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Articolo di ricerca
La frammentazione del DNA spermatozoo è aumentata e la motilità è diminuita significativamente con l'esposizione prolungata al seme dopo l'eiaculazione. In 14 campioni normali, la frammentazione del DNA è aumentata del 5,5%, 11,5% e 16,1% rispettivamente a 1 ora, 2 ore e 4 ore, mentre la motilità è diminuita. Questi risultati supportano la minimizzazione dei ritardi nella raccolta e nella lavorazione del seme fuori sede.
La frammentazione del DNA spermatozoo è nota per essere dannosa per la qualità dello spermatozoo, il che può influire negativamente sui cicli della tecnologia di riproduzione assistita (ART). Esaminare la frammentazione del DNA spermatozoo (SDF) nel fluido seminale nel tempo può fornire una comprensione degli effetti dell'esposizione prolungata allo sperma sull'integrità del DNA spermatozoideo. In questo studio preliminare, è stato eseguito un saggio SDF in vari momenti per simulare le condizioni di raccolta del seme fuori sito utilizzando il saggio di dispersione della cromatina spermatozoida su 14 campioni di sperma normali. L'analisi statistica delle percentuali di frammentazione del DNA durante la durata del saggio ha mostrato che la prolungata stagnazione del fluido seminale dall'eiaculazione all'analisi del seme ha aumentato significativamente la frammentazione del DNA. La motilità media degli spermatozoi è stata significativamente ridotta del 7,4% a 1 ora, del 14,5% a 2 ore e del 18,7% a 4 ore, e la FDA media è aumentata significativamente del 5,5% a 1 ora, dell'11,5% a 2 ore e del 16,1% a 4 ore dopo la raccolta dello sperma. Questa diminuzione della qualità dello sperma nel tempo può influenzare i protocolli delle cliniche di fertilità quando si considerano la preparazione dello sperma per i cicli ART, specialmente quando la raccolta avviene fuori sede dal laboratorio andrologico. I laboratori potrebbero considerare di stabilire una soglia di tempo accettabile per la ricezione dello sperma dalla raccolta esterna.
L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) identifica una persona su sei, ovvero il 17,5% della popolazione mondiale, come vivendo infertilità in qualche momento della lorovita. Circa il 20% dei casi di infertilità ha una diagnosi unica di infertilità maschile, con un ulteriore 30–40% dei casi che presenta fattore maschile come diagnosisecondaria 2. Anche negli uomini sani, i parametri seminali possono variare molto da individuo a individuo, incluse fluttuazioni di concentrazione, motilità, morfologia evitalità 3. Pertanto, è importante comprendere i fattori specifici che compromettono la fertilità maschile per fornire un trattamento adeguato in un contesto clinico.
Un ambito di ricerca in via di sviluppo riguarda l'effetto dell'integrità del DNA degli spermatozoi sui cicli 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Il manuale di laboratorio OMS per l'esame e l'elaborazione dello sperma umano, 5ª edizione, afferma che la frammentazione del DNA spermatozoideo (SDF) (tramite rotture a singolo o doppio filamento) può influenzare lo sviluppo embrionale, l'impianto e gli esiti dellagravidanza 14. Muriel et al. hanno effettuato un'analisi della SDF e hanno riscontrato che un aumento della SDF ha portato a una compromessa dei tassi di fecondazione, della qualità dell'embrione e dei tassi di impianto nei cicliART 10. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione di cosa causa la frammentazione del DNA.
Studi precedenti riportano che lo stress ossidativo può portare a una diminuzione della motilità degli spermatozoi, compromessa della produzione e funzione enzimatica e, cosa più significativa, danni alDNA 8. Tali danni al DNA possono includere, ma non si limitano a, delezioni geniche, traduzioni errate e SDF. Attualmente vengono utilizzati saghi SDF per valutare l'integrità del DNA degli spermatozoi. Sebbene gli studi abbiano correlato la crioconservazione, la gestione dei mezzi e lo stress ossidativo con SDF, si sa poco sull'SDF nel periodo dall'eiaculazioneall'analisi 4,5. Questo è un periodo critico nella vita del spermatozoo, data la crescente prevalenza di raccolte domestiche di sperma per la preparazione dello spermatozoo nei cicliART 15. Le riscossioni domiciliari sono diventate sempre più popolari durante la pandemia di COVID-19, poiché limitano il contatto diretto con il paziente e aumentano comfort e praticità. Tuttavia, non esistono linee guida specifiche che suggeriscano un tempo ottimale dall'eiaculazione all'analisi per le raccolte domiciliarie. Pertanto, l'obiettivo principale del nostro studio era capire se la SDF cambi nel tempo nel fluido seminale stagnante e se tali cambiamenti possano essere rilevanti per la gestione dei campioni ART.
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Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Consiglio di Revisione Istituzionale degli Ospedali Universitari (STUDY20201371). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti nello studio. Quattordici campioni di sperma sono stati selezionati da pazienti in un unico centro accademico di fertilità nel Nord-est dell'Ohio. Tutti i campioni analizzati in questo esperimento sono stati raccolti in loco nella nostra struttura. Il test di dispersione della cromatina spermatozoida è stato effettuato su campioni di sperma da un andrologo completamente formato, secondo le istruzioni del produttore, per minimizzare le variazioni interpersonali. Con questo kit, intatto, non fissato e lo sperma fresco veniva immerso in un microgel inerte di agarosio su un vetrino pretrattato e poi raffreddato a 4 °C per 5 minuti per solidificare il microgel. Un trattamento iniziale con acido è stato utilizzato per denaturare il DNA negli spermatozoi con DNA frammentato, e è stata applicata una soluzione tampone per la lisi per rimuovere le proteine nucleari. Dopo il lavaggio con acqua distillata, i vetrini venivano disidratati in soluzioni di etanolo classificate e asciugati all'aria. Quando visualizzati alla microscopia luce dopo la colorazione con le soluzioni di colorazione fornite dal kit, gli spermatozoi senza frammentazione hanno mostrato nucleoidi con un grande alone di dispersione (superiore a un terzo del diametro del nucleo), mentre gli spermatozoi con frammentazione hanno mostrato un piccolo alone (meno di 1/3 del diametro del nucleo) o l'assenza di halo. La percentuale di spermatozoi con frammentazione del DNA è stata calcolata come il numero di spermatozoi frammentati e degradati ed espressa in percentuale. Un totale di 300 spermatozoi sono stati conteggiati su un vetrino e sono stati classificati come con un alone di dispersione grande o medio o come assenza di un alone di dispersione. Questo conteggio è stato replicato due volte per valutare la variabilità tecnica, e i due conteggi sono stati mediati. La sensibilità diagnostica e la specificità del kit sono del 93%, e in ogni esperimento sono stati inclusi sia i controlli positivi che quelli negativi. I campioni di sperma sono stati valutati a 0, 1, 2 e 4 ore (0 h è stato definito come 15 minuti dopo il periodo di liquefazione a 37 °C) e sono stati mantenuti a temperatura ambiente (22–25 °C).
Un'ulteriore analisi di motilità è stata eseguita su ciascun campione a 0, 1, 2 e 4 ore. La valutazione della motilità è stata eseguita da un andrologo esperto tramite un protocollo di conteggio utilizzando una camera di conteggio usa e getta. Sono stati contati trecento spermatozoi mobili per griglia, e il conteggio è stato replicato due volte. Una concentrazione media di spermatozoi mobili è stata calcolata sulla base dei due conteggi replicati.
Analisi statistiche sono state effettuate utilizzando ANOVA a misure ripetute per confrontare ogni gruppo temporale. Quando è stato rilevato un effetto complessivo significativo, è stato applicato il test della differenza onestamente significativa (HSD) di Tukey per confronti a coppie post hoc. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le informazioni dettagliate sui materiali sono riassunte nella Tabella dei Materiali.
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Per valutare l'impatto dell'esposizione prolungata allo sperma sulla motilità dello spermatozoo e sulla frammentazione del DNA, sono stati analizzati in totale 14 campioni di pazienti normozoospermici in quattro momenti di raccolta dopo la prelieva. I campioni analizzati sono stati considerati "normali" secondo i parametri di analisi del seme secondo la5ª edizione14 dell'OMS. Tutti i campioni sono stati raccolti in loco presso il nostro Centro di Fertil...
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Nei campioni inclusi in questo esperimento, la SDF è aumentata nel tempo, mentre la motilità è diminuita nello stesso periodo. Ciò suggerisce che l'integrità del DNA dello spermatozoo possa diminuire quando il liquido seminale rimane stagnante per periodi più lunghi tra l'eiaculazione e l'analisi o l'elaborazione. Aumentare il tempo in cui i campioni sono rimasti stagnanti prima dell'analisi può aver aumentato l'esposizione a condizioni associate allo stress ossidativo. Come già discusso...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ANOVA Calculator | Statistics Kingdom | Analisi statistica https://www.statskingdom.com/anova_manova.html | |
| Halosperm G2 | Halotech | HT-HSG2 | Kit diagnostico in vitro per la misurazione della frammentazione del DNA spermatico https://halotechdna.com/it/producto/halosperm-g2/ |
| Microcell | Vitrolife | 15423 | Camera di conteggio monouso per l'analisi dello sperma https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/ |
| Controllo di qualità per strisce di test WBC/pH | Medical Electronic Systems | A-CA-01752-00 | Controllo positivo e negativo per le strisce di test QwikCheck WBC https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/ |
| Strisce di reattivo per test QwikCheck WBC/pH | Medical Electronic Systems | 0700 | Determinazione dei leucociti (WBC) nello sperma https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/ |
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