Articolo metodologico

Microiniezione di interleucina-6 nel flusso sanguigno delle larve di pesce zebra TSC per studiare comportamenti simili a disturbi neuropsichiatrici

152 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 giugno 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In questo articolo

Sommario

Per modellare come i segnali infiammatori influenzino lo sviluppo neuronaturale in organismi geneticamente suscettibili, presentiamo un protocollo per la microiniezione di IL-6 nel dotto di Cuvier (vena cardinale comune) delle larve di pesce zebra, consentendo un'induzione controllata dell'infiammazione e la valutazione del suo impatto sullo sviluppo nel contesto del complesso di sclerosi tuberosa (TSC).

Abstract

I pazienti con complesso di sclerosi tuberosa (mutazioni TSC1/TSC2) mostrano espressività variabile del disturbo dello spettro autistico (ASD), e l'attivazione immunitaria materna è nota per aumentare il rischio di ASD. L'interleucina-6 (IL-6) è una citochina pleiotropa con ruoli ben consolidati nella regolazione immunitaria, nell'infiammazione e nei processi neuroinfiammatori. Viene prodotto da molteplici tipi di cellule immunitarie in risposta a infezioni o lesioni tissutali ed è comunemente caratterizzato come mediatore pro-infiammatorio. In particolare, l'IL-6 può attraversare la barriera emato-encefalica ed è stata implicata in condizioni neuropsichiatriche associate a neuroinfiammazione e all'infiammazione, tra cui il disturbo dello spettro autistico (ASD) e la disabilità intellettiva (ID). Qui descriviamo un protocollo per indurre una segnalazione infiammatoria sistemica nel pesce zebra tramite l'iniezione di IL-6 nel flusso sanguigno tramite iniezione nel dotto di Cuvier. Questo approccio consente risposte infiammatorie controllate e riproducibili per studiare i cambiamenti causati dall'infiammazione nello sviluppo precoce. Il protocollo dettaglia i passaggi essenziali per la preparazione dell'IL-6, la microiniezione e le applicazioni sperimentali a valle in modelli di malattia e neuroinfiammazione del pesce zebra, inclusi studi progettati per sondare le interazioni geni-ambiente. Consentendo l'induzione controllata della segnalazione infiammatoria sistemica, questo approccio offre una piattaforma versatile per esaminare come la suscettibilità genetica e le esposizioni infiammatorie si intersecino per influenzare gli esiti dello sviluppo.

Introduzione

Comprendere come i segnali infiammatori influenzino lo sviluppo neuronaturale precoce è essenziale per analizzare i meccanismi alla base dei disturbi neurosviluppativi, in particolare in contesti geneticamente suscettibili. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire un approccio preciso e riproducibile per indurre una segnalazione infiammatoria sistemica nelle larve di pesce zebra tramite microiniezione diretta di interleucina-6 (IL-6) nel dotto di Cuvier (la vena cardinale comune).

Il complesso di sclerosi tuberosa (TSC) esemplifica tali interazioni genico-ambiente. Il TSC è un raro disturbo genetico causato da mutazioni in TSC1 o TSC2, che codificano rispettivamente per hamartin e tuberina, proteine che formano un complesso che normalmente sopprime la segnalazione di mTORC1. La perdita di questa inibizione porta all'iperattivazione della via mTORC1, con conseguente crescita cellulare anomala e un ampio spettro di manifestazioni cliniche, incluso il disturbo dello spettro autistico (ASD)1,2. Si stima che l'ASD colpisca ~1,5% degli individui con un'età media diagnosticata di ~3 anni nei paesisviluppati 3. L'ASD è caratterizzato da comportamenti ripetitivi, interazioni sociali compromesse e una riduzione della flessibilitàcognitiva 4, e i pazienti spesso presentano ulteriori sfide neurocomportamentali come ansia, depressione o disabilitàintellettiva 3. In particolare, il 40%-60% degli individui con TSC presenta caratteristiche correlateall'ASD 2, eppure la gravità dei sintomi varia notevolmente – anche tra pazienti con mutazioni simili – suggerendo che i fattori ambientali modulino il rischio geneticamente dato.

Uno di questi fattori è l'infiammazione. Sebbene l'eziologia dell'ASD rimanga in gran parte sconosciuta, la neuroinfiammazione in più aree cerebrali è da tempoimplicata 5. L'aumento delle evidenze precliniche e cliniche indica che la neuroinfiammazione fetale innescata dall'attivazione immunitaria materna (MIA) e l'aumento conseguente della segnalazione delle citochine possono contribuire in modo significativo alla patogenesidell'ASD 6. Pertanto, modellare l'esposizione alle citochine infiammatorie in sistemi geneticamente suscettibili, come il TSC, fornisce un potente quadro per indagare come i segnali immunitari si intersechino con la regolazione interrotta di mTORC1 per influenzare lo sviluppo cerebrale precoce.

La motivazione per lo sviluppo di questo protocollo deriva dal crescente riconoscimento che l'infiammazione mediata dalle citochine, inclusa la segnalazione IL-6, può interagire con vulnerabilità genetiche per influenzare le traiettorie neuroevolutive. Le citochine sono glicoproteine a basso peso molecolare che coordinano la comunicazione all'interno del sistema immunitario. Nell'ASD, diversi studi hanno costantemente riportato livelli elevati di citochine pro-infiammatorie, inclusa IL-6 nel sangueperiferico 7,8,9,10, a sostegno dell'ipotesi che una segnalazione disregolata dell'IL-6 possa contribuire alle caratteristiche neuroevolutive e comportamentali caratteristiche del disturbo. L'IL-6 è un mediatore chiave dell'attivazione immunitaria prodotta da diversi tipi di cellule immunitarie in risposta a infezioni o danni tissuti. Poiché l'IL-6 può attraversare la barriera emato-encefalica e influenzare direttamente neuroni, astrociti e microglia, l'elevazione sostenuta di questa citochina è stata implicata nell'alterazione delle vie neurosviluppative, della plasticità sinaptica e dell'omeostasi neuroimmune – meccanismi sempre più esplorati nella fisiopatologiadell'ASD 11,12. Questi legami sono ulteriormente rafforzati da studi MIA, in cui un aumento dell'IL-6 materno durante la gravidanza interrompe lo sviluppo cerebrale fetale e aumenta il rischio correlatoall'ASD 13. Tuttavia, i modelli di vertebrati esistenti spesso si basano sulla stimolazione immunitaria sistemica tramite molecole associate a patogeni o paradigmi di esposizione materna, che possono introdurre variabilità, attivare simultaneamente molteplici vie immunitarie e limitare la capacità di isolare il contributo specifico di IL-6. La microiniezione diretta di IL-6 nel pesce zebra supera queste limitazioni consentendo la manipolazione mirata di una singola citochina all'interno di un organismo trasparente e geneticamente trattabile.

Il pesce zebra offre diversi vantaggi per studiare gli effetti dello sviluppo guidati dalle citochine. La loro trasparenza ottica consente la visualizzazione in tempo reale delle risposte immunitarie e neurali; il loro rapido sviluppo consente sperimentazioni ad alto rendimento; e le loro vie di segnalazione delle citochine conservate li rendono un potente modello vertebrato per dissezionare i meccanismi infiammatori 14,15,16,17,18. Negli studi sperimentali, è necessario fornire materiali esogeni (batteri, cellule tumorali, DNA, nanoparticelle, ecc.) nelle larve del pesce zebra. Un approccio consiste nell'esporre le larve a una soluzione contenente il materiale di interesse, permettendo un'assorbimento passivo attraverso la pelle, le branchie o il tratto gastrointestinale. Il secondo metodo, più diretto, è la microiniezione, in cui materiali esterni vengono somministrati in specifici compartimenti embrionali o larvali utilizzando aghi di vetro fine 19,20,21. È importante sottolineare che la microiniezione nel dotto di Cuvier fornisce una via affidabile per la somministrazione sistemica, garantendo una rapida distribuzione di IL-6 in tutta la circolazione senza gli effetti di confusione della stimolazione immunitaria dell'organismo intero.

In questo protocollo, presentiamo una procedura passo dopo passo dalla preparazione delle siringhe per iniezione fino all'iniezione di IL-6 nel flusso sanguigno tramite il dotto di Cuvier delle larve di pesce zebra a 2 e 3 giorni dalla fecondazione (dpf). Questo metodo è particolarmente utile per i ricercatori che indagano come specifici segnali infiammatori influenzino i processi precoci dello sviluppo, le interazioni gene-ambiente in modelli di disturbi neurosviluppistici o immunologici, le conseguenze cellulari e molecolari dell'esposizione a citochine in vivo, o l'interazione tra mutazioni genetiche e vie di segnalazione infiammatorie. Offrendo un approccio controllato, specifico per citochine e con precisione nello sviluppo, questo protocollo fornisce una piattaforma versatile per indagare i meccanismi attraverso cui IL-6 e segnali immunitari correlati plasmano gli esiti immunitari, neurali e comportamentali precoce.

Protocollo

Per la procedura descritta qui, è stata utilizzata la linea di pesce zebra tsc2vu242/+ 22,23. Tutti gli esperimenti condotti sono stati condotti in conformità con tutta la legislazione rilevante e non è richiesta alcuna approvazione aggiuntiva del comitato etico specificamente perché la fase di sviluppo utilizzata (<5 dpf) esce dall'ambito della revisione etica obbligatoria. La Figura 1 presenta uno schema del protocollo.

1. Estrazione delle micropipette

  1. Preparare aghi di microiniezione da capillari di vetro borosilicato utilizzando un extracter per micropipette, seguendo le procedurestabilite 24.
  2. Usa capillari di vetro borosilicato lunghi 10 cm (diametro esterno di 1,0 mm, pareti sottili) e caricali in un estratore per micropipette.
  3. Posizionare con cura il capillare all'interno del trasportatore di tirare, assicurandosi un allineamento preciso all'interno della scanalatura designata, e fissarlo saldamente usando le morsette degli strumenti per evitare movimenti durante la tirata.
  4. Regola il capillare in modo che sia centrato all'interno del filamento riscaldante, assicurando un riscaldamento uniforme lungo la zona da estrarre per una formazione uniforme dell'ago.
  5. Avviare il programma di pull utilizzando parametri ottimizzati (ad esempio, per uno strumento Sutter usare calore: 533, pull: 50, velocità: 60, ritardo: 90 e pressione: 200) per generare aghi di microiniezione a punta fine.
    ATTENZIONE: I microaghi prelevati da capillari di vetro sono fragili e possono facilmente creparsi, ostruire o sviluppare forme irregolari delle punte che alterano il volume di iniezione. Ispezionare ogni ago sotto stereomicroscopio prima dell'uso, evitare di toccare la punta con superfici dure e sostituire immediatamente gli aghi se si osservano resistenza, perdite o dimensioni incoerenti delle gocce.
    NOTA: Dopo il processo di estrazione, si formano punte rastremate degli aghi a entrambe le estremità del capillare. Prima dell'uso, la punta deve essere aperta con cura rompendola delicatamente con pinze sottili sotto uno stereomicroscopio per ottenere la dimensione di apertura desiderata per la microiniezione.

2. Preparazione di tamponi e soluzione di stock

  1. Prepara una soluzione stock al 60× del mezzo embrionale E3 ( vedi Tabella 1). Sterilizza la soluzione tramite autoclaving e conserva a 4 °C. Per l'uso, diluire la soluzione originale in acqua ultrapura per ottenere 1× soluzione di lavoro E3.
    NOTA: il 60× soluzione stock del mezzo embrionale E3 può essere conservata a 4 °C per la conservazione a lungo termine.
  2. Prepara una soluzione di tricaina 20x (MS-222) come descritto nella Tabella 1. Conserva la soluzione a 4 °C al buio per prevenire il degrado. Prima dell'uso, diluire a 1× concentrazione di lavoro nel mezzo E3.
    NOTA: Regolare il pH della soluzione di tricaina a 7,5 usando 1 M Tris pH 9,0. Questa soluzione può essere alquotata e conservata a -20 °C (congelata) per una conservazione a lungo termine oppure conservata a 4 °C. La tricaina si degrada a RT e sotto luce diventando un composto tossico.
    ATTENZIONE: Bisogna prestare particolare attenzione nell'uso della tricaina (MS-222) per l'anestesia, poiché sia la sottoesposizione che la sovraesposizione possono influire negativamente sulla fisiologia e sul comportamento larvale. L'esposizione eccessiva può deprimere la funzione cardiaca e alterare il comportamento successivo, mentre un'anestesia insufficiente aumenta il rischio di lesioni durante il montaggio. Utilizzare solo la concentrazione e durata efficaci minime, e consentire il recupero completo nel mezzo embrionale fresco prima degli saggi comportamentali.
  3. Prepara una soluzione di agarosio all'1% (v/v) in mezzo E3 riscaldandola fino a quando non è completamente sciolta.
    NOTA: Se preparata in anticipo, la soluzione può essere conservata a 4 °C e riscaldata prima dell'uso. Il giorno dell'esperimento, mantenere l'agarosio in stato liquido a 55–60 °C per prevenire una solidificazione prematura.
  4. Prepara una soluzione di NaCl allo 0,9% (w/v) e conserva a temperatura ambiente fino a 1 settimana o a 4 °C per una conservazione prolungata. Prima dell'uso, bilanciare la soluzione a temperatura ambiente o incubare a 28,5 °C per adattarsi alle condizioni fisiologiche degli embrioni.
  5. Prepara una soluzione di 2 pg/nL IL-6 allo 0,9% di NaCl. Una soluzione per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo e conserva a -20 °C. Prima dell'uso, scongela e porta l'aliquota a temperatura ambiente.
  6. Prepara una soluzione operativa di pronasi da 0,5 mg/mL in mezzo E3 da una soluzione di stock da 20 mg/mL preparata in acqua ultrapura.

3. Ottenere e allevare embrioni fino a 2 dpf

  1. Organizza la riproduzione di gruppo mettendo più pesci zebra adulti TSC2vu242/vu242 in una vasca di riproduzione.
    NOTA: Maschi e femmine possono essere separati durante la notte usando un divisore per prevenire la deposizione prematura, con il divisore rimosso la mattina seguente per indurre l'accoppiamento sincronizzato. In alternativa, i pesci possono essere mantenuti senza un divisore in un ambiente controllato dalla luce, dove la transizione dal buio (notte) alla luce (mattina) funge da segnale per la riproduzione delle uova.
  2. Il giorno successivo, rimuovere il divisore (se usato) e lasciare che la deposizione proceda per circa 1 ora.
  3. Raccogliere rapidamente gli embrioni fecondati e trasferirli in piastre di Petri da 100 mm contenenti 40 mL di mezzo embrionale E3, mantenendo una densità non superiore a ~60 embrioni per piatto per garantire uno sviluppo ottimale.
  4. Incubare gli embrioni a 28,5 °C sotto un ciclo diurno controllato di 14 ore di luce e 10 ore di oscurità.
  5. A 1 dpf e 2 dpf, esaminare gli embrioni sotto stereomicroscopio e rimuovere embrioni morti, uova non fecondate e detriti per mantenere la qualità della coltura.
  6. Sostituire il mezzo E3 con una soluzione fresca per minimizzare l'accumulo di rifiuti e favorire lo sviluppo embrionale normale.

4. Preparazione di placche di agarosio per microiniezioni e decorionazione

  1. Prepara una soluzione di agarosio all'1% (w/v) in un mezzo E3 e riscaldala finché l'agarosio non si scioglie completamente e la soluzione diventa traslucida.
  2. Lascia raffreddare brevemente la soluzione, poi versa circa 30 mL in una piastra di Petri da 100 mm, assicurando uno strato uniforme sulla superficie.
  3. Mentre l'agarosio è ancora liquido ma sta iniziando a solidificarsi, posiziona delicatamente uno stampo in silicone sulla superficie per creare scanalature uniformi.
    NOTA: Qui, stampi in silicone con motivi piramidali (Figura 2) vengono utilizzati per generare pozzi in grado di trattenere l'eccesso di E3 durante la microiniezione. Questi pozzi sono progettati per fornire stabilità temporanea durante la manipolazione e l'iniezione, mantenendo sufficiente umidità per prevenire la disidratazione e garantire la vitalità dell'embrione per diversi minuti al di fuori delle condizioni standard di incubazione.
  4. Prepara piastre di Petri rivestite di agarosio per la decorionazione enzimatica (diametro di 50 mm) versando circa 5 mL di soluzione fusa all'1% (w/v) di agarosio e facendo ruotare delicatamente la piastra per ricoprire uniformemente la superficie.
  5. Rimuovi eventuali eccessi di agarosio.
  6. Lascia solidificare l'agarosio a temperatura ambiente per 10–15 minuti. Una volta pronti, i piatti sono pronti per l'uso nella decorionazione enzimatica degli embrioni.

5. Decorionazione enzimatica di 2 pesci dpf

  1. Trasferire circa 100 embrioni in corioni a 2 dpf in una piccola piastra di Petri rivestita di agarosio (50 mm).
  2. Rimuovere quanta più E3 possibile per minimizzare la diluizione della soluzione enzimatica e garantire un'efficiente decorionazione.
  3. Aggiungere 4 mL di soluzione pronase appena preparata (concentrazione stock: 20 mg/mL [preparata in acqua ultrapura], concentrazione operativa: 0,5 mg/mL [diluita in E3]) al piatto, assicurando che gli embrioni siano completamente sommersi.
    ATTENZIONE: Il trattamento con pronase deve essere controllato con attenzione, poiché una digestione eccessiva può danneggiare i tessuti larvali, aumentando la fragilità durante la maneggiamento e potenzialmente compromettendo la sopravvivenza o il comportamento. Utilizzare solo il tempo minimo di esposizione efficace e risciacquare accuratamente gli embrioni dopo per prevenire la continuazione dell'attività enzimatica.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 3–5 minuti, monitorando il rilascio dai corioni sotto uno stereomicroscopio.
  5. Ruota o fai roteare delicatamente la ciotola a intermittenza per facilitare la rimozione enzimatica dei corioni. Continua finché la maggior parte degli embrioni non è liberata dai loro cori.
    NOTA: Assicurati che gli embrioni nudi siano sempre immersi nella soluzione; altrimenti, il sacco vitellino può rompersi, causando la morte degli embrioni.
  6. Una volta raggiunta la decorionazione, si lava accuratamente gli embrioni trasferendoli attraverso 5–6 cambiamenti di mezzo E3 fresco.
    NOTA: Assicurati che gli embrioni nudi siano sempre immersi nella soluzione; altrimenti, il sacco vitellino può rompersi, causando la morte degli embrioni.
  7. Assicurarsi che tutti i cori e residui di pronasi siano rimossi per prevenire danni alle larve e mantenere condizioni ottimali di coltura.
  8. Trasferire ~50 larve dechorionate in una piastra di Petri da 100 mm contenente 40 mL di mezzo E3 utilizzando una pipetta Pasteur in vetro.
  9. Mantenere le larve in queste condizioni fino a quando non vengono microiniettate.

6. Iniezione di embrioni di pesci zebra

  1. Sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento ≥150×), usare pinze fini per rompere con cura la punta del capillare di vetro estratto (sezione 1), generando una micropipetta con un'apertura di circa 3 μm di diametro.
    NOTA: Una micropipetta adatta può essere riconosciuta assicurandosi che la punta sia finemente aperta, senza appiattimenti visibili o una grande superficie aperta sulla punta. Se la punta è troppo rotta, non penetrerà efficacemente nella pelle del pesce e può causare iniezioni scadenti o incoerenti. Pertanto, l'apertura della punta deve essere eseguita con attenzione sotto stereomicroscopio ad alto ingrandimento, garantendo una rottura minima e controllata all'estremità del capillare.
  2. Preparare soluzioni di iniezione di 0,9% (p/v) di NaCl (controllo) o IL-6 (2 pg/nL) allo 0,9% di NaCl e aggiungere 1 μL di blu di tripano allo 0,1% ogni 10 μL di soluzione per facilitare la visualizzazione durante l'iniezione.
  3. Riempi la micropipetta preparata con ~3 μL della soluzione di iniezione usando una punta microcaricatore, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria.
  4. Fissare la micropipetta caricata nel portacapillare (Figura 2) collegato al sistema di microiniezione.
  5. Metti una piccola goccia di olio minerale su un vetrino di calibrazione.
  6. Calibrare il volume di iniezione espellendo gocce nell'olio minerale e misurandone il diametro utilizzando un vetrino di calibrazione (Figura 2) con una scala di 0,01 mm. Regolare la pressione di iniezione (tra 300–500 hPa) per ottenere un volume di goccioline di ~1 nL.
  7. Aggiungere tricaina (MS-222) al mezzo contenente E3 le larve fino a una concentrazione finale di 1× per l'anestesia. Per minimizzare lo stress e garantire una sedazione costante, usa le larve in piccoli lotti.
  8. Trasferire 2 larve di dpf su una piastra di iniezione di agarosio solidificata. Più larve (ad esempio, fino a 10) possono essere posizionate per ciascuna ciotola, a seconda della capacità di manipolazione.
  9. Metti la piastra sotto lo stereomicroscopio. Utilizzando una pipetta di vetro, orienta delicatamente ogni larva in modo che il condotto di Cuvier sia chiaramente visibile e accessibile.
    NOTA: Quando si lavora con più larve, assicurarsi che la superficie dell'agarosio rimanga idratata aggiungendo periodicamente gocce di mezzo E3 contenente tricaina (1×) per prevenire la disidratazione.
  10. Posizionare la punta della micropipetta all'ingresso del dotto di Cuvier (come mostrato nella Figura 3), identificabile seguendo le cellule del sangue che si muovono verso il cuore sotto lo stereomicroscopio.
  11. Iniettare due goccioline consecutive (~1 nL ciascuna) della soluzione preparata nel condotto di Cuvier, con un intervallo di circa 20 secondi tra le iniezioni e l'altra per consentire una corretta distribuzione.
  12. Dopo l'iniezione, trasferire delicatamente le larve dalla piastra di agarosio in una nuova piastra di Petri da 100 mm contenente 40 mL di mezzo E3. Minimizza lo stress meccanico durante il trasferimento.
  13. Riportare le larve nell'incubatrice a 28,5 °C per il recupero.
  14. Il giorno successivo (3 dpf), ripetere la procedura di microiniezione come descritto nei passaggi 6.8–6.13.
    NOTA: Una singola iniezione produce solo segnalazioni di breve durata e nessuna risposta comportamentale coerente, mentre la seconda iniezione garantisce un'attivazione costante delle vie infiammatorie lungo la finestra di sviluppo larvale precoce rilevante per lo sviluppo neurologico e produce cambiamenti comportamentali come descritto nella sezione dei risultati rappresentativi.
  15. A 5 dpf, utilizzare le larve per applicazioni a valle, inclusi saghi comportamentali, imaging cerebrale o analisi di immunofluorescenza.

Risultati

Per valutare gli effetti della microiniezione di IL-6 sulla fisiologia e sul comportamento larvale, abbiamo confrontato le larve iniettate con IL-6 con i controlli iniettati con NaCl durante la sopravvivenza e due letture comportamentali comunemente utilizzate per valutare comportamenti simili all'ansia e ripetitivi nei pesci zebra. La microiniezione di IL-6 non ha influito sulla vitalità larvale rispetto alle iniezioni di NaCl (Figura 4A). I tassi di sopravvivenza a 5 dpf erano indistinguibili tra gruppi iniettati con IL-6 e iniettati con NaCl, indicando che il regime di somministrazione è ben tollerato e non introduce tossicità aspecifica. Le microiniezioni stesse riducono leggermente la vitalità rispetto a quelle non iniettate, indicando un impatto moderato legato alla manipolazione, indipendentemente dall'esposizione all'IL-6. Questo conferma che il protocollo è adatto per analisi comportamentali a valle.

Per convalidare che il paradigma della microiniezione di IL-6 induce una risposta infiammatoria misurabile a 5 dpf, abbiamo quantificato la prostaglandina E2 (PGE2), un mediatore a valle della segnalazione infiammatoriaguidata dalle citochine 25. I mutanti omozigoti tsc2-/- hanno mostrato livelli di PGE2 di base elevati anche senza iniezione di IL-6, significativamente più alti rispetto ai loro fratelli tsc2+/+ di tipo selvatico (WT) (Figura 4B). I mutanti eterozigoti tsc2+/- hanno mostrato un aumento modesto e non significativo della PGE2 basale rispetto alle larve WT, ma è importante notare che i loro livelli di PGE2 sono aumentati drasticamente dopo la microiniezione di IL-6. Questo schema è coerente con il nostro obiettivo di modellare le interazioni geni × ambiente: le larve WT rimangono in gran parte indifferenti a esposizioni lievi e transitorie a IL-6, mentre i mutanti TSC2+/- geneticamente suscettibili mostrano una risposta infiammatoria pronunciata.

In linea con queste differenze nel tono infiammatorio dipendenti dal genotipo, abbiamo poi esaminato se la segnalazione indotta da IL-6 si traducesse in cambiamenti comportamentali misurabili nel saggio a campo aperto. Il test in campo aperto a 5 dpf (comedescritto in precedenza 22) ha rivelato che le larve mutanti TSC2 hanno mostrato un comportamento ansioso aumentato rispetto ai fratelli WT (Figura 4C); tuttavia, le microiniezioni di IL6 non hanno influenzato questo comportamento. In particolare, le larve di tsc2+/- e tsc2-/- trascorrevano significativamente più tempo nella zona esterna dell'arena e mostravano una minore esplorazione del centro rispetto a tsc2+/+, coerente con fenotipi legati all'ansia stabiliti nelle larve di pesce zebra.

Le iniezioni di IL-6 hanno aumentato i modelli di nuoto ripetitivi e stereotipati, in particolare nelle larve mutanti TSC2+/- (Figura 4D–E), una caratteristica comportamentale comunemente utilizzata come rilevamento rilevante per l'ASD nei modelli di pescezebra 26. La quantificazione dettagliata del looping ripetitivo, definita come tre o più nuotazioni circolari consecutive, ha rivelato un aumento significativo della proporzione di mutanti tsc2+/- iniettati con IL-6 che mostrano questo comportamento rispetto ai controlli iniettati con NaCl. Questo potenziamento selettivo del nuoto ripetitivo in larve geneticamente suscettibili supporta ulteriormente un'interazione gene × ambiente, in cui una lieve stimolazione infiammatoria smaschera o amplifica tendenze comportamentali simili all'ASD, specificamente nel background mutante tsc2+/-

figure-results-1
Figura 1: Schema del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Configurazione della postazione di lavoro per microiniezione. Schema della postazione di microiniezione utilizzata per le iniezioni larvali di pesce zebra. (1) Micropipetta di vetro montata sul portainiettore dell'iniettore; (2) piastra di Petri rivestita di agarosio con pozzi modellati per il posizionamento larvale; (3) olio minerale per la calibrazione; (4) soluzione blu di tripano; (5) tirare aghi di vetro; (6) diapositiva di calibrazione; (7) punte di pipetta estese; (8) pipetta Pasteur; (9) Stampo in silicone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Iniezione nel condotto di Cuvier. (A) Rappresentazione schematica del condotto del sito di iniezione di Cuvier (la vena cardinale comune) nelle larve di pesci zebra e binari rappresentativi in campo aperto a 5 dpf. (B) Immagini rappresentative del controllo (non iniettato) e delle iniezioni con NaCl e IL-6. Barra di scala: 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'interazione gene-ambiente usando la linea mutante tsc2. (A) Tassi di sopravvivenza (%) delle larve tsc2vu242 nel corso dell'esperimento nei gruppi di controllo (non iniettati), iniettati con NaCl e iniettati con IL-6. I dati sono presentati come media ± SEM a 5 dpf (n = 4 replicazioni sperimentali indipendenti, ogni genotipo × combinazione di trattamento contenente 60–70 pesci). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA seguita dal test post hoc di Tukey per il confronto a coppie. Sono state osservate differenze significative tra i gruppi di controllo e quelli iniettati con IL-6 (p = 0,00150) e tra i gruppi di controllo e quelli iniettati con NaCl (p = 0,00243). (B) Boxplot che rappresentano i livelli di PGE2 nei mutanti TSC2 e nei fratelli, misurati a 5 dpf utilizzando un kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) secondo il protocollo del produttore (ANOVA a 2 vie per il genotipo: F = 7,4503; P = 0,01234). Ogni campione contiene 20 teste (le code venivano usate per la genotipazione). I puntini nei boxplot rappresentano repliche biologiche. (C) Boxplot dei risultati del test in campo aperto per pesci mutanti tsc2 che mostrano il tempo relativo trascorso accanto alle pareti per ciascun genotipo dopo iniezioni con NaCl e IL-6 e per controlli non iniettati (ANOVA a 2 vie per il genotipo: F = 7,021; P = 0,00106). Il test in campo aperto è stato eseguito utilizzando una camera di analisi automatizzata (Tabella dei Materiali) secondo il protocollo precedentementeriportato 22. (D) Figura esemplare che mostra comportamenti esplorativi casuali dopo l'iniezione di NaCl e il looping ripetitivo dopo iniezioni di IL-6. (E) Boxplot che rappresentano il numero di animali che mostrano comportamenti di looping normali e ripetitivi per ciascun genotipo tsc2 dopo l'iniezione con NaCl o IL-6 e per pesci di controllo non iniettati (ANOVA a 2 vie per il genotipo: F = 5,7615; P = 0,005849). Per questo sono stati utilizzati tre replicati sperimentali indipendenti, ciascun genotipo × combinazione di trattamento contenente 60–70 pesci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione originale 60 x E3
ReagenteConcentrazione finaleImporto
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl 2,6H 2O24 mM4,89 g
UltrapureH 2ON/Ariempire fino a 1 L
TotaleN/A1 L
Soluzione di calcio tricaine
ReagenteConcentrazione finaleImporto
Tricaine15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
UltrapureH 2ON/A244,75 mL
TotaleN/A250 mL

Tabella 1: Composizione delle soluzioni di E3 e Tricaine.

Discussione

Come previsto, i mutanti omozigoti TSC2 hanno mostrato alti livelli basali di ansia simili, coerenti con i fenotipiprecedentemente riportati 22,27. Poiché queste larve presentano già gravi anomalie comportamentali, l'iniezione di IL-6 non ne ha ulteriormente aggravato il fenotipo. Al contrario, gli eterozigoti tsc2 hanno mostrato chiare cambiamenti indotti da IL-6. Questa sensibilità selettiva evidenzia l'utilità di questo protocollo per sondare le interazioni geniche × ambiente, dove una segnalazione infiammatoria lieve ma prolungata interagisce con la vulnerabilità genetica sottostante per influenzare gli esiti neurocomportamentali.

L'esposizione alla LPS rimane il paradigma infiammatorio più utilizzato nei pesci zebra e produce in modo affidabile una risposta immunitaria ampia e robusta, caratterizzata da una forte induzione di citochine pro-infiammatorie, reclutamento di cellule immunitarie innate e mortalità dipendente dalladose 28. Pur essendo potente, LPS attiva simultaneamente più vie recettoriali simili a Toll 28,29,30, rendendo difficile isolare il contributo delle singole citochine agli effetti neuroevolutivi a valle. Al contrario, il protocollo di microiniezione IL-6 descritto qui fornisce un approccio mirato e controllato elevando una singola citochina nota per essere centrale nell'attivazione immunitaria materna. È importante sottolineare che le iniezioni di IL-6 non aumentano la mortalità rispetto ai controlli iniettati con NaCl, permettendo di esaminare fenotipi comportamentali e molecolari senza creare tossicità confondente. Inoltre, la microiniezione di IL-6 produce segnalazione infiammatoria specifica a valle, come dimostrato dall'elevato livello di PGE2, e induce cambiamenti comportamentali misurabili - in particolare un aumento del nuoto ripetitivo nelle larve eterozigoti TSC2 - dove la suscettibilità genetica interagisce con l'esposizione alle citochine. Insieme, queste distinzioni sottolineano che, mentre LPS modella l'attivazione immunitaria globale, la microiniezione di IL-6 consente una dissezione precisa dei meccanismi specifici delle citochine rilevanti per il rischio neuroevolutivo.

I risultati rappresentativi qui presentati illustrano gli effetti dell'IL-6 in uno sfondo mutante tsc2, ma il protocollo stesso è ampiamente applicabile. Il metodo può essere facilmente implementato in larve di tipo selvatico o in altri modelli genetici per indagare come segnali infiammatori definiti si intersecino con diversi contesti genetici durante lo sviluppo neurologico precoce. Per applicazioni oltre il modello TSC2, raccomandiamo di determinare empiricamente la dose ottimale di IL-6, poiché la sensibilità alle citochine e le soglie infiammatorie possono variare tra i genotipi e gli obiettivi sperimentali.

Una considerazione tecnica chiave in questo protocollo è la coerenza del volume di iniezione, poiché gli effetti biologici dell'IL-6 dipendono da una consegna accurata di circa 1 nL per iniezione. La variabilità nella dimensione delle goccioline spesso deriva da differenze nell'apertura dell'ago o nella pressione di iniezione. Se le gocce sono troppo piccole, aumentare gradualmente la pressione o allargare leggermente la punta dell'ago ad alta ingrandizione di solito ripristina il corretto flusso. Al contrario, gocce che superano il volume previsto di solito indicano che l'apertura dell'ago è troppo larga, nel qual caso è necessario ridurre la pressione o preparare un ago nuovo con una punta più stretta. Mantenere volumi di iniezione precisi è essenziale, poiché le deviazioni possono alterare il carico infiammatorio e comprometterne la riproducibilità. Occasionalmente, gli utenti possono trovarsi in situazioni in cui non viene espulsa alcuna soluzione dall'ago. Questo avviene più spesso a causa di bolle d'aria, detriti o ostruzioni alla punta dell'ago. Ispezionare l'ago sotto uno stereomicroscopio e controllare il sistema iniettore per perdite o connessioni allentate di solito risolve il problema. Garantire una punta dell'ago pulita e senza ostruzioni è essenziale per una consegna costante e per prevenire l'accumulo di pressione che potrebbe danneggiare le larve.

Un altro fattore importante è la tolleranza fisiologica al volume iniettato. Le larve generalmente tollerano bene ~1 nL, ma volumi maggiori possono aumentare la mortalità, soprattutto quando vengono effettuate più iniezioni in giorni consecutivi. Per esperimenti che richiedono dosaggi ripetuti, è fondamentale minimizzare lo stress meccanico, consentire un tempo di recupero sufficiente tra le iniezioni e regolare la concentrazione di IL-6 invece che di volume per raggiungere la dose desiderata. Queste considerazioni aiutano a garantire che i fenotipi osservati riflettano l'esposizione alle citochine piuttosto che lesioni legate all'iniezione.

Infine, la mortalità correlata alle iniezioni può variare notevolmente a seconda dell'esperienza dell'utente. Mentre gli utenti esperti raggiungono tipicamente tassi di mortalità vicini al 5%, gli utenti inesperti possono osservare tassi fino al 50%. La maggior parte delle perdite deriva da danni meccanici durante il montaggio, posizionamento errato dell'ago o foratura accidentale del sacco vitellino o dei tessuti circostanti. Praticare la procedura sulle larve di tipo selvatico prima di iniziare le iniezioni sperimentali migliora notevolmente la costanza e riduce la mortalità. Un corretto posizionamento delle larve per visualizzare chiaramente il dotto di Cuvier, combinato con una delicata gestione durante il montaggio e il recupero, minimizza ulteriormente i danni procedurali.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Kevin Ess e Lilianna Solnica-Krezel (Vanderbilt University) per i pescitsc2 vu242/+ e l'IIMCB ZCF per l'assistenza con i pesci adulti. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione SONATA BIS n. 2023/50/E/NZ3/00252, una sovvenzione a JZ dal Centro Nazionale della Scienza di Polonia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (cloruro di calcio)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Supporto per capillari (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Puller per micropipette Flaming/BrownSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGConcentrazione in stock: 10 µg/mL, Concentrazione di lavoro: 2 pg/nL (diluito in NaCl 0,9%)
Pompa iniettore FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (cloruro di potassio)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (cloruro di magnesio esaidrato)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips per Microiniettore FemtojetEppendorfEPE 5242956003
Microscopio Leica M165 FC 1983 ingrandimentoLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Olio mineraleSigma-AldrichM5904
NaCl (cloruro di sodio)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GConcentrazione in stock: 20 mg/mL (preparato in acqua ultra pura), Concentrazione di lavoro: 0,5 mg/mL (diluito in E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Blu di TripanoThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Agarose a basso punto di fusioneThermo Fischer Scientific16520050
Estensione ZebraBox - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxCamera di analisi automatizzata

Riferimenti

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

Ristampe e permessi

Tag

NeuroscienzeNumero 232Numero 232TuttiNumeroTuttiNumeroQuesto mese in JoVENumeroComplesso della sclerosi tuberosa TSCDisturbi neuropsichiatrici associati alla TSC TANDInterleuchina 6 IL 6Disturbo dello spettro autistico ASDneuroinfiammazionecondotto di CuvierAttivazione immunitaria materna MIA
Microiniezione di interleucina-6 nel flusso sanguigno delle larve di pesce zebra TSC per studiare comportamenti simili a disturbi neuropsichiatrici
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.