Articolo di ricerca

Deterioramento temporale della motilità dello spermatozoo e dell'integrità del DNA durante l'esposizione prolungata al seme

DOI:

10.3791/71515

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7 agosto 2026

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1University Hospitals Fertility Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La frammentazione del DNA spermatozoo è aumentata e la motilità è diminuita significativamente con l'esposizione prolungata al seme dopo l'eiaculazione. In 14 campioni normali, la frammentazione del DNA è aumentata del 5,5%, 11,5% e 16,1% rispettivamente a 1 ora, 2 ore e 4 ore, mentre la motilità è diminuita. Questi risultati supportano la minimizzazione dei ritardi nella raccolta e nella lavorazione del seme fuori sede.

Abstract

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La frammentazione del DNA spermatozoo è nota per essere dannosa per la qualità dello spermatozoo, il che può influire negativamente sui cicli della tecnologia di riproduzione assistita (ART). Esaminare la frammentazione del DNA spermatozoo (SDF) nel fluido seminale nel tempo può fornire una comprensione degli effetti dell'esposizione prolungata allo sperma sull'integrità del DNA spermatozoideo. In questo studio preliminare, è stato eseguito un saggio SDF in vari momenti per simulare le condizioni di raccolta del seme fuori sito utilizzando il saggio di dispersione della cromatina spermatozoida su 14 campioni di sperma normali. L'analisi statistica delle percentuali di frammentazione del DNA durante la durata del saggio ha mostrato che la prolungata stagnazione del fluido seminale dall'eiaculazione all'analisi del seme ha aumentato significativamente la frammentazione del DNA. La motilità media degli spermatozoi è stata significativamente ridotta del 7,4% a 1 ora, del 14,5% a 2 ore e del 18,7% a 4 ore, e la FDA media è aumentata significativamente del 5,5% a 1 ora, dell'11,5% a 2 ore e del 16,1% a 4 ore dopo la raccolta dello sperma. Questa diminuzione della qualità dello sperma nel tempo può influenzare i protocolli delle cliniche di fertilità quando si considerano la preparazione dello sperma per i cicli ART, specialmente quando la raccolta avviene fuori sede dal laboratorio andrologico. I laboratori potrebbero considerare di stabilire una soglia di tempo accettabile per la ricezione dello sperma dalla raccolta esterna.

Introduzione

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L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) identifica una persona su sei, ovvero il 17,5% della popolazione mondiale, come vivendo infertilità in qualche momento della lorovita. Circa il 20% dei casi di infertilità ha una diagnosi unica di infertilità maschile, con un ulteriore 30–40% dei casi che presenta fattore maschile come diagnosisecondaria 2. Anche negli uomini sani, i parametri seminali possono variare molto da individuo a individuo, incluse fluttuazioni di concentrazione, motilità, morfologia evitalità 3. Pertanto, è importante comprendere i fattori specifici che compromettono la fertilità maschile per fornire un trattamento adeguato in un contesto clinico.

Un ambito di ricerca in via di sviluppo riguarda l'effetto dell'integrità del DNA degli spermatozoi sui cicli 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Il manuale di laboratorio OMS per l'esame e l'elaborazione dello sperma umano, 5ª edizione, afferma che la frammentazione del DNA spermatozoideo (SDF) (tramite rotture a singolo o doppio filamento) può influenzare lo sviluppo embrionale, l'impianto e gli esiti dellagravidanza 14. Muriel et al. hanno effettuato un'analisi della SDF e hanno riscontrato che un aumento della SDF ha portato a una compromessa dei tassi di fecondazione, della qualità dell'embrione e dei tassi di impianto nei cicliART 10. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione di cosa causa la frammentazione del DNA.

Studi precedenti riportano che lo stress ossidativo può portare a una diminuzione della motilità degli spermatozoi, compromessa della produzione e funzione enzimatica e, cosa più significativa, danni alDNA 8. Tali danni al DNA possono includere, ma non si limitano a, delezioni geniche, traduzioni errate e SDF. Attualmente vengono utilizzati saghi SDF per valutare l'integrità del DNA degli spermatozoi. Sebbene gli studi abbiano correlato la crioconservazione, la gestione dei mezzi e lo stress ossidativo con SDF, si sa poco sull'SDF nel periodo dall'eiaculazioneall'analisi 4,5. Questo è un periodo critico nella vita del spermatozoo, data la crescente prevalenza di raccolte domestiche di sperma per la preparazione dello spermatozoo nei cicliART 15. Le riscossioni domiciliari sono diventate sempre più popolari durante la pandemia di COVID-19, poiché limitano il contatto diretto con il paziente e aumentano comfort e praticità. Tuttavia, non esistono linee guida specifiche che suggeriscano un tempo ottimale dall'eiaculazione all'analisi per le raccolte domiciliarie. Pertanto, l'obiettivo principale del nostro studio era capire se la SDF cambi nel tempo nel fluido seminale stagnante e se tali cambiamenti possano essere rilevanti per la gestione dei campioni ART.

Protocollo

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Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Consiglio di Revisione Istituzionale degli Ospedali Universitari (STUDY20201371). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio. Quattordici campioni di sperma sono stati selezionati da pazienti in un unico centro accademico di fertilità nel Nord-est dell'Ohio. Tutti i campioni analizzati in questo esperimento sono stati raccolti in loco nella nostra struttura. Il test di dispersione della cromatina spermatozoida è stato effettuato su campioni di sperma da un andrologo completamente formato, secondo le istruzioni del produttore, per minimizzare le variazioni interpersonali. Con questo kit, intatto, non fissato e lo sperma fresco veniva immerso in un microgel inerte di agarosio su un vetrino pretrattato e poi raffreddato a 4 °C per 5 minuti per solidificare il microgel. Un trattamento iniziale con acido è stato utilizzato per denaturare il DNA negli spermatozoi con DNA frammentato, e è stata applicata una soluzione tampone per la lisi per rimuovere le proteine nucleari. Dopo il lavaggio con acqua distillata, i vetrini venivano disidratati in soluzioni di etanolo classificate e asciugati all'aria. Quando visualizzati alla microscopia luce dopo la colorazione con le soluzioni di colorazione fornite dal kit, gli spermatozoi senza frammentazione hanno mostrato nucleoidi con un grande alone di dispersione (superiore a un terzo del diametro del nucleo), mentre gli spermatozoi con frammentazione hanno mostrato un piccolo alone (meno di 1/3 del diametro del nucleo) o l'assenza di halo. La percentuale di spermatozoi con frammentazione del DNA è stata calcolata come il numero di spermatozoi frammentati e degradati ed espressa in percentuale. Un totale di 300 spermatozoi sono stati conteggiati su un vetrino e sono stati classificati come con un alone di dispersione grande o medio o come assenza di un alone di dispersione. Questo conteggio è stato replicato due volte per valutare la variabilità tecnica, e i due conteggi sono stati mediati. La sensibilità diagnostica e la specificità del kit sono del 93%, e in ogni esperimento sono stati inclusi sia i controlli positivi che quelli negativi. I campioni di sperma sono stati valutati a 0, 1, 2 e 4 ore (0 h è stato definito come 15 minuti dopo il periodo di liquefazione a 37 °C) e sono stati mantenuti a temperatura ambiente (22–25 °C).

Un'ulteriore analisi di motilità è stata eseguita su ciascun campione a 0, 1, 2 e 4 ore. La valutazione della motilità è stata eseguita da un andrologo esperto tramite un protocollo di conteggio utilizzando una camera di conteggio usa e getta. Sono stati contati trecento spermatozoi mobili per griglia, e il conteggio è stato replicato due volte. Una concentrazione media di spermatozoi mobili è stata calcolata sulla base dei due conteggi replicati.

Analisi statistiche sono state effettuate utilizzando ANOVA a misure ripetute per confrontare ogni gruppo temporale. Quando è stato rilevato un effetto complessivo significativo, è stato applicato il test della differenza onestamente significativa (HSD) di Tukey per confronti a coppie post hoc. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le informazioni dettagliate sui materiali sono riassunte nella Tabella dei Materiali.

Risultati

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Per valutare l'impatto dell'esposizione prolungata allo sperma sulla motilità dello spermatozoo e sulla frammentazione del DNA, sono stati analizzati in totale 14 campioni di pazienti normozoospermici in quattro momenti di raccolta dopo la prelieva. I campioni analizzati sono stati considerati "normali" secondo i parametri di analisi del seme secondo la5ª edizione14 dell'OMS. Tutti i campioni sono stati raccolti in loco presso il nostro Centro di Fertilità per ottimizzare l'accuratezza dei parametri di analisi in ogni momento di tempo. L'età media dei pazienti era di 35,4 anni (24–45 anni). I risultati iniziali del parametro sperma del gruppo hanno fornito un volume medio di sperma di 3,7 mL, una concentrazione media di 42,2 milioni/mL, una motilità media del 46,9%, una morfologia normale media del 4% e globuli bianchi negativi per tutti i campioni secondo il test qualitativo (Tabella 1).

Nel tempo è stato osservato un progressivo calo della motilità degli spermatozoi. Rispetto alla base (0 h), la motilità media degli spermatozoi è diminuita del 7,4% (intervallo 3–16%) a 1 ora, 14,5% (intervallo 4–31%) a 2 ore e 18,7% (intervallo 8–37%) a 4 ore. La motilità degli spermatozoi è diminuita progressivamente nel tempo, dal 58,6% al punto di partenza al 42,5% dopo 4 ore di esposizione (Figura 1). Nel complesso, la riduzione della motilità tra i momenti temporali è stata statisticamente significativa (p = 0,0001585). Contemporaneamente, la SDF è aumentata significativamente con un'incubazione prolungata nel plasma seminale. La media SDF è aumentata dal 15,6% all'inizio al 21,1% a 1 ora, al 27,1% a 2 ore e al 31,7% a 4 ore. Rispetto alla linea di base, la SDF è aumentata di 5,5 punti percentuali (intervallo 4–8 punti percentuali) a 1 ora, 11,5 punti percentuali (intervallo 8–16 punti percentuali) a 2 ore e 16,1 punti percentuali (intervallo 13–22 punti percentuali) a 4 ore. Aumenti statisticamente significativi della SDF sono stati rilevati in tutti i momenti successivi rispetto alla linea di base, inclusi 1 h (p = 0,021129), 2 h (p < 0,00001) e 4 h (p = 0,000018) (Tabella 2).

DISPONIBILITÀ DEI DATI
I dati sulla motilità a livello di paziente e SDF utilizzati per l'analisi sono forniti nella Tabella Supplementare S1.

figure-results-1
Figura 1. Cambiamenti nella motilità dello spermatozoo nel tempo dopo l'eiaculazione. La motilità dello spermatozoo è stata valutata al punto di partenza e dopo 1 ora, 2 ore e 4 ore di esposizione al seme. La motilità è diminuita progressivamente con l'aumentare del tempo di esposizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ParametroMediaDeviazione standard
Età del paziente35,4 (intervallo, 24–45 anni)6.22
Volume di sperma3,7 mL2.18
Concentrazione42,2 milioni/mL33.45
Motilità46.9%18.77
Globuli bianchiNegativo (tutti)—
Morfologia4.0%0.77

Tabella 1: Caratteristiche seminali di base dei campioni dello studio. I parametri dello sperma sono stati registrati dopo la liquefazione e prima della valutazione temporanea della frammentazione e motilità del DNA spermatozoideo.

Tempo0 h1 h2 h4 h
Riduzione media della motilità degli spermatozoi da 0 h*—-7.4%-14.5%-18.7%
SDF media15.6%21.1%27.1%31.7%
Deviazione standard5.28%5.27%5.31%4.80%
Valore p vs. 0 h—p = 0,021129p < 0,00001p = 0,000018
*ANOVA a misure ripetute con confronti post hoc di Tukey HSD.

Tabella 2: Cambiamenti dipendenti dal tempo nella frammentazione e motilità del DNA dello spermatozoo. La frammentazione e la motilità del DNA spermatozoo sono state valutate al momento iniziale e dopo 1 ora, 2 ore e 4 ore di esposizione al seme. I valori sono presentati come riportati dagli autori, con confronti statistici effettuati rispetto alla linea di base.

Tabella supplementare S1. Differenza di motilità degli spermatozoi a livello di paziente e valori di frammentazione del DNA spermatozoo. I valori sono espressi come proporzioni; moltiplica per 100 per convertire in percentuali. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Nei campioni inclusi in questo esperimento, la SDF è aumentata nel tempo, mentre la motilità è diminuita nello stesso periodo. Ciò suggerisce che l'integrità del DNA dello spermatozoo possa diminuire quando il liquido seminale rimane stagnante per periodi più lunghi tra l'eiaculazione e l'analisi o l'elaborazione. Aumentare il tempo in cui i campioni sono rimasti stagnanti prima dell'analisi può aver aumentato l'esposizione a condizioni associate allo stress ossidativo. Come già discusso, lo stress ossidativo può essere dannoso per la qualità del DNA dello spermatozoo, portando a alti livelli di frammentazionedel DNA 6,8,13. I risultati di questo studio potrebbero influenzare la gestione dello sperma nei cicli ART.

Innanzitutto, potrebbe essere utile per le cliniche aggiungere questo test ai parametri tradizionali di analisi dello sperma per garantire la qualità del DNA spermatozoideo prima di utilizzare lo spermatozoo nei cicli ART. L'ottimizzazione della qualità dello spermatozoo può essere associata a risultati migliorati, come un numero maggiore di embrioni congelati, tassi di euploidia più elevati e tassi più alti di gravidanze positive e nascite vive, come riportato in studiprecedenti 16.

In secondo luogo, questi risultati forniscono una panoramica sugli effetti della raccolta domestica di sperma sugli esiti ART. Durante la pandemia di COVID-19, molte cliniche hanno iniziato a utilizzare la raccolta domestica del seme come opzione più sicura per i pazienti15, 17. Con l'inizio di questo cambiamento negli studi, ai pazienti è stata data l'opportunità non solo di ridurre l'esposizione al COVID, ma anche di effettuare la raccolta nella privacy delle proprie case. Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che questi cambiamenti nella pratica potrebbero comportare compromessi legati alla qualità dello spermatozoo e potenzialmente agli esiti dell'ART.

Studi precedenti sui kit di raccolta domiciliare hanno mostrato grandi fluttuazioni nei risultati dell'analisi dello sperma per uomini con diagnosi di fattori maschili diversi e per uomini che tipicamente producono campioni di sperma "normali" 18. Questa fluttuazione può essere dovuta alla stagnazione dello sperma durante il trasporto da casa alla clinica, specialmente durante la spedizione di campioni di sperma durante la notte in alcuni casi. Altri studi supportano il nostro risultato secondo cui la SDF aumenta rapidamente nelle prime 3–4 ore di incubazione con il 5% di CO2 a 37 °C dopo la preparazione dello spermatozoo, sia nello spermatozoo19 congelato/scongelato sia in quello fresco20, suggerendo che lo sperma dovrebbe essere usato il più rapidamente possibile dopo la preparazione per l'ART.

Kerdtawee et al. hanno effettuato una meta-analisi dell'effetto della posizione della raccolta dello sperma sui parametri dello sperma e sugli esiti di fertilità. Sebbene non abbiano mostrato differenze significative tra i campioni raccolti a casa e quelli in clinica, hanno comunque evidenziato un'eterogeneità significativa tra gli studi analizzati, la maggior parte dei quali erano studiosservazionali 16. È importante notare che questi studi non avevano nemmeno una tempistica controllata su quando i campioni raccolti a casa dovessero essere restituiti alle cliniche e analizzati. I dati analizzati in questo studio, tuttavia, hanno permesso un'analisi controllata della frammentazione del DNA su diversi punti temporali, garantendo maggiore precisione e coerenza nei risultati sperimentali.

Sebbene la raccolta domiciliare possa essere un'opzione per alcuni pazienti, comprendere il tasso di SDF può aiutare a sviluppare linee guida per identificare i pazienti per i quali la raccolta domiciliare può essere dannosa per gli esiti ART. Una revisione sistematica e una meta-analisi di Christoforaki et al. hanno rilevato che il potenziale di riduzione ossidativa nel liquido seminale influisce negativamente sull'infertilitàmaschile 21. I parametri analizzati includono concentrazione di spermatozoi, conteggio, motilità e morfologia, tutti sfavorevolmente influenzati da un potenziale di riduzione ossidativa più elevato, dimostrando che la qualità degli spermatozoi può essere influenzata dallo stress ossidativo.

I punti di forza di questo studio includono la sua novità, poiché pochi studi hanno valutato le variazioni SDF dipendenti dal tempo durante un'esposizione prolungata al fluido seminale. Questo studio è stato condotto anche in un contesto controllato con un gruppo relativamente omogeneo di uomini senza patologie seminali sottostanti. Tuttavia, questo studio è stato limitato a un campione ridotto di 14 pazienti. Ulteriori esperimenti dovrebbero essere completati per massimizzare la fiducia nei dati raccolti e nelle osservazioni conclusive.

Ulteriori ricerche dovrebbero anche indagare variabili che potrebbero influenzare i tassi di SDF, in particolare per comprendere meglio i fattori che contribuiscono al mantenimento della qualità dello spermatozoo. Alcuni fattori da considerare includono, ma non si limitano a, la gestione dei mezzi utilizzati durante la preparazione dello spermatozoo, la temperatura delle condizioni di trasporto da casa alla clinica, i metodi di crioconservazione e le condizioni preesistenti dei pazienti maschi. Ottenere una comprensione completa dei fattori che contribuiscono alla SDF permetterà infine alle cliniche di ottimizzare le proprie linee guida e di informare meglio le loro decisioni nell'istituire i protocolli per il trattamento dei pazienti che ricevono ART.

Il deterioramento osservato della qualità dello spermatozoo ha mostrato un chiaro schema dipendente dal tempo, caratterizzato da una diminuzione della motilità e dall'aumento della frammentazione del DNA durante l'esposizione prolungata al fluido seminale. In particolare, il deterioramento più marcato si è verificato dopo 2–4 ore di conservazione, quando la SDF ha superato il 30% e la motilità è diminuita di quasi un quinto rispetto alla linea basale. Questi risultati indicano che i ritardi tra l'eiaculazione e l'elaborazione dello sperma possono influire negativamente sull'integrità funzionale degli spermatozoi e sostengono l'importanza di minimizzare i tempi di trasporto e manipolazione dei campioni raccolti fuori sede per le procedure di tecnologia riproduttiva assistita. I laboratori di Andrologia possono considerare di stabilire e comunicare ai pazienti una soglia di tempo accettabile per la ricezione dello sperma proveniente da una raccolta esterna, specialmente nel contesto della preparazione per IUI o IVF. Il tempo dall'eiaculazione all'analisi e/o preparazione dello sperma dovrebbe essere considerato per la SDF, specialmente quando la raccolta avviene fuori sede dal laboratorio andrologico per l'ART.

A causa dei limiti del piccolo campione di questo studio, gli studi futuri dovrebbero valutare l'effetto dell'esposizione prolungata al seme sulla SDF in una gamma più ampia di categorie di qualità del seme, inclusi campioni di uomini con parametri seminali anomali. Inoltre, sono necessari studi controllati randomizzati prospettici per determinare se gli aumenti dipendenti dal tempo nella SDF si traducano in differenze clinicamente significative negli esiti ART, inclusi fecondazione, sviluppo embrionale, impianto, gravidanza, aborto spontaneo e tassi di nascita viva.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ANOVA CalculatorStatistics KingdomAnalisi statistica
https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2HalotechHT-HSG2Kit diagnostico in vitro per la misurazione della frammentazione del DNA spermatico
https://halotechdna.com/it/producto/halosperm-g2/
MicrocellVitrolife15423Camera di conteggio monouso per l'analisi dello sperma
https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Controllo di qualità per strisce di test WBC/pHMedical Electronic SystemsA-CA-01752-00Controllo positivo e negativo per le strisce di test QwikCheck WBC
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
Strisce di reattivo per test QwikCheck WBC/pHMedical Electronic Systems0700Determinazione dei leucociti (WBC) nello sperma
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/

Riferimenti

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