinare i valori medi così come le deviazioni standard (SD).
3. Determinare la significatività statistica usando ANOVA bidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey con α = 0,05.

Risultati

Questo protocollo descrive una piattaforma user-friendly e a basso costo per l'osservazione macroscopica della crescita e del movimento cellulare in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante. Il metodo utilizza spugne di fibroina di seta come mimetico ECM e incorpora un flusso interstiziale controllato per modellare condizioni dinamiche dei tessuti. Una panoramica schematica delle procedure passo dopo passo, dalla fabbricazione di spugna di seta e impalcatura alla semina delle celle e al...

Discussione

Il processo di produzione della spugna di seta descritto in questo protocollo è standardizzato, garantendo la fabbricazione riproducibile dell'impalcatura come riportato in uno studio^{precedente 16}. La produzione di spugne in condizioni completamente standardizzate, come l'altezza/quantità del letto di sale, il volume della soluzione di seta e l'incubazione con metanolo, è cruciale per ottenere spugne uniformi e comparabili. Le spugne prodotte devono seguire i crit...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,1,1,3,3,3-Esafluoroisopropanolo (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Attenzione: Pericoloso. Utilizzato per la dissoluzione di seta liofilizzata
Piastra a 24 pozzetti	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Conservazione di scaffold con cellule durante l'incubazione
Cellule di cancro al seno triplo-negativo murino 4T1-iRFP720	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	Sperimentazione con colture cellulari; 4T1-iRFP720 derivato internamente dalle cellule parentali 4T1 (ATCC: CRL-2539)
Cellule di cancro al seno triplo-negativo murino 4T1-wt	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	Sperimentazione con colture cellulari
Bruker Alpha Compact FTIR con modulo di campionamento Platinum-ATR	Bruker	A220/D-01	Analisi FT-IR
Cloruro di calcio, anidro, >93% grado reagente	Sigma-Aldrich	902179	Per la preparazione della matrice di dissoluzione
Flacone per coltura cellulare, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Materiale di consumo; per la coltura cellulare
Flacone per coltura cellulare, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Materiale di consumo; per la coltura cellulare
Centrifugatrice 5804 R	Eppendorf	5805000010	Utilizzata per la separazione dei campioni mediante centrifugazione
Tappo Combi (connettore Luer-lock femmina)	Braun Melsungen AG	4495101	Utilizzato per l'assemblaggio della piattaforma
Cucurbitacina E	Sigma-Aldrich	SML0577	Inibitore della migrazione cellulare
Pozzetto per biopsia dermica, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Utilizzato per ottenere scaffold di spugna cilindrica
Tubi per dialisi (3,5 kDa, cellulosa)	Spectra/Por di Spectrum Labs	SPEC132724	Per la dialisi della soluzione di fibroina di seta
Soluzione salina tamponata di Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Per la manutenzione delle cellule
Etanolo assoluto	Merck	1.07017	Per la preparazione della matrice di dissoluzione
Excel	Microsoft	v2604	Organizzazione dei dati, calcoli di base e tracciamento
Siero di vitello fetale (FCS) inattivato termicamente	Biowest	S181H-500	Supplemento per i mezzi di coltura cellulare
Fiji (ex ImageJ)	Open source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Elaborazione e analisi delle immagini
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Analisi statistica e creazione di grafici
Pompa HPLC Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Per condizioni di coltura dinamica nella piattaforma assemblata
Sistema IVIS 200 Spectrum CT	PerkinElmer	128201	Sistema di imaging ottico con capacità CT
Software IVIS Living Image	PerkinElmer	v4.5.2	Software per l'acquisizione, la visualizzazione e l'analisi quantitativa dei dati di imaging IVIS
Microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6510	JEOL GmbH	JSM-6510	Immagini SEM
L-glutamina, soluzione 200 mM, adatta alla coltura cellulare (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Supplemento per i mezzi di coltura cellulare
Liofilizzatore Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Per la liofilizzazione della fibroina di seta
Connettore Luer-lock maschio	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adattatore per i serbatoi dei campioni
Metanolo, >99,9 %, Grado Gradiente HPLC	Carl Roth	7342.1	Attenzione: Tossico. Induzione della formazione di beta-sheet nei compositi di seta
Tubi per estrazione in fase solida (SPE) otticamente trasparenti senza filtri	Sigma Aldrich	57240-U	Utilizzati per l'assemblaggio della piattaforma
Software di spettrografia OPUS	Bruker	v7.5	Analisi FT-IR
Agitatore orbitale e lineare MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Distribuzione/miscelamento uniforme
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Per sigillare/avvolgere piastre e contenitori per la conservazione (ad esempio, refrigerazione)
Penicillina-Streptomicina, liquida, adatta alla coltura cellulare (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Supplemento per i mezzi di coltura cellulare
Piatto di Petri, 9 cm	VWR	391-0598	Per la colata di sponge su letto di sale; per la semina su scaffold di seta
Frit per SPE da 1 mL	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Utilizzati per l'assemblaggio della piattaforma
Mezzo RPMI-1640, adatto alla coltura cellulare	Sigma-Aldrich	R0883	Il mezzo supplementato viene utilizzato per l'equilibrio della sponge di seta, la manutenzione della coltura cellulare e gli esperimenti correlati
Pipetta serologica, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Materiale di consumo; per la manutenzione delle cellule
Pipetta serologica, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Materiale di consumo; per la manutenzione delle cellule
Pipetta serologica, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Materiale di consumo; per la manutenzione delle cellule
Coconcini di seta di Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgaria	N/A	Materia prima per la produzione di sponge di fibroina di seta
Carbonato di sodio, anidro, >99,5% ACS	VWR	11552.A3	Utilizzato per la sgusciatura chimica, cioè la rimozione della serichina
Cloruro di sodio, >98%, tecnico	VWR	27788.366	Per la colata di sponge su letto di sale
Spingicolonna per SPE	Carl ROTH	36P9.1	Utilizzato per l'assemblaggio della piattaforma
Setacci analitici in acciaio inossidabile,