L'overespressione forzata di miR-486-3p sopprime l'attività associata alla proliferazione, la crescita clonogenica, la chiusura delle ferite e il passaggio attraverso Matrigel in cellule di adenocarcinoma polmonare A549 e H358. Questi effetti sono accompagnati da una ridotta espressione di WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2, indicando un'associazione in vitro con modifiche legate alla via Wnt, senza tuttavia stabilire un targeting diretto o una causalità della via.
Articolo di ricerca
miR-486-3p sopprime i fenotipi maligni ed è associato alla riduzione dell'espressione di WNT5B, DVL1 e β-catenina nelle cellule di adenocarcinoma polmonare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il carcinoma polmonare a cellule adenocarcinoma (LUAD) è il sottotipo istologico predominante del carcinoma polmonare non a piccole cellule ed è ancora associato a una notevole morbilità e mortalità. Studi precedenti hanno identificato funzioni soppressori tumorali di miR-486-3p nel LUAD, ma la sua relazione con i cambiamenti espressivi di WNT5B, DVL1 e β-catenina non è stata chiaramente definita. In questo studio, l'abbondanza basale di miR-486-3p è stata esaminata nelle cellule LUAD A549 e H358 e confrontata con quella delle cellule epiteliali bronchiali Beas-2b mantenute nelle rispettive condizioni abituali. Sono stati generati modelli stabili di sovraespressione di miR-486-3p mediante trasduzione lentivirale. L'attività associata alla crescita cellulare, la crescita clonogenica, la chiusura della ferita e il passaggio attraverso membrane rivestite di Matrigel sono stati valutati utilizzando i saggi con il Cell Counting Kit-8, di formazione di colonie, di guarigione della ferita e Transwell. L'abbondanza proteica di WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2 è stata valutata mediante immunoblotting, mentre i livelli di mRNA di WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 sono stati ulteriormente analizzati mediante RT-qPCR. Nelle condizioni di coltura utilizzate, l'abbondanza di miR-486-3p risultava inferiore nelle cellule A549 e H358 rispetto alle cellule Beas-2b, e la trasduzione lentivirale ha determinato una sovraespressione stabile in entrambe le linee cellulari LUAD. La sovraespressione forzata di miR-486-3p ha ridotto il segnale del CCK-8, la formazione di colonie, la chiusura della ferita e il passaggio attraverso membrane rivestite di Matrigel ed è stata accompagnata da una minore abbondanza proteica di WNT5B, DVL1, β-catenina totale e BCL-2. La RT-qPCR ha inoltre mostrato una ridotta abbondanza trascrizionale di WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2 in entrambe le linee cellulari LUAD dopo la sovraespressione di miR-486-3p. Questi risultati supportano un'associazione in vitro tra l'espressione forzata di miR-486-3p, l'attenuazione di diversi parametri cellulari maligni e modifiche nell'espressione legata alla via Wnt; tuttavia, non dimostrano un legame diretto tra miRNA e bersaglio, l'attività della via o un meccanismo di segnalazione lineare causale.
Introduzione
Il carcinoma polmonare a cellule adenocarcinoma (LUAD) è il sottotipo istologico più comune del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e contribuisce in modo significativo alla morbosità e mortalità legate al cancro del polmone a livello mondiale1,2,3,4,5. La classificazione molecolare e le terapie mirate hanno migliorato i risultati per alcuni gruppi selezionati di pazienti, ma il LUAD avanzato rimane difficile da trattare ed è biologicamente eterogeneo1,2,3,4,5. La definizione dei processi regolatori che contribuiscono al comportamento maligno delle cellule rimane quindi rilevante per lo sviluppo di ipotesi terapeutiche verificabili.
La segnalazione Wnt comprende rami dipendenti dalla β-catenina e indipendenti dalla β-catenina che regolano proliferazione, sopravvivenza, polarità e motilità6,7,8,9. WNT5B è più frequentemente associato alla segnalazione non canonica, sebbene i suoi effetti biologici varino a seconda del recettore e del contesto cellulare10,11. DVL1 è una proteina citoplasmatica di trasduzione del segnale condivisa da diversi rami della via Wnt ed è stata associata a comportamenti legati alla β-catenina nel cancro del polmone12. Pertanto, variazioni contemporanee di WNT5B, DVL1 e β-catenina non dovrebbero essere interpretate di per sé come evidenza di un singolo percorso lineare.
I microRNA (miRNA) sono RNA non codificanti corti che regolano l'espressione genica attraverso interazioni dipendenti dalla sequenza con trascritti bersaglio13,14,15. Poiché un singolo miRNA può influenzare diversi RNA, un'abbondanza alterata di miRNA può influire su svariati fenotipi associati al tumore13,14,15,16,17,18. Diversi miRNA sono stati associati alla crescita, alla motilità e al segnale nel cancro del polmone, ed è stata descritta una comunicazione incrociata tra miRNA e reti correlate alla via Wnt in diversi contesti tumorali16,17,18,19,20.
Il locus MIR486 dà origine ai filamenti maturi miR-486-3p e miR-486-5p. È stato dimostrato che miR-486-3p possiede attività soppressiva nei confronti del tumore nel cancro orale e nel glioblastoma, mentre è stato riportato un effetto promozionale del tumore nel carcinoma a cellule squamose cutaneo21,22,23,24,25. miR-486-3p è stato selezionato per il presente studio attraverso una strategia basata su ipotesi, fondata sulla sua minore abbondanza nei dati pubblici di LUAD, sulla sua attività soppressiva nei confronti del tumore precedentemente riportata nel LUAD e su previsioni bioinformatiche che lo collegano a trascritti candidati associati alla via WNT. Tomioka et al. hanno dimostrato gli effetti soppressori del tumore di entrambi i filamenti di miR-486 nel LUAD e hanno identificato GINS4 mediante screening genomica dei bersagli26. Pertanto, il presente studio non rivendica la prima dimostrazione di un fenotipo antitumorale. Piuttosto, valuta se l'espressione forzata di miR-486-3p sia accompagnata da variazioni nell'abbondanza di WNT5B, DVL1 e β-catenina e da cambiamenti fenotipici riproducibili in due linee cellulari di LUAD. Queste analisi valutano associazioni e non stabiliscono un diretto targeting, l'attività della via di segnalazione o un meccanismo lineare WNT5B/DVL1/β-catenina.
Protocollo
I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Coltura cellulare
Sono state utilizzate le linee cellulari di adenocarcinoma polmonare umano (LUAD) A549 e H358 e la linea cellulare epiteliale bronchiale immortalizzata Beas-2b. Le linee A549 (KRAS G12S) e H358 (KRAS G12C; priva di STK11) sono state selezionate come modelli LUAD comunemente impiegati con differenti background mutanti per KRAS, mentre Beas-2b è stata inclusa come controllo epiteliale bronchiale non maligno. Le cellule A549 e H358 sono state mantenute in mezzo RPMI-1640, mentre le cellule Beas-2b sono state mantenute in mezzo DMEM; ciascun mezzo conteneva il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Le colture cellulari sono state incubate a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Poiché le linee cellulari tumorali e la linea epiteliale di controllo sono state mantenute in mezzi di coltura differenti, i confronti tra i livelli basali di espressione sono stati interpretati con cautela.
Trasduzione lentivirale e selezione di cellule stabili
I vettori lentivirali portanti il precursore di hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) o una sequenza di controllo negativo randomizzata (LV-NC) sono stati utilizzati in un disegno sperimentale di tipo gain-of-function stabile. Le cellule A549 e H358 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti a una densità di 5 × 104 cellule/pozzetto e coltivate per una notte. Il giorno successivo, le cellule sono state esposte al lentivirus a una multiplicità di infezione (MOI) di 10 in presenza di 8 µg/mL di polibrenina. Dopo 24 h, l'inoculo virale è stato sostituito con mezzo completo fresco. Le cellule trasdotte sono state selezionate con 2 µg/mL di puromicina per 7 giorni. Al termine della selezione, le cellule sopravvissute sono state lasciate riprendere e amplificate per i successivi saggi molecolari e funzionali. Non è stato incluso un braccio con inibitore di miR-486-3p poiché lo studio è stato progettato specificamente per valutare gli effetti dell'overespressione forzata stabile.
NOTA: L'MOI, il tempo di esposizione alla polibrena e le condizioni di selezione con puromicina devono essere mantenuti identici tra i gruppi LV-NC e LV-miR-486-3p per minimizzare le differenze legate al trattamento nella vitalità cellulare.
RT-qPCR
La RT-qPCR è stata eseguita per determinare i livelli di espressione di miR-486-3p e per confermare l'efficienza della sovraespressione lentivirale nelle cellule A549 e H358. L'RNA totale è stato isolato utilizzando il reagente TRIzol seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria, considerando accettabile un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,1. Per l'analisi dell'mRNA, 1 µg di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando un kit commerciale per la sintesi di cDNA secondo il protocollo del produttore. Per l'analisi dei microRNA, la sintesi di cDNA è stata effettuata utilizzando un primer specifico per miRNA con struttura a stem-loop per la retrotrascrizione. La PCR quantitativa è stata eseguita in un volume totale di reazione di 20 µL contenente 10 µL di SYBR Green Master Mix 2×, 0,4 µM di ciascun primer e 2 µL di campione di cDNA. Il protocollo di amplificazione ha previsto un passaggio iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 min, seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s e di annealing/estensione a 60 °C per 30 s. Successivamente è stata effettuata un'analisi della curva di denaturazione per verificare la specificità dell'amplificazione. L'RNA nucleare piccolo U6 è stato utilizzato come controllo interno per la quantificazione dei miRNA, mentre GAPDH è stato impiegato come gene di riferimento per la normalizzazione dell'mRNA. I livelli di espressione relativi sono stati determinati utilizzando il metodo 2−ΔΔCq.
Le sequenze dei primer per miRNA erano le seguenti: primer per la retrotrascrizione a stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer forward per miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; primer reverse universale, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer forward per U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; e primer reverse per U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Le sequenze dei primer per WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 e GAPDH, insieme alle lunghezze degli ampliconi e alle efficienze di amplificazione, sono riportate nella Tabella 1. L'espressione dell'mRNA è stata normalizzata rispetto a GAPDH, mentre l'espressione di miR-486-3p è stata normalizzata rispetto a U6. Ogni esperimento includeva tre replicati biologici indipendenti, con tre replicati tecnici per ciascun replicato biologico.
Immunoblotting
Al termine della selezione con puromicina della durata di 7 giorni e di un periodo di recupero, le cellule sono state lisate in buffer RIPA contenente inibitori delle proteasi. Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante saggio proteico BCA. Quantità uguali di proteina (20 µg per corsia) sono state separate su gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10% e trasferite su membrane in PVDF mediante trasferimento umido a 300 mA per 120 min. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% preparato in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween-20 allo 0,1% (TBST) per 1 h a temperatura ambiente. Le membrane sono state incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) o β-actina (1:5.000). I produttori e i numeri di catalogo di tutti gli anticorpi sono riportati nella Tabella dei Materiali. Dopo tre lavaggi di 10 min ciascuno con TBST, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG coniugato con HRP, diluito 1:5.000, per 1 h a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state lavate tre volte con TBST e le bande proteiche sono state visualizzate mediante un substrato chemiluminescente e acquisite con un sistema di documentazione e imaging per gel. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando ImageJ. L'abbondanza di ciascuna proteina bersaglio è stata normalizzata rispetto al segnale corrispondente di β-actina ottenuto dallo stesso campione biologico. Per l'analisi densitometrica sono stati utilizzati esclusivamente tempi di esposizione compresi nell'intervallo lineare e non saturato di rilevamento. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.
Test con il kit per il conteggio delle cellule-8
Le cellule A549 e H358 transdotte stabilmente con LV-NC o LV-miR-486-3p sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1,5 × 104 cellule/pozzetto in 100 µL di mezzo completo. Dopo il fissaggio notturno, il mezzo è stato sostituito e l'assorbanza al tempo 0 h è stata misurata immediatamente dopo l'aggiunta del reagente del Cell Counting Kit-8. Ai tempi 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, sono stati aggiunti 10 µL di reagente per pozzetto e incubati per 1 h a 37 °C prima della lettura dell'assorbanza a 450 nm. Per l'analisi cinetica rivista, ogni gruppo è stato normalizzato al proprio valore al tempo 0 h prima della rappresentazione grafica. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti e i pozzetti tecnici all'interno di ciascun esperimento sono stati mediati prima dell'analisi statistica.
Saggio di formazione di colonie
Le cellule A549 e H358 stabilmente selezionate sono state preparate come sospensioni cellulari singole a 5 × 102 cellule/mL. Un millilitro di sospensione cellulare è stato seminato in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, seguito da 3 mL di mezzo completo. Le cellule sono state coltivate per 14 giorni, con sostituzione del mezzo ogni 5 giorni. Le colonie sono state lavate con PBS, fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti, colorate con violetto cristallo per 20 minuti, lavate e fatte asciugare all'aria. Sono state contate le colonie contenenti almeno 50 cellule utilizzando ImageJ. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.
NOTA: È richiesta una sospensione uniforme di singole cellule e il minimo disturbo possibile della piastra durante l'instaurazione delle colonie, per evitare un'aggregazione artificiale delle cellule.
Saggio di migrazione cellulare
Le cellule A549 e H358 stabilmente trasdotte sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e coltivate fino alla formazione di un monostrato confluenziale. Un graffio lineare è stato realizzato con una punta sterile da 10 µL, le cellule staccate sono state rimosse e gli stessi campi segnalati sono stati acquisiti a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. L'area della ferita è stata misurata utilizzando ImageJ e la chiusura della ferita è stata calcolata come (area a 0 h − area al tempo indicato) / area a 0 h × 100%. Sono stati effettuati tre esperimenti biologici indipendenti. Non è stato utilizzato alcun inibitore farmacologico della proliferazione; pertanto, questo saggio è stato interpretato come una misura della chiusura della ferita piuttosto che di una lettura specifica per la migrazione.
NOTA: I graffi devono essere prodotti con larghezza e pressione costanti, e i campi identici devono essere seguiti per tutta la durata del tempo.
Saggio di invasione cellulare
I saggi di invasione Transwell sono stati eseguiti utilizzando inserti con membrana in policarbonato da 24 pozzetti con un diametro dei pori di 8 µm. La superficie superiore di ciascun inserto è stata rivestita con 100 µL di matrice di membrana basale Matrigel diluita 1:8 in DMEM senza siero, ottenendo una concentrazione proteica finale approssimativa di 1 mg/mL, e incubata a 37 °C per 4 h. Le cellule A549 e H358 sono state sospese in mezzo RPMI-1640 senza siero a densità rispettivamente di 8 × 105 cellule/mL e 4 × 105 cellule/mL. Un'aliquote da 200 µL della sospensione cellulare è stata aggiunta alla camera superiore, corrispondente a 1,6 × 105 cellule A549 o 8 × 104 cellule H358 per inserto. La camera inferiore è stata riempita con 500 µL di mezzo RPMI-1640 contenente il 20% di siero fetale bovino come chemiotattico. Dopo un'incubazione a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 48 h, le cellule non invasive rimaste sulla superficie superiore della membrana sono state delicatamente rimosse con un bastoncino di cotone. Le cellule che avevano invaso la membrana sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 min e colorate con violetto cristallo allo 0,1% per 20 min a temperatura ambiente. Per ogni inserto sono stati selezionati cinque campi microscopici in modo casuale, i quali sono stati acquisiti mediante imaging, e il numero di cellule invase è stato quantificato utilizzando ImageJ. Il valore medio del conteggio cellulare ottenuto dai cinque campi è stato considerato un singolo valore per ciascun inserto, e l'inserto, piuttosto che un singolo campo microscopico, è stato considerato l'unità sperimentale. Sono stati eseguiti tre esperimenti biologici indipendenti.
NOTA: Rimuovere delicatamente e in modo uniforme le cellule non invasive per evitare di danneggiare la membrana o staccare le cellule che hanno migrato sulla sua superficie inferiore.
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SD e n indica esperimenti biologici indipendenti, salvo diversa indicazione. Le repliche tecniche o i diversi campi microscopici provenienti dalla stessa unità sperimentale sono stati mediati prima dei test inferenziali. Per il confronto tra le tre linee cellulari, è stata utilizzata l’analisi della varianza ad un fattore seguita da confronti multipli a coppie con correzione di Tukey. Per i tracciati temporali di CCK-8 e di chiusura della ferita, è stata impiegata l’analisi della varianza a due fattori con misure ripetute per valutare gli effetti del trattamento, del tempo e dell’interazione trattamento-per-tempo, seguita da confronti con correzione di Šídák ai singoli punti temporali. I confronti tra due gruppi sono stati analizzati mediante test t di Student non appaiato a due code. test t. Le analisi statistiche e la visualizzazione dei dati sono state eseguite utilizzando un software di analisi statistica e grafica. Esatto pi valori sono riportati nei pannelli delle figure o nelle tabelle dei dati originali. La significatività statistica è stata definita come p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 e ****p < 0.0001.
Risultati
L'analisi TCGA/starBase mostra una ridotta abbondanza di miR-486-3p nel carcinoma polmonare a cellule adenoidi (LUAD) e TargetScan identifica siti di legame candidati
I dati di espressione derivati da TCGA, accessibili tramite starBase v3.0, hanno mostrato che l'abbondanza di miR-486-3p era significativamente inferiore in 512 campioni di adenocarcinoma polmonare (LUAD) rispetto a 20 campioni polmonari non tumorali (test di Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻5; Figura 1). TargetScanHuman ha identificato un sito candidato 7mer-m8 scarsamente conservato per miR-486-3p alle posizioni 468–474 della regione non tradotta 3′ (DVL1 3′ UTR), con un punteggio context++ di −0,23 e un percentile del punteggio context++ dell'80. Un sito candidato 8mer scarsamente conservato è stato identificato alle posizioni 913–920 della 3′ UTR di WNT5B, con un punteggio context++ di −0,46 e un percentile del punteggio context++ del 97 (Figura 2). Questi siti predetti computazionalmente sono stati utilizzati per formulare l'ipotesi sperimentale e non sono stati considerati prove di un legame diretto tra miRNA e bersaglio. Gli URL delle fonti sono riportati in Tabella 2.
L'abbondanza di miR-486-3p è ridotta nelle linee cellulari di LUAD e notevolmente aumentata dopo la trasduzione lentivirale
Nelle rispettive condizioni abituali di coltura, l'analisi RT-qPCR ha mostrato che l'abbondanza di miR-486-3p era inferiore nelle cellule A549 e H358 rispetto alle cellule epiteliali bronchiali Beas-2b. Confronti aggiustati con il test di Tukey dopo l'analisi della varianza a un fattore hanno evidenziato differenze significative tra le cellule A549 e Beas-2b (p < 0,01) e tra le cellule H358 e Beas-2b (p < 0,001; Figura 3A).
La trasduzione stabile con LV-miR-486-3p ha notevolmente aumentato l'abbondanza di miR-486-3p rispetto ai corrispondenti gruppi LV-NC. L'espressione è aumentata di circa 1.470 volte nelle cellule A549 e di 220 volte nelle cellule H358, con entrambi i confronti che hanno raggiunto la significatività statistica (p < 0,001; Figura 3B,C). Questi risultati hanno confermato la corretta realizzazione di modelli cellulari stabili che overesprimono miR-486-3p.
L'espressione forzata di miR-486-3p è associata alla riduzione dell'espressione di WNT5B, DVL1, β-catenina e BCL-2
Il blotting di Western ha mostrato un'abbondanza proteica inferiore di WNT5B, DVL1, β-catenina totale e BCL-2 nelle cellule trasdotte con LV-miR-486-3p rispetto ai rispettivi controlli LV-NC (Figura 4A–E). Nelle cellule A549, l'espressione forzata di miR-486-3p era associata a una ridotta abbondanza proteica di β-catenina (p = 0.022), WNT5B (p = 0.0008), DVL1 (p = 0.019) e BCL-2 (p = 0.0017). Riduzioni corrispondenti sono state osservate anche nelle cellule H358 per β-catenina (p = 0.001), WNT5B (p = 0.0002), DVL1 (p = 0.0003) e BCL-2 (p = 0.0018).
È stata quindi eseguita un'analisi di RT-qPCR per determinare se le variazioni a livello di trascritto accompagnassero i risultati ottenuti a livello proteico (Figura 4F–I). Nelle cellule A549, l'espressione forzata di miR-486-3p ha ridotto l'mRNA di CTNNB1 a 0,226 volte rispetto al gruppo LV-NC (p = 0,004), l'mRNA di WNT5B a 0,180 volte (p = 0,004), l'mRNA di DVL1 a 0,278 volte (p = 0,006) e l'mRNA di BCL2 a 0,259 volte (p = 0,003).
Cambiamenti simili a livello di trascritto sono stati osservati nelle cellule H358. L'mRNA di CTNNB1 è risultato ridotto a 0,288 volte rispetto al gruppo LV-NC (p = 0,028), l'mRNA di WNT5B a 0,250 volte (p = 0,019), l'mRNA di DVL1 a 0,271 volte (p = 0,020) e l'mRNA di BCL2 a 0,534 volte (p = 0,003). Pertanto, l'andamento dei cambiamenti a livello di trascritto è risultato coerente con i corrispondenti risultati a livello proteico in entrambe le linee cellulari. Questi risultati dimostrano variazioni coordinate nell'espressione genica, ma non provano un targeting diretto né l'attività di un meccanismo lineare di segnalazione WNT5B/DVL1/β-catenina.
L'espressione forzata di miR-486-3p riduce il segnale CCK-8 associato alla crescita
Le misurazioni con CCK-8 sono state normalizzate rispetto al valore corrispondente a 0 h per ciascun gruppo sperimentale. Il segnale di CCK-8 normalizzato è aumentato nel tempo sia nelle cellule trasdotte con LV-NC che in quelle trasdotte con LV-miR-486-3p, ma valori più bassi sono stati generalmente osservati dopo l'espressione forzata di miR-486-3p (Figura 5).
In cell A549, i confronti corretti con il metodo di Šídák dopo l'analisi della varianza a due vie con misure ripetute hanno mostrato segnali CCK-8 significativamente più bassi nel gruppo LV-miR-486-3p rispetto al gruppo LV-NC a 24, 48 e 96 h (p < 0,05), mentre la differenza a 72 h non è risultata statisticamente significativa (Figura 5A). In cellule H358, il segnale CCK-8 è risultato significativamente più basso nel gruppo LV-miR-486-3p a 24, 48, 72 e 96 h (p < 0,05; Figura 5B). Questi risultati indicano che l'espressione forzata di miR-486-3p riduce l'attività metabolica associata alla crescita cellulare, con un effetto più costante lungo il corso temporale delle cellule H358.
L'espressione forzata di miR-486-3p riduce la crescita clonogenica
I saggi di formazione di colonie sono stati eseguiti per valutare la crescita clonogenica a lungo termine. Le cellule A549 transdotte con LV-miR-486-3p hanno formato un numero significativamente inferiore di colonie rispetto alle corrispondenti cellule LV-NC (p = 0,013; Figura 6A). Una riduzione significativa del numero di colonie è stata osservata anche nelle cellule H358 (p = 0,006; Figura 6B). La riduzione è risultata più pronunciata nelle cellule H358 rispetto alle cellule A549, indicando che l'entità dell'effetto clonogenico differiva tra i due modelli di LUAD.
L'espressione forzata di miR-486-3p riduce la chiusura della ferita
La chiusura della ferita è stata quantificata a 24 h, 48 h e 72 h dopo il graffio (Figura 7). Nelle colture di A549, il gruppo LV-miR-486-3p ha mostrato una chiusura della ferita significativamente inferiore rispetto al gruppo LV-NC a 24, 48 e 72 h (p < 0,05 per ogni confronto; Figura 7A,C).
Analogamente, la chiusura della ferita è risultata ridotta nelle colture di H358 trasdotte con LV-miR-486-3p a 24 h e 48 h (p < 0,05) e a 72 h (p < 0,01; Figura 7B,D). Poiché il saggio è stato condotto senza l'uso di un inibitore farmacologico della proliferazione, questi risultati sono stati interpretati come una riduzione della chiusura della ferita piuttosto che come prova di un effetto specifico esclusivamente per la migrazione.
L'espressione forzata di miR-486-3p riduce il passaggio attraverso membrane rivestite con Matrigel
Dopo 48 h è stata valutata la capacità delle cellule di attraversare membrane Transwell rivestite con Matrigel. Nel gruppo A549 LV-miR-486-3p sono state rilevate significativamente meno cellule colorate con violetto di cristallo sulla superficie inferiore della membrana rispetto al gruppo A549 LV-NC (p = 0.0001; Figura 8A). Una riduzione simile è stata osservata nelle cellule H358 (p = 0.0007; Figura 8B).
Per ogni inserto sono stati considerati in media cinque campi microscopici, e l'inserto è stato trattato come unità sperimentale. Questi risultati dimostrano una ridotta migrazione attraverso membrane rivestite con Matrigel in seguito all'espressione forzata di miR-486-3p nelle condizioni utilizzate in questo saggio.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati originali alla base delle figure sono inclusi nel File Supplementare 1, compresi i file sorgente del database, i dati di RT-qPCR, le immagini non ritagliate dei Western blot, i valori di densitometria, le immagini di microscopia, i record di conteggio, le misurazioni con CCK-8 e i file di analisi statistica.
Figura 1: Abbondanza di miR-486-3p in campioni di LUAD e polmonari normali da TCGA/starBase. I dati di espressione ottenuti da TCGA sono stati recuperati tramite starBase v3.0 nel maggio 2026 ed includevano 512 campioni di adenocarcinoma polmonare (LUAD) e 20 campioni di tessuto polmonare normale. I gruppi sono stati confrontati utilizzando il test di Wilcoxon per la somma dei ranghi (p = 3,2 × 10⁻5). LUAD, adenocarcinoma polmonare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Siti previsti da TargetScan per il legame di miR-486-3p nei 3′ UTR di DVL1 e WNT5B. TargetScanHuman ha identificato un sito candidato 7mer-m8 alle posizioni 468–474 della regione non tradotta 3′ (3′ UTR) di DVL1 e un sito candidato 8mer alle posizioni 913–920 del 3′ UTR di WNT5B. Gli URL delle fonti sono riportati in Tabella 2. Queste previsioni computazionali sono state utilizzate per la generazione di ipotesi e non costituiscono evidenza sperimentale di un legame diretto. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Abbondanza basale di miR-486-3p e verifica dell'overespressione mediata da lentivirus. (Aanalisi di RT-qPCR miR-486-3p abbondanza in cellule A549, H358 e Beas-2b mantenute nei rispettivi mezzi di coltura di routine. (B, CVerifica mediante RT-qPCR di miR-486-3p sopraespressione in A549 (B) e H358 (C) cellule trasdotte con LV-NC o LV-miR-486-3p. L'espressione è stata normalizzata rispetto a U6. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti. (Aè stato analizzato mediante ANOVA a un fattore seguita da confronti multipli corretti con il metodo di Tukey. (B, C) sono stati analizzati utilizzando il test t di Student non appaiato a due code t-test. *p < 0.01; **p < 0,001. LV-NC, lentivirus di controllo negativo; RT-qPCR, PCR quantitativa con trascrizione inversa; DS, deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'espressione forzata di miR-486-3p è associata alla riduzione dell'espressione del gene candidato. (A) Immunoblotting western rappresentativi che mostrano l'abbondanza di β-catenina, WNT5B, DVL1, BCL-2 e β-actina in cellule A549 e H358 transdotte con LV-NC o LV-miR-486-3p. Le masse molecolari sono indicate in chilodalton. (B–EQuantificazione densitometrica di β-catenina (B), WNT5B (C), DVL1 (D) e BCL-2 (E), normalizzato rispetto a β-actin. (F–Ianalisi di RT-qPCR CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), e BCL2 (I) abbondanza del trascritto, normalizzata a GAPDH. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti; ogni punto rappresenta un replicato biologico indipendente. Il confronto tra i gruppi è stato effettuato mediante il test t di Student non appaiato a due code t-test. Esatto pvalori e variazioni di fold sono riportati nei rispettivi pannelli. kDa, chilodalton; LV-NC, lentivirus di controllo negativo; RT-qPCR, PCR quantitativa con trascrizione inversa; DS, deviazione standard Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: L'espressione forzata di miR-486-3p riduce nel tempo i segnali di CCK-8 associati alla crescita. Le cellule A549 (A) e H358 (B) transdotte con LV-NC o LV-miR-486-3p sono state analizzate a 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. I valori di OD450 sono stati normalizzati rispetto al valore corrispondente a 0 h all'interno di ogni gruppo. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti. Gli effetti del trattamento, del tempo e dell'interazione trattamento-per-tempo sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie con misure ripetute, seguita da confronti aggiustati con il metodo di Šídák tra i gruppi a ciascun punto temporale. *p < 0,05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, lentivirus di controllo negativo; OD450, densità ottica a 450 nm; DS, deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: L'espressione forzata di miR-486-3p riduce la crescita clonogenica. Rappresentazione di immagini complete di pozzetti e conteggi quantitativi di colonie per A549 (A) e H358 (B) cellule trasdotte con LV-NC o LV-miR-486-3p. Le colonie sono state quantificate utilizzando ImageJ con impostazioni di analisi identiche per tutti i gruppi. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti e sono stati analizzati mediante test t di Student non appaiato a due code t-test. Esatto pi valori sono riportati nei pannelli corrispondenti. LV-NC, lentivirus di controllo negativo; DS, deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: L'espressione forzata di miR-486-3p riduce la chiusura della ferita. Sono mostrate immagini rappresentative e misurazioni quantitative della chiusura della ferita per le cellule A549 (A,C) e H358 (B,D) a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h dopo il graffio. La chiusura della ferita è stata calcolata secondo la seguente formula: (area della ferita a 0 h − area della ferita al tempo indicato) / area della ferita a 0 h × 100%. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti. Gli effetti del trattamento, del tempo e dell'interazione trattamento-per-tempo sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie con misure ripetute, seguita da confronti aggiustati con il metodo di Šídák tra i gruppi in ciascun punto temporale. Barre della scala, 200 µm. *p < 0,05; **p < 0,01. LV-NC, lentivirus di controllo negativo; DS, deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: L'espressione forzata di miR-486-3p riduce il passaggio attraverso membrane Transwell rivestite di Matrigel. Campi microscopici rappresentativi colorati con violetto di cristallo e conteggi cellulari quantitativi a livello degli inserti sono mostrati per A549 (A) e H358 (B) cellule trasdotte con LV-NC o LV-miR-486-3p. Inserti Transwell con un diametro di 8-µm dimensione dei pori sono state utilizzate. Per ogni inserto sono stati analizzati cinque campi microscopici, e ogni inserto è stato considerato come un'unità sperimentale. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti biologici indipendenti e sono stati analizzati mediante test t di Student non appaiato a due code t-test. Barre della scala, 200 µm. Esatto pi valori sono riportati nei pannelli corrispondenti. LV-NC, lentivirus di controllo negativo; DS, deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gene | Sequenze dei primer | Lunghezze degli ampliconi | Efficacità di amplificazione | |
| WNT5B | Forward: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| Reverse: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Forward: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95,60% | |
| Reverse: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Forward: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96,30% | |
| Reverse: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Forward: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97,20% | |
| Reverse: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Forward: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98,30% | |
| Reverse: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabella 1: Sequenze dei primer utilizzate per la RT-qPCR.
| Target | Informazioni sulla predizione | Fonte | ||
| DVL1 | 7mer-m8, posizioni 468–474 | URL di TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, posizioni 913–920 | URL di TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tabella 2: Database TargetScan e URL corrispondente.
File Supplementare 1: Dati a supporto dei risultati di questo studio.Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussione
Lo studio attuale di tipo gain-of-function ha valutato gli effetti dell'espressione stabile e forzata di miR-486-3p in cellule di adenocarcinoma polmonare (LUAD) A549 e H358. In entrambi i modelli, l'overespressione di miR-486-3p è risultata associata a segnali ridotti nel test CCK-8 correlati alla crescita cellulare, minore crescita clonogenica, ridotta chiusura del "wound" e minor numero di cellule in grado di attraversare membrane Transwell rivestite con Matrigel. Questi cambiamenti fenotipici si sono accompagnati a una riduzione dell'abbondanza proteica di WNT5B, DVL1, β-catenina totale e BCL-2, insieme a livelli più bassi dei trascritti WNT5B, DVL1, CTNNB1 e BCL2. Nel complesso, questi risultati supportano un'associazione tra l'espressione forzata di miR-486-3p, l'attenuazione di diversi fenotipi cellulari maligni e cambiamenti coordinati in alcune molecole legate alla via Wnt. Tuttavia, tali dati non dimostrano un legame diretto tra miRNA e bersaglio, l'attività della via di segnalazione o una sequenza causale di segnalazione.
Il fenotipo generale soppressore del tumore osservato in questo studio è coerente con le segnalazioni precedenti e non deve essere interpretato come la principale scoperta innovativa. Tomioka et al. hanno precedentemente dimostrato che sia miR-486-3p che miR-486-5p sopprimono i fenotipi maligni nelle cellule LUAD e hanno identificato GINS4 attraverso una strategia di screening mirata ai bersagli senza pregiudizi26. Il contributo del presente studio è più specifico: l'espressione forzata di miR-486-3p è stata accompagnata da una riduzione dell'abbondanza di WNT5B, DVL1 e β-catenina in due modelli cellulari LUAD. Inoltre, lo studio fornisce un flusso di lavoro sperimentale integrato che combina trasduzione lentivirale stabile, RT-qPCR, immunoblotting, analisi con CCK-8, formazione di colonie, chiusura del difetto e saggi Transwell rivestiti con Matrigel. Questa distinzione è importante perché il presente lavoro amplia le osservazioni molecolari associate all'overespressione di miR-486-3p senza affermare di aver dimostrato per la prima volta la sua attività antitumorale nel carcinoma polmonare adenoide (LUAD).
I risultati relativi alla via Wnt richiedono un'interpretazione cauta. WNT5B è comunemente descritto come un ligando Wnt non canonico e può attivare la segnalazione della polarità cellulare planare o la via Wnt/Ca2⁺ in modo dipendente dal recettore e dal contesto. In alcuni contesti cellulari, la segnalazione Wnt non canonica può anche antagonizzare la segnalazione dipendente da β-catenina10,11. DVL1 è un mediatore intracellulare comune che può partecipare sia alla segnalazione canonica che non canonica della via Wnt ed è stato associato a fenotipi legati alla β-catenina nel carcinoma polmonare non a piccole cellule12. Pertanto, la riduzione simultanea di WNT5B, DVL1 e della β-catenina totale non dimostra un percorso lineare WNT5B→DVL1→β-catenina. I dati attuali indicano invece una riduzione concomitante dell'espressione di WNT5B e dell'abbondanza di DVL1 e β-catenina a seguito dell'espressione forzata di miR-486-3p.
I risultati a livello di trascritto erano direttionalmente coerenti con i dati ottenuti mediante Western blot. L'espressione forzata di miR-486-3p ha ridotto l'abbondanza dei trascritti di WNT5B, DVL1 e CTNNB1 sia nelle cellule A549 che nelle H358. Questa concordanza suggerisce che le variazioni osservate nei livelli proteici potrebbero essere accompagnate da alterazioni nell'abbondanza dei trascritti piuttosto che derivare esclusivamente da cambiamenti nella stabilità proteica. Tuttavia, la riduzione dei livelli di trascritto e di proteina non dimostra un legame diretto di miR-486-3p con le regioni 3′ non tradotte previste. Sarebbero necessari saggi reporter con luciferasi duale utilizzando siti di legame di tipo selvaggio e mutati, insieme a esperimenti di recupero, per determinare se WNT5B o DVL1 siano regolati direttamente da miR-486-3p. Analogamente, la riduzione dell'abbondanza di BCL-2 indica un'alterazione di una proteina associata alla sopravvivenza cellulare, ma, in assenza di saggi validati per la morte cellulare, non può essere interpretata come evidenza di un aumento dell'apoptosi.
I saggi funzionali presentano anche limitazioni specifiche per ogni saggio. Il saggio CCK-8 misura l'attività metabolica cellulare anziché determinare direttamente il numero di cellule, e le variazioni nell'assorbanza possono riflettere alterazioni nella proliferazione, nel metabolismo o nella vitalità. La formazione di colonie fornisce una misura a lungo termine della capacità clonogenica, ma l'entità dell'effetto è risultata diversa tra le due linee cellulari, con una riduzione modesta nelle cellule A549 e una riduzione maggiore nelle cellule H358. Questa differenza suggerisce che la risposta all'espressione forzata di miR-486-3p possa dipendere dal contesto molecolare e cellulare.
È stata osservata una ridotta chiusura della ferita in entrambe le linee cellulari, ma durante il saggio non è stato utilizzato alcun inibitore della proliferazione. Poiché l'espressione forzata di miR-486-3p ha influenzato anche le misurazioni associate alla crescita, una ridotta proliferazione potrebbe aver contribuito al fenotipo di chiusura della ferita. I risultati devono pertanto essere interpretati come una ridotta chiusura della ferita piuttosto che come un effetto specifico sulla migrazione. Analogamente, il saggio Transwell con rivestimento di Matrigel di 48 ore potrebbe essere influenzato da differenze nel passaggio attraverso la membrana, nella proliferazione, nella sopravvivenza o nell'adesione. La riduzione osservata nel numero di cellule sulla superficie inferiore della membrana supporta quindi un alterato passaggio nelle condizioni testate, ma non permette di isolare un meccanismo specifico di invasione.
Un'ulteriore considerazione riguarda l'entità della sovraespressione di miR-486-3p. La trasduzione lentivirale ha aumentato l'abbondanza di miR-486-3p di circa 1.470 volte nelle cellule A549 e di 220 volte nelle cellule H358 rispetto ai corrispondenti gruppi di controllo. Una tale espressione soprafisiologica potrebbe incrementare la repressione fuori bersaglio dipendente dal seed, influenzare la disponibilità di componenti del complesso di silenziamento mediato da RNA o indurre uno stress cellulare aspecifico. Poiché non è stata eseguita una serie dose-risposta, non è stato possibile definire la relazione tra l'abbondanza di miR-486-3p e i fenotipi osservati. Inoltre, l'assenza di un esperimento di perdita di funzione basato su inibitori impedisce di trarre conclusioni sul ruolo fisiologico endogeno di miR-486-3p nelle cellule di carcinoma polmonare a cellule adenoidi (LUAD). I risultati attuali devono pertanto essere interpretati specificamente come conseguenze della sovraespressione forzata e stabile.
Vanno considerate diverse limitazioni. Sono state analizzate solo due linee cellulari di adenocarcinoma polmonare (LUAD) con mutazione del gene KRAS, e l'uso di diversi mezzi di coltura di routine limita l'interpretazione dei confronti con le cellule Beas-2b. Non è stata effettuata l'autenticazione delle linee cellulari né il test per la ricerca di micoplasmi durante lo studio, e l'U6 è stato utilizzato come unico riferimento per la quantificazione del miR-486-3p. Lo studio inoltre non ha incluso saggi di perdita di funzione, di dose-risposta, reporter, di recupero della funzione né saggi funzionali della via di segnalazione Wnt. Inoltre, i risultati dei saggi di chiusura del "wound" e dei saggi Transwell potrebbero essere stati influenzati da differenze nella proliferazione, vitalità o adesione cellulare. Infine, non sono stati inclusi modelli animali, campioni da pazienti o coorti di validazione clinica. Pertanto, i risultati si limitano a questo sistema in vitro con espressione forzata e non dimostrano un targeting diretto, una causalità della via di segnalazione né un'utilità clinica.
In conclusione, l'espressione stabile forzata di miR-486-3p ha ridotto diverse misurazioni associate alla crescita e alla motilità nelle cellule LUAD A549 e H358 ed è stata accompagnata da una minore espressione di WNT5B, DVL1, β-catenina totale e BCL-2. Questi risultati forniscono una base per ulteriori indagini meccanistiche, ma non stabiliscono WNT5B o DVL1 come bersagli diretti, un percorso lineare WNT5B/DVL1/β-catenina, né il valore clinico di miR-486-3p.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Il piano scientifico e tecnologico sanitario della provincia dello Zhejiang (2025KY349) e la disciplina chiave sostenuta della città di Jiaxing (2023-zc-014) hanno fornito il supporto finanziario per questo studio.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl 1 M (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Preparazione del gel di sovrapposizione SDS-PAGE |
| Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Preparazione del gel risolutivo SDS-PAGE |
| Tampone TBS 20× | Solarbio | 71080 | Tampone stock per lavaggio del western blot e diluizione degli anticorpi |
| Soluzione di acrilamide/bis-acrilamide al 30% (29:1) | Solarbio | A1010 | Preparazione dei gel SDS-PAGE |
| Fissativo al 4% di paraformaldeide | Servicebio | G1101 | Fissazione per i saggi di formazione di colonie e Transwell |
| Tampone di caricamento proteico 5× | Beyotime | P0015 | Preparazione del campione proteico per SDS-PAGE |
| Persolfato di ammonio | Solarbio | 427A038 | Iniziatore della polimerizzazione del gel SDS-PAGE |
| Kit per saggio proteico BCA | Beyotime | P0009-1 | Determinazione della concentrazione proteica |
| Anticorpo anti-BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Anticorpo policlonale da coniglio; western blotting 1:5.000 |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Saggio dell'attività metabolica associata alla crescita cellulare; 10 μL ogni 100 μL di mezzo di coltura |
| Sistema di imaging chemiluminescente | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Acquisizione delle immagini del western blot |
| Cloroformio | Servicebio | G3005 | Separazione delle fasi durante l'estrazione dell'RNA con TRIzol |
| Soluzione colorante al violetto di cristallo | Servicebio | G1014 | Colorazione di colonie e membrane Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Mezzo di coltura abituale per cellule Beas-2b |
| Anticorpo anti-DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000 |
| Serum bovino fetale (FBS) | Biosharp | BL203B | Intintore al 10% (v/v) per la coltura cellulare abituale; 20% (v/v) nella camera inferiore Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Versione 8 | Preparazione dei grafici e analisi statistica |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (senza Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | PCR quantitativa basata su SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix per qPCR (con digerente del DNA genomico) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Trascrizione inversa per RT-qPCR dell'mRNA |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versione 22,0 | Analisi statistica |
| ImageJ | National Institutes of Health | Versione 1,53 | Densitometria del western blot, misurazione dell'area della ferita, conteggio delle colonie e conteggio delle cellule Transwell |
| Microscopio invertito | Olympus | CKX53 | Acquisizione delle immagini nei saggi di guarigione della ferita e Transwell |
| Isopropanolo | Servicebio | G3006 | Precipitazione dell'RNA durante l'estrazione con TRIzol |
| Preparazioni lentivirali LV-miR-486-3p e LV-NC | GenePharma | Sintesi su misura | Vettore per sovraespressione stabile di miR-486-3p e vettore di controllo negativo randomizzato |
| Matrice della membrana basale Matrigel | Corning | 354234 | Diluita 1:8 in DMEM senza siero; concentrazione proteica finale di circa 1 mg/mL |
| Metanolo | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Attivazione della membrana PVDF |
| Lettore per micropiastre | BioTek | ELx800 | Misurazione dell'assorbanza a 450 nm |
| Spettrofotometro UV-Vis microvolume | Allsheng | Nano-600 | Valutazione della concentrazione dell'RNA e della purezza A260/A280 |
| Penicillina-streptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Intintore al 1% (v/v) per la coltura cellulare abituale |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Servicebio | G0002 | Lavaggio di cellule e membrane |
| Cocktail inibitore delle proteasi | APExBIO | K1007 | Aggiunto al tampone di lisi RIPA |
| Scala proteica | Biosharp | BL712A | Riferimento di peso molecolare per il western blotting |
| Membrana PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrana di trasferimento proteico per il western blotting |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Acquisizione dei dati di RT-qPCR |
| Tampone di lisi RIPA | Beyotime | P0013B | Estrazione delle proteine cellulari totali |
| Reagente per estrazione dell'RNA (tipo TRIzol) | Servicebio | G3013 | Estrazione totale dell'RNA |
| Mezzo RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Mezzo di coltura abituale per cellule A549 e H358 e sospensione cellulare Transwell senza siero |
| SDS | Solarbio | S8010 | Reagente per SDS-PAGE |
| Latte in polvere scremato | BD | 2271470 | Soluzione bloccante al 5% per il western blotting |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Analisi dell'espressione di miR-486-3p derivata da TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Previsione dei siti di legame candidati per miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Catalizzatore della polimerizzazione del gel SDS-PAGE |
| Inserti Transwell, 24 pozzetti, dimensione dei pori 8 μm | Corning | 3428 | Saggio di attraversamento della membrana rivestita con Matrigel |
| Tripsina | Servicebio | G4000 | Distacco cellulare |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Preparazione del tampone di lavaggio per il western blot |
| Sistema elettroforetico verticale | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Separazione proteica SDS-PAGE |
| Reagente luminolico per substrato HRP per western blot | Affinity Biosciences | KF001 | Rilevamento chemiluminescente del western blot |
| Sistema di trasferimento umido | Bio-Rad | 1703930 | Trasferimento delle proteine sulla membrana PVDF |
| Anticorpo anti-WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000 |
| Anticorpo anti-β-actina | Abcam | ab8227 | Controllo di caricamento; western blotting 1:5.000 |
| Anticorpo anti-β-catenina | Signalway Antibody | 21725 | Anticorpo primario da coniglio; western blotting 1:5.000 |
Riferimenti
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