Questo protocollo descrive un metodo LAMP basato su un chip microfluidico completamente integrato, che consente la rilevazione di 15 patogeni responsabili di infezioni del tratto respiratorio inferiore nei pazienti in terapia intensiva direttamente al letto del paziente entro un'ora.
Articolo metodologico
Rilevazione rapida point-of-care di patogeni per le infezioni delle basse vie respiratorie in pazienti di terapia intensiva
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le infezioni del tratto respiratorio inferiore (LRTIs) sono tra le principali cause di peggioramento clinico e decesso nei pazienti gravemente malati. Nell'unità di terapia intensiva (ICU), l'identificazione tempestiva del patogeno responsabile è essenziale per una terapia antimicrobica appropriata; tuttavia, i metodi convenzionali di coltura richiedono da 3 a 5 giorni e presentano tassi di positività subottimali, in particolare per i funghi. Gli approcci molecolari come la PCR riducono i tempi di analisi, ma dipendono ancora dall'estrazione manuale degli acidi nucleici e dal termociclaggio, limitandone l'adeguatezza per l'uso al letto del paziente. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro point-of-care basato su un chip microfluidico completamente integrato di forma discoidale (CD chip) che combina la purificazione degli acidi nucleici mediante microsferette magnetiche con l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Dopo una semplice fase manuale di liquefazione e lisi, il campione processato viene caricato sul chip insieme a due provette di reagenti preconfezionati. Lo strumento esegue quindi autonomamente l'estrazione, l'amplificazione a 65 °C e la lettura in tempo reale della fluorescenza, fornendo risultati qualitativi per 15 bersagli, ovvero 11 batteri, 3 funghi e 1 patogeno atipico, entro 45 minuti di tempo di esecuzione dello strumento (circa 1 ora per l'intero flusso di lavoro da campione a risultato, compreso il passaggio manuale di pre-elaborazione). Presentiamo dati di rilevamento ottenuti da 10 campioni provenienti da pazienti in terapia intensiva, inclusi espettorato, aspirati bronchiali e liquido di lavaggio broncoalveolare, che comprendono sia infezioni monomicrobiche sia co-infezioni polimicrobiche con fino a 7 organismi rilevati su un singolo chip. La progettazione chiusa della cartuccia riduce al minimo il rischio di contaminazione da aerosol e il singolo passaggio di caricamento non richiede formazione specializzata, posizionando questo sistema come uno strumento diagnostico pratico da utilizzare al letto del paziente per i team dell'ICU.
Introduzione
Nei pazienti gravemente malati in terapia intensiva (ICU), le infezioni del tratto respiratorio inferiore, tra cui la polmonite associata al ventilatore (VAP) è la principale, rimangono una causa persistente di morbosità, ventilazione meccanica prolungata e mortalità eccessiva1,4. Il panorama microbiologico delle infezioni del tratto respiratorio inferiore acquisite in ICU differisce notevolmente da quello delle malattie acquisite nella comunità. I batteri Gram-negativi multiresistenti (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) sono predominanti, spesso in associazioni polimicrobiche che complicano le terapie empiriche3,4. I funghi opportunistici aggiungono un ulteriore livello di complessità. L'aspergillosi polmonare invasiva, un tempo considerata un segno distintivo di profonda immunosoppressione, viene oggi diagnosticata con crescente frequenza nei pazienti in ICU non neutropenici, in particolare dopo influenza grave e COVID-195. Gli attuali algoritmi diagnostici per l'aspergillosi associano colture a basso rendimento al test dell'antigene galattomanano (GM), ma il saggio GM è limitato da finestre diagnostiche ben documentate e da una sensibilità variabile negli ospiti non neutropenici6. Ogni ora di ritardo nell'inizio di una terapia antimicrobica appropriata per il sepsi è associata a un aumento misurabile della mortalità7. Nel complesso, la rapidità e la complessità delle infezioni in ICU richiedono strumenti diagnostici in grado di rispondere all'urgenza clinica.
La coltura microbiologica standard, sebbene indispensabile per i test di suscettibilità, è fondamentalmente limitata nella velocità: i tempi di risposta si estendono da 3 a 5 giorni, gli organismi fastidiosi vengono spesso trascurati e la positività della coltura fungina rimane bassa8. Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS) offre un'alternativa imparziale, ma la sua adozione clinica è limitata dai costi, dai tempi di elaborazione di 24-48 ore, dalla dipendenza da pipeline bioinformatiche e dalla scarsa fattibilità in punto di cura9. I pannelli basati sulla PCR hanno ridotto il divario temporale, ma richiedono comunque estrazione multi-step degli acidi nucleici, strumentazione per cicli termici e, per i formati convenzionali, elettroforesi post-amplificazione10. Nessuna di queste piattaforme soddisfa pienamente le esigenze convergenti delle terapie intensive: velocità inferiore a un'ora, tempo manuale minimo, copertura multiplex di patogeni inclusi i funghi e semplicità operativa sufficiente per personale non specializzato in laboratorio.
L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) affronta diverse di queste limitazioni. Inizialmente descritta da Notomi et al., questo metodo amplifica il DNA bersaglio a una temperatura costante di 65 °C utilizzando un insieme di quattro a sei primer che riconoscono sei regioni distinte, grazie all'azione di una polimerasi con attività di spostamento del filamento11. La reazione genera strutture caratteristiche di ampliconi a stem-loop e simili a cavolfiori, rilevabili mediante fluorescenza in tempo reale, producendo curve a forma di S entro pochi minuti dal superamento della soglia. La sensibilità a basse concentrazioni di template è elevata e la progettazione con multipli primer conferisce selettività, riducendo i falsi positivi12,13. Quando abbinata a piattaforme basate su chip microfluidici, la LAMP può essere parallelizzata per analizzare più bersagli a partire da un singolo campione14. Studi precedenti hanno dimostrato che i sistemi LAMP su chip possono rilevare patogeni respiratori con un tempo di analisi inferiore a tre ore15. Un limite fondamentale di questi sistemi, tuttavia, è la dipendenza da un'estrazione manuale del DNA effettuata separatamente, che aggiunge tempo, complessità operativa e rischio di contaminazione.
Il sistema qui descritto elimina questo collo di bottiglia. Basato su un chip microfluidico monouso di forma circolare (86 mm di diametro), integra in un'unica cartuccia sigillata il caricamento del campione, la purificazione degli acidi nucleici mediante perline magnetiche e l'amplificazione LAMP in 16-plex (Figura 1). L'operatore esegue un breve passaggio manuale di lisi-liquefazione utilizzando una provetta appositamente progettata, quindi carica il lisato e due fiale di reagenti sul chip (Figura 2). Da quel momento in poi, lo strumento gestisce autonomamente l'estrazione, l'amplificazione isoterma a 65 °C e l'acquisizione della fluorescenza, fornendo risultati qualitativi per 15 bersagli clinicamente rilevanti, ovvero 11 batteri, 3 funghi (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) e 1 agente atipico (Mycoplasma pneumoniae), entro 45 minuti. Un gene della famiglia del breakpoint del neuroblastoma (NBPF), utilizzato come controllo interno, verifica l'idoneità del campione e l'integrità della reazione in ogni saggio. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'intero flusso di lavoro, dalla raccolta del campione in terapia intensiva, attraverso la pre-elaborazione, il caricamento del chip, il rilevamento automatizzato e l'interpretazione dei risultati, destinato sia al personale del laboratorio clinico sia ai team al letto del paziente in terapia intensiva.
Protocollo
Tutti i campioni sono stati raccolti seguendo un protocollo approvato dal Comitato per la Revisione Etica dell'Ospedale Peking Union Medical College, Accademia Cinese delle Scienze Mediche (Numero di approvazione: I-24PJ1778). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante o dal loro rappresentante legalmente autorizzato prima della raccolta dei campioni. Il pannello dei patogeni bersaglio e l'assegnazione delle pozzette di reazione sono elencati nella Tabella 1, mentre i materiali di consumo utilizzati durante la pre-elaborazione dei campioni sono elencati nella Tabella 2.
1. Raccolta di campioni clinici dalle vie respiratorie inferiori in terapia intensiva
- Prelevamento dell'espettorato
- Sciacquare la cavità orale con acqua pulita o soluzione fisiologica sterile per tre volte, per eliminare residui di cibo e la flora orale commensale.
- Chiedere al paziente di effettuare due o tre respiri profondi, quindi di tossire con forza per espellere direttamente nell'apposito contenitore sterile l'espettorato proveniente dalle profondità delle vie respiratorie.
NOTA: Un campione accettabile è costituito da materiale vischioso, purulento o con striature ematiche proveniente al di sotto della trachea; la saliva chiara o il muco post-nasale non sono adeguati e potrebbero compromettere i successivi test di rilevamento.
- Prelevamento dell'aspirato bronchiale (BAS)
- Per pazienti non intubati, inserire un catetere sterile per aspirazione (un catetere da 10–12 Fr, con la fonte di aspirazione regolata a una pressione di −0.0267 MPa, equivalente a −200 mmHg) attraverso la via nasale o orale fino a una profondità di circa 30 cm.
- Applicare l'aspirazione ruotando il catetere e ritirarlo lentamente. Raccogliere le secrezioni aspirate in un trappola per campioni sterile.
NOTA: Se le secrezioni sono scarse, instillare circa 5 mL di soluzione salina sterile attraverso il catetere prima dell'aspirazione. - Per pazienti sottoposti a ventilazione meccanica, scegliere il catetere per aspirazione in base alle dimensioni del tubo endotracheale: utilizzare un catetere da 10 Fr per un tubo da 7,0–7,5 mm e un catetere da 12 Fr per un tubo da 8,0 mm.
- Preossigenare il paziente con ossigeno al 100% per 30–60 s prima dell'aspirazione. Scollegare il circuito del ventilatore e inserire il catetere selezionato attraverso l'airway artificiale fino a quando si incontra resistenza.
- Applicare una pressione negativa di −0.0267 MPa (equivalente a −200 mmHg), limitando ogni passaggio di aspirazione, e quindi il tempo di scollegamento del ventilatore, a non più di 15 s per minimizzare il dereclutamento e l'ipossiemia, e reossigenare il paziente con ossigeno al 100% per 30–60 s dopo l'aspirazione.
- Instillare da 1 a 2 mL di soluzione salina sterile attraverso il catetere e attendere 3 s.
- Applicare l'aspirazione e ritirare il catetere. Raccogliere le secrezioni aspirate in una trappola per campioni sterile. Ricollegare immediatamente il circuito del ventilatore dopo il prelievo del campione.
NOTA: È fondamentale mantenere una tecnica asettica rigorosa per tutta la durata dell'operazione, al fine di evitare contaminazioni nosocomiali del campione.
- Prelevamento del lavaggio broncoalveolare (BALF)
- Individuare il segmento bersaglio tramite imaging toracico. Avanzare il broncoscopio e posizionarlo in modo da ostruire il bronco segmentale o sottosegmentale appropriato.
- Instillare rapidamente aliquote da 20–50 mL di soluzione salina sterile, per un totale di 3–5 aliquote (60–120 mL complessivi). Dopo ogni alique, applicare un'aspirazione delicata e raccogliere il liquido recuperato in un contenitore sterile e sigillato.
ATTENZIONE: È obbligatorio un monitoraggio continuo degli parametri emodinamici e ventilatori durante il BAL nei pazienti in terapia intensiva. Regolare le impostazioni del ventilatore in base alle necessità nei soggetti sottoposti a ventilazione meccanica.
NOTA: Il recupero tipico è del 40–60% del volume instillato. Un recupero scarso potrebbe richiedere il riposizionamento della punta del broncoscopio.
2. Liquefazione e lisi dei patogeni
- Utilizzando la pipetta monouso #2, aspirare il campione fino alla linea indicata (circa 1 mL) e dispensarlo nel tubo di liquefazione. Premere ripetutamente la boccetta della pipetta per trasferire tutto il materiale viscoso, quindi chiudere il tubo con il tappo.
NOTA: Per BALF o espettorato acquoso, caricare due volumi di pipetta per garantire un'adeguata quantità di patogeni. - Agitare vigorosamente a mano il tubo di liquefazione per 1 minuto. Ispezionare visivamente il campione e continuare ad agitare finché non rimangono grumi visibili di muco e il campione scorre liberamente attraverso la pipetta monouso #1 senza resistenza (una consistenza uniforme, simile a quella dell'acqua). Agitare per almeno 1 minuto, prolungando il tempo se necessario per campioni particolarmente viscosi, fino al raggiungimento di questi criteri.
- Aprire il tappo sigillante del tubo di lisi.
- Aspirare circa 0,5 mL del campione omogeneizzato utilizzando la pipetta monouso #1 e dispensare il campione nel tubo di lisi.
- Chiudere il tappo sigillante e verificare che il tappo della punta sia ben avvitato.
- Inserire il tubo di lisi nel dispositivo di pre-elaborazione del campione (dispositivo SP), premendo verso il basso fino a quando non è ben fissato. Premere Avvia.
- Lasciare che il dispositivo SP completi il ciclo automatizzato di liquefazione e lisi (parametri in Tabella 3) della durata di circa 15 minuti.
NOTA: Non aprire né rimuovere il tubo durante l'elaborazione.
3. Caricamento del chip e rilevamento automatico
- Caricamento del reagente e del campione
- Rimuovere la chip CD dallo stoccaggio a 4 °C e portarla a temperatura ambiente (circa 25 °C) per 10 min.
NOTA: I flaconi di reagente O e B e il lisato pretrattato vengono utilizzati a temperatura ambiente; l'amplificazione LAMP in chip viene eseguita a 65 °C (vedere passaggio 3.2.3 e Tabella 3). - Aprire la busta in foglio di alluminio e posizionare la chip su una superficie piana.
- Ruotare il cappuccio in senso antiorario per aprire la chip.
- Dare un colpetto al flacone O per raccogliere il liquido sul fondo del flacone.
- Svitare il flacone O, inserire la cannula nel porto O ed erogare l'intero contenuto nel porto.
- Smaltire il flacone O. Ripetere la procedura utilizzando il flacone B e il porto B.
- Rimuovere il tubo di lisi processato dal dispositivo SP ed eliminare il tappo della punta.
- Allineare la punta del tubo con il porto S ed erogare l'intero volume di lisato nella chip.
- Smaltire il tubo di lisi usato.
- Chiudere ruotando il cappuccio della chip in senso orario fino a quando due scatti udibili confermano una chiusura completa.
NOTA: Un caricamento incompleto di uno qualsiasi dei porti potrebbe causare malfunzionamenti dei singoli canali. Verificare l'erogazione completa prima della chiusura. Per evitare una chiusura incompleta e rischi di contaminazione, non indossare guanti in PE durante la chiusura; si raccomandano guanti in lattice o in nitrile.
- Rimuovere la chip CD dallo stoccaggio a 4 °C e portarla a temperatura ambiente (circa 25 °C) per 10 min.
- Funzionamento dello strumento
- Accendere l'analizzatore automatico di acidi nucleici. Premere Rileva, scansionare il codice a barre sulla busta in foglio di alluminio della chip ed inserire i dati anagrafici del paziente e l'ID del campione.
- Montare la chip sull'alberino rotante e premere verso il basso fino a quando uno scatto conferma l'aggancio.
- Premere Avvia. Lo strumento esegue autonomamente la distribuzione centrifuga dei reagenti, l'estrazione con perle magnetiche, l'amplificazione LAMP a 65 °C e l'acquisizione della fluorescenza. La durata dell'analisi è di circa 45 min (il caricamento di reagenti/campioni e il flusso di lavoro dello strumento sono riassunti in Figura 3).
NOTA: Non aprire il coperchio durante l'esecuzione.
- Interpretazione dei risultati
- Il software identifica il punto di flesso di ciascuna curva di amplificazione a forma di S mediante analisi del massimo della derivata seconda e riporta il corrispondente valore TP (tempo alla positività).
- Confrontare ciascun valore TP con la soglia corrispondente indicata in Tabella 4. Classificare come positivi i canali con valori TP uguali o inferiori alla soglia e come negativi i canali con valori TP superiori alla soglia.
- Verificare che il canale del controllo interno (pozzetto 16) mostri una curva di amplificazione a forma di S con un valore TP inferiore a 12 min.
- Scartare l'analisi se il controllo interno non risulta valido. Ripetere il test utilizzando una chip nuova o raccogliere nuovamente il campione.
Risultati
Al termine di un'esecuzione valida, lo strumento ha mostrato tracce di fluorescenza in tempo reale per tutti e 16 i canali. I canali positivi hanno mostrato una cinetica di amplificazione a forma di S prevista, con valori di TP annotati automaticamente, mentre i canali negativi sono rimasti al livello di base. Il canale IC (pozzetto 16) ha prodotto una curva a forma di S con TP < 12 min in tutte le esecuzioni valide.
Come dimostrazione pilota e di prova di concetto del protocollo, sono stati selezionati 10 campioni rappresentativi per illustrare la varietà di scenari clinici riscontrati nella pratica in terapia intensiva, inclusi 6 aspirati bronchiali (BAS), 2 campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) e 2 campioni di espettorato profondo (Spt). Tali campioni sono stati scelti appositamente per comprendere sia casi monomicrobici sia casi polimicrobici complessi, piuttosto che per stimare la prevalenza dei patogeni; 8 dei 10 campioni erano polimicrobici (da 2 a 7 bersagli ciascuno) e 2 erano monomicrobici. I dati completi di TP sono riportati nella Tabella 5, mentre le curve di amplificazione rappresentative sono mostrate nella Figura 4.
All'estremità inferiore dello spettro di complessità, il campione S1 (BAS) ha prodotto un singolo segnale positivo per Aspergillus spp. (TP = 8 min), mentre tutti i canali batterici sono rimasti negativi. Questo profilo era coerente con un'aspergillosi invasiva isolata, una diagnosi che la coltura convenzionale spesso non riesce a rilevare tempestivamente. Il campione S10 (Spt) ha dato in modo simile un singolo risultato positivo per Streptococcus pneumoniae (TP = 5,5 min). Questi risultati hanno dimostrato la capacità del saggio di identificare infezioni monomicrobiche in presenza di un contesto di 15 bersagli patogeni.
Infezioni polimicrobiche sono state osservate nei campioni rimanenti, in accordo con l'epidemiologia delle infezioni respiratorie nei pazienti in terapia intensiva. I campioni S2–S5 contenevano ciascuno Aspergillus spp. insieme a uno o più patogeni batterici e, in due campioni, Candida albicans. Il campione più complesso, S5 (BALF), ha prodotto sette segnali positivi simultanei, inclusi Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Stenotrophomonas maltophilia. Questi risultati hanno dimostrato la capacità di rilevamento multiplex del chip microfluidico a 16 pozzetti in condizioni di test clinico.
I campioni S6–S9, che contenevano co-infezioni batteriche senza coinvolgimento fungino, variavano dalla rilevazione di due agenti patogeni (S6: B. cepacia e E. coli) fino alla rilevazione di quattro agenti patogeni (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae e S. maltophilia). Su tutti e 10 i campioni, i valori di TP per i canali positivi sono compresi tra 3,5 e 9 min, e tutti i canali di controllo interno hanno soddisfatto il criterio predefinito di validità di TP < 12 min.
Per questo set pilota, i risultati ottenuti con il chip sono stati confrontati con due metodi di riferimento eseguiti in parallelo sugli stessi 10 campioni: il sequenziamento metagenomico mirato di nuova generazione (tNGS) e la coltura convenzionale dell'espettorato. La concordanza per ogni bersaglio sui 15 canali patogeni è riassunta nella Tabella 6. Rispetto al tNGS, il saggio ha mostrato una concordanza percentuale positiva (PPA) del 100% e una concordanza percentuale negativa (NPA) del 100% per tutti i bersagli in questi campioni. Rispetto alla coltura dell'espettorato, la PPA è stata del 100% per ogni bersaglio risultato positivo alla coltura, mentre la NPA è variata dal 44,4% al 100%; i valori più bassi di NPA riflettevano bersagli rilevati dal chip (e dal tNGS) ma non isolati tramite coltura, in linea con la maggiore sensibilità analitica dell'amplificazione degli acidi nucleici rispetto alla coltura, piuttosto che con una positività spuria. Considerando la dimensione ridotta e deliberatamente selezionata del campione, questi dati rappresentano stime descrittive della concordanza per la coorte pilota e non sono intesi come misure formali di accuratezza diagnostica. Poiché il tNGS è esso stesso un metodo basato sugli acidi nucleici, l'accordo con il tNGS conferma la concordanza a livello di acido nucleico, senza tuttavia stabilire lo stato clinico di ciascun microrganismo; nessuno dei due metodi, preso singolarmente, è in grado di distinguere un'infezione vera da una colonizzazione.
Figura 1: Architettura del chip microfluidico e materiali di consumo associati. (A) Vista d'insieme del chip a disco di 86 mm, che mostra tre zone concentriche: una regione di caricamento, una regione intermedia per la purificazione con microsferette magnetiche e una regione esterna per l'amplificazione e il rilevamento. (B) Anello esterno per l'amplificazione contenente le 16 pozzette di reazione (posizioni 1, 4, 8, 12 e 16 indicate). (C) Componenti del tubo per la lisi (tappo del puntale, tappo sigillante e corpo del tubo). (D) Fiale monodose con i reagenti "O" e "B". (E) Regione di caricamento con la pozzetta del campione "S" e le pozzette dei reagenti "O" e "B". Abbreviazioni: O = reagente O; B = reagente B; S = campione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Kit di pre-elaborazione e flusso di lavoro della pre-elaborazione del campione. (A) Il campione viene trasferito nel tubo di liquefazione e omogeneizzato mediante agitazione manuale. (B) Il campione omogeneizzato viene trasferito dal tubo di liquefazione al tubo di lisi. (C) Il tubo di lisi viene inserito nel dispositivo di pre-elaborazione del campione (SP) per il ciclo automatizzato di liquefazione-lisi. (D) Materiali monouso per la pre-elaborazione: pipette monouso #1 e #2 (le frecce rosse indicano i segni di caricamento del campione), il tubo di lisi e il tubo di liquefazione. Abbreviazione: SP = Pre-elaborazione del campione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Flusso di lavoro per il caricamento del chip e il rilevamento automatizzato. (A) Il flacone del reagente O, il flacone del reagente B e il campione processato vengono caricati nelle rispettive porte del chip (O, B e S). (B) Il chip viene assemblato e sigillato. (C) Il chip viene montato sull'analizzatore automatico di acidi nucleici e il codice a barre viene scansionato. (D) L'esecuzione viene avviata dallo schermo touch, dopo di che l'estrazione, l'amplificazione e il rilevamento della fluorescenza degli acidi nucleici procedono automaticamente. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Curve di amplificazione rappresentative ottenute da 10 campioni di tratto respiratorio inferiore prelevati da pazienti in terapia intensiva. Ogni pannello rappresenta un singolo campione (S1–S10). Le curve di amplificazione a forma di S indicano bersagli positivi con valori di TP annotati, mentre tracce piatte indicano bersagli negativi. Il campione S1 conteneva solo Aspergillus spp.; i campioni S2–S5 contenevano Aspergillus spp. insieme a patogeni batterici e/o Candida albicans; i campioni S6–S9 presentavano infezioni batteriche polimicrobiche; il campione S10 conteneva solo Streptococcus pneumoniae. I corrispondenti valori di TP sono riportati nella Tabella 5. Abbreviazioni: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = controllo interno; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Pozzetto | Target | Abbreviazione | Categoria | Tipo |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Batteri | Batterio |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | Fungi | Fungo |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Batteri | Batterio |
| 4 | Candida albicans | Cal | Fungi | Fungo |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Batteri | Batterio |
| 6 | Escherichia coli | Eco | Batteri | Batterio |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | Batteri | Batterio |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | Batteri | Batterio |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Batteri | Batterio |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atipico | Batterio atipico |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Batteri | Batterio |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Fungi | Fungo |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Batteri | Batterio |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Batteri | Batterio |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Batteri | Batterio |
| 16 | NBPF (controllo interno) | IC | controllo interno | Controllo interno |
Tabella 1: Pannello dei patogeni bersaglio e assegnazioni dei pozzetti di reazione.
| Consumabile | Specifica/volume | Funzione |
| Tubo di liquefazione | 2 mL/tubo | Riceve il campione; omogeneizzazione manuale |
| Tubo di lisi | 0,5 mL/tubo | Corpo in silicone comprimibile con membrana filtrante da 200 µm; reagenti di lisi pre-caricati |
| Pipetta monouso #1 | 0,5 mL | Trasferisce il campione omogeneizzato nel tubo di lisi |
| Pipetta monouso #2 | 2 mL | Aspira il campione fino alla linea segnata nel tubo di liquefazione |
Tabella 2: Specifiche delle materie di consumo utilizzate durante la pre-elaborazione del campione.
| Passaggio | Temperatura | Durata |
| Liquefazione | 50 °C | 10 min |
| Lisi dei patogeni | 95 °C | 5 min |
| Ciclo totale | — | ~15 min |
Tabella 3: Parametri operativi del ciclo del dispositivo di preelaborazione del campione (SP).
| Target | Soglia TP (min) | Regola di classificazione |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ soglia = positivo |
| Aspergillus spp. | 15,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Burkholderia cepacia | 12,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Candida albicans | 13,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ soglia = positivo |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ soglia = positivo |
| Haemophilus influenzae | 13,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Klebsiella pneumoniae | 15,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Legionella pneumophila | 14,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ soglia = positivo |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ soglia = positivo |
| Pneumocystis jirovecii | 14,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Staphylococcus aureus | 15,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ soglia = positivo |
| Streptococcus pneumoniae | 14,5 | TP ≤ soglia = positivo |
| NBPF (controllo interno) | 12 | Run valido se TP < 12 min |
Tabella 4: Valori soglia di TP utilizzati per la classificazione delle destinazioni.
| Specimen | Tipo | Target rilevato | TP (min) | Cultura / tNGS (reads) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7.5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 55,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6.5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5.5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,221 | ||
| Candida albicans | 7.5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6.5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7.5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8.5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7.5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5.5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6.5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5.5 | + / 8,005 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | + / 28,007 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6.5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3.5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8.5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8.5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5.5 | – / 29,893 |
Tabella 5: Risultati della rilevazione e valori di TP per 10 campioni rappresentativi delle vie respiratorie inferiori prelevati da pazienti in terapia intensiva.
| Obiettivo | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87.5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71.4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44.4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50.0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90.0% |
Tabella 6: Concordanza per bersaglio del saggio con il sequenziamento metagenomico mirato di nuova generazione (tNGS) e la coltura convenzionale dell'espettorato per i 10 campioni rappresentativi. Per ciascuno dei 15 bersagli patogeni, sono riportati il numero di risultati positivi e negativi ottenuti con ciascun metodo e la corrispondente percentuale di accordo positivo (PPA) e percentuale di accordo negativo (NPA). Abbreviazioni: PPA = percentuale di accordo positivo; NPA = percentuale di accordo negativo; tNGS = sequenziamento metagenomico mirato di nuova generazione; PPA/NPA indicati come "/" nei casi in cui non erano disponibili risultati di riferimento positivi (o negativi).
| N. | Agente patogeno | Limite di rilevabilità (copie/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1.000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2.000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2.000 |
| 4 | Candida albicans | 1.000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1.000 |
| 6 | Escherichia coli | 4.000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2.000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4.000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2.000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1.000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2.000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1.000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2.000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2.000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4.000 |
| 16 | Controllo interno (NBPF) | Non applicabile (controllo interno) |
Tabella 7: Limite analitico di rilevazione (LoD) per ciascun target del pannello. Il LoD è stato determinato utilizzando acido nucleico genomico quantificato mediante digital PCR, aggiunto in quantità nota in un campione negativo di liquido da lavaggio broncoalveolare, diluito in serie e analizzato in triplice replicato, ed è stato definito come la concentrazione più bassa rilevata in almeno il 95% dei replicati. I valori sono espressi in copie/mL. Abbreviazione: LoD = limite di rilevazione.
| Dimensione | POCT (questo saggio) | Cultura dell'espettorato | PCR convenzionale | mNGS |
| Tempo di risposta | ~1 h | 2–5 giorni | 4–8 h | > 24 h |
| Competenza richiesta all'operatore | Bassa | Alta | Alta | Alta |
| Requisiti di laboratorio | Bassi; al letto del paziente | Alti; laboratorio di batteriologia | Alti; laboratorio PCR | Alti; struttura specializzata |
| Investimento in attrezzature | Basso–moderato | Basso | Moderato | Alto |
| Costo per test | Moderato | Basso | Moderato | Alto |
| Sensibilità analitica | Alta | Bassa | Alta | Alta |
| Vantaggio principale | Completamente integrato, da campione a risultato, senza operazioni specializzate | Standard di riferimento; fornisce informazioni sulla suscettibilità | Alta sensibilità; quantitativo | Non prevenuto; rileva patogeni rari o inattesi; risolve casi complessi |
Tabella 8: Confronto qualitativo dell'attuale saggio diagnostico al punto di cura con la coltura dell'espettorato, la PCR convenzionale e il sequenziamento metagenomico. I metodi vengono confrontati in base al tempo di risposta, al livello di competenza richiesto all'operatore, ai requisiti di infrastruttura di laboratorio, all'investimento in attrezzature, al costo per test, alla sensibilità analitica e ai principali vantaggi. Abbreviazioni: POCT = test diagnostici al punto di cura; PCR = reazione a catena della polimerasi; mNGS = sequenziamento metagenomico di nuova generazione.
Discussione
L'identificazione rapida dei patogeni è fondamentale nella gestione delle infezioni in terapia intensiva. Il sistema descritto riduce il tempo necessario per l'identificazione del patogeno da 3 a 5 giorni, tipicamente richiesti per la coltura, a meno di 1 ora, un lasso di tempo entro il quale spesso vengono effettuate le decisioni sugli antimicrobici di prima linea7. Integrando l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici con un'amplificazione LAMP in 16-plex all'interno di un singolo chip sigillato, questo flusso di lavoro elimina il passaggio manuale di estrazione del DNA, che rappresentava il principale collo di bottiglia operativo delle precedenti piattaforme basate su chip LAMP15. Il risultato è una singola procedura di caricamento che può essere eseguita da personale privo di formazione specialistica in biologia molecolare.
Diversi aspetti procedurali richiedono particolare attenzione. La qualità del campione è essenziale. I campioni respiratori profondi, come l'aspirato bronchiale o il lavaggio broncoalveolare, sono preferibili rispetto all'espettorato espulso nei pazienti ventilati, nei quali la contaminazione orofaringea potrebbe oscurare il segnale del vero agente patogeno. La liquefazione incompleta è la causa più comune di lisi subottimale; pertanto, l'agitazione manuale deve proseguire fino a quando il campione non abbia chiaramente raggiunto una consistenza acquosa. Durante il caricamento del chip, lo svuotamento incompleto della provetta del reagente o del tubo di lisi potrebbe privare le pozzette a valle del materiale necessario, causando errori specifici per canale che potrebbero essere interpretati erroneamente come risultati negativi. Inoltre, la chiusura a doppio scatto del cappuccio del chip non è soltanto una caratteristica meccanica; è necessaria per mantenere lo spazio di testa sigillato richiesto per l'amplificazione isoterma e per prevenire la perdita per evaporazione.
La risoluzione dei problemi è relativamente semplice. L'espettorato viscoso proveniente dalle terapie intensive può richiedere un'agitazione manuale più lunga del minuto raccomandato. Campioni diluiti, in particolare il lavaggio broncoalveolare, potrebbero richiedere un volume di pipettaggio doppio rispetto al volume standard per compensare la minore densità di patogeni. Il fallimento del controllo interno, definito dall'assenza di una curva di amplificazione a forma di S o da un valore di TP superiore a 12 minuti, indica una cellularità del campione insufficiente oppure un malfunzionamento del sistema fluidico all'interno del chip. In tali casi, la procedura corretta consiste nel raccogliere un nuovo campione o ripetere il test utilizzando un chip nuovo, piuttosto che reinterpretare i singoli canali.
Questo metodo presenta anche importanti limitazioni. Il pannello è limitato a 15 bersagli predefiniti e non è in grado di rilevare organismi al di fuori di questo elenco, inclusi molti determinanti di resistenza agli antimicrobici. Ogni set di primer mira a una regione conservata e specifica per la specie dell'organismo previsto, fatta eccezione per il saggio a livello di genere Aspergillus; pertanto, specie o ceppi non inclusi nel pannello non vengono rilevati, e il pannello non cattura la variabilità a livello di ceppo all'interno delle specie. Poiché ciascuna delle 16 pozzette contiene un set di primer liofilizzato dedicato, il pannello è modulare e può essere riorganizzato nelle versioni future per aggiungere nuovi bersagli.
L'esito del saggio è qualitativo. Sebbene i valori di TP possano mostrare una relazione approssimata con il carico di patogeni, non possono sostituire i risultati quantitativi ottenuti tramite coltura o le stime basate sulla PCR derivate dai valori di soglia del ciclo. Come per ogni test di amplificazione degli acidi nucleici eseguito su campioni respiratori, il saggio da solo non è in grado di distinguere tra colonizzazione e infezione vera e propria. L'interpretazione clinica deve quindi integrare i risultati del chip con marcatori infiammatori come la proteina C-reattiva e la procalcitonina, esiti di imaging, biomarcatori fungini tra cui il galattomanano e il (1,3)-β-D-glucano, e l'andamento clinico complessivo. Inoltre, il sistema non fornisce dati sulla sensibilità agli antimicrobici, e la coltura convenzionale rimane indispensabile a tale scopo.
Infine, tutti i campioni inclusi in questo studio sono stati ottenuti da una singola terapia intensiva di terzo livello e la prevalenza degli agenti patogeni e i modelli di co-infezione potrebbero differire tra istituzioni e popolazioni di pazienti. Il presente lavoro deve pertanto essere considerato una dimostrazione pilota, a titolo di prova di principio, del protocollo su un piccolo insieme di campioni rappresentativi, selezionati deliberatamente; non è stato progettato per stimare l'accuratezza diagnostica. La sensibilità e specificità clinica per ogni bersaglio, nonché la concordanza sistematica con la coltura convenzionale e il sequenziamento metagenomico di nuova generazione (mNGS), saranno stabilite in uno studio prospettico, multicentrico, con arruolamento consecutivo, già pianificato.
Come prima misura della prestazione analitica, il limite di rilevamento (LoD) per ciascun bersaglio è stato stimato utilizzando acido nucleico genomico quantificato mediante digital PCR, aggiunto in una matrice negativa di fluido di lavaggio broncoalveolare. I campioni sono stati diluiti in serie e analizzati in triplice replicato. Il LoD è stato definito come la concentrazione più bassa rilevata in almeno il 95% delle repliche. I valori di LoD ottenuti sono compresi tra 1.000 e 4.000 copie/mL per l'intero pannello (Tabella 7). Poiché in questo studio pilota non era disponibile una quantificazione basata sul conteggio di colonie per ciascun organismo, queste stime di LoD verranno affinate in lavori futuri utilizzando ceppi di riferimento formalmente enumerati.
Il confronto con gli approcci diagnostici esistenti chiarisce ulteriormente la posizione di questa piattaforma. La coltura convenzionale, sebbene lenta, rimane lo standard di riferimento e fornisce informazioni sulla suscettibilità. Il sequenziamento metagenomico di nuova generazione offre una copertura degli organismi molto più ampia, ma a un costo notevolmente maggiore, tempi di consegna più lunghi (tipicamente 24–48 h) e con requisiti bioinformatici che molte terapie intensive non possono sostenere in loco9. I comuni test multiplex basati sulla PCR riducono il tempo necessario per ottenere un risultato, ma richiedono comunque generalmente un'estrazione separata degli acidi nucleici e, a seconda della piattaforma, una lavorazione per lotti che può introdurre ulteriori ritardi10.
Dal punto di vista dei costi, sebbene un'analisi formale di costo-efficacia fosse al di là dell'ambito di questo studio pilota, la piattaforma affronta i principali fattori di costo nel mondo reale in terapia intensiva, inclusi sia il coltura batterica che la PCR convenzionale o multiplex (un confronto qualitativo tra i metodi è riportato nella Tabella 8). Fornisce risultati in circa 1 h, rispetto alle 2–5 giorni richiesti dalla coltura dell'espettorato, 4–8 h per la PCR convenzionale (che tipicamente richiede un'elaborazione a lotti) e >24 h per il sequenziamento metagenomico. Poiché il flusso di lavoro è completamente integrato (dal campione al risultato), richiede un solo passaggio manuale di caricamento, senza estrazione separata degli acidi nucleici, può essere eseguito al letto del paziente senza la necessità di un laboratorio dedicato di batteriologia o molecolare né di personale specializzato in biologia molecolare, e utilizza una cartuccia chiusa monouso che riduce i test ripetuti dovuti a contaminazioni. Anche i costi dell'attrezzatura sono contenuti, evitando la necessità di uno strumento per PCR quantitativa in tempo reale o di una piattaforma per sequenziamento. Per i pazienti gravemente malati in terapia intensiva, questo rapido tempo di risposta potrebbe ridurre la durata di una terapia empirica inadeguata e abbreviare la degenza, offrendo un beneficio indiretto ma potenzialmente significativo in termini di costi.
Il sistema attuale occupa una nicchia ben definita caratterizzata da tempi rapidi di risposta, semplicità operativa e sicurezza biologica garantita dalla cartuccia chiusa, caratteristiche che congiuntamente rendono possibile l’implementazione al letto del paziente. L’inclusione di tre bersagli fungini rappresenta una caratteristica particolarmente importante. Aspergillus spp. è stato rilevato in 5 dei 10 campioni (intervallo TP: 5,5–8 min). Considerando i noti limiti della coltura e la finestra diagnostica limitata del test del galattomanano per Aspergillus5,6, un segnale molecolare disponibile entro 45 minuti potrebbe permettere un’analisi più precoce di una terapia antifungina mirata, sebbene il valore clinico di questo segnale anticipato dovrà essere confermato mediante studi prospettici.
Sono evidenti diverse direzioni future. L'ampliamento del pannello per includere, come minimo, i geni determinanti della resistenza ai carbapenemi e il gene mecA, contribuirebbe a colmare il divario tra l'identificazione del patogeno e la scelta empirica degli antimicrobici. Inoltre, all'aumentare dei set di dati TP, modelli di apprendimento automatico addestrati su profili di amplificazione abbinati a metadati clinici potrebbero in futuro aiutare a distinguere la colonizzazione dall'infezione vera e propria, sebbene tali applicazioni richiederanno una rigorosa validazione prospettica. Più in generale, sarà necessaria una valutazione multicentrica su popolazioni di terapia intensiva geograficamente diverse prima che le prestazioni diagnostiche di questa piattaforma possano essere considerate generalizzabili.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Malattie croniche non trasmissibili - Progetto nazionale importante di scienza e tecnologia (n. 2023ZD0516500), Finanziamento nazionale per la ricerca clinica degli ospedali di alto livello (2026-PUMCH-A-103) e Programma di concorso aperto CMB (24-561) e Programma di formazione del personale dell'Ospedale dell'Università Medica di Pechino (n. UGG11571).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Analizzatore Automatico di Acidi Nucleici | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; esegue la distribuzione centrifuga dei reagenti, l'estrazione con perline magnetiche, la LAMP a 65 °C e il rilevamento in tempo reale della fluorescenza (durata ~45 min) |
| Pipetta Pasteur monouso #1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consumabile monouso; 0,5 mL; trasferisce il campione omogeneizzato nel tubo di lisi |
| Pipetta Pasteur monouso #2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consumabile monouso; 2 mL; aspira il campione fino al segno indicato nel tubo di liquefazione |
| Chip CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; disco da 86 mm con zona centrale di caricamento (porte O, B, S), zona di purificazione con perline magnetiche e anello esterno con 16 pozzetti per reazioni (15 bersagli patogeni + controllo interno NBPF) |
| Reagenti per reazione LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Reagenti per reazione LAMP pre-immagazzinati nel chip CD sotto forma di perle liofilizzate |
| Tubo di liquefazione | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; 2 mL/tubo; riceve il campione per l'omogeneizzazione manuale |
| Tubo di lisi | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; 0,5 mL/tubo; corpo in silicone comprimibile con membrana filtrante da 200 µm; reagenti di lisi pre-caricati |
| Primers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Miscela di primer incorporata nella camera di reazione del chip CD |
| Dispositivo di Preelaborazione del Campione | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; ciclo automatizzato di liquefazione–lisi (durata ~15 min) |
| Flaconcino monodose “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; reagente preconfezionato sul chip; uno per test; conservato a 4 °C ed equilibrato a temperatura ambiente (~25 °C) prima del caricamento |
| Flaconcino monodose “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consumabile monouso; reagente preconfezionato sul chip; uno per test; conservato a 4 °C ed equilibrato a temperatura ambiente (~25 °C) prima del caricamento |
Riferimenti
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