Articolo metodologico

Modifica del genoma con CRISPR-Cas9 in Mesorhizobium ciceri mediante l'interruzione di nodC per studi sulla simbiosi con il cece

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DOI:

10.3791/71513

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25 settembre 2026

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1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'interruzione mediata da CRISPR-Cas9 del locus nodC in Mesorhizobium ciceri mediante riparazione guidata dall'omologia e screening basato sulla GFP, al fine di generare mutanti difettivi nella simbiosi per studi di genomica funzionale in rizobi associati al cece.

Abstract

Mesorhizobium ciceri, un simbionte fissatore di azoto del ceci (Cicer arietinum), rimane geneticamente difficile da manipolare utilizzando approcci convenzionali di ricombinazione omologa, che sono laboriosi e spesso lasciano marcatori di selezione indesiderati. In questo protocollo, descriviamo una strategia semplificata di editing del genoma che utilizza un sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) a ampio spettro di ospite, adattato per M. ciceri. Dimostriamo l'efficacia di questo metodo rivolgendoci a nodC, che codifica la N-acetilglucosaminiltransferasi necessaria per la sintesi del filamento di chitina nei fattori N, le principali molecole segnale coinvolte nella comunicazione molecolare simbiotica. Questo protocollo descrive in modo sistematico la progettazione di RNA guida singoli (sgRNA) e la costruzione di un template di riparo mediato da ricombinazione omologa (HDR). Il template HDR è stato progettato per facilitare l'integrazione sito-specifica di un reporter proteico verde fluorescente (GFP) ai lati del nodC sito di taglio. Dopo il trasferimento del costrutto Cas9/sgRNA/HDR mediante incrocio biparentale, i mutanti presunti sono stati identificati utilizzando un approccio di screening basato sulla fluorescenza. L'interruzione con successo del frammento di 1,3 kb nodC locus all'interno della nodulazione (nodulo) è stata inizialmente selezionata mediante la visualizzazione dell'espressione di GFP in colonie mutanti utilizzando microscopia a fluorescenza. L'interruzione è stata ulteriormente confermata mediante digestione con enzimi di restrizione, amplificazione del cassette integrato da DNA genomico e sequenziamento di Sanger. L'espressione di GFP è stata inoltre quantificata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa. Per validare l'impatto funzionale della mutazione, sono stati eseguiti saggi di infezione su ceci, che hanno dimostrato una nodulazione compromessa nelle piante inoculate con ΔnodC M. ciceri rispetto al ceppo di tipo selvatico. Nel complesso, questo protocollo fornisce un quadro efficiente e riproducibile per lo studio preciso dell'interruzione genica e della genomica funzionale in Mesorhizobium.

Introduzione

Il sistema della nucleasi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9), originariamente identificato come un meccanismo immunitario adattativo nei procarioti, è stato adattato in uno strumento efficace e affidabile per la modifica del genoma1,2. Il sistema utilizza un RNA guida sintetico (sgRNA) per identificare sequenze di DNA bersaglio attraverso l'appaiamento delle basi secondo Watson-Crick. L'sgRNA è composto da 20 nucleotidi complementari alla regione genomica adiacente al motivo protospacer adiacente (PAM) NGG. Cas9 genera un'interruzione a doppio filamento (DSB) in un sito specifico all'interno della sequenza bersaglio, generalmente 3 paia di basi (bp) a monte del sito PAM1. Le DSB risultanti possono essere riparate attraverso il meccanismo di riparazione non omologa delle estremità oppure mediante riparazione guidata dall'omologia (HDR) utilizzando un template donatore3,4. Questa strategia è stata ampiamente applicata per approcci di interruzione genica, knock-in e knock-out in batteri5,6,7,8. L'obiettivo principale di questo protocollo è sviluppare un metodo efficiente di editing genomico per Mesorhizobium ciceri utilizzando un sistema CRISPR-Cas9 a vasto spettro di ospiti.

M. ciceri è un batterio del suolo Gram-negativo che funziona come endosimbionte essenziale fissatore di azoto del cece (Cicer arietinum)9. Un ceppo, M. ciceri CC1192, mostra un'elevata efficienza di nodulazione e il suo genoma è stato sequenziato10. Nonostante la sua importanza agricola, la manipolazione genetica delle specie di Mesorhizobium rimane limitata. Sistemi basati su CRISPR sono stati precedentemente implementati in altri rizobi, tra cui l'interferenza CRISPR (CRISPRi) in Rhizobium etli11, la modifica del genoma in Sinorhizobium meliloti12 e la modifica di basi in S. meliloti13. Tuttavia, non è stato ancora descritto un sistema robusto per la modifica del genoma in M. ciceri. Gli approcci convenzionali si basano sulla ricombinazione omologa mediata da plasmidi suicidi, un metodo laborioso, che richiede ripetuti cicli di selezione e spesso lascia marcatori di resistenza agli antibiotici come lesioni genomiche14.

Per superare queste limitazioni, il sistema vettoriale pCasPP, inizialmente sviluppato per Paenibacillus polymyxa, è stato adattato per l'uso in M. ciceri15. Il sistema pCasPP utilizza una Cas9 di Streptococcus pyogenes ottimizzata per codoni in attinomiceti ad alto contenuto di GC e contiene una cassetta lacZ per la selezione blu-bianca del clonaggio dell'RNA guida sotto il promotore costitutivo gapdh8. È stato effettuato un incrocio biparentale tra il ceppo donatore di Escherichia coli e il ceppo ricevente di Mesorhizobium per trasferire il vettore di editing16. Per migliorare l'efficienza della selezione, la variante della proteina fluorescente verde (GFP) bjGFP, inizialmente ottimizzata per codoni in Bradyrhizobium diazoefficiens, è stata inserita nel modello donatore di riparazione mediante ricombinazione omologa (HDR)16. Questa strategia di screening basata sulla fluorescenza è stata applicata per colpire il locus essenziale nodC, necessario per le fasi iniziali della segnalazione simbiotica tra il batterio e il cece17,18.

Questo protocollo fornisce un'alternativa precisa ed efficiente ai metodi di mutagenesi chimica casuale o mediante ultravioletti (UV). Negli esperimenti di validazione, oltre l'80% delle colonie ottenute ha mostrato fluorescenza GFP, e colonie rappresentative modificate sono state ulteriormente confermate mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento di Sanger. I mutanti risultanti ΔnodC M. ciceri costituiscono una risorsa utile per lo studio della segnalazione simbiotica e delle interazioni ospite-microbo. Nel complesso, questo approccio offre alla comunità di ricerca sugli rhizobi un metodo efficiente e scalabile per studi di genomica funzionale in Mesorhizobium.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali che prevedevano la crescita delle piante, l'inoculazione microbica e la manipolazione di batteri geneticamente modificati sono stati condotti in conformità con le linee guida e le normative istituzionali. La coltivazione delle piante e le inoculazioni batteriche sono state eseguite in condizioni controllate all'interno di camere di crescita. Il ceppo di M. ciceri utilizzato in questo studio è classificato come microorganismo di Livello di Sicurezza Biologica 1 (BSL-1). Poiché tutti gli esperimenti sono stati condotti in condizioni di laboratorio controllate, senza rilascio nell'ambiente, non è stata richiesta un'approvazione formale del comitato per la sicurezza biologica istituzionale, in conformità alle politiche istituzionali in materia di sicurezza biologica. Tutti i rifiuti biologici prodotti durante lo studio sono stati sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento.

1. Preparazione delle cellule competenti

I ceppi di E. coli DH5α e E. coli S17-1λpir chimicamente competenti sono stati preparati e convalidati secondo la procedura descritta nel File Supplementare 1.

2. Progettazione dell'RNA guida

  1. Progettazione delle RNA guida
    1. Aprire la piattaforma Benchling (https://benchling.com/). Accedere a un account Benchling esistente o crearne uno nuovo.
    2. Creare un nuovo progetto e aprire lo strumento di progettazione delle guide CRISPR.
    3. Caricare o incollare la sequenza completa di DNA bersaglio per la progettazione dell'RNA guida. Selezionare l'opzione di progettazione "Singola guida" e impostare la lunghezza della guida a 20 bp.
    4. Selezionare il genoma di riferimento tra le opzioni disponibili. Per la progettazione dell'RNA guida rivolta a M. ciceri, selezionare Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 come genoma di riferimento. Utilizzare NGG come motivo protospaziale adiacente al PAM (PAM) richiesto per l'attività di Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. Utilizzare l'algoritmo di Hsu et al.19 per calcolare le frequenze previste di taglio fuori bersaglio. Mantenere un punteggio soglia di ≥50 per minimizzare il taglio non specifico sullo sfondo del genoma di riferimento.
    6. Utilizzare l'algoritmo Doench-Root20 per calcolare i punteggi previsti di efficienza sul bersaglio. Impostare una soglia di selezione del bersaglio di ≥60 per identificare le guide con un'efficienza prevista favorevole di scissione da parte di Cas9 nel locus bersaglio.
    7. Fare clic su "Fine" per generare l'elenco delle RNA guida candidate.
  2. Selezione delle RNA guida
    1. Aprire il pannello di output delle RNA guida.
    2. Dare priorità alle sgRNA candidate previste per generare una rottura a doppio filamento entro 100 bp dal codone di inizio della traduzione (ATG), aumentando la probabilità di produrre una proteina non funzionale.
    3. Valutare i punteggi fuori bersaglio e sul bersaglio. Dare priorità a un punteggio più alto fuori bersaglio rispetto a un punteggio leggermente più alto sul bersaglio per ridurre il rischio di scissione fuori bersaglio non intenzionale.
    4. Selezionare una o due RNA guida singole candidate (sgRNA) che soddisfano tutti i criteri di selezione.
  3. Preparazione degli oligonucleotidi gRNA
    1. Generare la sequenza complementare inversa dell'RNA guida selezionato.
    2. Aggiungere la sequenza 5′-ACGC all'estremità 5′ dell'RNA guida e aggiungere la sequenza 5′-AAAC all'estremità 5′ del filamento complementare inverso.
    3. Ordinare entrambi gli oligonucleotidi con fosforilazione 5′ e purificazione PAGE su scala di sintesi di 25 nmol.
  4. Appaiamento degli oligonucleotidi gRNA
    1. Preparare un buffer HEPES 30 mM sciogliendo 7,15 g di acido HEPES libero in circa 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,8 utilizzando idrossido di sodio e portare il volume finale a 1 L.
    2. Risospendere ciascun oligonucleotide fosforilato in acqua priva di nucleasi a una concentrazione finale di 100 µM. Combinare 5 µL di ciascun oligonucleotide con 90 µL di buffer HEPES 30 mM in una provetta sterile per microcentrifuga.
    3. Vortexare brevemente e centrifugare per raccogliere il liquido. Appaiare gli oligonucleotidi in un termociclatore incubando a 95°C per 5 min e raffreddando a 4°C con una velocità di rampa di 0,1°C/s.
    4. Diluire gli oligonucleotidi appaiati 10 volte utilizzando acqua priva di nucleasi.
  5. Assemblaggio della gRNA nel vettore pCasPP
    1. Reperire il vettore pCasPP descritto in precedenza da Rütering et al.15.
    2. La sequenza plasmidica è stata fornita da Jochen Schmid, e il costrutto utilizzato in questo studio è stato ottenuto tramite il dottor Syed Shams Yazdani (ICGEB).  
    3. Assemblare una reazione Golden Gate contenente 100 ng di vettore pCasPP, 0,3 µL di inserto oligonucleotidico appaiato, 2 µL di buffer 10× per T4 DNA ligasi, 1 µL di T4 DNA ligasi, 1 µL di enzima di restrizione BbsI e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 20 µL.
    4. Preparare una reazione di controllo negativo sostituendo l'inserto con acqua priva di nucleasi.
    5. Mescolare delicatamente le reazioni e centrifugare brevemente.
  6. Condizioni di termociclaggio per l'assemblaggio Golden Gate
    1. Caricare le provette della reazione in un termociclatore. Eseguire nove cicli costituiti da 37°C per 10 min seguiti da 16°C per 10 min.
    2. Incubare le reazioni a 50°C per 5 min e poi a 65°C per 20 min. Mantenere le reazioni a 4°C fino all'uso.
  7. Trasformazione delle reazioni di assemblaggio
    1. Scongelare 50 µL di cellule competenti di Escherichia coli DH5α sul ghiaccio per 10–15 min.
    2. Aggiungere 3 µL di ciascuna reazione di assemblaggio Golden Gate alle cellule competenti. Processare la reazione di controllo negativo in parallelo. Incubare le miscele sul ghiaccio per 30 min.
    3. Sottoporre le cellule a shock termico a 42°C per 45 s e riportare immediatamente le provette sul ghiaccio per 2 min. Aggiungere 950 µL di brodo Super Ottimale con repressione da cataboliti (SOC).
    4. Preparare il mezzo SOC contenente 0,5% estratto di lievito, 2% triptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ e 20 mM glucosio. Sterilizzare il mezzo per filtrazione utilizzando un filtro a siringa da 0,4 µm in condizioni asettiche.
    5. Incubare le colture a 37°C e 180 rpm per 1 h.
  8. Selezione dei trasformanti positivi
    1. Preparare piastre di agar LB supplementate con 50 µg/mL di neomicina, 0,2 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 32 mg/L di 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galattopiranoside (X-gal). Piastrare 100 µL della coltura di recupero sulle piastre selettive. Incubare le piastre a 37°C per 12–16 h.
    2. Selezionare le colonie bianche e scartare quelle blu. Verificare che la piastra di controllo negativo contenga meno di cinque colonie.
  9. Selezione e amplificazione dei cloni positivi
    1. Trapiantare da tre a quattro colonie bianche indipendenti su piastre fresche di agar LB selettivo.
    2. Incubare le piastre a 37°C per 12–16 h. Inoculare colonie singole in 10 mL di mezzo LB supplementato con 50 µg/mL di neomicina.
    3. Processare ciascun costrutto di RNA guida in modo indipendente durante tutto il flusso di lavoro successivo.
  10. Convalida dei costrutti pCasPP-gRNA
    1. Raccogliere le colture batteriche mediante centrifugazione. Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di purificazione di plasmidi con colonna in silice.
    2. Digerire il DNA plasmidico isolato con XbaI ed EcoRI nel buffer di reazione appropriato per 1 h a 37°C.
    3. Risolvere i prodotti di digestione su un gel di agarosio al 1% preparato in buffer 1× Tris-acetato-EDTA (TAE) contenente bromuro di etidio a una concentrazione finale di 0,5 µg/mL.
    4. Eseguire il gel a 90–110 V fino a quando il fronte del colorante migra per circa il 70–80% della lunghezza del gel. Visualizzare i frammenti di DNA utilizzando un transilluminatore UV.
    5. Confermare i cloni positivi rilevando un frammento di 1.280 bp e identificare i controlli del vettore vuoto rilevando un frammento di 1.630 bp. Il vettore pCasPP vuoto è di circa 9.663 bp e contiene un gene lacZ; l'inserzione dell'oligonucleotide gRNA di 24 bp rimuove il frammento lacZ, producendo un costrutto pCasPP più piccolo contenente la gRNA. I siti di restrizione XbaI ed EcoRI che delimitano la regione lacZ vengono utilizzati per la conferma diagnostica del clonaggio della gRNA.
  11. Preparazione delle scorte glicerolate
    1. Coltivare un clone positivo confermato in mezzo LB selettivo.
    2. Preparare una scorta glicerolata mescolando 700 µL di coltura in fase logaritmica con 300 µL di glicerolo sterile al 50%. Trasferire la miscela in cryovials sterili. Conservare le scorte glicerolate a −80°C.
      NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Preparare più aliquote per mantenere la stabilità del plasmide e la vitalità batterica. La reazione di assemblaggio Golden Gate completata può essere conservata a 4°C per una notte o a −20°C per 1–2 settimane prima della trasformazione.

3. Assemblaggio del modello per la riparazione guidata da ricombinazione omologa

  1. Preparazione del frammento di DNA contenente la proteina fluorescente verde (GFP)
    1. Ottenere il plasmide pRJPaph-bjGFP contenente la cassetta del reporter fluorescente16 (Tabella 1)10,15,16,21,22,23Il plasmide è stato fornito dal Prof. Hans-Martin Fischer (ETH Zurigo, Svizzera) ed è disponibile tramite Addgene (Plasmide #67032).
    2. Escidere il cassetto gfp da pRJPaph-bjGFP mediante digestione di restrizione con SacI e KpnI come descritto in File Supplementare 2 (Step 3.1). La sequenza gfp in pRJPaph-bjGFP è un gene sintetico bjGFP ottimizzato nei codoni per Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. Purificare il frammento di gfp di 1081 bp previsto.
  2. Costruzione di pUC18-gfp
    1. Ottenere il vettore pUC18 (plasmide Addgene #50004)21.
    2. Linearizzare il pUC18 utilizzando SacI e KpnI come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.2).
    3. Ligare il frammento di gfp purificato nel vettore pUC18 linearizzato come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.2).
    4. Trasformare cellule competenti E. coli DH5α cellule utilizzando la procedura di trasformazione descritta al punto 2.7, sostituendo la miscela di ligazione ottenuta al punto 3.2.3 alla reazione di assemblaggio Golden Gate.
    5. Selezionare i trasformanti positivi e verificare l'inserzione di gfp mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) su colonie come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.2).
  3. Amplificazione dei Bracci di Omologia
    1. Progettare primer per amplificare bracci di omologia a monte (UHA) e a valle (DHA) di circa 400–500 pb dal DNA genomico di M. ciceri (Tabella 2).
    2. Incorporare i siti di restrizione SacI/EcoRI nei primer UHA e i siti di restrizione XbaI/KpnI nei primer DHA. Utilizzare i primer F_nodC_Up_EcoRI e R_nodC_Up_SacI per l'amplificazione dell'UHA e i primer F_nodCdown_KpnI e R_nodCdown_XbaI per l'amplificazione del DHA (Tabella 2).
    3. Isolare M. ciceri DNA genomico secondo Weerakkody et al.25.
    4. Amplificare e purificare i frammenti UHA e DHA come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.3).
  4. Costruzione del plasmide pUC18-UHA-gfp
    1. Clonare il frammento UHA in pUC18-gfp utilizzando EcoRI e SacI come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.4).
    2. Verificare l'assemblaggio corretto del plasmide mediante digestione di restrizione con XbaI e KpnI. Un assemblaggio corretto dovrebbe generare frammenti di circa 500 e 3725 pb.
    3. Procedere con una clone verificata.
  5. Costruzione del plasmide pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. Clonare il frammento DHA in pUC18-UHA-gfp utilizzando KpnI e XbaI come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.5).
    2. Verificare il corretto assemblaggio mediante digestione con SacI ed EcoRI. Un assemblaggio corretto dovrebbe generare frammenti di circa 400 e 4271 pa.
    3. Verificare 5-6 cloni candidati mediante sequenziamento Sanger utilizzando i primer F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 e R_nodCdown_XbaI (Tabella 2), che insieme coprono la maggior parte della sequenza del cassetto di riparazione mediante ricombinazione omologa (HDR).
  6. Amplificazione e Purificazione del Template Finale di HDR
    1. Amplificare l'intero cassetta HDR utilizzando i primer F_FL_nodCgfp_XbaI e R_nodCdown_XbaI (Tabella 2).
    2. Purificare il frammento di HDR previsto di 2012 pa e digerire il prodotto PCR purificato con XbaI come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.6).
  7. Preparazione dei vettori pCasPP-gRNA
    1. Recuperare i plasmidi pCasPP-gRNA1 e pCasPP-gRNA2 generati al Passaggio 2.
    2. Linearizzare i plasmidi con XbaI e de-fosforilare il vettore come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.7).
  8. Clonaggio del modello HDR nei vettori pCasPP-gRNA
    1. Ligare la cassetta HDR in pCasPP-gRNA1 o pCasPP-gRNA2 linearizzati con XbaI come descritto in File Supplementare 2 (Passo 3.8).
    2. Trasformare cellule competenti E. coli DH5α cellule e selezionare i trasformanti su agar LB contenente 50 µg/mL neomicina
  9. Selezione di Cloni Contenenti HDR
    1. Selezionare i trasformanti in base alla fluorescenza GFP utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza dotato di un set di filtri standard per GFP (eccitazione 470–488 nm; emissione 507–510 nm).
    2. Classificare le colonie come GFP-positive in base alla presenza di una fluorescenza verde distinta e uniforme, chiaramente superiore alla debole autofluorescenza osservata nelle colonie di controllo negative non modificate.
    3. Espandere le colonie positive per GFP ed isolare il DNA plasmidico.
  10. Convalida dell'Assemblaggio del Vettore per la Ricombinazione Omologa
    1. Confermare l'inserzione HDR mediante digestione con l'enzima di restrizione XbaI.
    2. Verificare l'avvenuta assemblaggio mediante il rilascio del frammento HDR di 2012 pa previsto, insieme a un vettore pCasPP-gRNA di circa 9.300 pa.
      NOTA: Dopo l'inattivazione termica degli enzimi di restrizione e della fosfatasi, le miscele di reazione possono essere conservate a 4°C per tutta la notte o a −20°C per un massimo di 1 mese. Conservare i costrutti plasmidici confermati a −20°C per la conservazione a lungo termine.
Stirpe o plasmideDescrizioneRiferimento
Mesorhizobium ciceri CC1192Stirpe ricevente utilizzata per la modifica genomica mediante CRISPR-Cas9 e per i saggi di nodulazione del ceciHaskett et al.10
pCasPPVettore per la modifica genomica mediante CRISPR-Cas9, utilizzato per il clonaggio dell'RNA guida e il trasferimento del modello HDRRütering et al.15
pRJPaph-bjGFPPlasmide reporter GFP utilizzato come fonte del cassetto GFP
(Addgene plasmid #67032)		Ledermann et al.16
pUC18Vettore generico per clonaggio utilizzato per l'assemblaggio del modello HDR
(Addgene plasmid #50004)		Norrander et al.21
Escherichia coli S17-1λpirStirpe donatrice utilizzata per la coniugazione biparentaleSimon et al.22
Escherichia coli DH5αCeppo ospite per clonaggio utilizzato per la propagazione dei plasmidiHanahan et al.23

Tabella 1: Stirpi batteriche e plasmidi utilizzati in questo studio. Questa tabella elenca le stirpi batteriche e i plasmidi utilizzati per la propagazione di plasmidi, la modifica genomica mediata da CRISPR-Cas9, l'assemblaggio del template per la riparazione diretta da omologia (HDR), l'incrocio biparentale e l'etichettatura fluorescente di Mesorhizobium ciceri CC1192.

CategoriaNomeSequenza (5′ figure-protocol-1 3′) o descrizione
Stirpe battericaEscherichia coli DH5αStirpe ospite per clonaggio
Stirpe battericaEscherichia coli S17-1λpirStirpe donatrice per accoppiamento biparentale
Vettore di clonaggiopUC18Vettore di base per clonaggio
Vettore CRISPRpCasPPVettore CRISPR-Cas9 a ampio spettro di ospiti
Plasmide reporterpRJPaph-bjGFPPlasmide reporter GFP
PrimerF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
PrimerR_guide1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
PrimerF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
PrimerR_guide2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
PrimerF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
PrimerR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
PrimerF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
PrimerR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
PrimerBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
PrimerBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
PrimerBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
Primer16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
Primer16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
Primer16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
Primer16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
PrimerF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimernodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimerR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
PrimerF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
PrimerR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
PrimerF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
PrimerF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
PrimerR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
PrimerF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
PrimerR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

Tabella 2: Stirpi batteriche, plasmidi e primer oligonucleotidici utilizzati in questo studio. Questa tabella elenca le stirpi batteriche, i plasmidi e i primer oligonucleotidici utilizzati per la costruzione dell'RNA guida singolo (sgRNA), l'assemblaggio del template per la riparazione diretta da omologia (HDR), la reazione a catena della polimerasi (PCR) diagnostica, il sequenziamento di Sanger e la reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR). Le sequenze dei primer sono riportate in orientamento 5′ figure-protocol-2 3′. Nota: BjGFP_BP_F2 e GFP_R si riferiscono alla stessa sequenza oligonucleotidica ma sono elencati con nomi di primer diversi perché sono stati utilizzati in saggi sperimentali differenti.

4. Incrocio biparentale per il trasferimento del plasmide in M. ciceri CC1192

  1. Trasformazione delle cellule donatrici di E. coli
    1. Trasformare le cellule di E. coli S17-1λpir con i costrutti pCasPP-gRNA1-HDR o pCasPP-gRNA2-HDR seguendo la procedura descritta nel File Supplementare 3 (Passaggio 4.1).
    2. Selezionare i trasformanti su agar LB contenente 50 µg/mL di neomicina.
    3. Analizzare i trasformanti per la fluorescenza della GFP utilizzando un'illuminazione a circa 488 nm e rilevando l'emissione a circa 510–520 nm.
    4. Classificare le colonie come GFP-positive se mostrano una fluorescenza verde uniforme e distinta, assente nelle colonie di controllo di E. coli S17-1λpir non trasformato, quando esaminate con le stesse impostazioni del microscopio.
    5. Preparare stock glicerolati da cloni donatori GFP-positivi confermati.
  2. Preparazione delle colture seme e di avviamento
    1. Preparare colture di avviamento di E. coli S17-1λpir donatore e di M. ciceri ricevente seguendo il File Supplementare 3 (Passaggio 4.2).
    2. Far crescere le colture di avviamento fino a un OD₆₀₀ di 0.3–0.4, corrispondente a una densità cellulare stimata di circa 1 × 108 UFC/mL.
  3. Preparazione delle sottocolture per l'incrocio biparentale
    1. Preparare sottocolture donatrici e riceventi e farle crescere fino alla fase esponenziale richiesta seguendo il File Supplementare 3 (Passaggio 4.3).
    2. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro UV–visibile secondo la procedura di misurazione della densità ottica descritta nel File Supplementare 1 (Passaggio 1.2.3).
  4. Procedura di incrocio biparentale
    1. Eseguire l'incrocio biparentale su filtro membrana seguendo il File Supplementare 3 (Passaggio 4.4).
    2. Piastrare quattro aliquote della sospensione di incrocio su un filtro in polivinilidenfluoruro (PVDF) sterile da 0,22 µm (diametro 47 mm), assicurandosi di mantenere un'adeguata distanza tra i punti per evitare mescolamenti.
  5. Ripristino e selezione dei transcongiuganti
    1. Ripristinare i transcongiuganti ed eseguire la selezione con doppio antibiotico seguendo il File Supplementare 3 (Passaggio 4.5).
    2. Passare ripetutamente i transcongiuganti su mezzo contenente solo carbenicillina per eliminare i plasmidi residui.
    3. Confermare l'eliminazione del plasmidica mediante l'incapacità delle colonie di crescere su mezzo contenente neomicina e mediante PCR diagnostica che dimostri l'assenza del tratto pCasPP mentre si mantiene la cassetta HDR integrata nel cromosoma.
      NOTA: È necessario effettuare passaggi ripetuti per verificare la stabilità della modifica integrata ed eliminare i plasmidi episomiali residui.
  6. Selezione delle colonie GFP-positive
    1. Analizzare i transcongiuganti purificati per la fluorescenza della GFP e confrontarli con i controlli di M. ciceri selvatico seguendo il File Supplementare 3 (Passaggio 4.6).
    2. Selezionare le colonie fluorescenti come ceppi putativamente positivi per HDR.
    3. Classificare le colonie come GFP-positive se mostrano una fluorescenza verde uniforme e distinta, assente nelle colonie di M. ciceri selvatico quando esaminate con le stesse impostazioni del microscopio e condizioni di esposizione.
    4. Confermare le colonie GFP-positive mediante PCR diagnostica prima di procedere alla validazione successiva.
    5. Conservare le colonie confermate su agar mannosio lievito (YM) a 4°C per la manutenzione a breve termine o come stock glicerolati contenenti 20%–25% di glicerolo a −80°C per la conservazione a lungo termine.

5. Convalida dei mutanti nodC

  1. Convalida dell'integrazione di GFP nel locus nodC
    1. Inoculare un singolo ceppo esprimente GFP M. ciceri colonia in 10 mL di brodo di lievito e mannitolo (YMB) integrato con 100 µg/mL carbenicillina24. Incubare la coltura a 28°C con agitazione a 180 giri/min per 20–24 h.
    2. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 8.000 × g per 10 min a 25°C. Raccogliere il pellet cellulare e isolare il DNA genomico secondo Weerakkody et al.25.
    3. Eseguire una PCR diagnostica utilizzando il DNA genomico come stampo (Tabella 2). Preparare un 10 µL reazione PCR contenente 5 µL 2× PCR Master Mix, 0.2 µM Primers F1_nodB e nodC_R oppure primers F1_nodB e gfp_R, e 50 ng di DNA genomico.
    4. Programmare il termociclatore per una denaturazione iniziale a 95°C per 5 min, seguiti da 35 cicli di 95°C per 1 minuto, 62°C per 30 s, e 72°C per 45 s, con un'estensione finale a 72°C per 5 min.
    5. Separare i prodotti della PCR su un gel di agarosio al 1% (p/v) come descritto in precedenza. Confermare l'integrazione di GFP rilevando un prodotto di circa 430 pb nel tipo selvatico (WT) e un prodotto di circa 1500 pb nel mutante interrotto utilizzando i primer F1_nodB/nodC_R, e un prodotto di circa 1000 pb nel mutante (nessun prodotto nel WT) utilizzando i primer F1_nodB/gfp_R.
    6. Includere controlli appropriati durante la validazione della PCR. Utilizzare un DNA plasmidico contenente la sequenza bersaglio come controllo positivo e un controllo senza stampo (NTC) contenente acqua priva di nucleasi come controllo negativo.
  2. Quantificazione dell'espressione di GFP mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR)
    1. Isolare l'RNA totale da WT e mutante M. ciceri colture utilizzando il reagente TRIzol seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Trattare l'RNA con DNasi I seguendo le istruzioni del produttore per rimuovere il DNA genomico contaminante. Verificare la completa rimozione del DNA utilizzando un controllo senza trascrittasi inversa (−RT) durante la qPCR.
    3. Sintetizzare il cDNA del primo filamento da 1 µg RNA totale utilizzando un kit commerciale per la sintesi del primo filamento di cDNA seguendo le istruzioni del produttore. Preparare un 20 µL reazione contenente RNA, primer oligo(dT), dNTP, tampone di reazione, inibitore della RNasi e trascrittasi inversa
    4. Incubare la reazione di sintesi del cDNA a 42°C per 60 min seguita da inattivazione termica a 70°C per 5 min. Conservare il cDNA a −20°C fino all'uso.
    5. Preparare le reazioni di RT-qPCR in triplicato tecnico. Assemblare 10 µL reazioni contenenti 5 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0.2 µM Primers BjGFP_BP_F1 e BjGFP_BP_R1 per l'amplificazione di GFP, oppure primers 16S_F1 e 16S_R1 per l'amplificazione del gene di riferimento (Tabella 2), 2 µL modello di cDNA (circa 20 ng) e acqua priva di nucleasi.
    6. Eseguire la RT-qPCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale a 95°C per 2 min, seguiti da 40 cicli di 95°C per 15 s e 58°C per 45 s, seguito da analisi della curva di denaturazione da 65°C a 95°C.
    7. Eseguire una qRT-PCR utilizzando un sistema di rilevamento in tempo reale Bio-Rad CFX96. Analizzare i tracciati di amplificazione, i valori Ct valori e curve di denaturazione utilizzando il software Bio-Rad CFX Manager.
    8. Calcolare l'espressione genica relativa utilizzando il metodo 2−ΔΔCt metodo. Normalizzare l'espressione rispetto al gene di riferimento 16S rRNA e utilizzare il WT M. ciceri utilizzare il ceppo come campione calibratore. Analizzare tre replicati biologici, ciascuno misurato in triplicato tecnico.
  3. Valutazione del Potenziale di Nodulazione
    1. Preparazione dell'inoculo batterico
      1. Inoculare singole colonie di ceppi WT e mutanti in YMB selettivo contenente 100 µg/mL carbenicillina. Incubare le colture a 28°C con agitazione a 180 giri/min per 30–36 h.
      2. Diluire le colture 1:100 in YMB selettivo fresco e monitorare la crescita misurando l'OD600 utilizzando uno spettrofotometro UV-Visibile. Azzerare lo strumento con YMB non inoculato e continuare l'incubazione fino a quando le colture raggiungono un OD600 compreso tra 0,3 e 0,4, corrispondente a circa 1 × 108 UFC/mL
      3. Utilizzare 3 mL della sospensione batterica standardizzata per l'inoculazione di ogni pianta.
    2. Saggio di Infezione della Pianta di Ceci
      1. Ottenere semi di C. arietinum cultivar BDG25618,24 dall'ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI), Nuova Delhi, India
      2. Lavare accuratamente i semi con acqua di rubinetto corrente, seguita da acqua purificata Milli-Q. Sterilizzare la superficie dei semi con ipoclorito di sodio al 1% per 5 minuti sotto agitazione, quindi risciacquare cinque volte con acqua purificata sterile.
      3. Trattare i semi con fungicida Bavistin allo 0,1% (polvere bagnabile al 50% di carbendazim) per 2–3 ore a temperatura ambiente. Lavare i semi trattati due volte con acqua purificata sterile.
      4. Posizionare i semi su carta filtrante sterile e umida in piastre di Petri sterili (110 mm) × 40 mm), sigillare con Parafilm e incubare al buio a 28°C ± 2°C per 3 giorni.
      5. Trasferire individualmente le piantine germinate nella sabbia sterile. Sterilizzare la sabbia a 121°C e 15 psi per 20 min prima dell'uso.
      6. Preparare la soluzione nutritiva priva di azoto di McKnight sciogliendo 6,0 g di CaSO₄, 1,0 g di MgSO₄₄·7H₂O, 1,0 g KH₂PO₄, 1,5 g di KCl, 14,3 mg di H₃BO₃, 0,4 mg di CuSO₄₄·5H₂O, 0,08 mg di MnSO₄₄·4H₂O, 0,45 mg H₂MoO₄e 1,1 mg di ZnSO₄₄·7H₂O in acqua distillata sterile fino a un volume finale di 5 L.
      7. Coltivare le piantine in vasi di 10 cm di diametro contenenti sabbia sterile, mantenendo quattro piante per vaso. Irrigare ogni vaso due volte alla settimana con 20 mL di soluzione di McKnight priva di azoto.
      8. Mantenere le piante in condizioni controllate di 22°C ± 2°C (giorno), 18°C ± 2°C (notte), umidità relativa del 55%–60%, fotoperiodo di 16 h di luce e 8 h di buio, e intensità luminosa di 200 µmol fotoni m⁻2 s⁻1. Coltivare le piantine per 6-7 giorni prima dell'inoculazione.
      9. Applicare direttamente 3 mL di sospensione batterica a ciascun seme germogliato. Mantenere i controlli trattati con soluzione fittizia applicando 3 mL di YMB sterile. Utilizzare 16 piante come repliche biologiche per ciascun gruppo di trattamento.
      10. Raccogliere radici e germogli 20 giorni dopo l'inoculazione. Contare manualmente i noduli e registrare immediatamente la biomassa fresca dopo il raccolto.
      11. Tessuti secchi a 65°C fino al raggiungimento di un peso costante. Definire peso costante come due misurazioni consecutive ottenute dopo intervalli di essiccazione di 24 h che differiscano tra loro di <0,01 g, quindi registrare la biomassa secca.
      12. Esprimere i risultati come media ± errore standard (SE). Eseguire un'ANOVA ad un fattore seguita dal test di confronto multiplo di Tukey utilizzando GraphPad Prism versione 10.0, considerando P < 0,05 statisticamente significativo.
        NOTA: Mantenere condizioni sterili durante tutta la sterilizzazione dei semi, la germinazione, l'inoculazione e la crescita delle piante.
        ATTENZIONE: Manipolare le soluzioni di ipoclorito di sodio e fungicida utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti e protezione oculare.

Risultati

In questo protocollo, la modifica del genoma mediante CRISPR-Cas9 è stata adattata per M. ciceri CC1192 mirando il locus nodC. Per favorire la perdita di funzione, sono state progettate sgRNA per bersagliare la regione prossimale 5′ della sequenza codificante di nodC, introducendo così un DSB nella regione iniziale del codice per interrompere la traduzione della proteina codificata (Figura 1A).

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Figura 1. Progettazione di RNA guida singoli (sgRNA) mirati al nodC locus in Mesorhizobium ciceri. (A) Rappresentazione schematica del M. ciceri nodC locus che mostra le posizioni dei due sgRNA di 20 bp progettati per il targeting mediato da CRISPR-Cas9. I siti bersaglio degli sgRNA sono indicati in blu. (B) Sequenze nucleotidiche di sgRNA1 e sgRNA2 mirate al nodC locus. Il motivo del protospacer adiacente (PAM; 5′-NGG-3′) è indicato in rosso, e il nodC il codone di inizio della traduzione (ATG) è evidenziato in giallo Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Due sequenze bersaglio di 20 bp sono state identificate immediatamente a monte di un 5′-NGG-3′ sequenza PAM (Figura 1B). Analisi in silico di questi sgRNA candidati mediante l'algoritmo di Hsu et al.19 hanno prodotto punteggi di specificità pari a 100, indicando un'elevata specificità predetta del bersaglio, senza rilevare complementarità significative fuori bersaglio all'interno del M. ciceri genoma. Sono state osservate lievi differenze nei punteggi di efficienza prevista in-target degli sgRNA selezionati (Tabella 3), che ha orientato la selezione delle guide per la successiva valutazione sperimentale.

Posizione bersaglio
(bp)		FiloSequenza sgRNA (5′ figure-results-2 3′)PAMPunteggio di specificitàPunteggio di efficienza
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

Tabella 3: RNA guida singoli (sgRNA) candidati progettati per la modifica del gene nodC in Mesorhizobium ciceri mediante CRISPR-Cas9. Gli sgRNA candidati sono stati progettati utilizzando lo strumento di progettazione guide CRISPR di Benchling, con il genoma di riferimento di Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110. Le guide sono state ordinate in base ai punteggi predetti di specificità ed efficienza sul bersaglio, e sono state selezionate quelle che mirano a sequenze adiacenti al codone di inizio traduzionale di nodC e che contengono il motivo protospaziatore adiacente (PAM) NGG richiesto per la Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9).

Per facilitare la ricombinazione omologa (HDR) e lo screening basato sulla fluorescenza di mutanti putativi, è stata assemblata una cassetta HDR utilizzando il vettore di clonaggio pUC18 (Figura 2). La cassetta reporter gfp è stata escissa da pRJPaph-bjGFP mediante digestione di restrizione con SacI e KpnI ed inserita per ligazione nel vettore lineare pUC18 (Figura 2A). Dopo la trasformazione in E. coli, i cloni positivi putativi sono stati identificati mediante screening bianco-blu. L'inserzione del frammento gfp nel vettore pUC18 è stata ulteriormente confermata mediante amplificazione PCR utilizzando primer specifici per il gene, che hanno prodotto l'amplicone previsto di 500 bp nei cloni positivi (Figura 2A).

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Figura 2. Costruzione del sistema di riparazione guidata da omologia CRISPR-Cas9 (HDR) per l'interruzione di nodC. (A) Costruzione e convalida del plasmide intermedio pUC18-gfp. Il pannello superiore mostra la mappa del plasmide pUC18-gfp ottenuta inserendo il cassetto della proteina fluorescente verde (gfp) nel vettore pUC18. Il pannello centrale mostra colonie rappresentative dopo lo screening bianco-blu. Il pannello inferiore mostra la convalida mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando la coppia di primer BjGFP_BP_F1 e BjGFP_BP_R2. (B) Assemblaggio sequenziale del modello HDR nel vettore pUC18. Le mappe plasmidiche e le analisi di digestione con enzimi di restrizione confermano l'inserimento del braccio di omologia upstream (UHA), del braccio di omologia downstream (DHA) e dell'intero cassetto UHA-gfp-DHA per l'HDR. (C) Clonaggio e convalida del cassetto UHA-gfp-DHA per l'HDR nel vettore CRISPR-Cas9 pCasPP. Il pannello superiore mostra la mappa finale del plasmide pCasPP-HDR, mentre il pannello inferiore mostra la digestione con enzimi di restrizione che conferma l'inserimento del cassetto HDR. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il costrutto HDR è stato successivamente assemblato introducendo bracci di omologia nodC che delimitano il cassetto gfp. Un UHA di 500 bp e un DHA di 400 bp, posizionati adiacenti al sito di scissione previsto per Cas9, sono stati clonati in modo sequenziale nel costrutto pUC18-gfp mediante digestione con enzimi di restrizione e ligazione (Figura 2B). L'assemblaggio del cassetto UHA-gfp-DHA è stato confermato tramite analisi di digestione con enzimi di restrizione, che ha prodotto il frammento previsto di 2012 bp (Figura 2B). Il cassetto HDR completo è stato quindi sottoclontato nel vettore CRISPR a ampio spettro di ospite pCasPP (Figura 2C). L'analisi di digestione con enzimi di restrizione ha confermato l'integrità del costrutto finale e l'assemblaggio corretto del vettore di consegna per la modifica del genoma di M. ciceri (Figura 2C).

L'incrocio biparentale è stato eseguito tra il donatore E. coli S17-1λpir e il ceppo ricevente M. ciceri per trasferire il costrutto pCasPP-gRNA-HDR in M. ciceri (Figura 3A). Figura 3B illustra l'organizzazione dell'operone nod e la sostituzione prevista del locus nodC mediante il cassetta gfp attraverso ricombinazione omologa utilizzando il modello HDR. Le colonie transcongiuganti sono state inizialmente identificate mediante screening della fluorescenza GFP dopo l'incrocio biparentale (Figura 3B e 3C). Oltre l'80% delle colonie isolate ha mostrato fluorescenza GFP con gRNA2, e oltre il 65% delle colonie ha mostrato fluorescenza dopo l'introduzione di gRNA1 (Figura 3C). Poiché lo screening della fluorescenza da solo non può distinguere l'espressione di GFP portata da un plasmide dall'integrazione genomica riuscita, è stata effettuata una validazione molecolare successiva per confermare l'inserzione specifica del cassetta reporter nel locus.

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Figura 3. Interruzione mediata da CRISPR-Cas9 del locus nodC in Mesorhizobium ciceri. (A) Illustrazione schematica dell'incrocio biparentale utilizzato per trasferire il costrutto pCasPP-gRNA-HDR da cellule donatrici Escherichia coli S17-1λpir a cellule riceventi M. ciceri. (B) Diagramma che illustra la sostituzione mediata da riparazione diretta tramite omologia (HDR) del locus nodC con la cassetta gfp a seguito del taglio da parte di CRISPR-Cas9. Il modello HDR contiene bracci di omologia di circa 500 bp a monte e 400 bp a valle che delimitano la cassetta gfp. (C) Screening basato sulla fluorescenza delle colonie di M. ciceri transconjuganti. Vengono mostrate immagini rappresentative ottenute mediante stereomicroscopia in fluorescenza e in campo chiaro di colonie positive per GFP, insieme alla percentuale di transconjuganti fluorescenti isolati dopo l'incrocio biparentale utilizzando costrutti contenenti sgRNA1 o sgRNA2. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per validare l'integrazione del cassetto gfp nel locus nodC, colonie rappresentative positive per GFP sono state sottoposte ad analisi PCR. L'amplificazione della regione genomica compresa tra nodB e nodC ha prodotto un frammento di 1511 bp nei cloni modificati, coerente con l'integrazione del cassetto reporter, mentre il ceppo selvatico (WT) ha prodotto un amplicone di 430 bp (Figura 4A). L'amplificazione PCR utilizzando primer specifici per gfp e primer adiacenti a nodC ha generato un frammento distinto di 997 bp nei cloni modificati, mentre nessuna amplificazione è stata rilevata nel controllo WT, confermando l'inserzione specifica per locus. L'orientamento del cassetto reporter è stato confermato mediante sequenziamento di Sanger. Inoltre, l'espressione di GFP nei ceppi modificati è stata valutata mediante RT-qPCR, che ha dimostrato un accumulo aumentato di trascritti GFP rispetto al ceppo WT (Figura 4B). I valori di espressione sono stati calcolati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt e normalizzati al gene di riferimento 16s, con il ceppo WT come controllo. I dati rappresentano la media ± DS di tre replicati biologici (n = 3). La significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA ad un fattore seguita dal test di Dunnett rispetto al controllo WT.

L'attuale limite dello studio è l'assenza di un vettore di controllo, come un pCasPP-HDR con gRNA vuoto, per stabilire il coefficiente di ricombinazione di base. Studi futuri dovrebbero includere un simile controllo.

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Figura 4. Convalida molecolare dei mutanti ΔnodC Mesorhizobium ciceri. (A) Conferma basata sulla PCR dell'interruzione di nodC. Il pannello sinistro mostra l'amplificazione utilizzando la coppia di primer F1_nodB e nodC_R. Linea M, scala di DNA; linee 1–4, mutanti ΔnodC M. ciceri; linea WT, M. ciceri di tipo selvatico. Il pannello destro mostra l'amplificazione utilizzando la coppia di primer F1_nodB e gfp_R. Linea M, scala di DNA; linee 1–4, mutanti ΔnodC M. ciceri; linea WT, M. ciceri di tipo selvatico. Le dimensioni attese degli ampliconi sono indicate. (B) Espressione relativa della proteina verde fluorescente (GFP) nei mutanti ΔnodC M. ciceri determinata mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa (RT-qPCR). L'espressione genica è stata normalizzata rispetto al gene di riferimento dell'RNA ribosomiale 16S (16S rRNA) di M. ciceri ed espressa in rapporto al controllo di tipo selvatico (WT) utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La significatività statistica è stata determinata in confronto al controllo WT. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'impatto biologico di nodC la rottura è stata valutata mediante saggi di infezione su ceci. Piante inoculate con ceppo selvatico M. ciceri formavano noduli radicali visibili, mentre le piante inoculate con ΔnodC M. ciceri hanno mostrato una riduzione evidente o l'assenza di nodulazione (Figura 5A). Le piante del controllo non inoculato sono rimaste prive di noduli, a conferma del mantenimento delle condizioni sperimentali sterili (Figura 5A). L'analisi quantitativa dei parametri della crescita vegetale ha ulteriormente evidenziato differenze tra WT e ΔnodC M. ciceripiante inoculate, inclusi lunghezza radicale, peso fresco della radice, peso secco della radice, lunghezza della parte aerea, peso fresco della parte aerea, peso secco della parte aerea e numero di noduli (Figura 5B). Le piante inoculate con ceppi selvatici hanno mostrato un numero maggiore di noduli e parametri associati alla crescita migliorati rispetto a ΔnodC M. ciceripiante di controllo inoculate e non inoculate. Questi risultati sono coerenti con un'interruzione del nodC-associata alla nodulazione e supportano l'applicabilità di questo flusso di lavoro basato su CRISPR-Cas9 per studi di genomica funzionale in M. ciceri. I dati quantitativi relativi al fenotipo vegetale sono stati valutati per confrontare le differenze tra i gruppi sottoposti a trattamento. Un totale di 90 repliche biologiche è stato incluso nell'analisi (n = 30 piante per gruppo di trattamento). I dati sono presentati come media ± SD. La significatività statistica è stata valutata mediante analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. Le differenze sono state considerate statisticamente significative per P < 0.05.

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Figura 5. Convalida funzionale di mutanti ΔnodC Mesorhizobium ciceri mediante un saggio di infezione su ceci. (A) Piante rappresentative di cece (Cicer arietinum) a 20 giorni dall'inoculazione con M. ciceri di tipo selvatico, ΔnodC M. ciceri o controlli non inoculati. (B) Analisi quantitativa dei parametri di crescita e nodulazione delle piante, inclusi la lunghezza delle radici, il peso fresco delle radici, il peso secco delle radici, la lunghezza della parte aerea, il peso fresco della parte aerea, il peso secco della parte aerea e il numero di noduli. I dati sono riportati per piante inoculate con M. ciceri di tipo selvatico, ΔnodC M. ciceri o controlli non inoculati. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La significatività statistica è stata determinata mediante analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1. Protocollo dettagliato per la preparazione e la validazione di cellule di Escherichia coli chimicamente competenti. Questo file supplementare fornisce la procedura completa per la preparazione e la validazione di cellule di Escherichia coli DH5α e di E. coli S17-1λpir chimicamente competenti, inclusa la preparazione della coltura batterica, l'induzione della competenza, il recupero cellulare, il lavaggio con tampone CaCl₂–glicerolo, l'allestimento di aliquote, la criopreservazione e la validazione mediante test di efficienza di trasformazione. Sono inoltre inclusi misure critiche di controllo qualità, raccomandazioni per lo stoccaggio e criteri di accettazione della competenza. Cliccare qui per scaricare il file.

File supplementare 2. Protocollo dettagliato per la costruzione di modelli di riparazione guidata da omologia (HDR) e l'assemblaggio di vettori per la modifica del genoma mediante CRISPR-Cas9. Questo file supplementare fornisce procedure dettagliate per l'escissione del cassetta della proteina fluorescente verde (GFP), la costruzione del plasmide intermedio pUC18-gfp, l'amplificazione e il clonaggio dei bracci di omologia a monte e a valle, l'assemblaggio del modello completo di riparazione guidata da omologia (HDR), la preparazione dei vettori pCasPP-RNA guida (gRNA), l'inserimento dei modelli HDR nei plasmidi CRISPR-Cas9, lo screening dei cloni basato sulla fluorescenza e la validazione dei plasmidi ricombinanti mediante analisi con enzimi di restrizione e sequenziamento di Sanger. Cliccare qui per scaricare questo file.

File Supplementare 3. Protocollo dettagliato per l'incrocio biparentale e la generazione di transconuganti di Mesorhizobium ciceri marcati con GFP. Questo file supplementare descrive la preparazione dei ceppi donatori e ricettori, l'incrocio biparentale su filtro membrana, il recupero e la selezione antibiotica dei transconuganti, le procedure di eliminazione del plasmide, lo screening basato sulla fluorescenza delle colonie ricombinanti, la conferma molecolare dei ceppi modificati a livello genomico e la conservazione a breve e a lungo termine dei transconuganti di M. ciceri positivi al GFP. Vengono fornite informazioni dettagliate sulle condizioni di coltura, sui parametri di incrocio e sulle procedure di selezione. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

L'istaurazione di un sistema di editing genomico CRISPR-Cas9 in M. ciceri affronta una limitazione tecnica fondamentale nella manipolazione genetica di questo simbionte fissatore di azoto, di importante rilevanza agricola. Interrompendo il locus nodC mediante un reporter gfp e la riparazione mediante ricombinazione omologa (HDR), questo protocollo fornisce un approccio assistito da fluorescenza per la modifica genomica mirata in M. ciceri.

I tradizionali approcci di manipolazione genetica nei rizobi si sono basati principalmente sulla mutagenesi casuale mediata da Tn5 o sullo scambio allelico mediato da sacB19,26,27. Sebbene questi approcci rimangano validi, sono laboriosi, spesso richiedono più cicli di contro-selezione e possono lasciare marcatori di resistenza agli antibiotici all'interno del genoma, complicando ulteriori round di modifica. Al contrario, la modifica del genoma mediata da CRISPR-Cas9 offre un'alternativa più mirata ed efficiente per l'ingegneria genomica. Studi recenti hanno riportato l'uso di sistemi basati su CRISPR per la modifica di basi e su Cas12e in S. meliloti al fine di ridurre la tossicità associata a Cas912,13, mentre la repressione trascrizionale mediata da dCas9 è stata esplorata in R. etli11. Per quanto ne sappiamo, questo studio rappresenta una delle prime applicazioni della perturbazione cromosomica mediata da CRISPR-Cas9 in M. ciceri. Il protocollo incorpora un indirizzamento guidato da sgRNA, il trasferimento del plasmide mediante doppia parentale e la ricombinazione mediata da HDR per una modifica specifica del locus. L'integrazione del reporter gfp all'interno del cassetto HDR facilita inoltre uno screening rapido basato sulla fluorescenza delle colonie potenzialmente modificate, riducendo così il numero di colonie che richiedono una successiva validazione molecolare.

Diversi fattori sono stati importanti per l'implementazione con successo del flusso di lavoro. La selezione di sgRNA con elevata specificità predetta ha ridotto al minimo gli effetti fuori bersaglio potenziali all'interno del genoma di M. ciceri, mentre il mantenimento dell'integrità dei bracci di omologia ha favorito l'efficienza della ricombinazione mediata da HDR. Inoltre, l'ottimizzazione delle condizioni di crescita del donatore e del ricevente durante l'incrocio biparentale ha migliorato il recupero dei transconjuganti. Lo screening basato sulla fluorescenza ha permesso l'identificazione rapida di mutanti putativi; tuttavia, la validazione molecolare mediante PCR e sequenziamento di Sanger è stata comunque necessaria per confermare l'integrazione specifica del cassetta reporter a livello del locus. Studi futuri potrebbero utilizzare un vettore controllo pCasPP-HDR con gRNA vuoto per quantificare il coefficiente di ricombinazione di base.

Oltre ai progressi metodologici, questa piattaforma potrebbe supportare futuri studi volti a indagare la segnalazione simbiotica e la genomica funzionale nei rizobi associati al ceci28. Ceci (Cicer arietinum L.) rappresenta una coltura leguminosa di importanza globale e un contributo fondamentale per sistemi agricoli sostenibili29,30. Il ΔnodC M. ciceri Il ceppo generato in questo studio fornisce un background genetico potenzialmente utile per lo studio della compatibilità ospite-microbo e delle vie di segnalazione associate alla nodulazione. Studi precedenti hanno suggerito che gli RNA di piccole dimensioni (sRNA) svolgono la funzione di effettori regolatori durante la simbiosi iniziale del nodulo radicale.31Di conseguenza, la nodulazione-deficiente ΔnodC M. ciceri Il ceppo descritto in questo studio potrebbe facilitare futuri studi incentrati sui meccanismi molecolari alla base della comunicazione rizosferica e della simbiosi fissatrice di azoto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto o conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT) tramite la borsa MK Bhan HRD-16016/15/2023-AFS-DBT assegnata alla dott.ssa Nandita Pasari. Il lavoro è inoltre sostenuto da una borsa fondamentale assegnata al dott. Senjuti Sinharoy dall'Istituto Nazionale di Ricerca sul Genoma delle Piante, Nuova Delhi, India.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioGenetixPG-40005Elettroforesi su gel
Foglio di alluminioRolia’sGF83048115Uso generale in laboratorio
Agar batteriologicoHiMediaGRM026Preparazione di terreni
Piattaforma per la progettazione di guide CRISPR BenchlingBenchlingN/AProgettazione di RNA guida
Acido boricoHiMediaPCT0102Preparazione della soluzione di McKnight’s
Beuta conica in vetro borosilicatoSigmaCLS5100500Preparazione di colture
Tubi in vetro borosilicatoSigmaDWK73500-1075Preparazione di colture
Cloruro di calcio diidratoHiMediaMB034Preparazione di cellule competenti
Solfato di calcio diidratoHiMediaGRM328Preparazione della soluzione di McKnight’s
Carbenicillina disodicaDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18Utilizzata a 100 µg/mL
Kit per la sintesi di cDNAThermo Fisher ScientificAB1543ASintesi di cDNA
Pellicola trasparenteOA10954049Uso generale in laboratorio
Kit di clonaggio/T4 DNA ligasiThermo Fisher ScientificK1422Reazioni di ligazione
Rosso CongoHiMedia573-58-0Lavorazione di colture microbiche
Pentaidrato di solfato di rame(II)HiMediaPCT0104Preparazione della soluzione di McKnight’s
Tubo per coltureBorosil9800U08Coltivazione di colture batteriche primarie; 15 cm × 2,5 cm
Phmetro digitaleEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSRegolazione del pH
Fosfato bicalicoHiMediaTC596MPreparazione di YMB
Scala molecolare per DNABIO-HELIXDM015-R500Elettroforesi su gel
Kit per l'eliminazione della DNasiInvitrogenAM1907Rimozione del DNA dall'RNA isolato
Mix di dNTPThermo ScientificR0181Amplificazione PCR
EtileneSigma-Aldrich1.00983.0511Utilizzato al 75%
Bromuro di etidioSigma-AldrichE1510Colorazione del DNA su gel
Fosfatasi alcalina termosensibile FastAPThermo Fisher ScientificEF0651Deposforilazione del vettore durante il clonaggio
Buffer FastDigestThermo Fisher ScientificB64Digestione con enzimi di restrizione
Cloruro ferrico anidroHiMediaTC583Preparazione della soluzione di McKnight’s
Stereo microscopio a fluorescenzaNikonSMZ25Selezione di GFP
Fungicida, BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WPTrattamento dei semi
Kit per estrazione da gelQIAGEN28704Purificazione del DNA
GliceroloThermo Fisher ScientificQ24505Cellule competenti/banche di glicerolo
Incubatore con agitatore orbitaleMRCLOM-150Coltura batterica
Guanti monousoKimtech97612Equipaggiamento di protezione individuale
HEPESHiMediaMB016Appaiamento di oligonucleotidi
IPTGG BiosciencesRC1113DSelezione bianco-blu
Cappa a flusso laminareBiolinkBL-H1300Manipolazione sterile
Agar LBHiMediaM1151Piastre per colture batteriche
Brodo LBHiMediaG1245Coltura batterica
Solfato di magnesioHiMediaGRM1281-500GPreparazione di YMB
Solfato eptaidrato di magnesioHiMediaPCT0008Preparazione della soluzione di McKnight’s
Tetraidrato di solfato di manganese(II)Sigma-AldrichM3634Preparazione della soluzione di McKnight’s
MannitoloHiMediaMB198Preparazione di YMB
Soluzione di McKnight’sPreparata in laboratorioN/ASoluzione nutritiva per piante
Punte micro, 0,2–10 µLTarsons521000Maneggiamento di liquidi
Punte micro, 2–200 µLTarsons521010Maneggiamento di liquidi
Punte micro, 200–1000 µLTarsons521020XManeggiamento di liquidi
Microprovette, 0,5 mLTarsons500000Maneggiamento del campione
Microprovette, 1,5 mLTarsons500010Maneggiamento del campione
Microprovette, 2,0 mLTarsons500020Maneggiamento del campione
Acido molibdicoSigma-Aldrich232084Preparazione della soluzione di McKnight’s
Spettrofotometro NanoDropThermo Fisher Scientific13-400-519Quantificazione di DNA/RNA
NeomicinaDuchefa BiochemieM0135Utilizzata a 50 µg/mL
Acqua priva di nucleasiHiMediaML064-100MLUso in biologia molecolare
Master mix PCRThermo Fisher ScientificK0171Master mix 2×
Strisce per provette PCR, 0,2 mLTarsons610040Impostazione della PCR
Piastre di Petri, 90 mmPSC2041Piastre con agar
Pipetta, 0,1–2,5 µLEppendorfN10178MManeggiamento di liquidi
Pipetta, 0,5–10 µLEppendorfH40069LManeggiamento di liquidi
Pipetta, 2–20 µLEppendorfH30046MManeggiamento di liquidi
Pipetta, 10–100 µLEppendorfI00395MManeggiamento di liquidi
Pipetta, 20–200 µLEppendorfM38186MManeggiamento di liquidi
Pipetta, 100–1000 µLEppendorfN20610MManeggiamento di liquidi
Kit per estrazione di DNA plasmidicoQIAGEN12143Isolamento di plasmidi
Cloruro di potassioHiMediaTC010Preparazione della soluzione di McKnight’s
Fosfato monopotassico anidroHiMediaTC011MPreparazione della soluzione di McKnight’s
Filtro in membrana PVDF, 0,22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700Accoppiamento biparentale
Apparecchio per PCR quantitativa in tempo realeBio-RadCFX96RT-qPCR
Centrifuga da banco refrigerataEppendorf04-987-373Raccolta delle cellule
Enzima di restrizione, BbsIThermo Fisher ScientificER1011Clonaggio di gRNA
Enzima di restrizione, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274Clonaggio
Enzima di restrizione, KpnIThermo Fisher ScientificFD0524Clonaggio
Enzima di restrizione, SacIThermo Fisher ScientificFD1133Clonaggio
Enzima di restrizione, XbaIThermo Fisher ScientificFD0684Clonaggio
DNasi priva di RNasiQIAGEN79254Purificazione dell'RNA
SabbiaRam SuratSandSubstrato per la crescita delle piante
SequenziatoreApplied BiosystemsABI3730xl DNA AnalyzerSequenziamento Sanger
Mezzo SOCPreparato in laboratorioN/ARipresa dopo trasformazione
Cloruro di sodioHiMediaTC046Preparazione di terreni
Idrossido di sodioHiMediaPCT1325Regolazione del pH di HEPES
Lama chirurgica sterileMedicare Surgical16020Escissione del gel/manipolazione dei tessuti
Siringa sterileHMD Dispovan10ml syringe without needleFiltrazione sterile
Filtro per siringa sterile, 0,22 µmMerck Millex Durapore12766842Sterilizzazione per filtrazione
Master mix SYBR GreenNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
TetraciclinaDuchefa BiochemieT01050Utilizzata a 5 µg/mL
Ciclatore termicoApplied BiosystemsA24811Amplificazione PCR
Rotolo di carta assorbenteRolia’s07AAECR4885K1ZTUso generale in laboratorio
Reagente TRIzolInvitrogen15596026Isolamento di RNA
Transilluminatore UVAnalytik JenaTW-43Visualizzazione del gel
Spettrofotometro UV-VisEppendorfD30Misurazione dell'OD600
Cuvette per spettrofotometro visibileEppendorf30079345Misurazione dell'OD600
Mixer vortexNeuationiSWIX-VTMiscelazione del campione
X-galG BiosciencesRC1233Selezione bianco-blu
Estratto di lievitoHiMediaRM668-500GPreparazione di terreni
Setteidrato di solfato di zincoSigma-AldrichZ0251Preparazione della soluzione di McKnight’s

Riferimenti

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