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Articolo di ricerca

Firma immunitaria legata allo stress del reticolo endoplasmatico nella fibrillazione atriale: apprendimento automatico e trascrittomica a singola cellula

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DOI:

10.3791/71532

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7 agosto 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Basic Medical Sciences, Harbin Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per identificare le firme immunitarie correlate allo stress del reticolo endoplasmatico nella fibrillazione atriale, integrando la trasscrittomica di massa pubblica, il machine learning, l'analisi dell'infiltrazione immunitaria e la transcriptomica a cellula singola per la priorità dei biomarcatori riproducibili e la localizzazione dei tipi cellulari.

Abstract

Questo studio descrive un flusso di lavoro computazionale riproducibile per identificare firme geniche correlate allo stress del reticolo endoplasmatico (ERS) nella fibrillazione atriale (AF) integrando trascrittomica di massa, machine learning, analisi dell'infiltrazione immunitaria e trascrittomica a singola cellula. I dataset trascrivomici pubblici in massa sono stati recuperati dal Gene Expression Omnibus (GEO), seguiti da armonizzazione fenotipa, normalizzazione, correzione degli effetti batch e analisi dell'espressione differenziale. L'analisi della rete di coespressione genica pesata (WGCNA) è stata combinata con set genici correlati all'ERS per identificare i geni candidati associati all'ERS. Successivamente è stato utilizzato un framework di apprendimento automatico multi-algoritmo per confrontare le strategie di selezione delle caratteristiche e di adattamento dei modelli. Il modello selezionato è stato valutato in una coorte di validazione esterna indipendente (GSE115574) e ulteriormente valutato in una coorte aggiuntiva (GSE14975), con prestazioni discriminatorie quantificate dall'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e dall'area sotto la curva (AUC). Utilizzando questo flusso di lavoro, sono stati identificati 22 geni core correlati all'ERS e un modello Elastic Net (Enet) a 18 geni ha mostrato la più alta performance discriminatoria complessiva tra le coorti di addestramento e validazione. L'analisi SHapley Additive ExPlanations (SHAP) ha evidenziato il contributo principale di geni come RPS11, NCF2 e S100A4 alla previsione del modello. La deconvoluzione immunitaria e l'analisi trascrittomica a singola cellula hanno ulteriormente mappato la firma correlata all'ERS prevalentemente alla linea monocito-macrofagio, suggerendo il suo potenziale coinvolgimento nella rimodellazione immunitaria associata alla FA. Questo flusso di lavoro fornisce una strategia riproducibile per collegare le firme trascricomiche associate alla malattia a specifiche popolazioni di cellule immunitarie e può essere adattato ad altri contesti di malattia con dataset di massa e singole cellule adeguati.

Introduzione

La fibrillazione atriale (FA) è l'aritmia sostenuta più comune nella pratica clinica, caratterizzata da attività elettrica disordinata negli atri e perdita di funzione meccanica. Aumenta significativamente i rischi di ictus, insufficienza cardiaca e mortalità per ogni causa, diventando un importante onere globale per la salutepubblica 1. La gestione clinica attuale della FA affronta sfide significative: i farmaci antiaritmici tradizionali hanno un'efficacia a lungo termine limitata nel mantenere il ritmo sinusale, e i loro effetti avversi, come aritmie e cardiotossicità, ne limitanol'uso continuo 2,3. L'ablazione del catetere rimane inoltre impegnativa nel mantenere il ritmo sinusale a lungo termine per unaFA4 persistente. Le nuove strategie terapeutiche sono attualmente limitate dalla mancanza di una comprensione sistematica del panorama molecolare dei meccanismi a monte della FA, il che ostacola l'identificazione e la traduzione di bersagli precisi. Le ricerche hanno dimostrato che la progressione patologica della FA coinvolge interazioni complesse attraverso molteplici dimensioni, inclusi il rimodellamento elettrico, strutturale e del sistema nervoso autonomo. Tra questi, il rimodellamento strutturale atriale, incentrato sulla fibrosi miocardica, è un meccanismo chiave per il mantenimento dell'AF 5,6,7.

Pertanto, chiarire le vie di stress a monte che guidano la fibrosi è una delle chiavi per superare il collo di bottiglia terapeutico nella FA persistente. Studi recenti suggeriscono che lo stress del reticolo endoplasmatico (ERS), un nucleo regolatore fondamentale che permette alle cellule di affrontare le perturbazioni intra- ed extracellulari, sia una risposta adattativa altamente conservata innescata quando l'omeostasi del RE viene disturbata, portando a un eccessivo accumulo di proteine non ripiegate o mal ripiegate all'interno del lume del RE. L'ERS può partecipare al rimodellamento atriale regolando la proteostasi, il ciclo del calcio, le risposte infiammatorie e l'apoptosi 8,9. Tuttavia, i trigger a monte, le molecole di effettore chiave e le vie a valle dell'ERS nella FA non sono ancora stati caratterizzati sistematicamente, rendendo difficile definire i suoi nodi critici e i punti di intervento azionabili nella rimodellazione atriale.

Rispetto agli studi trascritomici tradizionali in massa, l'integrazione multi-omica può produrre segnali associati alla malattia a livello di popolazione più robusti. Inoltre, l'incorporazione della trascrittomica a singola cellula consente la dissezione dell'eterogeneità cellulare e l'identificazione delle sorgenti cellulari di questi segnali, mappando così i risultati dell'associazione a specifici tipi cellulari e alle loro potenziali vie di interazione. Questo fornisce una base per successive indagini meccanicistiche e la priorità dei bersagli. Nel presente studio, dataset trascrittomici di massa e trascrittomici a singola cellula correlati alla FA sono stati recuperati dal database Gene Expression Omnibus (GEO). I moduli fondamentali correlati all'ERS sono stati identificati tramite analisi di espressione differenziale e analisi della rete di coespressione genica pesata (WGCNA). Integrando analisi a singola cellula, le molecole chiave sono state ulteriormente localizzate a specifici tipi cellulari e alle loro reti di interazione. Collettivamente, questo studio mira a delineare le reti chiave correlate all'ERS nella FA e le loro associazioni con il rimodellamento strutturale, fornendo così una giustificazione per la scoperta dei bersagli e strategie terapeutiche stratificate guidate dai meccanismi.

Rispetto all'analisi differenziale di espressione a singolo dataset o allo screening di biomarcatori a singolo algoritmo, questo flusso di lavoro migliora la robustezza e l'interpretabilità integrando la validazione cross-coorte, la selezione di caratteristiche biologicamente vincolate, il confronto di modelli multi-algoritmo, la deconvoluzione immunitaria e la trascrittomica a singola cellula. Questi passaggi aiutano a dare priorità alle firme riproducibili correlate all'ERS e a localizzare segnali derivati dalla massa a specifiche popolazioni di cellule immunitarie e reti di interazione. Questo flusso di lavoro è adatto a studi che utilizzano dataset trascritomici pubblici o interni con gruppi ben definiti di malattie e controlli, fonti tissutali comparabili, dimensioni adeguate del campione e annotazioni fenotipiche disponibili. È particolarmente utile per la generazione di ipotesi, la priorità dei biomarcatori e la localizzazione di tipi cellulari di programmi molecolari associati a malattie. Tuttavia, le sue prestazioni dipendono dalla qualità del dataset, dalla coerenza fenotipica e dalla correzione efficace degli effetti batch; Pertanto, le firme candidate identificate da questo flusso di lavoro richiedono validazione in coorti indipendenti e modelli sperimentali prima della traduzione clinica. Il flusso di lavoro complessivo dello studio è mostrato nella Figura 1.

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Protocollo

In conformità con le Misure per la Revisione Etica delle Scienze della Vita e della Ricerca Medica che Coinvolgono Soggetti Umani promulgate in Cina il 18 febbraio 2023, la ricerca che utilizza dati pubblicamente disponibili può soddisfare i criteri per l'esenzione dalla revisione etica. Questo studio ha utilizzato solo dati trascrivomici secondari pubblicamente disponibili e de-identificati e non ha coinvolto il reclutamento di nuovi partecipanti umani, la raccolta di campioni umani o esperimenti su animali. Pertanto, non era richiesta un'ulteriore approvazione etica istituzionale. Non sono stati condotti esperimenti con animali in questo studio. Pertanto, l'approvazione del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali non era applicabile.

Fonti di dati per geni correlati allo stress del reticolo endoplasmatico nella fibrillazione atriale
In questo studio, dataset trascritomici correlati alla FA disponibili pubblicamente sono stati recuperati dal database GEO, inclusi GSE41177, GSE79768, GSE115574, GSE14975 e GSE165838. Informazioni dettagliate sui dataset GSE sono fornite nel File Supplementare 1—Tabella Supplementare S1. GSE41177 e GSE79768 sono stati utilizzati per costruire la coorte di formazione trascrittomica integrata in massa, mentre GSE115574 e GSE14975 sono stati utilizzati come due coorti di validazione esterna indipendenti. GSE165838 veniva utilizzato per l'analisi trascriromica a singola cellula. Poiché questi dataset sono stati generati su piattaforme diverse e possono differire per fonte tissutale, background clinico e composizione del campione, ogni dataset è stato pre-elaborato separatamente in base alle caratteristiche della piattaforma prima dell'integrazione o della validazione. La correzione a batch effect è stata poi eseguita utilizzando il pacchetto sva R per la coorte di addestramento unificata. Il set genico legato allo stress del reticolo endoplasmatico è stato recuperato dal database GeneCards con un punteggio di rilevanza ≥ 3 e, dopo la deduplicazione, ha formato la lista dei geni target utilizzata in questo studio.

Analisi dei geni espressi differenzialmente
Dopo la standardizzazione e la normalizzazione dei dati, il pacchetto R limma è stato utilizzato per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) nel set di addestramento integrato. I DEG sono stati definiti utilizzando i seguenti criteri di significatività: valore P aggiustato per tasso di scoperta falsa (adj. P.Val) < 0,05 e |log2FC| > 0,58510. Per visualizzare i modelli di espressione dei DEG, sono stati generati grafici vulcanici e heatmap utilizzando rispettivamente i pacchetti ggplot2 e pheatmap.

Analisi WGCNA
Per chiarire i potenziali meccanismi della regolazione genica coordinata, definire i modelli di associazione tra moduli di co-espressione e variabili di tratto clinico, e identificare biomarcatori fondamentali o bersagli terapeutici con potenziale traslazionale, è stato applicatoWGCNA 11.

Una rete di coespressione pesata è stata costruita utilizzando il pacchetto WGCNA in R. Il potere di soglia morbida (β) è stato selezionato secondo il criterio della topologia senza scala; il corrispondente valore di β è stato scelto per analisi successive quando l'indice di adattamento a topologia senza scala (R2) ha raggiunto e rimasto sopra 0,8512. Durante l'identificazione del modulo, i parametri relativi al taglio dinamico degli alberi e alla sensibilità al rilevamento dei moduli sono stati ottimizzati per migliorare la risoluzione e la stabilità dei confini del modulo. Infine, sono stati estratti moduli significativamente associati al tratto target e sono stati identificati geni hub intramodulari come set di geni candidati per analisi a valle.

Analisi di arricchimento delle DEG correlate alla FA
Per identificare con precisione i geni hub, i DEG sono stati inizialmente intersecati con i geni dei moduli chiave WGCNA per definire un insieme di geni implicati nella patogenesi AF. Successivamente, questo insieme di geni AF è stato ulteriormente intersecato con geni correlati all'ERS, e i geni sovrapposti risultanti sono stati mantenuti per analisi successive.

L'arricchimento funzionale dei geni selezionati è stato valutato utilizzando le analisi Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). I termini GO sono stati analizzati con il cluster Profiler del pacchetto R per riassumere l'arricchimento tra le categorie13 di processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF). L'analisi KEGG è stata poi utilizzata per identificare le vie arricchite associate ai geni target14. I risultati di arricchimento con un valore P aggiustato < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. I termini GO principali e i percorsi KEGG venivano visualizzati come diagrammi a barre e grafici a bolle usando ggplot2.

Analisi dell'interazione proteina-proteina (PPI)
L'analisi PPI è stata effettuata caricando il set genico intersecato nel database STRING, con l'organismo limitato a Homo sapiens. I nodi scollegati sono stati rimossi e le interazioni sono state recuperate utilizzando una soglia di punteggio di confidenza media (punteggio combinato ≥ 0,4). La rete PPI risultante è stata poi importata in uno strumento di visualizzazione e analisi della rete per l'analisi topologica e l'identificazione dei nodi chiave.

Costruzione di un modello candidato di classificazione AF-ERS basato su 12 algoritmi di apprendimento automatico
In questo studio, è stato sviluppato un quadro di classificazione d'ensemble basato su dodici algoritmi convenzionali di apprendimento automatico per selezionare i geni di firma candidati correlati all'ERS associati all'AF e ottimizzare le prestazioni di classificazione. Per la partizione dei dati, dopo standardizzazione e normalizzazione, GSE41177 e GSE79768 sono stati uniti per generare la matrice di espressione della coorte di addestramento. GSE115574 è stato utilizzato come coorte di validazione esterna indipendente per valutare la generalizzabilità del modello. In particolare, i DEG sono stati identificati per la prima volta nella coorte di addestramento (|log2FC| >0,585, aggiustato p < 0,05). Questi DEG venivano poi intersecati con i geni provenienti dai moduli chiave WGCNA e con i geni correlati all'ERS, e il set genico risultante veniva utilizzato come caratteristica di input per la costruzione del modello.

Per collegare geni correlati all'ERS con il fenotipo AF, è stato sviluppato un modello di classificazione candidato utilizzando 12 approcci di apprendimento automatico: Lasso, Ridge, modello lineare generalizzato a passo a passo (Stepglm), aumento del gradiente estremo (XGBoost), foresta casuale (RF), rete elastica (Enet), regressione parziale dei minimi quadrati per modelli lineari generalizzati (plsRglm), modellazione della regressione potenziata generalizzata (GBM), Bayes naïve, analisi discriminante lineare (LDA), glmBoost, e macchina a vettori di supporto (SVM). È stata adottata una strategia sistematica di modellazione combinatoria aggiungendo un secondo algoritmo al primo e integrandoli tramite il parametro di tuning α, ottenendo 113 combinazioni di selezione di caratteristiche e adattamento del modello che sono state valutate in modo completo. La discriminazione del modello è stata valutata calcolando l'area sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore (AUC). Secondo criteri di selezione del modello precedentemente riportati, il framework finale del candidato è stato definito come il modello con la migliore performance complessiva, valutata dalla media AUC tra le coorti di formazione e validazione.

Questa strategia di modellazione combinatoria è stata informata da studi precedenti nel machine learningbiomedico 15,16,17. Collettivamente, questi studi indicano che nessun singolo algoritmo supera costantemente gli altri in base a dataset e compiti analitici. Sulla base di questa premessa, adottare un framework di apprendimento e modellazione combinatoria in ensemble può aumentare la probabilità di ottenere un modello candidato ad alte prestazioni con una generalizzazione più stabile e migliorare la robustezza della selezione del modello.

Successivamente, sono stati applicati i valori SHapley Additive ExPlanations (SHAP) per interpretare il modello di apprendimento automatico visualizzando le caratteristiche chiave che guidano la classificazione AF, quantificando così il contributo di ciascuna caratteristica all'esito previsto e illustrando come i singoli geni di firma influenzino l'output finaledel modello 18.

Valutazione delle prestazioni del modello e validazione esterna del modello ottimale
La performance del modello ottimale è stata valutata nella coorte di addestramento e nella coorte indipendente di validazione esterna (GSE115574). A livello di modello, è stata costruita una matrice di confusione basata sulle etichette di classe predette, e sono state riportate le corrispondenti metriche di classificazione. Le curve di caratteristica operativa del ricevitore (ROC) venivano generate utilizzando il pacchetto R pROC, e l'AUC veniva calcolato per quantificare le prestazioni discriminative.

A livello di biomarcatore, sono state tracciate curve ROC a singolo gene per ciascun gene chiave nel modello ottimale e sono stati calcolati i corrispondenti AUC per valutarne la capacità discriminatoria individuale. Inoltre, l'espressione differenziale dei geni chiave è stata riassunta utilizzando un grafico vulcanico, e sono stati utilizzati boxplot per rappresentare le loro distribuzioni di espressione in campioni di malattia rispetto a campioni sani. Per valutare ulteriormente la generalizzabilità della firma genica derivata dal modello ottimale precedentemente definita, è stata effettuata un'ulteriore validazione esterna indipendente utilizzando GSE14975. GSE14975 contiene dati trascrivomici provenienti da campioni di appendice atriale sinistra, inclusi cinque campioni di fibrillazione atriale e cinque campioni di ritmo sinusale/controllo. Tutti i geni inclusi nella firma bloccata erano disponibili in questo dataset. Per mantenere la coerenza con il flusso di lavoro analitico originale cross-cohort, la coorte di sviluppo e i GSE14975 sono stati armonizzati utilizzando ComBat con la sorgente del dataset come variabile batch. Questa armonizzazione veniva eseguita in modo non supervisionato. È importante sottolineare che le etichette di malattia/controllo di GSE14975 non sono state utilizzate per la selezione delle caratteristiche, la stima dei coefficienti, la determinazione della soglia o la sintonizzazione degli iperparametri.

Il modello ottimale di punteggio derivato dal modello è stato adattato utilizzando solo la coorte di sviluppo e poi applicato a GSE14975 per la validazione esterna. Le prestazioni del modello in GSE14975 sono state valutate utilizzando analisi della curva caratteristica operativa del ricevitore, area sotto la curva, intervallo di confidenza (IC) al 95%, sensibilità, specificità, accuratezza, valori predittivi positivi e negativi e punteggio Brier. Inoltre, sono state generate curve ROC a singolo gene per tutti i geni ottimali derivati dal modello in GSE14975 per illustrarne la capacità discriminatoria individuale. Per valutare ulteriormente il potenziale overfitting nella coorte di sviluppo, sono state eseguite ripetute 10 validazioni incrociate e correzione dell'ottimismo bootstrap utilizzando la firma genica derivata dal modello ottimale bloccato. Per una validazione incrociata ripetuta, la coorte di sviluppo è stata ripetutamente suddivisa in 10 parti, e la discriminazione dei modelli è stata riassunta in tutte le iterazioni. Per la validazione bootstrap, sono stati generati 1.000 ricampionamenti bootstrap per stimare l'ottimismo delle prestazioni apparenti del set di sviluppo e per calcolare l'AUC corretta dall'ottimismo. Poiché la firma finale è stata derivata dal modello ottimale, il contributo di ciascun gene è stato interpretato principalmente in base alla grandezza assoluta e alla direzione dei coefficienti del modello. Inoltre, in GSE14975 sono state effettuate analisi ROC su un singolo gene per illustrare la capacità discriminatoria individuale di ciascun gene componente. Per scopi di visualizzazione, le curve ROC a gene singolo sono state orientate per riflettere la capacità discriminatoria indipendentemente dal fatto che un'espressione più alta o più bassa fosse associata alla FA.

Analisi dell'arricchimento degli insiemi genici (GSEA)
Per esplorare le implicazioni funzionali dei geni chiave, è stato eseguito il GSEA utilizzando campioni del gruppopatologico 19. Per ciascun gene chiave, i campioni sono stati stratificati in sottogruppi ad alta e bassa espressione utilizzando il valore mediano di espressione nel gruppo della malattia come cutoff. La differenza media di espressione tra i due sottogruppi per ciascun gene è stata calcolata e una lista genica classificata in ordine decrescente è stata generata come input per l'analisi di arricchimento. GSEA è stato condotto utilizzando il cluster package R PackageProfiler, con set genici ottenuti dalla collezione MSigDB c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05. La direzione dell'arricchimento è stata determinata dal segno del punteggio di arricchimento normalizzato (NES), e sono stati generati grafici di arricchimento per i percorsi rappresentativi.

Valutazione dell'abbondanza del sottotipo di cellula immunitaria e dell'espressione differenziale
L'algoritmo di deconvoluzione CIBERSORT è stato applicato per stimare l'abbondanza relativa dei sottoinsiemi di cellule immunitarie infiltranti e le loro interrelazioni tra i campioni. Sulla base della matrice di firma leucocitaria LM22, la composizione delle cellule immunitarie è stata dedotta quantitativamente dai profili di espressione genica utilizzando il pacchetto RCIBERSORT 20. Per filtrare i risultati è stata utilizzata una soglia di p < 0,05, e solo i campioni che soddisfano questo criterio sono stati mantenuti per le analisi successive. Sono stati generati diagrammi a scatola per confrontare le frazioni relative stimate dei sottoinsiemi delle cellule immunitarie tra i gruppi AF e di controllo. Inoltre, l'analisi di correlazione di Spearman è stata effettuata per valutare le associazioni tra i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie e l'espressione genica centrale.

Analisi a singola cella
L'analisi trascrittomica a singola cellula è stata effettuata utilizzando il dataset GEO GSE165838. Le matrici grezze di conteggio delle cellule geniche sono state importate in R e processate utilizzando Seurat v4.4.0. Per ogni campione, veniva generato un oggetto Seurat usando CreateSeuratObject con min.celle = 5 e min.features = 300. Per ciascuna cellula sono stati calcolati metriche di controllo qualità, inclusi il numero di geni rilevati, il totale degli identificatori molecolari unici (UMI), la percentuale di geni mitocondriali, la percentuale di geni ribosomici e la percentuale di gene dell'emoglobina. Le cellule sono state mantenute se avevano più di 500 geni rilevati, meno di 5.000 conteggi UMI, percentuale di geni mitocondriali < 25%, percentuale di geni ribosomici > 3% e percentuale di gene dell'emoglobina < 1%. I geni rilevati in meno di tre cellule sono stati rimossi. Anche MALAT1 e i geni mitocondriali sono stati esclusi prima dell'analisi a valle. DoubletFinder veniva usato per rilevare ed escludere potenziali doppietti. In breve, le cellule sono state divise per identità del campione e il rilevamento del doppio è stato eseguito separatamente per ciascun campione utilizzando i componenti principali 1–30.

Il parametro pN è stato impostato a 0,25 e il valore pK ottimale è stato selezionato secondo la metrica BC massima ottenuta dallo sweeping dei parametri. Il tasso previsto di doppio è stato stimato in base al numero di cellule recuperate in ciascun campione, con tassi del 2,5%, 5% e 6,5% utilizzati per campioni con numeri cellulari relativamente bassi, intermedi e alti, rispettivamente. Sono state trattenute solo le celle classificate come singole singole. La contaminazione da RNA ambientale è stata ulteriormente stimata utilizzando DecontX, e sono state escluse cellule con un punteggio di contaminazione ≥ 0,2. Dopo il controllo di qualità, la rimozione del doppio e il filtraggio dell'RNA ambientale, sono state trattenute 40.886 cellule e 23.947 geni per l'analisi a valle. Il dataset filtrato a singola cellula è stato normalizzato con il metodo LogNormalize utilizzando un fattore di scala di 10.000, seguito dall'identificazione di geni altamente variabili. I dati sono stati poi scalati prima dell'analisi dei componenti principali.

Per ridurre gli effetti batch specifici per campione, Harmony è stato applicato usando orig.ident come variabile batch. La visualizzazione di Approssimazione e Proiezione di Varietà Uniforme (UMAP) e la costruzione del grafo del vicino più prossimo sono state eseguite utilizzando le prime 15 dimensioni corrette perHarmony 21. Il clustering è stato eseguito utilizzando l'algoritmo di Louvain e sono state valutate molteplici risoluzioni di clustering. L'ultima annotazione principale per tipi di cella si basava sul risultato del clustering a risoluzione 0,05. I cluster cellulari venivano annotati manualmente secondo l'espressione canonica dei gene marcatori. Questa strategia di annotazione basata sui marcatori è coerente con precedenti studi di profilazione immunitaria a singolacellula 22. Le cellule T sono state identificate da CD3D, CD3E e TRAC; cellule natural killer (NK) di NKG7, GNLY, NCAM1 e KLRG1; cellule monociti-macrofagi di LYZ, CD14, FCGR3A, CD68, CD163, FCN1, TYROBP, S100A8 e S100A9; cellule B da MS4A1 e CD79A; plasmocellule di MZB1 e XBP1; cellule endoteliali da parte di PECAM1, VWF e CDH5; cellule muscolari lisce vascolari da ACTA2, TAGLN, MYH11 e MYL9; fibroblasti di DCN, LUM, COL1A1, COL1A2 e PDGFRA; cellule simili a neutrofile da FCGR3B, CXCR2, S100A8 e MPO; mastociti tramite TPSB2; e cellule dendritiche da LILRA4, CD1C e XCR1. L'espressione dei geni marcatori tra i cluster è stata visualizzata utilizzando dot plot, e la distribuzione di espressione dei geni hub finali correlati all'ERS è stata visualizzata sugli embeddings UMAP.

Per quantificare l'attività trascrizionale correlata all'ERS a livello di singola cellula, il set finale di geni hub è stato utilizzato per calcolare i punteggi di firma cellulari utilizzando AUCell, analisi di arricchimento del set genico a campione singolo e Seurat AddModuleScore. Per AUCell, le classifiche cellulari sono state costruite dalla matrice di espressione dell'RNA normalizzata, e i punteggi AUC sono stati calcolati utilizzando il set hub-gene con il 10% superiore dei geni classificati come soglia massima di classificazione. Per ssGSEA, i punteggi di arricchimento sono stati calcolati utilizzando il pacchetto GSVA. I tre output di punteggio sono stati centrati e scalati, poi normalizzati al minimo e infine sommati per generare un punteggio composito integrato correlato all'ERS per ciascuna cella. La distribuzione del punteggio composito è stata confrontata tra popolazioni cellulari annotate per valutare l'eterogeneità dei tipi cellulari del programma correlato all'ERS. Poiché la linea monocita-macrofagi ha mostrato un arricchimento di firma ERS prominente ed era strettamente associata al rimodellamento immunitario-infiammatorio, è stata selezionata per analisi successive all'interno della linea. Le cellule monocito-macrofagi sono state suddivise in gruppi con punteggi alti e bassi secondo il punteggio composito mediano correlato all'ERS. L'analisi della traiettoria pseudotemporale è stata poi eseguita sulle cellule monocito-macrofagi utilizzando Monocle.

Per l'analisi del pseudotempo, un oggetto CellDataSet è stato creato dalla matrice di conteggio grezzo utilizzando un modello di espressione binomiale negativa. Sono stati poi stimati fattori di dimensione e dispersioni. I geni di ordinamento sono stati selezionati utilizzando una soglia media di espressione di ≥ 0,1 e una dispersione empirica superiore alla dispersione adattata. La dimensionalità è stata ridotta con l'algoritmo DDRTree e le celle sono state ordinate lungo la traiettoria deferita. Sono stati visualizzati i modelli dinamici di espressione dei geni hub correlati all'ERS lungo il pseudotempo. L'analisi della comunicazione cellulare è stata effettuata utilizzando CellChat per esplorare potenziali interazioni ligando-recettore che coinvolgono cellule monocito-macrofagi con diversi punteggi correlati all'ERS. Per questa analisi, le cellule monocito-macrofagi sono state etichettate come punteggio alto o basso secondo il punteggio composito mediano, mentre altre cellule hanno mantenuto le loro etichette originali del tipo cellulare. La matrice di espressione dell'RNA normalizzata e le corrispondenti annotazioni dei gruppi cellulari sono state utilizzate per creare l'oggetto CellChat. Per l'analisi della comunicazione cellula-cellula, è stato selezionato il database umano CellChatDB e sono state valutate solo le interazioni di segnalazione secrete. Geni sovraespressi e coppie ligando-recettore sono stati rilevati prima di calcolare le probabilità di comunicazione. I gruppi cellulari contenenti meno di 10 cellule sono stati esclusi dall'analisi di interazione. Le probabilità di comunicazione a livello di percorso sono state successivamente stimate e aggregate per confrontare il numero e la forza delle interazioni tra le popolazioni cellulari. Per facilitare la riproducibilità, viene fornita una tabella dei checkpoint qui collega ogni passaggio del protocollo alla corrispondente cifra o tabella di output attesa (File Supplementare 1—Tabella Supplementare S2).

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Risultati

Identificazione di geni espressi differenzialmente nella FA
Per migliorare la comparabilità tra le coorti, sono stati integrati due dataset trascricomici correlati alla FA (GSE41177 e GSE79768) e gli effetti batch sono stati corretti sulla matrice di espressione fusa. La Figura 2A,B mostra i boxplot delle distribuzioni globali di espressione prima e dopo la correzione degli effetti batch, utilizzati per valutare se le dis...

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Discussione

Questo studio ha integrato trascrittomi di massa e unicellulari per indagare il ruolo del ERS nella FA. È stata derivata una firma genica correlata all'ERS con una favorevole discriminazione tra coorti, e questi segnali sono stati mappati prevalentemente alla linea monocito-macrofagio e associati a una comunicazione intercellulare estesa. Collettivamente, i risultati suggeriscono che i programmi associati all'ERS siano abbinati a un rimodellamento incentrato sulle cellule immunitarie nel...

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Dichiarazioni

Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse in quest'opera. Durante la revisione di questo manoscritto, ChatGPT di OpenAI è stato utilizzato solo per assistere nella rifinitura della lingua inglese. Gli autori hanno revisionato, verificato e modificato tutto il testo assistito dall'IA e si assumono la piena responsabilità per l'accuratezza e l'integrità del manoscritto finale. Non sono stati utilizzati strumenti assistiti dall'IA per generare idee di ricerca, analizzare dati, interpretare i risultati, creare figure o tabelle, o trarre conclusioni scientifiche. Il lavoro riportato nell'articolo è stato svolto dagli autori. F.T., PR. W: Scrittura - bozza originale, software, metodologia, visualizzazione, validazione e cura dei dati. SY. T: Indagine e metodologia. FF. B: Supervisione. QR. L: Supervisione, Metodologia, Cura dei dati. XY. J, YX. X: Recupero della letteratura e interpretazione dei dati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AddModuleScoreFunzione Seuratversione 4.4.0NA
AUCellBioconductorversione 1.32.0RRID:SCR_021327
caretCRANversione 7.0.1RRID:SCR_022524
celda / decontXBioconductorversione 1.24.0NA
CellChatGitHub / CellChatversione 2.2.0RRID:SCR_021946
CIBERSORT / LM22 signature matrixCIBERSORTLM22NA
clusterProfilerBioconductorversione 4.12.6RRID:SCR_016884
CytoscapeCytoscape Consortiumversione 3.10RRID:SCR_003032
DoubletFinderGitHub / McGinnis Labversione 2.0.4NA
e1071CRANversione 1.7.16NA
gbmCRANversione 2.2.2NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNational Center for Biotechnology Information (NCBI)GSE41177NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE79768NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE115574NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE14975NA
Gene Expression Omnibus (GEO) databaseNCBIGSE165838NA
glmnetCRANversione 4.1.8NA
HarmonyCRANversione 1.2.4NA
limmaBioconductorversione 3.60.6RRID:SCR_010943
MASSCRANversione 7.3.61NA
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