Questo protocollo descrive un metodo LAMP basato su un chip microfluidico completamente integrato, che consente la rilevazione di 15 patogeni responsabili di infezioni del tratto respiratorio inferiore nei pazienti in terapia intensiva direttamente al letto del paziente entro un'ora.
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Articolo metodologico
Rilevazione rapida point-of-care di patogeni per le infezioni delle basse vie respiratorie in pazienti di terapia intensiva
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Le infezioni del tratto respiratorio inferiore (LRTIs) sono tra le principali cause di peggioramento clinico e decesso nei pazienti gravemente malati. Nell'unità di terapia intensiva (ICU), l'identificazione tempestiva del patogeno responsabile è essenziale per una terapia antimicrobica appropriata; tuttavia, i metodi convenzionali di coltura richiedono da 3 a 5 giorni e presentano tassi di positività subottimali, in particolare per i funghi. Gli approcci molecolari come la PCR riducono i tempi di analisi, ma dipendono ancora dall'estrazione manuale degli acidi nucleici e dal termociclaggio, limitandone l'adeguatezza per l'uso al letto del paziente. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro point-of-care basato su un chip microfluidico completamente integrato di forma discoidale (CD chip) che combina la purificazione degli acidi nucleici mediante microsferette magnetiche con l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Dopo una semplice fase manuale di liquefazione e lisi, il campione processato viene caricato sul chip insieme a due provette di reagenti preconfezionati. Lo strumento esegue quindi autonomamente l'estrazione, l'amplificazione a 65 °C e la lettura in tempo reale della fluorescenza, fornendo risultati qualitativi per 15 bersagli, ovvero 11 batteri, 3 funghi e 1 patogeno atipico, entro 45 minuti di tempo di esecuzione dello strumento (circa 1 ora per l'intero flusso di lavoro da campione a risultato, compreso il passaggio manuale di pre-elaborazione). Presentiamo dati di rilevamento ottenuti da 10 campioni provenienti da pazienti in terapia intensiva, inclusi espettorato, aspirati bronchiali e liquido di lavaggio broncoalveolare, che comprendono sia infezioni monomicrobiche sia co-infezioni polimicrobiche con fino a 7 organismi rilevati su un singolo chip. La progettazione chiusa della cartuccia riduce al minimo il rischio di contaminazione da aerosol e il singolo passaggio di caricamento non richiede formazione specializzata, posizionando questo sistema come uno strumento diagnostico pratico da utilizzare al letto del paziente per i team dell'ICU.
Introduzione
Nei pazienti gravemente malati in terapia intensiva (ICU), le infezioni del tratto respiratorio inferiore, tra cui la polmonite associata al ventilatore (VAP) è la principale, rimangono una causa persistente di morbosità, ventilazione meccanica prolungata e mortalità eccessiva1,4. Il panorama microbiologico delle infezioni del tratto respiratorio inferiore acquisite in ICU differisce notevolmente da quello delle malattie acquisite nella comunità. I batteri Gram-negativi multiresistenti (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) sono predominanti, spesso in associazioni polimicrobiche che complicano le terapie empiriche3,4. I funghi opportunistici aggiungono un ulteriore livello di complessità. L'aspergillosi polmonare invasiva, un tempo considerata un segno distintivo di profonda immunosoppressione, viene oggi diagnosticata con crescente frequenza nei pazienti in ICU non neutropenici, in particolare dopo influenza grave e COVID-195. Gli attuali algoritmi diagnostici per l'aspergillosi associano colture a basso rendimento al test dell'antigene galattomanano (GM), ma il saggio GM è limitato da finestre diagnostiche ben documentate e da una sensibilità variabile negli ospiti non neutropenici6. Ogni ora di ritardo nell'inizio di una terapia antimicrobica appropriata per il sepsi è associata a un aumento misurabile della mortalità7. Nel complesso, la rapidità e la complessità delle infezioni in ICU richiedono strumenti diagnostici in grado di rispondere all'urgenza clinica.
La coltura microbiologica standard, sebbene indispensabile per i test di suscettibilità, è fondamentalmente limitata nella velocità: i tempi di risposta si estendono da 3 a 5 giorni, gli organismi fastidiosi vengono spesso trascurati e la positività della coltura fungina rimane bassa8. Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) offre un'alternativa imparziale, ma la sua adozione clinica è limitata dai costi, dai tempi di elaborazione di 24-48 ore, dalla dipendenza da pipeline bioinformatiche e dalla scarsa fattibilità in punto di cura9. I pannelli basati sulla PCR hanno ridotto il divario temporale, ma richiedono comunque estrazione multi-step degli acidi nucleici, strumentazione per cicli termici e, per i formati convenzionali, elettroforesi post-amplificazione10. Nessuna di queste piattaforme soddisfa pienamente le esigenze convergenti delle terapie intensive: velocità inferiore a un'ora, tempo manuale minimo, copertura multiplex di patogeni inclusi i funghi e semplicità operativa sufficiente per personale non specializzato in laboratorio.
L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) affronta diverse di queste limitazioni. Inizialmente descritta da Notomi et al., questo metodo amplifica il DNA bersaglio a una temperatura costante di 65 °C utilizzando un insieme di quattro a sei primer che riconoscono sei regioni distinte, grazie all'azione di una polimerasi con attività di spostamento del filamento11. La reazione genera strutture caratteristiche di ampliconi a stem-loop e simili a cavolfiori, rilevabili mediante fluorescenza in tempo reale, producendo curve a forma di S entro pochi minuti dal superamento della soglia. La sensibilità a basse concentrazioni di template è elevata e la progettazione con multipli primer conferisce selettività, riducendo i falsi positivi12,13. Quando abbinata a piattaforme basate su chip microfluidici, la LAMP può essere parallelizzata per analizzare più bersagli a partire da un singolo campione14. Studi precedenti hanno dimostrato che i sistemi LAMP su chip possono rilevare patogeni respiratori con un tempo di analisi inferiore a tre ore15. Un limite fondamentale di questi sistemi, tuttavia, è la dipendenza da un'estrazione manuale del DNA effettuata separatamente, che aggiunge tempo, complessità operativa e rischio di contaminazione.
Il sistema qui descritto elimina questo collo di bottiglia. Basato su un chip microfluidico monouso di forma circolare (86 mm di diametro), integra in un'unica cartuccia sigillata il caricamento del campione, la purificazione degli acidi nucleici mediante perline magnetiche e l'amplificazione LAMP in 16-plex (Figura 1). L'operatore esegue un breve passaggio manuale di lisi-liquefazione utilizzando una provetta appositamente progettata, quindi carica il lisato e due fiale di reagenti sul chip (Figura 2). Da quel momento in poi, lo strumento gestisce autonomamente l'estrazione, l'amplificazione isoterma a 65 °C e l'acquisizione della fluorescenza, fornendo risultati qualitativi per 15 bersagli clinicamente rilevanti, ovvero 11 batteri, 3 funghi (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) e 1 agente atipico (Mycoplasma pneumoniae), entro 45 minuti. Un gene della famiglia del breakpoint del neuroblastoma (NBPF), utilizzato come controllo interno, verifica l'idoneità del campione e l'integrità della reazione in ogni saggio. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'intero flusso di lavoro, dalla raccolta del campione in terapia intensiva, attraverso la pre-elaborazione, il caricamento del chip, il rilevamento automatizzato e l'interpretazione dei risultati, destinato sia al personale del laboratorio clinico sia ai team al letto del paziente in terapia intensiva.
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Protocollo
Tutti i campioni sono stati raccolti seguendo un protocollo approvato dal Comitato per la Revisione Etica dell'Ospedale Peking Union Medical College, Accademia Cinese delle Scienze Mediche (Numero di approvazione: I-24PJ1778). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante o dal loro rappresentante legalmente autorizzato prima della raccolta dei campioni. Il pannello dei patogeni bersaglio e l'assegnazione delle pozzette di reazione sono elencati nella Tabella 1, mentre i materiali di consumo utilizzati durante la pre-elaborazione dei campioni sono elencati nella Tabella 2.
1. Raccolta di campioni clinici dalle vie respiratorie inferiori in terapia intensiva
- Prelevamento dell'espettorato
- Sciacquare la cavità orale con acqua pulita o soluzione fisiologica sterile per tre volte, per eliminare residui di cibo e la flora orale commensale.
- Chiedere al paziente di effettuare due o tre respiri profondi, quindi di tossire con forza per espellere direttamente nell'apposito contenitore sterile l'espettorato proveniente dalle profondità delle vie respiratorie.
NOTA: Un campione accettabile è costituito da materiale vischioso, purulento o con striature ematiche proveniente al di sotto della trachea; la saliva chiara o il muco post-nasale non sono adeguati e potrebbero compromettere i successivi test di rilevamento.
- Prelevamento dell'aspirato bronchiale (BAS)
- Per pazienti non intubati, inserire un catetere sterile per aspirazione (un catetere da 10–12 Fr, con la fonte di aspirazione regolata a una pressione di −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) attraverso la via nasale o orale fino a una profondità di circa 30 cm.
- Applicare l'aspirazione ruotando il catetere e ritirarlo lentamente. Raccogliere le secrezioni aspirate in un trappola per campioni sterile.
NOTA: Se le secrezioni sono scarse, instillare circa 5 mL di soluzione salina sterile attraverso il catetere prima dell'aspirazione. - Per pazienti sottoposti a ventilazione meccanica, scegliere il catetere per aspirazione in base alle dimensioni del tubo endotracheale: utilizzare un catetere da 10 Fr per un tubo da 7,0–7,5 mm e un catetere da 12 Fr per un tubo da 8,0 mm.
- Preossigenare il paziente con ossigeno al 100% per 30–60 s prima dell'aspirazione. Scollegare il circuito del ventilatore e inserire il catetere selezionato attraverso l'airway artificiale fino a quando si incontra resistenza.
- Applicare una pressione negativa di −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando ogni passaggio di aspirazione, e quindi il tempo di scollegamento del ventilatore, a non più di 15 s per minimizzare il dereclutamento e l'ipossiemia, e reossigenare il paziente con ossigeno al 100% per 30–60 s dopo l'aspirazione.
- Instillare da 1 a 2 mL di soluzione salina sterile attraverso il catetere e attendere 3 s.
- Applicare l'aspirazione e ritirare il catetere. Raccogliere le secrezioni aspirate in una trappola per campioni sterile. Ricollegare immediatamente il circuito del ventilatore dopo il prelievo del campione.
NOTA: È fondamentale mantenere una tecnica asettica rigorosa per tutta la durata dell'operazione, al fine di evitare contaminazioni nosocomiali del campione.
- Prelevamento del lavaggio broncoalveolare (BALF)
- Individuare il segmento bersaglio tramite imaging toracico. Avanzare il broncoscopio e posizionarlo in modo da ostruire il bronco segmentale o sottosegmentale appropriato.
- Instillare rapidamente aliquote da 20–50 mL di soluzione salina sterile, per un totale di 3–5 aliquote (60–120 mL complessivi). Dopo ogni alique, applicare un'aspirazione delicata e raccogliere il liquido recuperato in un contenitore sterile e sigillato.
ATTENZIONE: È obbligatorio un monitoraggio continuo degli parametri emodinamici e ventilatori durante il BAL nei pazienti in terapia intensiva. Regolare le impostazioni del ventilatore in base alle necessità nei soggetti sottoposti a ventilazione meccanica.
NOTA: Il recupero tipico è del 40–60% del volume instillato. Un recupero scarso potrebbe richiedere il riposizionamento della punta del broncoscopio.
2. Liquefazione e lisi dei patogeni
- Utilizzando la pipetta monouso #2, aspirare il campione fino alla linea indicata (circa 1 mL) e dispensarlo nel tubo di liquefazione. Premere ripetutamente la boccetta della pipetta per trasferire tutto il materiale viscoso, quindi chiudere il tubo con il tappo.
NOTA: Per BALF o espettorato acquoso, caricare due volumi di pipetta per garantire un'adeguata quantità di patogeni. - Agitare vigorosamente a mano il tubo di liquefazione per 1 minuto. Ispezionare visivamente il campione e continuare ad agitare finché non rimangono grumi visibili di muco e il campione scorre liberamente attraverso la pipetta monouso #1 senza resistenza (una consistenza uniforme, simile a quella dell'acqua). Agitare per almeno 1 minuto, prolungando il tempo se necessario per campioni particolarmente viscosi, fino al raggiungimento di questi criteri.
- Aprire il tappo sigillante del tubo di lisi.
- Aspirare circa 0,5 mL del campione omogeneizzato utilizzando la pipetta monouso #1 e dispensare il campione nel tubo di lisi.
- Chiudere il tappo sigillante e verificare che il tappo della punta sia ben avvitato.
- Inserire il tubo di lisi nel dispositivo di pre-elaborazione del campione (dispositivo SP), premendo verso il basso fino a quando non è ben fissato. Premere Avvia.
- Lasciare che il dispositivo SP completi il ciclo automatizzato di liquefazione e lisi (parametri in Tabella 3) della durata di circa 15 minuti.
NOTA: Non aprire né rimuovere il tubo durante l'elaborazione.
3. Caricamento del chip e rilevamento automatico
- Caricamento del reagente e del campione
- Rimuovere la chip CD dallo stoccaggio a 4 °C e portarla a temperatura ambiente (circa 25 °C) per 10 min.
NOTA: I flaconi di reagente O e B e il lisato pretrattato vengono utilizzati a temperatura ambiente; l'amplificazione LAMP in chip viene eseguita a 65 °C (vedere passaggio 3.2.3 e Tabella 3). - Aprire la busta in foglio di alluminio e posizionare la chip su una superficie piana.
- Ruotare il cappuccio in senso antiorario per aprire la chip.
- Dare un colpetto al flacone O per raccogliere il liquido sul fondo del flacone.
- Svitare il flacone O, inserire la cannula nel porto O ed erogare l'intero contenuto nel porto.
- Smaltire il flacone O. Ripetere la procedura utilizzando il flacone B e il porto B.
- Rimuovere il tubo di lisi processato dal dispositivo SP ed eliminare il tappo della punta.
- Allineare la punta del tubo con il porto S ed erogare l'intero volume di lisato nella chip.
- Smaltire il tubo di lisi usato.
- Chiudere ruotando il cappuccio della chip in senso orario fino a quando due scatti udibili confermano una chiusura completa.
NOTA: Un caricamento incompleto di uno qualsiasi dei porti potrebbe causare malfunzionamenti dei singoli canali. Verificare l'erogazione completa prima della chiusura. Per evitare una chiusura incompleta e rischi di contaminazione, non indossare guanti in PE durante la chiusura; si raccomandano guanti in lattice o in nitrile.
- Rimuovere la chip CD dallo stoccaggio a 4 °C e portarla a temperatura ambiente (circa 25 °C) per 10 min.
- Funzionamento dello strumento
- Accendere l'analizzatore automatico di acidi nucleici. Premere Rileva, scansionare il codice a barre sulla busta in foglio di alluminio della chip ed inserire i dati anagrafici del paziente e l'ID del campione.
- Montare la chip sull'alberino rotante e premere verso il basso fino a quando uno scatto conferma l'aggancio.
- Premere Avvia. Lo strumento esegue autonomamente la distribuzione centrifuga dei reagenti, l'estrazione con perle magnetiche, l'amplificazione LAMP a 65 °C e l'acquisizione della fluorescenza. La durata dell'analisi è di circa 45 min (il caricamento di reagenti/campioni e il flusso di lavoro dello strumento sono riassunti in Figura 3).
NOTA: Non aprire il coperchio durante l'esecuzione.
- Interpretazione dei risultati
- Il software identifica il punto di flesso di ciascuna curva di amplificazione a forma di S mediante analisi del massimo della derivata seconda e riporta il corrispondente valore TP (tempo alla positività).
- Confrontare ciascun valore TP con la soglia corrispondente indicata in Tabella 4. Classificare come positivi i canali con valori TP uguali o inferiori alla soglia e come negativi i canali con valori TP superiori alla soglia.
- Verificare che il canale del controllo interno (pozzetto 16) mostri una curva di amplificazione a forma di S con un valore TP inferiore a 12 min.
- Scartare l'analisi se il controllo interno non risulta valido. Ripetere il test utilizzando una chip nuova o raccogliere nuovamente il campione.
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Risultati
Al termine di un'esecuzione valida, lo strumento ha mostrato tracce di fluorescenza in tempo reale per tutti e 16 i canali. I canali positivi hanno mostrato una cinetica di amplificazione a forma di S prevista, con valori di TP annotati automaticamente, mentre i canali negativi sono rimasti al livello di base. Il canale IC (pozzetto 16) ha prodotto una curva a forma di S con TP < 12 min in tutte le esecuzioni valide.
Come dimostrazione pilota e di prova di concetto del protocollo, sono sta...
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Discussione
L'identificazione rapida dei patogeni è fondamentale nella gestione delle infezioni in terapia intensiva. Il sistema descritto riduce il tempo necessario per l'identificazione del patogeno da 3 a 5 giorni, tipicamente richiesti per la coltura, a meno di 1 ora, un lasso di tempo entro il quale spesso vengono effettuate le decisioni sugli antimicrobici di prima linea7. Integrando l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici con un'amplificazione LAMP in 16-plex all'interno di un singolo chip...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Malattie croniche non trasmissibili - Progetto nazionale importante di scienza e tecnologia (n. 2023ZD0516500), Finanziamento nazionale per la ricerca clinica degli ospedali di alto livello (2026-PUMCH-A-103) e Programma di concorso aperto CMB (24-561) e Programma di formazione del personale dell'Ospedale dell'Università Medica di Pechino (n. UGG11571).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Analizzatore Automatico di Acidi Nucleici | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; esegue la distribuzione centrifuga dei reagenti, l'estrazione con perline magnetiche, la LAMP a 65 °C e il rilevamento in tempo reale della fluorescenza (durata ~45 min) |
| Pipetta Pasteur monouso #1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consumabile monouso; 0,5 mL; trasferisce il campione omogeneizzato nel tubo di lisi |
| Pipetta Pasteur monouso #2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consumabile monouso; 2 mL; aspira il campione fino al segno indicato nel tubo di liquefazione |
| Chip CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; disco da 86 mm con zona centrale di caricamento (porte O, B, S), zona di purificazione con perline magnetiche e anello esterno con 16 pozzetti per reazioni (15 bersagli patogeni + controllo interno NBPF) |
| Reagenti per reazione LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Reagenti per reazione LAMP pre-immagazzinati nel chip CD sotto forma di perle liofilizzate |
| Tubo di liquefazione | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; 2 mL/tubo; riceve il campione per l'omogeneizzazione manuale |
| Tubo di lisi | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; 0,5 mL/tubo; corpo in silicone comprimibile con membrana filtrante da 200 µm; reagenti di lisi pre-caricati |
| Primers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Miscela di primer incorporata nella camera di reazione del chip CD |
| Dispositivo di Preelaborazione del Campione | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; ciclo automatizzato di liquefazione–lisi (durata ~15 min) |
| Flaconcino monodose “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; reagente preconfezionato sul chip; uno per test; conservato a 4 °C ed equilibrato a temperatura ambiente (~25 °C) prima del caricamento |
| Flaconcino monodose “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; reagente preconfezionato sul chip; uno per test; conservato a 4 °C ed equilibrato a temperatura ambiente (~25 °C) prima del caricamento |
Riferimenti
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