Protocollo di trasfezione inversa ottimizzato per l'erogazione di mRNA della telomerasi in fibroblasti umani in fase di senescenza precoce

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

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Articolo metodologico

Protocollo di trasfezione inversa ottimizzato per l'erogazione di mRNA della telomerasi in fibroblasti umani in fase di senescenza precoce

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DOI:

10.3791/71538

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18 agosto 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo di trasfezione inversa ottimizzato per il trasferimento efficiente di mRNA umano della telomerasi a trascrittasi inversa modificato a livello di nucleosidi (hTERT mRNA) in fibroblasti umani senescenti. Il pre-trattamento delle superfici di coltura con complessi mRNA hTERT-lipidi migliora l'assorbimento, consentendo l'attivazione della telomerasi, l'allungamento dei telomeri e un parziale ringiovanimento. Le colture rientrano infine in senescenza o in crisi senza raggiungere l'immortalizzazione.

Abstract

La senescenza cellulare è associata a profonde alterazioni della fisiologia cellulare, tra cui ridotta fluidità della membrana, alterato traffico endosomiale, capacità endocitica diminuita e aumento dell'attività di RNasi extracellulari, tutti fattori che ostacolano un efficiente trasferimento di mRNA. Queste barriere hanno limitato l'applicazione di approcci basati sull'RNA in cellule senescenti, in particolare per il trasferimento di trascritti terapeutici di grandi dimensioni. Questo protocollo descrive un metodo di transfezione inversa ottimizzato per il trasferimento efficiente di RNA messaggero (mRNA) modificato in fibroblasti umani senescenti. Sebbene sia stato utilizzato l'mRNA della telomerasi umana (hTERT) come trascritto modello, il flusso di lavoro è ampiamente applicabile ad altri mRNA. A differenza dei metodi convenzionali di transfezione, nei quali i complessi RNA-lipidi vengono aggiunti al mezzo di coltura dopo l'adesione cellulare, la transfezione inversa deposita i complessi sulla superficie della coltura prima della semina delle cellule, consentendo un'interazione diretta tra le cellule in adesione e i complessi di transfezione. Per massimizzare l'efficienza di transfezione, il protocollo prevede l'utilizzo di mRNA con nucleosidi modificati contenenti pseudouridina e 5-metilcitosina, code poli(A) prolungate, tempistiche ottimizzate per la formazione dei complessi, inibizione delle RNasi, aumento transitorio del pH endosomiale con cloroquina, densità di semina cellulare aumentata e periodi di incubazione prolungati. Con questo approccio, sono state raggiunte efficienze di transfezione di circa il 50%–80% in fibroblasti senescenti dopo il trasferimento di un trascritto di mRNA hTERT di 5 kb. L'attività telomerasica massima è stata rilevata 24–48 h dopo la transfezione. Un singolo ciclo di transfezione ha prodotto un allungamento misurabile dei telomeri, mentre tre transfezioni consecutive hanno determinato un'estensione telomerica sostanziale ma finita. È stata osservata una parziale inversione dei fenotipi associati alla senescenza entro 72–96 h, inclusa una riduzione dell'attività della β-galattosidasi associata alla senescenza, una diminuzione dell'espressione di p16 e p21, il ripristino della morfologia cellulare e un prolungamento della durata replicativa della cellula. L'mRNA trasferito è stato degradato entro 72–96 h e non è stata osservata immortalizzazione. Questo protocollo fornisce un approccio pratico per il trasferimento transitorio di mRNA in cellule senescenti e potrebbe essere adattato a un'ampia gamma di tipi cellulari e specie.

Introduzione

L'approccio della trasfezione inversa rappresenta un'adattazione metodologica fondamentale per le cellule senescenti, superando le barriere fondamentali che queste cellule oppongono ai metodi di trasfezione standard. A differenza della trasfezione diretta, in cui le cellule vengono seminate in anticipo e lasciate aderire prima dell'aggiunta dei complessi di trasfezione, la trasfezione inversa prevede l'aggiunta diretta di cellule in sospensione sui complessi preformati di mRNA di hTERT e lipidi. Questa tecnica aumenta notevolmente l'efficienza di trasfezione nelle cellule senescenti, massimizzando l'esposizione ai complessi di trasfezione durante la fase critica di adesione, quando il rimodellamento della membrana è più attivo.

Il cambiamento concettuale fondamentale del protocollo consiste nel considerare le cellule senescenti come un problema distinto di somministrazione, e non semplicemente come versioni difficili da trasfettare di cellule giovani. Nella senescenza, cambiamenti globali nella composizione lipidica della membrana, inclusi fosfolipidi, sfingolipidi e colesterolo, alterano la fluidità della membrana, la curvatura e le interazioni proteina-lipidi, contribuendo contemporaneamente al fenotipo secretorio associato alla senescenza¹^,²^,³. Le cellule senescenti mostrano inoltre una ridotta endocitosi mediata da clatrina e caveole e un diverso indirizzamento endocitico, determinati in parte dalla down-regolazione dell'amphiphysin-1 e da cambiamenti compensativi nell'espressione della caveolina, che attenuano l'assorbimento e il segnale mediati dai recettori⁴^,⁵^,⁶. Parallelamente, l'asse dei late endosomi- lisosomi regolato da Rab7 e la più ampia rete endosomiale-autofagica-lisosomiale (EAL) diventano disregolati, con Rab7 che agisce come regolatore principale della maturazione endolisosomiale e della fusione autofagosoma-lisosoma, processi alterati nell'invecchiamento e nelle malattie neurodegenerative⁷.

Le cellule senescenti spesso aumentano l'espressione di diversi componenti del sistema di elaborazione e adattamento lisosomiale (LYPAS), inclusa la biogenesi lisosomiale mediata da TFEB/TFE3 e l'autofagia mediata da chaperoni, aumentando così la massa lisosomiale. Tuttavia, i singoli lisosomi mostrano frequentemente un pH luminale elevato, danni alla membrana e una capacità proteolitica alterata, contribuendo alla disfunzione lisosomiale nonostante il loro aumento di numero⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Nel complesso, questi cambiamenti possono indirizzare più efficientemente il materiale internalizzato verso compartimenti endolisosomiali degradativi, aumentando la probabilità che l'RNA o le proteine consegnati vengano degradati prima del rilascio produttivo nel citosol⁹^,¹⁰^,¹¹. La trasfezione inversa mira direttamente alla fase iniziale in cui le membrane stanno subendo rimodellamento, durante l'adesione, imponendo un contatto sostenuto e ad alta affinità tra le cellule e i complessi mRNA-lipidi, aggirando almeno in parte l'endocitosi compromessa allo stato stazionario nelle cellule senescenti completamente aderenti⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Per quanto riguarda la progettazione dell'RNA, il protocollo presuppone che, in un contesto di invecchiamento, una semplice cappuccio + coda poliadenilica di base sia insufficiente: la modifica completa dei nucleosidi (ad esempio, pseudouridina o N1-metilpseudouridina più 5-metilcitosina) è considerata imprescindibile per dissociare la traduzione dal riconoscimento da parte dei recettori Toll-like endosomiali e dall'induzione dell'interferone di tipo I. Studi fondamentali hanno dimostrato che l'incorporazione di nucleosidi modificati nell'RNA sopprime l'attivazione di TLR3, TLR7 e TLR8 e riduce in modo significativo la produzione di citochine da parte delle cellule dendritiche, fornendo una base meccanicistica alla ridotta immunogenicità innata delle attuali piattaforme di mRNA con nucleosidi modificati¹³. Recenti revisioni sui vaccini mRNA–LNP e sui farmaci a base di mRNA sottolineano l'ingegnerizzazione coordinata del cappuccio 5′, delle regioni non tradotte (UTR), della sequenza codificante e della coda poli(A) per aumentare la stabilità e la traduzione in vivo, minimizzando al contempo l'attivazione della risposta immunitaria innata¹⁴. In particolare, la lunghezza e l'architettura della coda poli(A) si sono rivelate determinanti chiave della stabilità e dell'efficienza traduzionale dell'mRNA trascritto in vitro, giustificando l'uso di code poli(A) allungate o ingegnerizzate nei mRNA terapeutici¹⁵.

Su questo strato, il protocollo incorpora esplicitamente protezioni contro le RNasi extracellulari ed endosomiali durante la formazione e l'assunzione dei complessi, insieme a una finestra definita di fuga dagli endosomi mediante l'uso di un agente lisosomotropo transitorio come la cloroquina¹⁶^,¹⁷. La cloroquina è da tempo utilizzata come sonda funzionale per studiare le barriere endosomiali e può aumentare notevolmente l'interazione con il bersaglio e il silenziamento indotto da siRNA o oligonucleotidi antisenso, promuovendo la rottura della membrana endosomiale e il rilascio del carico di acidi nucleici nel citosol¹⁸. Allo stesso tempo, l'analisi mediante imaging in cellule vive e a super-risoluzione dell'mRNA veicolato da nanoparticelle lipidiche (LNP) ha dimostrato che il successo del rilascio è fortemente limitato da rari eventi di fuga dagli endosomi precoci o di recupero, piuttosto che dall'assunzione iniziale in sé, sottolineando l'importanza di progettare in modo mirato un passaggio di fuga dagli endosomi per i farmaci a base di mRNA¹⁹.

Collettivamente, queste alterazioni associate alla senescenza nella dinamica della membrana, nel traffico endocitico, nell'elaborazione lisosomiale e nell'attivazione dell'immunità innata creano barriere sostanziali per una consegna efficiente dell'mRNA. La strategia di retro-trasfezione qui descritta è stata sviluppata per superare tali limitazioni combinando un'ingegnerizzazione ottimizzata dell'mRNA, la protezione dalle RNasi, un migliorato rilascio endosomiale e l'esposizione diretta delle cellule in adesione a complessi preformati di mRNA e lipidi. Sebbene l'mRNA di hTERT venga utilizzato come carico modello, il flusso di lavoro è ampiamente applicabile alla consegna di altri trascritti terapeutici di grandi dimensioni in popolazioni cellulari senescenti e difficili da trasfettare²⁰^,²¹^,²².

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Protocollo

1. Trascrizione in vitro dell'mRNA di hTERT

Trascrizione in vitro (IVT) con ARCA e ΨUTP
1. Preparare una reazione IVT di 20 µL secondo la Tabella 1. Aumentare linearmente la scala della reazione se è richiesta una resa maggiore.
2. Combinare tutti i componenti della reazione tranne la polimerasi T7 in una provetta priva di RNasi. Aggiungere la polimerasi T7 per ultima, mescolare delicatamente e centrifugare brevemente la provetta.
3. Incubare la reazione a 37 °C per 0,5–4 h.
  NOTA: Regolare il tempo di incubazione in base alla lunghezza del template. Incubare le reazioni contenenti template più corti (circa 500 bp) per circa 30 min e quelle contenenti template più lunghi (circa 4 kb) per 3–4 h.
Trattamento con DNasi
1. Aggiungere direttamente 1 µL di DNasi I priva di RNasi alla miscela di reazione IVT.
2. Incubare la reazione a 37 °C per 15 min.
  NOTA: Il trattamento con DNasi deve essere eseguito direttamente nella reazione IVT senza purificazione preliminare dell'mRNA sintetizzato.
Purificazione dell'mRNA
1. Aggiungere 115 µL di H₂O priva di nucleasi per diluire la miscela di reazione.
2. Purificare l'mRNA utilizzando un kit di pulizia dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
3. Eluire l'mRNA purificato in 20–30 µL di H₂O priva di nucleasi.
4. Verificare la purezza dell'mRNA mediante spettrofotometria e controllare l'integrità dell'RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio denaturante al 1,0–1,5% o su gel di poliacrilammide a bassa percentuale.
Aggiunta della coda poli(A)
1. Preparare una reazione di poliadenilazione di 50 µL secondo la Tabella 2. Mescolare delicatamente i componenti della reazione e incubare a 37 °C per 30–60 min.
  NOTA: Regolare il tempo di incubazione in base alla quantità di RNA in ingresso.
2. Terminare la reazione aggiungendo 2 µL di EDTA 0,5 M (pH 8,0).
Purificazione finale e controllo di qualità
1. Purificare l'mRNA con coda poli(A) utilizzando un kit di pulizia dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
2. Eluire l'mRNA purificato in 20–30 µL di H₂O priva di nucleasi.
3. Valutare la qualità dell'mRNA prima di procedere con la trasfezione
  1. Misurare la concentrazione dell'mRNA a 260 nm e determinare la purezza utilizzando i rapporti A260/A280 e A260/A230. Utilizzare preparazioni di mRNA con valori di A260/A280 di circa 2,0 e valori di A260/A230 superiori a 2,0.
  2. Valutare l'integrità dell'mRNA mediante elettroforesi su gel o un sistema di analisi dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Confermare la lunghezza della coda poli(A) mediante RT-PCR o analisi con Bioanalyzer. Verificare che la lunghezza della coda poli(A) sia compresa tra 120 e 200 nucleotidi.
  4. Aliquotare l'mRNA purificato e conservare le aliquote a −80 °C per ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento.

2. Trasfezione inversa

Giorno −1: Preparazione pre-trasfezione
1. Verificare il fenotipo senescente
  1. Eseguire la colorazione per la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) su un campione rappresentativo di cellule. Verificare che oltre il 70% delle cellule sia positivo.
  2. Confermare l'espressione dei marcatori di senescenza (p16 e p21) mediante qRT-PCR o immunofluorescenza.
  3. Determinare la vitalità cellulare e verificare che superi il 90%.
2. Preparare i reagenti
  1. Riscaldare in anticipo il mezzo di coltura completo a 37 °C.
  2. Riscaldare in anticipo il tampone salino fosfato (PBS) a 37 °C.
  3. Preparare del mezzo Opti-MEM I fresco.
    NOTA: Non aggiungere inibitore di RNasi all'Opti-MEM I prima dell'uso.
Giorno 0: Giorno della trasfezione
NOTA: Prevedere circa 3 h tra la preparazione dei reagenti e l'incubazione delle cellule trasfettate.
1. Preparazione dell'mRNA di hTERT
  1. Scongelare l'mRNA di hTERT sul ghiaccio. Misurare la concentrazione di mRNA e utilizzare preparazioni con concentrazioni comprese tra 0,5 e 1,0 µg/µL.
  2. Diluire la quantità desiderata di mRNA di hTERT in Opti-MEM I in base al formato di coltura utilizzato (Tabella 3). Aggiungere l'inibitore di RNasi a una concentrazione finale di 0,5–1,0 U/µL e mescolare delicatamente.
  3. Mantenere l'mRNA diluito sul ghiaccio fino alla formazione del complesso.
    NOTA: Aggiungere l'inibitore di RNasi immediatamente prima dell'uso. Non conservare l'mRNA con l'inibitore di RNasi, poiché la sua attività diminuisce dopo il congelamento.
2. Preparazione del reagente di trasfezione
  1. Mescolare 6,0 µL di reagente di trasfezione con 100 µL di Opti-MEM I in un tubo sterile privo di RNasi. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
  2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
    NOTA: Per costrutti di mRNA di hTERT di grandi dimensioni (~5 kb), ottimizzare i rapporti tra reagente e mRNA tra 0,4 e 0,6 µL di reagente per 100 ng di mRNA.
3. Formazione del complesso mRNA-lipidico
  1. Aggiungere la soluzione di mRNA di hTERT diluito (100 µL) alla soluzione di reagente di trasfezione diluito (106 µL). Mescolare delicatamente mediante 5–6 pipettaggi.
  2. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15–20 min.
  3. Non superare i 30 min di complessazione.
  4. Verificare il corretto completamento della formazione del complesso osservando l'aspetto di una soluzione leggermente torbida.
    NOTA: Eseguire la preparazione delle cellule durante il periodo di complessazione.
4. Preparazione delle cellule per la trasfezione inversa
  1. Aspirare il mezzo di coltura dalle colture cellulari senescenti.
  2. Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato (2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
  3. Aggiungere 500 µL di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto.
  4. Incubare le cellule a 37 °C per 3–5 min.
  5. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di mezzo completo contenente siero.
  6. Triturare delicatamente le cellule per ottenere una sospensione monocellulare.
  7. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico.
  8. Preparare una sospensione contenente 2,0–2,5 × 10⁵ cellule per pozzetto in mezzo completo.
    NOTA: Evitare una prolungata tripsinizzazione poiché le cellule senescenti sono altamente suscettibili allo stress meccanico. Mantenere le cellule in sospensione; non pre-piastrellare prima della trasfezione inversa.
5. Trasfezione inversa
  1. Preparazione della piastra per la coltura
    1. Aggiungere 500 µL di poli-L-lisina allo 0,01% in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    2. Aspirare immediatamente la soluzione di rivestimento prima dell'uso.
    3. Aggiungere 200 µL del complesso mRNA di hTERT-lipidico al centro di ogni pozzetto.
    4. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO₂ per 30 min.
      NOTA: Eseguire il rivestimento della piastra in parallelo alla formazione del complesso e alla preparazione delle cellule.
  2. Preparazione della sospensione cellulare
    1. Sospendere 2,0–2,5 × 10⁵ cellule in 1800 µL di mezzo completo senza antibiotici.
    2. Risospenderle delicatamente per ottenere una sospensione monocellulare uniforme.
      NOTA: Utilizzare mezzo senza antibiotici durante la trasfezione.
  3. Seeding delle cellule sui complessi
    1. Aggiungere direttamente 1800 µL della sospensione cellulare sui complessi preformati di mRNA di hTERT-lipidico.
    2. Inclinare delicatamente la piastra 2–3 volte in ogni direzione per distribuire uniformemente le cellule.
      NOTA: Non pipettare la sospensione dopo l'aggiunta delle cellule, poiché ciò potrebbe alterare i complessi mRNA-lipidici.
  4. Incubazione delle cellule
    1. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% CO₂ per 6–8 h.
    2. Monitorare l'adesione cellulare mediante microscopia ottica 2–3 h dopo la trasfezione.
    3. Verificare che le cellule siano distribuite uniformemente e stiano iniziando ad aderire alla superficie di coltura.
      NOTA: Un numero eccessivo di cellule in sospensione o di detriti cellulari potrebbe indicare citotossicità associata alla trasfezione.

3. Mitigazione della citotossicità

Ridurre il periodo di esposizione alla trasfezione a 48 h se la perdita cellulare supera il 20%.
Integrare le colture con 10 µM di inibitore ROCK Y-27632 durante il periodo di trasfezione per migliorare la sopravvivenza cellulare.
Dopo 6–8 h di trasfezione, aspirare con attenzione il mezzo di trasfezione minimizzando il disturbo delle cellule parzialmente aderenti. Lasciare circa 100 µL di mezzo residuo in ogni pozzetto.
Aggiungere 1 mL di mezzo di crescita completo fresco, pre-riscaldato e integrato con il 15% di FBS, in ogni pozzetto.
Aggiungere cloroquina a una concentrazione finale di 10–20 µM immediatamente dopo la sostituzione del mezzo.
Incubare le colture per ulteriori 2 h a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂.
Sostituire il mezzo contenente cloroquina con mezzo di crescita completo fresco.
Riposizionare le colture nell'incubatore per la prosecuzione della crescita.
NOTA: Monitorare la morfologia cellulare e la vitalità durante tutto il periodo di recupero. Un’eccessiva distacco cellulare o la presenza di detriti possono indicare citotossicità associata alla trasfezione.

4. Analisi post trasfezione

Valutare l'espressione della proteina TERT 24–48 h dopo la trasfezione.
Misurare i livelli della proteina TERT mediante western blotting o colorazione immunofluorescente seguendo le procedure standard di laboratorio.
Misurare l'attività della telomerasi nello stesso intervallo utilizzando un saggio appropriato per l'attività della telomerasi.
NOTA: L'attività della telomerasi di solito diminuisce dopo 48 h a causa della degradazione dell'mRNA di hTERT espresso in modo transitorio.
Valutare la lunghezza dei telomeri 48–72 h dopo la trasfezione utilizzando la PCR quantitativa monocroma multiplex (MMqPCR) o un metodo equivalente di analisi della lunghezza dei telomeri.
NOTA: Un allungamento dei telomeri rilevabile può essere osservato dopo una corretta somministrazione dell'mRNA di hTERT.
Valutare i fenotipi associati alla senescenza e quelli associati al ringiovanimento 7 giorni dopo la trasfezione
1. Misurare l'attività della β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal).
2. Misurare i livelli di espressione di p16 e p21.
3. Valutare l'espressione di Ki67.
4. Esaminare la morfologia cellulare mediante microscopia ottica.
  NOTA: Confrontare le colture trattate con controlli senescenti non trattati o sottoposti a trasfezione fittizia per valutare i cambiamenti nei fenotipi associati alla senescenza e nelle caratteristiche proliferative.

5. Protocollo di somministrazione ripetuta (Opzionale)

Eseguire la trasfezione iniziale come descritto nei paragrafi da 2 a 4.
Ripetere le trasfezioni secondo il seguente programma: Giorno 0: prima trasfezione; Giorno 5: seconda trasfezione; Giorni 10–12: terza trasfezione.
Mantenere le cellule come colture aderenti e non trattare con tripsina prima delle trasfezioni successive.
Preparare complessi freschi di mRNA di hTERT con lipidi come descritto nei paragrafi da 2.2.1 a 2.2.3.
Aspirare il mezzo di coltura da ogni pozzetto.
Aggiungere direttamente 200 µL di complessi di mRNA di hTERT con lipidi a ogni pozzetto.
Aggiungere immediatamente dopo l'aggiunta dei complessi 800 µL di mezzo F-10 completo fresco.
Incubare le cellule per 4–6 h a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂.
Sostituire il mezzo di trasfezione con mezzo completo fresco.
NOTA: Limitare il trattamento a un massimo di tre cicli di trasfezione per minimizzare la citotossicità cumulativa associata alla trasfezione.

6. Protocollo di trasfezione diretta (2 µg/mL, formato a pozzetti da 6)

Giorno −1: Semina delle cellule
1. Staccare i fibroblasti senescenti o in fase precoce di senescenza utilizzando tripsina-EDTA al 0,05%.
2. Neutralizzare la tripsina con mezzo di coltura completo.
3. Determinare il numero e la vitalità cellulare.
4. Sezionare le cellule in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2,0–2,5 × 10⁵ cellule per pozzetto.
5. Incubare le cellule per tutta la notte a 37 °C in un'incubatrice umidificata contenente 5% di CO₂ fino al raggiungimento di una confluenza pari a circa il 60–80%.
Giorno 0: Preparazione dei complessi mRNA-hTERT–reattivo
1. Scongelare un'aliquote di mRNA-hTERT modificato con nucleosidi su ghiaccio.
2. Diluire l'mRNA-hTERT in Opti-MEM fino a una concentrazione finale di 2 µg/mL in un tubo sterile privo di RNasi (Tubo A).
3. Aggiungere l'inibitore di RNasi al Tubo A fino a una concentrazione finale di 0,5–1,0 U/µL e mescolare delicatamente.
4. Diluire il reattivo di trasfezione in Opti-MEM in un secondo tubo privo di RNasi (Tubo B), utilizzando da 0,4 a 0,6 µL di reattivo per ogni 100 ng di mRNA.
5. Aggiungere il contenuto del Tubo B al Tubo A, goccia a goccia, mescolando delicatamente.
6. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15–20 min.
Giorno 0: Trasfezione diretta
1. Verificare che le cellule abbiano raggiunto una confluenza del 60–80% e presentino una morfologia sana.
2. Aspirare il mezzo di coltura.
3. Lavare le cellule una volta con 1–2 mL di PBS preriscaldato.
4. Aggiungere 0,5 mL di mezzo completo o con ridotto contenuto di siero, preriscaldato, in ogni pozzetto.
5. Opzionalmente, aggiungere clorochina fino a una concentrazione finale di 10–20 µM.
6. Aggiungere 0,5 mL dei complessi mRNA-hTERT–reattivo preparati al punto 6.2.6 in ogni pozzetto.
7. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente i complessi.
8. Incubare le cellule per 4–6 h a 37 °C in un'incubatrice umidificata contenente 5% di CO₂.
  NOTA: Se necessario, estendere il periodo di incubazione a 6–8 h per le cellule senescenti.
9. Aspirare il mezzo di trasfezione.
10. Aggiungere 2,0 mL di mezzo completo fresco in ogni pozzetto.
11. Eseguire le analisi post-trasfezione come descritto nella Sezione 4.
  NOTA: Utilizzare lo stesso lotto di mRNA-hTERT, lo stesso reattivo di trasfezione e la stessa dose nominale quando si confrontano le condizioni di trasfezione diretta e inversa.

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Risultati

Il modRNA d2EGFP-T2A-hTERT è stato progettato come un'unità di lettura ibrida in cui un reporter di EGFP destabilizzato (d2EGFP) è collegato alla telomerasi umana (hTERT) tramite un peptide auto-cleavante T2A. Le sequenze complete di nucleotidi e proteiche di tutti i costrutti sono riportate nel File Supplementare 1. La sequenza codificante era delimitata da una regione non tradotta (UTR) 5′ sintetica e dall'UTR 3′ della β-globina umana, per aumentare l'efficienza traduzionale e la stabilità dell'mRNA (<...

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Discussione

Questo studio riformula la senescenza cellulare come un problema distinto di consegna, piuttosto che come una semplice variazione della fisiologia proliferativa, e sviluppa una strategia di trasfezione dell'mRNA della telomerasi adattata ai vincoli biofisici e immunologici dello stato senescente. Le cellule senescenti presentano membrane rigide e ricche di colesterolo, nonché un'attività endocitica ridotta, creando una barriera sostanziale alla consegna efficiente di acidi nucleici. Adottando un approccio di trasfezione ...

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Dichiarazioni

J.M.S. è cofondatore e presidente del comitato scientifico di Transposon Therapeutics.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti degli Istituti Nazionali di Sanità (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 e R01 AG078925 a JS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11550043	Mezzo di coltura cellulare.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog	New England Biolab	S1411L	Per la maggior parte degli RNA, la struttura di cap aumenta la stabilità, riduce la suscettibilità alla degradazione da parte delle esonucleasi e favorisce la formazione di complessi di inizio dell'mRNA.
5-Methyl-Cytidine-5´-Triphosphate (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	I NTP modificati sono comunemente utilizzati per ridurre l'immunogenicità dell'RNA ottenuto per trascrizione in vitro.
6 Well Plate	Corning	351146	Per coltivare e trattare volumi medi o grandi di cellule aderenti o in sospensione in condizioni sperimentali indipendenti.
Anti-Ki67 antibody (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 è espressa principalmente nelle cellule in proliferazione.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal Staining)	cellbiolabs	CBA-230	Identificazione delle cellule senescenti mediante saggio di colorazione SA-β-gal
DNA LoBind 0.5ml Tubes	Eppendorf	022431005	Per recuperare in modo efficiente DNA e RNA senza alcuna perdita
DNA LoBind 1.5ml Tubes	Eppendorf	22431021	Per recuperare in modo efficiente DNA e RNA senza alcuna perdita
DNase I, RNase-free (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	La DNase I, priva di RNasi, è un'endonucleasi che digerisce il DNA a singolo e doppio filamento.
E. coli Poly(A) Polymerase	New England Biolab	M0276S	In Escherichia coli, la Poli(A) Polimerasi I (PAP I) funge principalmente da catalizzatore per l'aggiunta indipendente dal modello di residui di adenosina monofosfato (AMP) all'estremità 3' delle molecole di RNA.
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	A5256701	Supplemento per colture cellulari
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England Biolab	E2065S	Il HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (con tailing) è progettato per la rapida produzione in vitro di mRNA capped con coda di poli(A). Gli mRNA capped vengono sintetizzati mediante incorporazione co-trascrizionale di Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) utilizzando la T7 RNA Polimerasi.
HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AG	New England Biolab	E2080S	il HiScribe T7 mRNA Kit con CleanCap Reagent AG consente la produzione rapida e semplificata di uno o più trascritti con rese tipiche di ≥90 μg per reazione,
LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase	New England Biolab	M0534S	La LongAmp Hot Start Taq DNA Polimerasi offre prestazioni eccezionali con amplificoni lunghi.
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolab	M0253L	La M-MuLV Reverse Trascrittasi sintetizza un filamento complementare di DNA a partire da un primer utilizzando come stampo o RNA (sintesi di cDNA) o DNA a singolo filamento.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)	New England Biolab	T2040L	La funzione principale del Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) è purificare e concentrare fino a 50 μg di RNA di alta qualità proveniente da reazioni enzimatiche o miscele di estrazione.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	La NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix consente l'assemblaggio senza interruzioni di più frammenti di DNA, indipendentemente dalla lunghezza del frammento o dalla compatibilità degli estremi. È utile per la comunità di biologia sintetica, nonché per il clonaggio in un unico passaggio di più frammenti grazie alla sua facilità d'uso, flessibilità e semplice formato di master mix.
Opti-MEM -Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985070	Per massimizzare l'efficienza di trasfezione cellulare durante la formazione del complesso lipidico-carico. Funge da ambiente ottimizzato e chimicamente definito che mantiene le cellule mammifere altamente vitali riducendo la necessità di supplementazione standard con siero
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	L'utilizzo principale del Phosphate-Buffered Saline (PBS) a pH 7,4 è mantenere un pH stabile e un equilibrio osmotico per le cellule e le molecole biologiche di mammifero.
PCR Strips	Thermo Fisher	AB0776	L'utilizzo principale delle strip PCR (generalmente in formato 8-strip o 12-strip) è contenere reazioni liquide in piccolo volume durante cicli termici ad alta produttività.
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Millipore Sigma	P4707-50ML	L'utilizzo principale del Poly-L-Lysine (PLL) Hydrobromide per l'adesione cellulare è rivestire superfici solide cariche negativamente (come vetro o plastica) per creare un substrato altamente adesivo e carico positivamente.
Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Il Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP) è comunemente utilizzato per ridurre l'immunogenicità dell'RNA ottenuto per trascrizione in vitro.
Ribonucleotide Solution Set	New England Biolab	N0450L	Quattro soluzioni separate di ATP, GTP, CTP e UTP
ROCK inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 è un inibitore permeabile alle cellule, altamente potente e selettivo della chinasi associata a Rho, contenente coil-coil (ROCK). Y-27632 inibisce sia ROCK1 (Ki = 220 nM) che ROCK2 (Ki = 300 nM) competendo con l'ATP per il legame al sito catalitico
RT-PCR Grade Water	Thermo Fisher	AM9935	L'utilizzo principale dell'acqua di grado RT-PCR (spesso indicata come acqua priva di nucleasi) è fungere da solvente ultra puro per saggi enzimatici sensibili in cui qualsiasi contaminazione degraderebbe il campione o inibirebbe l'amplificazione.
SUPERase·In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase Inhibitor è un inibitore proteico di origine non umana che si lega in modo non covalente e inibisce le RNasi più comuni e problematiche, inclusi RNase A, B, C, 1 e T1.
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Thermo Fisher	S7563	L'utilizzo principale del colorante gel per acidi nucleici SYBR™ Green I è visualizzare e quantificare il DNA a doppio filamento (dsDNA) in gel di agarosio o poliacrilamide.
TransIT-mRNA Transfection Kit	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Un reagente di trasfezione ad alta efficienza e bassa tossicità per RNA di grandi dimensioni
TRAPeze Telomerase Detection Kit	Millipore Sigma	S7700	Il saggio TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) è un metodo sensibile e ampiamente utilizzato basato su PCR per rilevare e misurare l'attività della telomerasi in cellule e campioni di tessuti di mammifero. Comprende tre fasi principali: estensione delle ripetizioni telomeriche da parte della telomerasi, amplificazione di questi prodotti mediante PCR e successivo rilevamento.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300054	Per staccare le cellule mammifere aderenti dai contenitori di coltura durante il passaggio routinario (sottocoltura) e il raccolto.

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Fibroblasti senescenti mRNA hTERT mRNA modificato con nucleosidi inibizione della RNasi modulazione del pH endosomiale allungamento dei telomeri durata della vita replicativa