Questo studio ha identificato otto potenziali bersagli farmacologici per l'insufficienza cardiaca tramite analisi genetiche ed ha esplorato composti terapeutici candidati associati a questi bersagli.
Articolo di ricerca
Questo studio ha identificato otto potenziali bersagli farmacologici per l'insufficienza cardiaca tramite analisi genetiche ed ha esplorato composti terapeutici candidati associati a questi bersagli.
L'insufficienza cardiaca (IC) è una malattia cardiovascolare diffusa che compromette significativamente la qualità della vita nelle sue fasi avanzate. Nonostante la varietà delle strategie terapeutiche attuali, il carico di malattia dell'IC rimane significativo. Pertanto, è urgentemente necessario esplorare nuovi bersagli terapeutici. Questo studio ha utilizzato la randomizzazione mendeliana (MR) per valutare le relazioni causali tra geni farmacologici e HF. Sono state condotte analisi di colocalizzazione e randomizzazione mendeliana basata su dati riassuntivi (SMR) per validare ulteriormente la relazione tra essi. Infine, sono stati identificati 8 potenziali bersagli terapeutici per l'IC, inclusi 4 fattori di rischio (CYP11A1, GALT, KCNH2 e METRN) e 4 fattori protettivi (APOM, CHD4, IL11RA e LPAR5). L'arricchimento GO, l'arricchimento KEGG e l'analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI) indicarono che questi geni erano principalmente coinvolti nella regolazione metabolica e nei processi elettrofisiologici cardiaci. Inoltre, potenziali farmaci che mirano a questi bersagli sono stati identificati tramite previsione dei farmaci e docking molecolare, tra cui mitotano, adehl, benzofurani, 1,3-Di-o-tolilguanidina, 96-69-5 e lattone bromoenolo. Inoltre, i risultati della PCR hanno anche dimostrato che il mitotano potrebbe essere associato a CYP11A1 e KCNH2. I farmaci progettati sulla base di questi potenziali bersagli terapeutici possono offrire tassi di successo più elevati e migliorare gli esiti clinici.
L'insufficienza cardiaca (IC) è una sindrome cardiovascolare diffusa definita da obturazione ventricolare compromessa o contrattilità miocardica, che porta a una portata cardiaca insufficiente per soddisfare le esigenzemetaboliche 1,2,3. Clinicamente, l'IC è caratterizzata da congestione polmonare e sistemica, iperfusione tissutale e sintomi come dispnea, affaticamento ed edemaperiferico 1,4,5. Nonostante i progressi terapeutici, l'IC rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello mondiale, colpendo oltre 64 milioni di individui secondo lo studio Global Burden of Disease(GBD) 6,7,8. Il notevole carico di malattie sottolinea l'urgente necessità di nuove strategie terapeutiche.
Gli attuali interventi farmacologici e basati su dispositivi per l'IC sono limitati da efficacia subottimale ed effetti avversi, contribuendo a tassi di ricovero persistentemente elevati e a una qualità della vitacompromessa 9,10,11,12. Identificare nuovi bersagli molecolari con legami causali alla patogenesi dell'IC è quindi fondamentale per migliorare i risultati clinici. L'integrazione della genomica nella scoperta di farmaci rappresenta una strategia altamente efficace per migliorare l'efficienza, poiché le terapie geneticamente validate dimostrano un tasso di successo significativamente più alto negli studiclinici 13,14,15. Inoltre, le proteine codificate da questi geni azionabili fungono da bersagli terapeutici principali sia per piccole molecole che per anticorpimonoclonali 16,17.
I recenti progressi nella genetica umana hanno facilitato la priorità dei target dei farmaci attraverso l'analisi integrativa degli studi di associazione genomica a livello genomico (GWAS) e dei dati di loci quantitativi di tratti di espressione (eQTL). La randomizzazione mendeliana (MR) sfrutta varianti genetiche come variabili strumentali per stimare gli effetti causali, minimizzando la confusione e la causalità inversa insite negli studiosservazionali 13,14. Quando combinato con la colocalizzazione e la risonanza magnetica basata su sommari (SMR), questo approccio consente una prioritizzazione robusta dei geni la cui modulazione può influenzare il rischio di malattia, offrendo una strategia geneticamente ancorata per la scoperta dei bersagli 18,19,20. Rispetto agli studi di associazione convenzionali, integrare RM, SMR e colocalizzazione supera la causalità confondente e inversa per stabilire inferenze causali robuste. Inoltre, questo quadro filtra i segnali falsi positivi provenienti da disequilibrio di collegamento assicurando che espressione genica e rischio di insufficienza cardiaca condividano la stessa variante causale sottostante, ottimizzando la priorità dei bersagli. Vale la pena notare che, sebbene i tessuti cardiovascolari mostrino un'elevata specificità, questo studio utilizza principalmente dati su larga scala sul sangue cis-eQTL per massimizzare la potenza statistica. Sebbene questo approccio possa non catturare completamente i meccanismi specifici dei tessuti insiti nell'IC, le varianti derivate dal sangue fungono da biomarcatori accessibili e forniscono approfondimenti solidi sui fattori genetici sistemici della malattia.
In questo studio, sono stati utilizzati set di dati su larga scala GWAS ed eQTL per valutare gli effetti causali dei geni farmacologici sul rischio di HF. Le associazioni significative sono state ulteriormente validate tramite analisi di colocalizzazione e SMR. Per chiarire le funzioni biologiche dei target prioritari, sono state effettuate analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), insieme all'analisi di interazione proteina-proteina (PPI) di reti. Il potenziale terapeutico è stato successivamente valutato tramite previsione dei farmaci e docking molecolare. Infine, le associazioni tra geni farmacologici selezionati e farmaci candidati sono state validate tramite esperimenti in vitro .
In conclusione, questo studio offre importanti spunti per la scoperta di nuovi bersagli terapeutici per l'IC. Utilizzando risonanza magnetica, SMR, analisi di colocalizzazione, analisi di arricchimento genico, costruzione di reti PPI, previsione dei farmaci, docking molecolare ed esperimenti in vitro , questi risultati possono contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci per l'HF.
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Tutti i dataset utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da studi precedentemente pubblicati con approvazione etica. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Progettazione dello studio
Il flusso di lavoro di questo studio è illustrato nella Figura 1. Innanzitutto, i dati di esposizione sono stati ottenuti dai cis-eQTLs dei geni farmacologici. In secondo luogo, è stata condotta un'analisi RM per indagare la relazione causale tra geni farmacologici e IC. I candidati bersagli terapeutici per l'HF sono stati successivamente identificati tramite analisi di colocalizzazione e SMR. Successivamente sono state eseguite analisi di arricchimento genico e costruzione di reti PPI. Infine, sono state condotte previsioni dei farmaci e docking molecolare per esplorare l'affinità dei farmaci per i geni.
2. Fonte dei dati
Sono stati identificati in totale 6.888 geni farmacologici da due fonti. Un dataset includeva 4.463 geni da uno studio precedentemente pubblicato che ha integrato più fontidi dati 17. L'altro dataset conteneva 5.012 geni dal Drug-Gene Interaction Database (DGIdb)21. Informazioni dettagliate sono state illustrate sul sito web (https://www.dgidb.org/). Dopo la fusione e la rimozione dei duplicati, sono stati conservati 6.888 geni farmacologici unici per l'analisi.
I dati Cis-eQTL sono stati ottenuti dal consorzio eQTLGen (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html), che include profili di espressione da 31.684 campioni di sangue e copre 16.987 geni22.
Le statistiche riassuntive sull'HF sono state ottenute dalla versione R12 del databaseFinnGen 23, che includeva 37.653 casi e 462.695 controlli. La diagnosi dell'IC si basava sulla Classificazione Internazionale delle Malattie (ICD), inclusi ICD-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, ICD-9—4029B|428 e ICD-8—42700|42710|428|7824. Tutti i partecipanti erano di origine europea. Informazioni dettagliate sono disponibili sul sito web di FinnGen e sull'articolo originale (https://www.finngen.fi/en/access_results).
3. Analisi della randomizzazione mendeliana
Le variabili strumentali (IV) sono state selezionate sulla base di tre assunzioni fondamentali della RM: 24. Innanzitutto, le flebo sono direttamente associate ai fattori di esposizione. In secondo luogo, le flebo non sono associate a fattori di confusione. Infine, le flebo influenzano l'esito solo tramite l'esposizione. Dato che gli eQTL prossimali esercitano un controllo regolatorio più immediato e robusto sui geni target, la RM ha utilizzato esclusivamente SNP situati entro 100 kb di regioni dai geni per massimizzare la vicinanza biologica. Sono stati applicati criteri rigorosi per la selezione dell'SNP. Tutti gli SNP selezionati si trovavano entro 100 kb a monte del sito di inizio della trascrizione e a 100 kb a valle del sito finale di trascrizione di ciascun gene farmacologico. Solo gli SNP con significatività genomica (p < 5×10-8) sono statiinclusi 25. Per minimizzare lo squilibrio di collegamento (LD), è stato eseguito il clustering LD utilizzando una sogliar2 di 0,001 e una distanza di aggregazione di 10.000kb 26. Sono stati mantenuti SNP con F-statistica >10, calcolati usando la formula: F = [R2(N−k−1)]/[k(1−R2)]27. Le informazioni sugli SNP sono fornite nella Tabella Supplementare 1.
I metodi analitici principali erano ponderati per varianza inversa (IVW) e rapporto di Wald. Un p-value inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamentesignificativo 28,29. Il tasso di false discovery (FDR) è stato applicato per regolare il p-value e minimizzare i risultati di falsi positivi30. Quando era disponibile un solo SNP, veniva utilizzato il metodo del rapporto di Wald; altrimenti veniva applicata la fecondazione in vitro. Le analisi includevano MR-Egger, mediana ponderata, modalità ponderata e modalità semplice quando erano presenti abbastanza SNP.
Il test Q di Cochran e l'analisi dell'intercetta MR-Egger sono stati impiegati per testare eterogeneità e pleiotropia. Un valore Q-p superiore a 0,05 indicava l'assenza di eterogeneità31. Un p-valore per l'intercetta MR-Egger inferiore a 0,05 indicava la presenza di pleiotropiadirezionale 18. Infine, è stato condotto il test lascia-uno-fuori per verificare se i risultati potessero essere influenzati da un singolo SNP. Le analisi MR sono state effettuate utilizzando il pacchetto TwoSampleMR (versione 0.6.11) in R (versione 4.4.2).
4. Analisi di colocalizzazione
L'analisi di colocalizzazione è stata condotta utilizzando il pacchetto coloc R (versione 6.0.1) per identificare se le varianti genetiche condivise influenzassero sia l'espressione genica sia il rischiodi HF 32. Le probabilità precedenti che un SNP fosse associato a uno dei due tratti e a entrambi i tratti erano impostate rispettivamente a 1 × 10-4 e 1 × 10-5. Le probabilità a posteriori delle cinque ipotesi possono essere calcolate: (1) PPH0: Gli SNP non sono collegati a due caratteristiche. (2) PPH1/PPH2: Gli SNP sono associati all'espressione genica o HF. (3) PPH3: Gli SNP sono collegati all'HF e all'espressione genica, ma sono guidati da SNP diversi. (4) PPH4: Gli SNP sono collegati all'HF e all'espressione genica, e sono guidati dagli SNP comuni. Un PPH4 > 0,8 è stato considerato evidenziare per la colocalizzazione.
5. Analisi SMR
L'analisi SMR è stata condotta per esplorare la relazione tra il gene e l'HF utilizzando il software SMR (versione 1.3.1)33. Il test di eterogeneità negli strumenti dipendenti (HEIDI) è stato effettuato per determinare se le associazioni osservate fossero dovute al collegamento. Un significativo valore p SMR (< 0,05) combinato con un valore p HEIDI > 0,05 è stato interpretato come prova a sostegno di una vera relazione causale piuttosto che come un'associazione causata da uno scenario di collegamento. I protocolli operativi dettagliati e le impostazioni computazionali sono accessibili sul sito ufficiale.
6. Analisi dell'arricchimento
L'analisi di arricchimento GO e KEGG è stata impiegata per caratterizzare le funzioni biologiche e le vie dei geni target terapeutici potenzialiselezionati 34. L'arricchimento GO includeva processi biologici (BP), funzioni molecolari (MF) e componenti cellulari (CC). Il pacchetto R clusterProfiler (versione 4.14.6) e Pathview (versione 1.46.0) sono stati utilizzati per condurre l'analisi diarricchimento 35,36.
7. Previsione dei farmaci candidati
Per identificare potenziali composti terapeutici, è stata effettuata un'analisi di previsione dei farmaci utilizzando il Drug Signatures Database (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)37. Nel DSigDB sono inclusi 22.527 set genici, inclusi 17.389 composti unici che coprono 19.531 geni. Sono state analizzate le associazioni tra geni candidati e composti, seguite da un'analisi di arricchimento per identificare farmaci potenzialmente rilevanti che mirano ai geni associati all'HF.
8. Costruzione di reti di interazione proteica
Le reti di interazione proteina-proteina (PPI) sono state costruite utilizzando GeneMANIA (https://genem ania.org/)38. GeneMANIA potrebbe aiutare a generare ipotesi sulla funzione genica, analizzare liste geniche e dare priorità ai geni per i test funzionali.
9. Aggancio molecolare
È stato eseguito un docking molecolare per validare la farmacogabilità dei geni e la loro relazione con i candidati farmaci. Le simulazioni di docking aiutano a valutare l'affinità di legame e i modelli di interazione tra composti e proteine bersaglio, informando così la priorità e l'ottimizzazione dei candidati. Le strutture proteiche sono state recuperate dal Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/), mentre le strutture dei composti sono state ottenute da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)39. L'attracco è stato effettuato utilizzando CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), che utilizza il rilevamento delle cavità per guidare l'aggancio cieco40,41. Procedure operative dettagliate e informazioni sulle impostazioni di calcolo potevano essere reperite sul sito ufficiale.
10. Coltura cellulare
Cellule cardiomiocitarie immortalate umane (AC16) sono state coltivate in un mezzo di coltura specifico per cellule AC16 in condizioni sterili. Le cellule sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO2. Il mezzo di coltura veniva sostituito ogni 2–3 giorni e le cellule venivano passate a circa il 70%–80% di confluenza per mantenere condizioni ottimali di crescita. La morfologia cellulare e la confluenza venivano monitorate regolarmente tramite microscopia ottica prima di ogni esperimento. Tutte le procedure di coltura cellulare venivano eseguite in un armadietto di biosicurezza per minimizzare il rischio di contaminazione. Per gli esperimenti di trattamento, le cellule AC16 sono state seminate in piastre a 6 pozzi e lasciate aderire durante la notte prima della somministrazione del trattamento.
11. PCR per trascrizione inversa quantitativa (RT-PCR)
Le cellule AC16 sono state trattate con acido palmitico (PA) 200 μM o 20 μM mitotano per 24 ore dopo aver raggiunto una confluenza approssimativamente al 60%–70%. La PA veniva disciolta nell'albumina sieroica bovina (BSA), mentre il mitotano era disciolto nel dimetilsolfosido (DMSO). Tutti i reagenti potenzialmente pericolosi sono stati maneggiati secondo le procedure standard di sicurezza di laboratorio, utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata, inclusi guanti e camici da laboratorio.
Dopo il trattamento, l'RNA totale veniva estratto utilizzando un kit di estrazione RNA secondo le istruzioni del produttore in condizioni prive di RNasi. Le procedure di estrazione dell'RNA venivano eseguite sul ghiaccio ogni volta che era possibile per minimizzare la degradazione dell'RNA. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate prima degli esperimenti a valle, e solo campioni con un rapporto A260/A280 tra 1,8 e 2,0 sono stati utilizzati per le analisi successive.
Il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore. La RT-PCR quantitativa è stata successivamente eseguita utilizzando SYBR Green Master Mix su un sistema di rilevamento PCR in tempo reale. Ogni reazione è stata preparata in un volume finale da 10 μL contenente 5 μL di SYBR Green Master Mix, 0,4 μL di primer diretto, innesto inverso da 0,4 μL, 1 μL di cDNA e 3,2 μL di acqua priva di nucleasi. L'amplificazione è stata eseguita nelle seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 secondi e ricottezza/estensione a 60 °C per 30 secondi. Ogni esperimento è stato condotto con tre repliche biologiche e tutte le reazioni sono state condotte in triplice.
Il GAPDH è stato utilizzato come gene di riferimento interno, e i livelli relativi di espressione di mRNA di CYP11A1 e KCNH2 sono stati calcolati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt . Un singolo picco nell'analisi della curva di fusione è stato considerato indicativo di un'amplificazione specifica. Le sequenze di primer utilizzate per la RT-PCR sono elencate nella Tabella Supplementare 2.
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Randomizzazione mendeliana
I risultati della risonanza magnetica che valutano gli effetti causali tra espressione genica farmacologica e IC sono stati presentati nella Tabella Supplementare 3. Un valore P corretto secondo FDR inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Sono stati identificati in totale 11 geni con associazioni causali significative con l'IC (Figura 2). Tra questi, sei geni erano as...
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Questa ricerca ha valutato sistematicamente gli effetti causali dei geni farmacologici sul rischio di HF utilizzando la risonanza magnetica, identificando otto potenziali bersagli terapeutici. Questi includevano quattro fattori protettivi (APOM, CHD4, IL11RA e LPAR5) e quattro fattori di rischio (CYP11A1, GALT, KCNH2 e METRN). Queste associazioni sono state ulteriormente supportate dall'analisi di colocalizzazione e dalla SMR. L'annotazione funzionale tramite analisi GO, arricchimento KE...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
Vengono riconosciuti i partecipanti e i ricercatori allo studio FinnGen. Il consorzio eQTLGen, DGIdb e altri ricercatori che hanno fornito dati pubblicamente disponibili per questa analisi sono anch'essi riconosciuti con gratitudine. Questo lavoro è stato supportato dal Progetto di Innovazione nella Ricerca del Master del Primo Collegio Clinico della Chongqing Medical University (CYYY-SSCX202516) e dal Standardized Diagnosis and Treatment of Heart Failure (2025cyjstg006).
Contributo dell'autore
Huiling Zhu ha contribuito alla concettualizzazione, all'acquisizione di finanziamenti, alle indagini, alla metodologia, alle risorse, al software, alla supervisione, alla validazione, alla stesura della bozza originale e alla revisione e revisione del manoscritto. Suxin Luo contribuì al finanziamento dell'acquisizione, metodologia, supervisione, revisione e revisione del manoscritto.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix | Abclonal | RK21203 | |
| AC16 | HyCyte | TCH-C119 | |
| AC16 cell-specific culture medium | HyCyte | TCH-G119 | |
| cDNA reverse kit | Abclonal | RK20400 | |
| CFX96™ Real-Time system | Bio-Rad Laboratories | ||
| Mitotane | TargetMol | T1199 | |
| Palmitic acid | TargetMol | T2908 | |
| RNA extraction kit | Abclonal | RK30120 |
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