miR-486-3p sopprime i fenotipi maligni ed è associato alla riduzione dell'espressione di WNT5B, DVL1 e β-catenina nelle cellule di adenocarcinoma polmonare

Wanli Cheng; Weibo Qi; Niu Niu; Junjie Zhao

doi:10.3791/71545

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Articolo di ricerca

miR-486-3p sopprime i fenotipi maligni ed è associato alla riduzione dell'espressione di WNT5B, DVL1 e β-catenina nelle cellule di adenocarcinoma polmonare

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DOI:

10.3791/71545

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21 agosto 2026

Wanli Cheng^*¹ , Weibo Qi^*¹ , Niu Niu¹ , Junjie Zhao¹

¹Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'overespressione forzata di miR-486-3p sopprime l'attività associata alla proliferazione, la crescita clonogenica, la chiusura delle ferite e il passaggio attraverso Matrigel in cellule di adenocarcinoma polmonare A549 e H358. Questi effetti sono accompagnati da una ridotta espressione di WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2, indicando un'associazione in vitro con modifiche legate alla via Wnt, senza tuttavia stabilire un targeting diretto o una causalità della via.

Abstract

Il carcinoma polmonare a cellule adenocarcinoma (LUAD) è il sottotipo istologico predominante del carcinoma polmonare non a piccole cellule ed è ancora associato a una notevole morbilità e mortalità. Studi precedenti hanno identificato funzioni soppressori tumorali di miR-486-3p nel LUAD, ma la sua relazione con i cambiamenti espressivi di WNT5B, DVL1 e β-catenina non è stata chiaramente definita. In questo studio, l'abbondanza basale di miR-486-3p è stata esaminata nelle cellule LUAD A549 e H358 e confrontata con quella delle cellule epiteliali bronchiali Beas-2b mantenute nelle rispettive condizioni abituali. Sono stati generati modelli stabili di sovraespressione di miR-486-3p mediante trasduzione lentivirale. L'attività associata alla crescita cellulare, la crescita clonogenica, la chiusura della ferita e il passaggio attraverso membrane rivestite di Matrigel sono stati valutati utilizzando i saggi con il Cell Counting Kit-8, di formazione di colonie, di guarigione della ferita e Transwell. L'abbondanza proteica di WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2 è stata valutata mediante immunoblotting, mentre i livelli di mRNA di WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 sono stati ulteriormente analizzati mediante RT-qPCR. Nelle condizioni di coltura utilizzate, l'abbondanza di miR-486-3p risultava inferiore nelle cellule A549 e H358 rispetto alle cellule Beas-2b, e la trasduzione lentivirale ha determinato una sovraespressione stabile in entrambe le linee cellulari LUAD. La sovraespressione forzata di miR-486-3p ha ridotto il segnale del CCK-8, la formazione di colonie, la chiusura della ferita e il passaggio attraverso membrane rivestite di Matrigel ed è stata accompagnata da una minore abbondanza proteica di WNT5B, DVL1, β-catenina totale e BCL-2. La RT-qPCR ha inoltre mostrato una ridotta abbondanza trascrizionale di WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 in entrambe le linee cellulari LUAD dopo la sovraespressione di miR-486-3p. Questi risultati supportano un'associazione in vitro tra l'espressione forzata di miR-486-3p, l'attenuazione di diversi parametri cellulari maligni e modifiche nell'espressione legata alla via Wnt; tuttavia, non dimostrano un legame diretto tra miRNA e bersaglio, l'attività della via o un meccanismo di segnalazione lineare causale.

Introduzione

Il carcinoma polmonare a cellule adenocarcinoma (LUAD) è il sottotipo istologico più comune del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e contribuisce in modo significativo alla morbosità e mortalità legate al cancro del polmone a livello mondiale¹^,²^,³^,⁴^,⁵. La classificazione molecolare e le terapie mirate hanno migliorato i risultati per alcuni gruppi selezionati di pazienti, ma il LUAD avanzato rimane difficile da trattare ed è biologicamente eterogeneo¹^,²^,³^,⁴^,⁵. La definizione dei processi regolatori che contribuiscono al comportamento maligno delle cellule rimane quindi rilevante per lo sviluppo di ipotesi terapeutiche verificabili.

La segnalazione Wnt comprende rami dipendenti dalla β-catenina e indipendenti dalla β-catenina che regolano proliferazione, sopravvivenza, polarità e motilità⁶^,⁷^,⁸^,⁹. WNT5B è più frequentemente associato alla segnalazione non canonica, sebbene i suoi effetti biologici varino a seconda del recettore e del contesto cellulare¹⁰^,¹¹. DVL1 è una proteina citoplasmatica di trasduzione del segnale condivisa da diversi rami della via Wnt ed è stata associata a comportamenti legati alla β-catenina nel cancro del polmone¹². Pertanto, variazioni contemporanee di WNT5B, DVL1 e β-catenina non dovrebbero essere interpretate di per sé come evidenza di un singolo percorso lineare.

I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti corti che regolano l'espressione genica attraverso interazioni dipendenti dalla sequenza con trascritti bersaglio¹³^,¹⁴^,¹⁵. Poiché un singolo miRNA può influenzare diversi RNA, un'abbondanza alterata di miRNA può influire su svariati fenotipi associati al tumore¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Diversi miRNA sono stati associati alla crescita, alla motilità e al segnale nel cancro del polmone, ed è stata descritta una comunicazione incrociata tra miRNA e reti correlate alla via Wnt in diversi contesti tumorali¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Il locus MIR486 dà origine ai filamenti maturi miR-486-3p e miR-486-5p. È stato dimostrato che miR-486-3p possiede attività soppressiva nei confronti del tumore nel cancro orale e nel glioblastoma, mentre è stato riportato un effetto promozionale del tumore nel carcinoma a cellule squamose cutaneo²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. miR-486-3p è stato selezionato per il presente studio attraverso una strategia basata su ipotesi, fondata sulla sua minore abbondanza nei dati pubblici di LUAD, sulla sua attività soppressiva nei confronti del tumore precedentemente riportata nel LUAD e su previsioni bioinformatiche che lo collegano a trascritti candidati associati alla via WNT. Tomioka et al. hanno dimostrato gli effetti soppressori del tumore di entrambi i filamenti di miR-486 nel LUAD e hanno identificato GINS4 mediante screening genomica dei bersagli²⁶. Pertanto, il presente studio non rivendica la prima dimostrazione di un fenotipo antitumorale. Piuttosto, valuta se l'espressione forzata di miR-486-3p sia accompagnata da variazioni nell'abbondanza di WNT5B, DVL1 e β-catenina e da cambiamenti fenotipici riproducibili in due linee cellulari di LUAD. Queste analisi valutano associazioni e non stabiliscono un diretto targeting, l'attività della via di segnalazione o un meccanismo lineare WNT5B/DVL1/β-catenina.

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Protocollo

I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Coltura cellulare

Sono state utilizzate le linee cellulari di adenocarcinoma polmonare umano (LUAD) A549 e H358 e la linea cellulare epiteliale bronchiale immortalizzata Beas-2b. Le linee A549 (KRAS G12S) e H358 (KRAS G12C; priva di STK11) sono state selezionate come modelli LUAD comunemente impiegati con differenti background mutanti per KRAS, mentre Beas-2b è stata inclusa come controllo epiteliale bronchiale non maligno. Le cellule A549 e H358 sono state mantenute in mezzo RPMI-1640, mentre le cellule Beas-2b sono state mantenute in mezzo DMEM; ciascun mezzo conteneva il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Le colture cellulari sono state incubate a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Poiché le linee cellulari tumorali e la linea epiteliale di controllo sono state mantenute in mezzi di coltura differenti, i confronti tra i livelli basali di espressione sono stati interpretati con cautela.

Trasduzione lentivirale e selezione di cellule stabili

I vettori lentivirali portanti il precursore di hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) o una sequenza di controllo negativo randomizzata (LV-NC) sono stati utilizzati in un disegno sperimentale di tipo gain-of-function stabile. Le cellule A549 e H358 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti a una densità di 5 × 10⁴ cellule/pozzetto e coltivate per una notte. Il giorno successivo, le cellule sono state esposte al lentivirus a una multiplicità di infezione (MOI) di 10 in presenza di 8 µg/mL di polibrenina. Dopo 24 h, l'inoculo virale è stato sostituito con mezzo completo fresco. Le cellule trasdotte sono state selezionate con 2 µg/mL di puromicina per 7 giorni. Al termine della selezione, le cellule sopravvissute sono state lasciate riprendere e amplificate per i successivi saggi molecolari e funzionali. Non è stato incluso un braccio con inibitore di miR-486-3p poiché lo studio è stato progettato specificamente per valutare gli effetti dell'overespressione forzata stabile.

NOTA: L'MOI, il tempo di esposizione alla polibrena e le condizioni di selezione con puromicina devono essere mantenuti identici tra i gruppi LV-NC e LV-miR-486-3p per minimizzare le differenze legate al trattamento nella vitalità cellulare.

RT-qPCR

La RT-qPCR è stata eseguita per determinare i livelli di espressione di miR-486-3p e per confermare l'efficienza della sovraespressione lentivirale nelle cellule A549 e H358. L'RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente TRIzol seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria, considerando accettabile un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,1. Per l'analisi dell'mRNA, 1 µg di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando un kit commerciale per la sintesi di cDNA secondo il protocollo del produttore. Per l'analisi dei microRNA, la sintesi di cDNA è stata effettuata utilizzando un primer specifico per miRNA con struttura a stem-loop per la retrotrascrizione. La PCR quantitativa è stata eseguita in un volume totale di reazione di 20 µL contenente 10 µL di SYBR Green Master Mix 2×, 0,4 µM di ciascun primer e 2 µL di campione di cDNA. Il protocollo di amplificazione ha previsto un passaggio iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 min, seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s e di annealing/estensione a 60 °C per 30 s. Successivamente è stata effettuata un'analisi della curva di denaturazione per verificare la specificità dell'amplificazione. L'RNA nucleare piccolo U6 è stato utilizzato come controllo interno per la quantificazione dei miRNA, mentre GAPDH è stato impiegato come gene di riferimento per la normalizzazione dell'mRNA. I livelli di espressione relativi sono stati determinati utilizzando il metodo 2^−ΔΔCq.

Le sequenze dei primer per miRNA erano le seguenti: primer per la retrotrascrizione a stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer forward per miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; primer reverse universale, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer forward per U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; e primer reverse per U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Le sequenze dei primer per WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 e GAPDH, insieme alle lunghezze degli ampliconi e alle efficienze di amplificazione, sono riportate nella Tabella 1. L'espressione dell'mRNA è stata normalizzata rispetto a GAPDH, mentre l'espressione di miR-486-3p è stata normalizzata rispetto a U6. Ogni esperimento includeva tre replicati biologici indipendenti, con tre replicati tecnici per ciascun replicato biologico.

Immunoblotting

Al termine della selezione con puromicina della durata di 7 giorni e di un periodo di recupero, le cellule sono state lisate in buffer RIPA contenente inibitori delle proteasi. Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante saggio proteico BCA. Quantità uguali di proteina (20 µg per corsia) sono state separate su gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferite su membrane in PVDF mediante trasferimento umido a 300 mA per 120 min. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% preparato in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween-20 allo 0,1% (TBST) per 1 h a temperatura ambiente. Le membrane sono state incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) o β-actina (1:5.000). I produttori e i numeri di catalogo di tutti gli anticorpi sono riportati nella Tabella dei Materiali. Dopo tre lavaggi di 10 min ciascuno con TBST, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG coniugato con HRP, diluito 1:5.000, per 1 h a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state lavate tre volte con TBST e le bande proteiche sono state visualizzate mediante un substrato chemiluminescente e acquisite con un sistema di documentazione e imaging per gel. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando ImageJ. L'abbondanza di ciascuna proteina bersaglio è stata normalizzata rispetto al segnale corrispondente di β-actina ottenuto dallo stesso campione biologico. Per l'analisi densitometrica sono stati utilizzati esclusivamente tempi di esposizione compresi nell'intervallo lineare e non saturato di rilevamento. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.

Test con il kit per il conteggio delle cellule-8

Le cellule A549 e H358 transdotte stabilmente con LV-NC o LV-miR-486-3p sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1,5 × 10⁴ cellule/pozzetto in 100 µL di mezzo completo. Dopo il fissaggio notturno, il mezzo è stato sostituito e l'assorbanza al tempo 0 h è stata misurata immediatamente dopo l'aggiunta del reagente del Cell Counting Kit-8. Ai tempi 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, sono stati aggiunti 10 µL di reagente per pozzetto e incubati per 1 h a 37 °C prima della lettura dell'assorbanza a 450 nm. Per l'analisi cinetica rivista, ogni gruppo è stato normalizzato al proprio valore al tempo 0 h prima della rappresentazione grafica. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti e i pozzetti tecnici all'interno di ciascun esperimento sono stati mediati prima dell'analisi statistica.

Saggio di formazione di colonie

Le cellule A549 e H358 stabilmente selezionate sono state preparate come sospensioni cellulari singole a 5 × 10² cellule/mL. Un millilitro di sospensione cellulare è stato seminato in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, seguito da 3 mL di mezzo completo. Le cellule sono state coltivate per 14 giorni, con sostituzione del mezzo ogni 5 giorni. Le colonie sono state lavate con PBS, fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti, colorate con violetto cristallo per 20 minuti, lavate e fatte asciugare all'aria. Sono state contate le colonie contenenti almeno 50 cellule utilizzando ImageJ. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.

NOTA: È richiesta una sospensione uniforme di singole cellule e il minimo disturbo possibile della piastra durante l'instaurazione delle colonie, per evitare un'aggregazione artificiale delle cellule.

Saggio di migrazione cellulare

Le cellule A549 e H358 stabilmente trasdotte sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e coltivate fino alla formazione di un monostrato confluenziale. Un graffio lineare è stato realizzato con una punta sterile da 10 µL, le cellule staccate sono state rimosse e gli stessi campi segnalati sono stati acquisiti a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. L'area della ferita è stata misurata utilizzando ImageJ e la chiusura della ferita è stata calcolata come (area a 0 h − area al tempo indicato) / area a 0 h × 100%. Sono stati effettuati tre esperimenti biologici indipendenti. Non è stato utilizzato alcun inibitore farmacologico della proliferazione; pertanto, questo saggio è stato interpretato come una misura della chiusura della ferita piuttosto che di una lettura specifica per la migrazione.

NOTA: I graffi devono essere prodotti con larghezza e pressione costanti, e i campi identici devono essere seguiti per tutta la durata del tempo.

Saggio di invasione cellulare

I saggi di invasione Transwell sono stati eseguiti utilizzando inserti con membrana in policarbonato da 24 pozzetti con un diametro dei pori di 8 µm. La superficie superiore di ciascun inserto è stata rivestita con 100 µL di matrice di membrana basale Matrigel diluita 1:8 in DMEM senza siero, ottenendo una concentrazione proteica finale approssimativa di 1 mg/mL, e incubata a 37 °C per 4 h. Le cellule A549 e H358 sono state sospese in mezzo RPMI-1640 senza siero a densità rispettivamente di 8 × 10⁵ cellule/mL e 4 × 10⁵ cellule/mL. Un'aliquote da 200 µL della sospensione cellulare è stata aggiunta alla camera superiore, corrispondente a 1,6 × 10⁵ cellule A549 o 8 × 10⁴ cellule H358 per inserto. La camera inferiore è stata riempita con 500 µL di mezzo RPMI-1640 contenente il 20% di siero fetale bovino come chemiotattico. Dopo un'incubazione a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 48 h, le cellule non invasive rimaste sulla superficie superiore della membrana sono state delicatamente rimosse con un bastoncino di cotone. Le cellule che avevano invaso la membrana sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 min e colorate con violetto cristallo allo 0,1% per 20 min a temperatura ambiente. Per ogni inserto sono stati selezionati cinque campi microscopici in modo casuale, i quali sono stati acquisiti mediante imaging, e il numero di cellule invase è stato quantificato utilizzando ImageJ. Il valore medio del conteggio cellulare ottenuto dai cinque campi è stato considerato un singolo valore per ciascun inserto, e l'inserto, piuttosto che un singolo campo microscopico, è stato considerato l'unità sperimentale. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.

NOTA: Rimuovere delicatamente e in modo uniforme le cellule non invasive per evitare di danneggiare la membrana o staccare le cellule che hanno migrato sulla sua superficie inferiore.

Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± SD e n indica esperimenti biologici indipendenti, salvo diversa indicazione. Le repliche tecniche o i diversi campi microscopici provenienti dalla stessa unità sperimentale sono stati mediati prima dei test inferenziali. Per il confronto tra le tre linee cellulari, è stata utilizzata l’analisi della varianza ad un fattore seguita da confronti multipli a coppie con correzione di Tukey. Per i tracciati temporali di CCK-8 e di chiusura della ferita, è stata impiegata l’analisi della varianza a due fattori con misure ripetute per valutare gli effetti del trattamento, del tempo e dell’interazione trattamento-per-tempo, seguita da confronti con correzione di Šídák ai singoli punti temporali. I confronti tra due gruppi sono stati analizzati mediante test t di Student non appaiato a due code. test t. Le analisi statistiche e la visualizzazione dei dati sono state eseguite utilizzando un software di analisi statistica e grafica. Esatto pi valori sono riportati nei pannelli delle figure o nelle tabelle dei dati originali. La significatività statistica è stata definita come p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 e ****p < 0.0001.

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Risultati

L'analisi TCGA/starBase mostra una ridotta abbondanza di miR-486-3p nel carcinoma polmonare a cellule adenoidi (LUAD) e TargetScan identifica siti di legame candidati

I dati di espressione derivati da TCGA, accessibili tramite starBase v3.0, hanno mostrato che l'abbondanza di miR-486-3p era significativamente inferiore in 512 campioni di adenocarcinoma polmonare (LUAD) rispetto a 20 campioni polmonari non tumorali (test di Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻⁵;...

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Discussione

Lo studio attuale di tipo gain-of-function ha valutato gli effetti dell'espressione stabile e forzata di miR-486-3p in cellule di adenocarcinoma polmonare (LUAD) A549 e H358. In entrambi i modelli, l'overespressione di miR-486-3p è risultata associata a segnali ridotti nel test CCK-8 correlati alla crescita cellulare, minore crescita clonogenica, ridotta chiusura del "wound" e minor numero di cellule in grado di attraversare membrane Transwell rivestite con Matrigel. Questi cambiamenti fenotipici si sono accompagnati a u...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Il piano scientifico e tecnologico sanitario della provincia dello Zhejiang (2025KY349) e la disciplina chiave sostenuta della città di Jiaxing (2023-zc-014) hanno fornito il supporto finanziario per questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tris-HCl 1 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020	Preparazione del gel di sovrapposizione SDS-PAGE
Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010	Preparazione del gel risolutivo SDS-PAGE
Tampone TBS 20×	Solarbio	71080	Tampone stock per lavaggio del western blot e diluizione degli anticorpi
Soluzione di acrilamide/bis-acrilamide al 30% (29:1)	Solarbio	A1010	Preparazione dei gel SDS-PAGE
Fissativo al 4% di paraformaldeide	Servicebio	G1101	Fissazione per i saggi di formazione di colonie e Transwell
Tampone di caricamento proteico 5×	Beyotime	P0015	Preparazione del campione proteico per SDS-PAGE
Persolfato di ammonio	Solarbio	427A038	Iniziatore della polimerizzazione del gel SDS-PAGE
Kit per saggio proteico BCA	Beyotime	P0009-1	Determinazione della concentrazione proteica
Anticorpo anti-BCL-2	Boster Biological Technology	A00040-2	Anticorpo policlonale da coniglio; western blotting 1:5.000
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	TargetMol	C0005	Saggio dell'attività metabolica associata alla crescita cellulare; 10 μL ogni 100 μL di mezzo di coltura
Sistema di imaging chemiluminescente	Bio-Rad	ChemiDoc MP	Acquisizione delle immagini del western blot
Cloroformio	Servicebio	G3005	Separazione delle fasi durante l'estrazione dell'RNA con TRIzol
Soluzione colorante al violetto di cristallo	Servicebio	G1014	Colorazione di colonie e membrane Transwell
DMEM	Servicebio	G4511	Mezzo di coltura abituale per cellule Beas-2b
Anticorpo anti-DVL1	Signalway Antibody	53180	Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000
Serum bovino fetale (FBS)	Biosharp	BL203B	Intintore al 10% (v/v) per la coltura cellulare abituale; 20% (v/v) nella camera inferiore Transwell
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	Versione 8	Preparazione dei grafici e analisi statistica
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (senza Rox)	Yeasen Biotechnology	11201ES08	PCR quantitativa basata su SYBR Green
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix per qPCR (con digerente del DNA genomico)	Yeasen Biotechnology	11141ES60	Trascrizione inversa per RT-qPCR dell'mRNA
IBM SPSS Statistics	IBM	Versione 22,0	Analisi statistica
ImageJ	National Institutes of Health	Versione 1,53	Densitometria del western blot, misurazione dell'area della ferita, conteggio delle colonie e conteggio delle cellule Transwell
Microscopio invertito	Olympus	CKX53	Acquisizione delle immagini nei saggi di guarigione della ferita e Transwell
Isopropanolo	Servicebio	G3006	Precipitazione dell'RNA durante l'estrazione con TRIzol
Preparazioni lentivirali LV-miR-486-3p e LV-NC	GenePharma	Sintesi su misura	Vettore per sovraespressione stabile di miR-486-3p e vettore di controllo negativo randomizzato
Matrice della membrana basale Matrigel	Corning	354234	Diluita 1:8 in DMEM senza siero; concentrazione proteica finale di circa 1 mg/mL
Metanolo	Xilong Scientific	GB/T 683-2006	Attivazione della membrana PVDF
Lettore per micropiastre	BioTek	ELx800	Misurazione dell'assorbanza a 450 nm
Spettrofotometro UV-Vis microvolume	Allsheng	Nano-600	Valutazione della concentrazione dell'RNA e della purezza A260/A280
Penicillina-streptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15240062	Intintore al 1% (v/v) per la coltura cellulare abituale
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)	Servicebio	G0002	Lavaggio di cellule e membrane
Cocktail inibitore delle proteasi	APExBIO	K1007	Aggiunto al tampone di lisi RIPA
Scala proteica	Biosharp	BL712A	Riferimento di peso molecolare per il western blotting
Membrana PVDF	Millipore	K2MA8350E	Membrana di trasferimento proteico per il western blotting
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 5	Acquisizione dei dati di RT-qPCR
Tampone di lisi RIPA	Beyotime	P0013B	Estrazione delle proteine cellulari totali
Reagente per estrazione dell'RNA (tipo TRIzol)	Servicebio	G3013	Estrazione totale dell'RNA
Mezzo RPMI 1640	Servicebio	G4510	Mezzo di coltura abituale per cellule A549 e H358 e sospensione cellulare Transwell senza siero
SDS	Solarbio	S8010	Reagente per SDS-PAGE
Latte in polvere scremato	BD	2271470	Soluzione bloccante al 5% per il western blotting
StarBase v3.0	Sun Yat-sen University	https://rnasysu.com/encori/	Analisi dell'espressione di miR-486-3p derivata da TCGA
TargetScanHuman	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://www.targetscan.org/vert_80/	Previsione dei siti di legame candidati per miR-486-3p
TEMED	Sigma-Aldrich	T8090	Catalizzatore della polimerizzazione del gel SDS-PAGE
Inserti Transwell, 24 pozzetti, dimensione dei pori 8 μm	Corning	3428	Saggio di attraversamento della membrana rivestita con Matrigel
Tripsina	Servicebio	G4000	Distacco cellulare
Tween-20	Solarbio	815A043	Preparazione del tampone di lavaggio per il western blot
Sistema elettroforetico verticale	Liuyi Biotechnology	DYCZ-24DN	Separazione proteica SDS-PAGE
Reagente luminolico per substrato HRP per western blot	Affinity Biosciences	KF001	Rilevamento chemiluminescente del western blot
Sistema di trasferimento umido	Bio-Rad	1703930	Trasferimento delle proteine sulla membrana PVDF
Anticorpo anti-WNT5B	Signalway Antibody	56808	Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000
Anticorpo anti-β-actina	Abcam	ab8227	Controllo di caricamento; western blotting 1:5.000
Anticorpo anti-β-catenina	Signalway Antibody	21725	Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000

Riferimenti

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