Isolamento, purificazione e caratterizzazione di mitocondri funzionali derivati dal muscolo scheletrico del topo per il trapianto mitocondriale

Summary

Fu istituito un protocollo standardizzato che combinava digestione tripsina e centrifugazione differenziale per l'isolamento, purificazione e caratterizzazione funzionale dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo, nonché per valutare la loro applicazione nel trapianto mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo energetico, la trasduzione del segnale e l'omeostasi cellulare nelle cellule eucariotiche. La disfunzione mitocondriale contribuisce alla patogenesi di numerose malattie e ha portato allo sviluppo del trapianto mitocondriale come strategia terapeutica rigenerativa. L'applicazione efficace del trapianto mitocondriale dipende dalla disponibilità di mitocondri altamente purificati e funzionalmente intatti. Il muscolo scheletrico è una fonte donatrice adatta grazie al suo alto contenuto mitocondriale, all'attività metabolica e alla sua accessibilità. Questo studio ha stabilito un protocollo standardizzato e riproducibile per l'isolamento, purificazione e caratterizzazione dei mitocondri funzionali dal muscolo scheletrico del topo e ne ha valutato l'uso nel trapianto mitocondriale. La procedura era composta da due fasi principali. Innanzitutto, i mitocondri sono stati isolati dal muscolo scheletrico di topi C57BL/6 utilizzando digestione tripsinica seguita da centrifugazione differenziale. In secondo luogo, i mitocondri isolati sono stati caratterizzati per valutare purezza, ultrastruttura e attività funzionale. La purezza mitocondriale è stata valutata tramite quantificazione della proteina dell'acido bicinconinico (BCA) e analisi del Western blot. L'integrità ultrastrutturale è stata esaminata tramite microscopia elettronica a trasmissione. L'attività funzionale è stata valutata utilizzando JC-1 e marcatura fluorescente mitocondriale, insieme a misurazioni del consumo di ossigeno, della capacità di produzione di ATP e del rapporto di controllo respiratorio tramite un sistema di respirometria ad alta risoluzione. I mitocondri isolati hanno mostrato potenziale di membrana preservato, ultrastruttura intatta e attività respiratoria stabile, indicando l'idoneità per studi funzionali a valle e applicazioni di trapianti mitocondriali.

Introduction

I mitocondri sono i principali siti di produzione di adenosina trifosfato (ATP) e svolgono ruoli centrali nell'apoptosi, nell'omeostasi del calcio e nel metabolismo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS). L'integrità funzionale dei mitocondri è quindi fondamentale per mantenere l'omeostasi cellulare e determinare il destino^{cellulare 1,2}. La disfunzione mitocondriale, incluse mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) e anomalie della catena di trasporto elettronico (ETC), porta a un metabolismo energetico compromesso, stress ossidativo e apoptosi^{disregolata 3,4}. Queste anomalie sono associate a un'ampia gamma di malattie, tra cui disturbi mitocondriali ereditari, malattie neurodegenerative e malattie^{cardiovascolari 5,6}. Le strategie terapeutiche convenzionali per la disfunzione mitocondriale, come gli antiossidanti e i cofattori metabolici, generalmente offrono un'efficacia limitata perché alleviano i sintomi senza ripristinare direttamente la funzione mitocondriale ^7,8. Di conseguenza, il trapianto mitocondriale è emerso come un approccio terapeutico promettente nella medicina rigenerativa. Questa strategia prevede la consegna di mitocondri esogeni intatti nelle cellule danneggiate o disfunzionali per ripristinare l'attività mitocondriale e il metabolismo energetico^{cellulare 9,10}. Studi precedenti hanno dimostrato che i mitocondri esogeni possono essere internalizzati dalle cellule riceventi e incorporati nella rete mitocondriale endogena, con conseguente miglioramento della funzione bioenergetica e sopravvivenza^{cellulare aumentata} 11,12,13.

Il muscolo scheletrico è considerato un donatore adatto per l'isolamento mitocondriale grazie al suo alto contenuto mitocondriale, all'attività metabolica e all'accessibilità 14,15,16. Il trapianto mitocondriale richiede diversi passaggi critici, tra cui l'isolamento mitocondriale, la purificazione, la caratterizzazione funzionale e l'efficienza nell'erogazione nelle cellule riceventi. Tuttavia, tra i protocolli riportati rimane una sostanziale variabilità metodologica, in particolare nelle procedure che coinvolgono omogeneizzazione tissutale, digestione enzimattica, controllo della temperatura e purificazione. Tale variabilità può influire sulla ressa, la purezza e l'integrità funzionale mitocondriali, limitando così la riproducibilità sperimentale.

Per migliorare la consistenza metodologica e la riproducibilità, questo studio presenta un protocollo standardizzato per isolare e caratterizzare i mitocondri funzionali dal muscolo scheletrico del topo utilizzando la digestione della tripsina e la centrifugazione differenziale. I mitocondri isolati sono stati valutati per purezza, integrità ultrastrutturale e attività funzionale utilizzando la quantificazione delle proteine con acido bicinchoninico (BCA), Western blotting, microscopia elettronica a trasmissione, saggi sul potenziale a membrana basati su fluorescenza e respirometria ad alta risoluzione. Inoltre, è stata valutata la rilevazione di mitocondri isolati da parte delle cellule riceventi per valutarne l'idoneità alle applicazioni di trapianto mitocondriale. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per ottenere mitocondri funzionali derivati dal muscolo scheletrico per studi sperimentali a valle.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in una struttura specifica priva di patogeni (SPF) e approvati dal Comitato per l'Etica e l'Uso degli Animali del Terzo Ospedale Affiliato dell'Air Force Medical University (Numero di approvazione: IACUC-2024kq-065).

I maschi C57BL/6 topi (6-8 settimane, 18-20 g) sono stati acquistati dal Laboratory Animal Center dell'Air Force Medical University (Licenza di produzione: SCXK (Shaanxi) 2024-002). I topi venivano alloggiati in gabbie ventilate individualmente (IVC) in condizioni di pressione positiva e pulite, con una temperatura di 20-26 °C, umidità relativa 40%-70%, un ciclo chiaro-buio di 12 ore e almeno 15 cambi d'aria all'ora. Venivano forniti diete sterilizzate, acqua potabile e arricchimento ambientale.

I reagenti, i prodotti chimici e gli strumenti sperimentali utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sacrificio animale e raccolta di tessuti

1. Inserire il topo in una camera di eutanasia ermetica e eutanasiare tramite inalazione graduale di anidride carbonica (CO₂), dal 30%-70% del volume della camera al minuto.
2. Confermare la morte per cessazione della respirazione e del battito cardiaco spontanei, perdita dei riflessi pupilari e assenza di risposta alla stimolazione meccanica.
3. Immergi i topi eutanasiati C57BL/6 in etanolo al 75% per 5 minuti per la disinfezione.
   NOTA: Per evitare fissazione tessutale indotta dall'alcol e danni cellulari, limitare il tempo di immersione a 10 minuti. Utilizzare tessuto fresco durante tutto il protocollo perché il congelamento compromette la vitalità mitocondriale e l'integrità funzionale.
4. Inserire il topo in una piastra di Petri sterile all'interno di un cappuccio a flusso laminare con l'addome rivolto verso l'alto per esporre completamente le regioni addominali e posteriori.
5. Sollevi la pelle della parte bassa dell'addome vicino alla zona genitale usando una pinza e fai una piccola incisione. Esegui una dissezione contusiva per separare la pelle dal tessuto sottostante. Estendi l'incisione superiormente lungo la linea mediana fino alla caviglia e lateralmente verso entrambi gli arti posteriori per esporre completamente i gruppi muscolari degli arti posteriori.
6. Identificare il muscolo quadricipite femorale sulla parte anteriore della coscia e separare con cura il muscolo lungo la direzione delle fibre muscolari usando una dissezione smussata. Recidi il legamento rotuleo distale e il tendine prossimale per isolare completamente il tessuto muscolare.
   NOTA: Lavare il tessuto tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pre-raffreddata, integrata con penicillina-streptomicina al 2%, utilizzando una piastra di Petri fresca per ogni lavaggio per minimizzare la contaminazione.
7. Inserire immediatamente il tessuto muscolare isolato in PBS pre-raffreddato e risciacquare accuratamente per rimuovere peli e sangue dalla superficie del tessuto.
8. Tampona delicatamente l'eccesso di umidità dal tessuto usando una garza sterile. Dividere il tessuto in tubi microcentrifughe da 1,5 mL e pesare i campioni. Usa circa 100 mg di tessuto per campione per mantenere la consistenza tra una preparazione e l'altra.

2. Triturazione dei tessuti e omogeneizzazione

1. Metti il tubo della microcentrifuga contenente il tessuto dello Passo 1.8 sul ghiaccio. Trita il tessuto in piccoli frammenti di circa 1-2^{mm 3} di dimensione usando forbici sterili.
2. Aggiungi 8 volumi di tripsina allo 0,25% pre-raffreddata e digerisci i frammenti di tessuto sul ghiaccio per 15 minuti.
   NOTA: Calcola il volume richiesto di tripsina in base alla massa tissutale (1 mg ≈ 1 μL). Ad esempio, aggiungere 640 μL di tripsina allo 0,25% a 80 mg di tessuto.
3. Centrifuga la miscela a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il soprantantante e conservare la pallina di tessuto. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone isolante mitocondriale pre-raffreddato contenente D-mannitolo (215 mM), saccarosio (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) e albumina sirica bovina priva di acidi grassi (0,5% p/v).
4. Trasferire la sospensione a un omogeneizzatore di vetro mantenuto sul ghiaccio. Omogeneizzare il tessuto usando 10-12 movimenti dolci su e giù finché la sospensione non diventa torbida.
   NOTA: Evitare di ruotare lateralmente il pestello di vetro alla base dell'omogeneizzatore perché una forza meccanica eccessiva potrebbe danneggiare le membrane mitocondriali e compromettere la funzione mitocondriale.

3. Centrifugazione differenziale

1. Trasferire l'omogeneato in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
2. Trasferire il soprandanante in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 mL e centrifugare a 12.000 × g per 5 minuti a 4 °C per ottenere il pellet mitocondriale grezzo.
   NOTA: Raccogliere con cura il soprantantante usando una siringa da 1 mL evitando disturbare il pellet e i residui di tessuto.

4. Purificazione e stoccaggio mitocondriale

1. Risospendere delicatamente il pellet mitocondriale grezzo in un tampone di lavaggio pre-raffreddato contenente saccarosio (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7,4), EGTA (1 mM) e albumina sieroica bovina (0,15% p/v). Centrifuga la sospensione a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
2. Trasferire il soprandanante in un tubo centrifuga fresco e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C per ottenere la pellet mitocondriale purificata.
   NOTA: Usa subito i mitocondri appena isolati ogni volta che è possibile. È fattibile la conservazione a breve termine a 4 °C o la conservazione a lungo termine a −80 °C in un tampone mitocondriale contenente saccarosio (0,25 M), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) ed EGTA (0,1 mM). Tuttavia, il congelamento può compromettere l'attività enzimatica mitocondriale e la funzione respiratoria. Usa campioni congelati principalmente per l'analisi delle proteine.

5. Estrazione di proteine mitocondriali e citosoliche e quantificazione della BCA

1. Estrazione di proteine mitocondriali
   1. Risospendere il pellet mitocondriale purificato in 50 μL di tampone di lisi RIPA ogni 100 mg di tessuto iniziale e incubare la sospensione sul ghiaccio per 15 minuti.
   2. Centrifugare il lisato a circa 14.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Trasferire il soprandanante in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 mL per ottenere la frazione proteica mitocondriale.
2. Estrazione di proteine citosoliche
   1. Centrifugare il soprantantante citosolico ottenuto nello Passo 4.2 a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il sovrantante e mantenere la pellet come frazione citosolica arricchita.
   2. Risospendere il pellet citosolico in 50 μL di tampone di lisi RIPA e processare il campione come descritto nei passaggi 5.1.1-5.1.2.
      NOTA: Preparare il tampone di lisi con inibitori della proteasi ed eseguire tutte le procedure sul ghiaccio per minimizzare la degradazione proteica. Le mitocondrie utilizzate in questo passaggio possono essere fresche o congelate.
3. Quantificazione della proteina BCA
   1. Preparare la soluzione di lavoro BCA mescolando il reagente A e il reagente B in un rapporto di 50:1 (v/v). Aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro a ciascun pozzo di una piastra da 96 pozzi.
      NOTA: Prepara la soluzione di lavoro BCA immediatamente prima dell'uso e usala entro 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Diluire la soluzione di stocco di albumina sieroica bovina (BSA) a 0,5 mg/mL e lasciare la soluzione sul ghiaccio fino all'uso.
   3. Preparare la curva standard aggiungendo 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 o 0 μL di soluzione BSA a pozzi separati. Regola il volume finale a 20 μL usando la soluzione di NaCl.
   4. Aggiungi 4 μL di proteina mitocondriale e 16 μL di soluzione di NaCl in un insieme di pozzi. Aggiungere 4 μL di proteina citosolica e 16 μL di soluzione NaCl in un altro set di pozzi.
   5. Aggiungi 200 μL di soluzione di lavoro BCA in ogni pozzo e incuba la piastra a 37 °C al buio per 30 minuti. Misura l'assorbenza a 562 nm usando un lettore di microplacche.
   6. Costruire una curva standard proteica con un coefficiente di correlazione (R²) ≥ 0,999. Calcola le concentrazioni proteiche (μg/μL) interpolando i valori di assorbanza dalla curva standard.

6. Valutazione della purezza dei mitocondri derivati dal muscolo scheletrico

1. Diluire campioni di proteine mitocondriali e citosoliche a una concentrazione finale di 1,5 μg/μL. Prepara miscele di reazione da 20 μL contenenti 30 μg di proteine e 4 × tampone di carico. Regola il volume residuo con la soluzione NaCl. Fai bollire i campioni per 10 minuti e conservarli a −80 °C fino all'uso.
2. Separare i campioni proteici usando gel prefabbricati gradiente 4%-20%. Esegui l'elettroforesi a 140-150 V per 50 minuti.
3. Attiva la membrana PVDF (0,22 μm) nel metanolo per 1 minuto. Trasferire proteine utilizzando il tampone a trasferimento rapido a 400 mA per 30 minuti.
4. Rimuovi la membrana PVDF dal sandwich di trasferimento e lava in TBST per 5 minuti. Blocca la membrana con latte scremato al 5% a temperatura ambiente per 1 ora con una lieve agitazione.
5. Diluire gli anticorpi primari (COX IV, citocromo c, β-actina) 1:1.000 in tampone di diluizione degli anticorpi. Incubare la membrana con anticorpi primari durante la notte a 4 °C.
6. Lava la membrana tre volte con TBST per 10 minuti a ogni lavaggio.
7. Incubare la membrana con anticorpi secondari diluiti 1:10.000 a temperatura ambiente per 1 ora.
8. Lava la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna. Sviluppa il blot e cattura le immagini.

7. Colorazione MitoTracker dei mitocondri derivati dal muscolo scheletrico

1. Diluire la soluzione di lavoro per la colorazione a una concentrazione finale di 200 nM in un mezzo preriscaldato immediatamente prima dell'uso.
2. Risospendere la pellet mitocondriale in 100 μL della soluzione di lavoro e incubare a 37 °C al buio per 20 minuti.
3. Aggiungi cinque volumi di buffer di stoccaggio pre-raffreddato dopo l'incubazione. Centrifugare la sospensione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e scartare il surnante contenente il colorante non legato.
4. Trasferire un'aliquota della sospensione mitocondriale colorata su un vetrino di vetro e coprire il campione con un copertino.
5. Cattura immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con impostazioni appropriate di eccitazione ed emissione per la rilevazione di coloranti mitocondriali fluorescenti rossi.

8. Valutazione del potenziale della membrana mitocondriale tramite colorazione JC-1

1. Gruppo di trattamento CCCP (cianuro carbonilico m-clorofenil idrazona)
   1. Trattare la sospensione mitocondriale con CCCP a una concentrazione finale di 10 μM e incubare per 20 minuti per dissipare il potenziale della membrana mitocondriale.
   2. Incubare la sospensione mitocondriale trattata con CCCP con 250 μL di soluzione di colorazione JC-1 a 37 °C per 20 minuti con agitazione delicata.
2. Gruppo di trattamento JC-1
   1. Sospendere il pellet mitocondriale in 100 μL di soluzione lavorativa JC-1 e incubare a 37 °C per 20 minuti protetto dalla luce.
   2. Prepara 1× tampone di colorazione JC-1 diluendo la soluzione di 5× con acqua distillata in un rapporto di 2:8 (v/v) e mantenendo il tampone sul ghiaccio.
   3. Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare il pellet mitocondriale due volte con un tampone di colorazione ×JC-1 pre-raffreddato.
   4. Sospendi i mitocondri colorati in PBS e riprodurli con un microscopio confocale a scansione laser. Utilizzare impostazioni appropriate di eccitazione ed emissione per la rilevazione dei monomeri fluorescenti verdi JC-1 e degli aggregati fluorescenti rossi JC-1.

9. Analisi ultrastrutturale di mitocondri muscolari scheletrici isolati tramite microscopia elettronica a trasmissione

1. Fissare i mitocondri appena isolati in glutaraldeide al 2,5% preparato in tampone fosfato 0,2 M (pH 7,4) e incubare i campioni durante la notte a 4 °C.
2. Lavare i campioni con soluzione salina tamponata fosfato a 0,1 M (PBS, pH 7,4) e fissare i campioni in tetrossido di osmio all'1% per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo gradato, seguita da infiltrazione, incorporazione e polimerizzazione in resina epossidica.
4. Taglia i campioni incorporati a uno spessore di 50-70 nm utilizzando un ultramicrotomo.
5. Colora doppiamente le sezioni con acetato di uranyle e citrato di piombo. Osserva e immagini i campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.

10. Assorbimento cellulare dei mitocondri derivati dal muscolo scheletrico

1. Clone NCTC 929 (L929) della coltura; RRID: CVCL_0462) ottenute da un fornitore commerciale in un mezzo completo contenente MEM Alpha integrato con siero fetale al 10% e 1% di penicillina-streptomicina.
2. Quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, aspira il mezzo e lava le cellule due volte con PBS preriscaldato. Aggiungi tripsina-EDTA e incuba finché le cellule non si staccano.
3. Aggiungere un mezzo completo per interrompere la digestione e generare una sospensione a singola tramite pipetazione delicata. Centrifuga la sospensione a 1.000 × g per 5 minuti e scarta il soprantantante.
4. Risospendere il pellet cellulare in un mezzo fresco e completo e seminare le cellule in nuovi vasi di coltura a densità adeguata. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
5. Fai passare le cellule di semi 5 (P5) in piastre di vetro da 35 mm e coltivare le cellule durante la notte.
6. Etichettare i mitocondri isolati con un colorante rosso fluorescente specifico per mitocondri a 37 °C al buio per 20 minuti e lavare i mitocondri con PBS per rimuovere il colorante non legato.
7. Aggiungere mitocondri fluorescenti rossi marcati con coloranti (20 μg di proteine mitocondriali per piatto) alle cellule e incubare per 24 ore a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂.
8. Tingere le cellule con una sonda fluorescente di actina per 30 minuti per visualizzare il citoscheletro di actina e controcolorare i nuclei con un colorante nucleare fluorescente.
   NOTA: Controllate attentamente la concentrazione sierica durante la co-incubazione perché un eccesso di siero può ridurre l'efficienza dell'assorbimento mitocondriale. I mitocondri utilizzati in questo passaggio sono freschi.

11. Misurazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

1. Preparazione degli strumenti
   1. Pulire le camere respiratorie, i compartimenti degli elettrodi e i tappi.
   2. Inserire una barra magnetica di agitazione in ogni camera e verificare l'integrità della membrana dell'elettrodo dell'ossigeno.
2. Calibrazione degli strumenti
   1. Aggiungi 2,1 mL di buffer per la respirazione mitocondriale (MiR05, pH 7.10) in ogni camera respiratoria e assicurati che non ci siano bolle d'aria.
   2. Bilanciare il sistema di respirometria ad alta risoluzione a 37 °C per 30 minuti ed eseguire la calibrazione quotidiana dell'aria dopo la stabilizzazione della linea di base dell'ossigeno.
      NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria nella camera respiratoria, poiché interferiscono con i segnali degli elettrodi dell'ossigeno e compromettono la qualità dei dati. I mitocondri utilizzati in questo passaggio sono freschi.
3. Carico e bilanciamento del campione
   1. Aggiungi mitocondri appena isolati contenenti circa 30 μg di proteine nella camera respiratoria e sigillala in camera.
   2. Bilancia la camera per 5-8 minuti e registra il consumo basale di ossigeno.
      NOTA: Mantieni i mitocondri sul ghiaccio ed esegui misurazioni della respirazione immediatamente dopo l'isolamento per preservare l'attività.
4. Protocollo SUIT
   1. Aggiungere 5 μL di piruvato (2 M), 10 μL di glutammato (2 M) e 10 μL di malato (400 mM) in sequenza. Stabilizza la reazione per 5 minuti e registra la respirazione CI leak.
   2. Aggiungere 10 μL di ADP (500 mM) per indurre la fosforilazione ossidativa e registrare la respirazione CI OXPHOS. Aggiungi 10 μL di cloruro di magnesio (0,3 M).
   3. Aggiungere 20 μL di succinato (1 M) e registrare la respirazione CI+CII OXPHOS dopo la stabilizzazione.
   4. Aggiungere 2 μL di inibitore ATP sintasi (0,01 mM) e registrare la respirazione da fuga di protoni.
   5. Aggiungere CCCP (1 mM) in modo incrementale in tre aggiunte da 2 μL ogni 2 minuti fino a raggiungere un plateau nel consumo di ossigeno. Registrare la massima capacità del sistema di trasferimento elettronico.
   6. Aggiungere 1 μL di rotenone (1 mM) per inibire l'attività del complesso I.
   7. Aggiungere 1 μL di antimicina A (5 mM) per inibire l'attività del complesso III e registrare il consumo residuo di ossigeno.
   8. Aggiungi 5 μL di ascorbato (800 mM) e 5 μL N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenediamina (200 mM). Registrare la massima attività respiratoria complessiva IV dopo la stabilizzazione.
      NOTA: Applicare tutti i reagenti prima del congelamento per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Aggiungi gradualmente la CCCP, poiché un eccessivo disaccoppiamento inibisce la respirazione mitocondriale.
5. Analisi dei dati
   1. Ottenere parametri di respirazione mitocondriale, inclusi CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET e CIV, utilizzando il software di analisi dei dati.
   2. Calcola il rapporto di controllo respiratorio (RCR; Respirazione in stato 3/respirazione in stato 4) e capacità produttiva di ATP. Mantenere tutti i valori a tre cifre significative per l'analisi statistica. Il software utilizzato per l'analisi dei dati era Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Una panoramica schematica del flusso di lavoro di isolamento e purificazione mitocondriale è mostrata nella Figura 1. Tutte le procedure sono state eseguite a 4 °C per preservare l'integrità mitocondriale e l'attività funzionale. Il tessuto muscolare scheletrico appena isolato è stato tritato e digerito con tripsina per facilitare la dissociazione tissutale, quindi omogeneizzato in un buffer isotonico di isolamento utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Successivamente è stata eseguita centrifugazione differenziale per separare i mitocondri dai detriti tissutali e dai contaminanti citosolici. La centrifugazione iniziale a 1.000 × g rimosse nuclei e grandi detriti, mentre la centrifugazione successiva a 12.000 × g produsse un pellet mitocondriale grezzo. Ulteriori passaggi di lavaggio e centrifugazione hanno ulteriormente ridotto la contaminazione citosolica, producendo mitocondri purificati adatti ad analisi strutturali e funzionali a valle (Figura 1).

Figura 1: Diagramma schematico dell'isolamento e purificazione mitocondriale. Le mitocondrie ad alta purezza sono state isolate attraverso un approccio combinato di digestione controllata della tripsina e centrifugazione differenziale. Tutte le procedure sono state eseguite a 4 °C per preservare l'integrità strutturale e funzionale mitocondriale. Il tessuto muscolare scheletrico appena isolato è stato sottoposto a digestione enzimatica, omogeneizzazione e centrifugazione sequenziale per ottenere mitocondri purificati adatti ad analisi funzionali e strutturali a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'attività funzionale dei mitocondri isolati è stata valutata utilizzando la colorazione JC-1 e la marcatura mitocondriale fluorescente (Figura 2). La colorazione con JC-1 ha mostrato una forte fluorescenza rossa nei mitocondri appena isolati in condizioni basali, indicando la conservazione del potenziale della membrana mitocondriale. Dopo il trattamento con cianuro carbonilico m-clorofenil idrazona (CCCP), la fluorescenza rossa è diminuita e quella verde è aumentata, compatibile con la depolarizzazione della membrana mitocondriale. Questi risultati hanno confermato che i mitocondri isolati hanno mantenuto la potenziale reattività della membrana e sono rimasti funzionalmente attivi dopo l'isolamento. La marcatura fluorescente ha inoltre dimostrato che i mitocondri apparivano come strutture puntate discrete e uniformemente distribuite in tutto il campo, senza aggregazione evidente o precipitazione di colorante. La bassa fluorescenza di fondo e il modello uniforme di colorazione suggerivano la conservazione dell'integrità mitocondriale e del potenziale di membrana dopo l'isolamento.

Figura 2: Caratterizzazione dell'attività funzionale dei mitocondri isolati. (A) Valutazione del potenziale della membrana mitocondriale tramite colorazione JC-1. I mitocondri purificati sono stati colorati con JC-1 e osservati tramite microscopia a fluorescenza. Aggregati fluorescenti rossi distinti sono stati osservati nel gruppo mitocondriale di controllo, indicando un potenziale di membrana mitocondriale preservato. Dopo il trattamento con il disaccoppiatore CCCP, la fluorescenza si è spostata prevalentemente verso i monomeri verdi JC-1, indicando la depolarizzazione della membrana e il collasso del potenziale della membrana (barra di scala = 50 μm). (B) Marcatura mitocondriale fluorescente dei mitocondri purificati. I mitocondri marcati fluorescentmente apparivano come strutture sparse e puntate, senza aggregazione evidente e con fluorescenza di fondo minima, indicando un'integrità mitocondriale preservata e un potenziale di membrana stabile (barra di scala = 100 μm). (C) Analisi quantitativa dei rapporti di intensità di fluorescenza di JC-1 in diversi gruppi dopo la colorazione con JC-1. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando un test t non accoppiato (****P < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'integrità ultrastrutturale dei mitocondri isolati è stata esaminata tramite microscopia elettronica a trasmissione (Figura 3). L'imaging a basso ingrandimento ha rivelato mitocondri purificati con morfologia prevalentemente ovale, mentre l'imaging ad alto ingrandimento ha mostrato membrane esterne intatte e strutture cristae chiaramente definite. Non è stato osservato gonfiore, rottura o alterazione strutturale evidente. Per la valutazione quantitativa, sono stati analizzati cinque campi selezionati casualmente contenenti circa 40-60 mitocondri per campo. Queste osservazioni hanno dimostrato che la procedura di isolamento ha efficacemente preservato l'ultrastruttura mitocondriale e generato mitocondri adatti a studi funzionali a valle.

Figura 3: Integrità ultrastrutturale delle mitocondri muscolari scheletrici isolati valutata tramite microscopia elettronica a trasmissione. (Sinistra) Immagine rappresentativa TEM a basso ingrandimento (4.000×; barra di scala = 2 μm) che mostra mitocondri purificati con morfologia prevalentemente ovale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

(Destra) Immagine TEM ad alto ingrandimento (40.000×; barra di scala = 200 nm) che dimostra membrane mitocondriali esterne lisce e continue e strutture cristae chiaramente definite. Le frecce gialle indicano membrane mitocondriali esterne intatte, mentre le frecce bianche indicano criste mitocondriali ben organizzate. Non sono state osservate segni di gonfiore, rottura o alterazione strutturale. Sono stati analizzati cinque campi selezionati casualmente contenenti circa 40-60 mitocondri per campo. Questi risultati dimostrano che il protocollo di isolamento ha preservato l'integrità ultrastrutturale mitocondriale e fornito una base strutturale affidabile per i test funzionali a valle.

La resa e la purezza mitocondriale sono state successivamente valutate tramite quantificazione delle proteine e analisi immunoblot (Figura 4). Il confronto tra i metodi di digestione della tripsina (TD) e quello di estrazione normale (NE) ha mostrato che il metodo TD ha prodotto circa 2,3-2,4 μg di proteina mitocondriale per ogni mg di tessuto, mentre il metodo NE ha prodotto circa 1,7-1,8 μg/mg di tessuto. L'analisi immunoblot ha dimostrato un forte arricchimento dei marcatori mitocondriali, citocromo c ossidasi e COX IV, nelle frazioni mitocondriali, con una rilevazione minima nelle frazioni citosolici. Al contrario, il marcatore citosolico β-actin ha mostrato solo segnali deboli nelle frazioni mitocondriali, indicando una contaminazione citosolica limitata. Il confronto tra i gruppi TD e NE suggeriva che la digestione della tripsina migliorava la resa e la purezza mitocondriali. Collettivamente, questi risultati hanno dimostrato che il protocollo generava mitocondri adatti ad analisi molecolari e funzionali a valle.

Figura 4: Confronto tra resa e purezza dei mitocondri purificati. (A) Confronto della resa proteica mitocondriale per unità di massa tissutale ottenuta utilizzando i metodi di digestione della tripsina (TD) e di estrazione normale (NE). Il gruppo TD ha prodotto circa 2,3-2,4 μg/mg di tessuto, mentre il gruppo NE ha prodotto circa 1,7-1,8 μg/mg di tessuto. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando un test t non accoppiato (*P < 0,05). (B) Analisi immunoblot delle proteine marcatrici mitocondriali e citosoliche in frazioni mitocondriali isolate utilizzando i metodi TD e NE. (C-D) Analisi quantitativa delle proteine marcatrici mitocondriali, citocromo c ossidasi e COX IV. I marcatori mitocondriali erano fortemente arricchiti nelle frazioni mitocondriali, ma mostravano un'espressione minima nelle frazioni citosoliche. Il marcatore citosolico β-actin ha mostrato solo una debole espressione nelle frazioni mitocondriali, indicando una rimozione efficiente dei contaminanti citosolici. Rispetto al gruppo NE, il gruppo TD ha mostrato un miglioramento della purezza mitocondriale. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando un test t non accoppiato (*P < 0,05; **P < 0,01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare ulteriormente la funzione respiratoria mitocondriale, il consumo di ossigeno è stato misurato utilizzando respirometria ad alta risoluzione (Figura 5). Le mitocondrie isolate con il metodo TD hanno mostrato valori di rapporto di controllo respiratorio (RCR) di circa 9-10, mentre i mitocondri isolati con il metodo NE hanno mostrato valori RCR di circa 8-9. Poiché valori RCR superiori a 4 sono generalmente considerati indicative di attività respiratoria mitocondriale preservata, questi risultati hanno dimostrato che i mitocondri isolati con entrambi i metodi hanno mantenuto l'integrità funzionale. I valori RCR più alti osservati nel gruppo TD suggerivano una migliore conservazione della funzione respiratoria mitocondriale rispetto al gruppo NE. L'efficienza di accoppiamento biochimico è stata valutata anche utilizzando l'equazione 1 − (velocità di respirazione da perdita/velocità di trasferimento elettronico), con valori vicini a 1 che indicano un accoppiamento respiratorio più stretto e una produzione di ATP più efficiente. Entrambi i gruppi hanno mostrato efficienze di accoppiamento vicine a 1, indicando che la funzione bioenergetica mitocondriale è stata preservata dopo l'isolamento.

Figura 5: Analisi della funzione respiratoria nei mitocondri purificati. (A) Confronto del rapporto di controllo respiratorio mitocondriale (RCR) tra i gruppi di digestione della tripsina (TD) e quelli di estrazione normale (NE). I valori RCR in entrambi i gruppi erano superiori a 4, indicando la conservazione dell'attività respiratoria mitocondriale dopo l'isolamento. Il gruppo TD ha mostrato valori RCR leggermente più alti rispetto al gruppo NE, suggerendo una migliore conservazione della funzione respiratoria. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando un test t non abbinato (**P < 0,01). (B) Confronto tra l'efficienza di accoppiamento biochimico mitocondriale e la capacità di sintesi ATP tra i gruppi TD e NE. I valori di efficienza di accoppiamento si avvicinarono a 1 in entrambi i gruppi, indicando una respirazione altamente accoppiata e una produzione efficiente di ATP. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando un test t non accoppiato (*P < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'assorbimento dei mitocondri isolati da parte delle cellule riceventi è stato valutato utilizzando cellule L929 (Figura 6). Le cellule sono state co-incubate con mitocondri derivati dal muscolo scheletrico marcato con colorante fluorescente rosso, e il citoscheletro di actina è stato visualizzato utilizzando una sonda fluorescente di actina. La microscopia confocale ha rivelato strutture fluorescenti rosse puntate distribuite in tutto il citoplasma, indicando che le cellule L929 avevano assorbito mitocondri esogeni. L'analisi quantitativa ha dimostrato un aumento dipendente dal tempo dell'assorbimento mitocondriale a 12, 24 e 48 ore. Tuttavia, è stato osservato solo un lieve aumento tra 24 e 48 ore, suggerendo che l'efficienza di assorbimento si avvicinava alla saturazione dopo 24 ore. Inoltre, le cellule L929 riceventi hanno mostrato un potenziale aumentato della membrana mitocondriale dopo l'assorbimento mitocondriale, indicando un miglioramento della funzione mitocondriale. Questi risultati hanno dimostrato che i mitocondri derivati dal muscolo scheletrico isolati tramite questo protocollo potevano essere efficacemente interiorizzati dalle cellule riceventi mantenendo l'attività funzionale.

Figura 6: Assorbimento cellulare dei mitocondri derivati dal muscolo scheletrico da parte delle cellule L929. (A) Assorbimento dei mitocondri purificati da parte delle cellule L929 in tempi di incubazione diversi (12 h, 24 h e 48 h). Mitocondrie e mitocondri marcati con coloranti fluorescenti (rosso) sono stati rilevati nel citoplasma delle cellule riceventi, mentre la colorazione con falloidina (verde) è stata utilizzata per visualizzare il citoscheletro di actina. La colorazione nucleare veniva eseguita utilizzando DAPI (blu). La microscopia confocale ha confermato l'internalizzazione dei mitocondri esogeni da parte delle cellule L929 (barra di scala = 50 μm). (B) Analisi quantitativa dell'efficienza di assorbimento mitocondriale da parte delle cellule L929 in diversi momenti temporali. (C) Analisi della colorazione JC-1 del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule L929 dopo l'assorbimento di mitocondri derivati dal muscolo scheletrico. (D) Analisi quantitativa dei rapporti di fluorescenza aggregato-monomerico di JC-1 nelle cellule riceventi L929 dopo l'assorbimento mitocondriale. Il potenziale della membrana mitocondriale è aumentato significativamente dopo l'internalizzazione delle mitocondri derivate dal muscolo scheletrico attivo. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). La significatività statistica è stata analizzata utilizzando ANOVA unidirezionale (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il trapianto mitocondriale è una strategia emergente nella terapia cellulare e nella medicina rigenerativa che ripristina la funzione fisiologica nelle cellule con metabolismo energetico compromesso attraverso la somministrazione di mitocondri funzionalmente intatti. Oltre a regolare il metabolismo energetico cellulare, questa tecnica può modulare processi biologici chiave come l'apoptosi e lo stress ossidativo, offrendo così nuove opportunità terapeutiche per una varietà di malattie ^4,17,18,19. Tuttavia, la traduzione clinica del trapianto mitocondriale affronta ancora diverse sfide, tra cui la mancanza di protocolli standardizzati, efficienti e riproducibili di isolamento mitocondriale, che rimane un importante collo di bottiglia.

Per affrontare questo problema, il presente studio ha stabilito un protocollo sperimentale standardizzato e visualizzato basato sulla centrifugazione differenziale per l'isolamento efficiente dei mitocondri liberi funzionali dal muscolo scheletrico del topo C57BL/6. Ottimizzando la procedura di purificazione e incorporando le fasi di pre-digestione, lavaggio e purificazione della tripsina, questo metodo migliora efficacemente la dissociazione tissutale, preserva l'integrità strutturale mitocondriale e riduce la contaminazione da componenti cellulari non bersaglio.

Il protocollo proposto raggiunge un equilibrio favorevole tra purezza mitocondriale e resa mitocondriale. Rispetto ai metodi convenzionali di estrazione basati sulla macinazione, il metodo attuale è più veloce, pratico ed economico, rendendolo adatto per applicazioni di laboratorio di routine e preparazione mitocondriale donata. Gli approcci esistenti all'isolamento mitocondriale presentano ciascuno alcune limitazioni. Ad esempio, la centrifugazione a gradiente di densità e la purificazione di immunoaffinità possono raggiungere una purezza superiore ma richiedono tempo e sono costose, mentre gli approcci basati su sonde su scala nanometrica restano insufficientemente sviluppati per un uso di routine^20,21. Per tessuti densi come il muscolo scheletrico, la fase ottimizzata della pre-digestione della tripsina (0,25% di tripsina a 37 °C per 10-15 minuti), combinata con una delicata omogeneizzazione, preserva meglio l'integrità mitocondriale rispetto alla centrifugazione differenziale convenzionale da sola.

In questo studio, un kit di centrifugazione differenziale disponibile commercialmente è stato utilizzato in condizioni di bassa temperatura durante tutta la procedura e seguendo un flusso di lavoro standardizzato, consentendo un'acquisizione rapida di mitocondri strutturalmente intatti. Per affrontare i potenziali problemi incontrati durante il processo di estrazione, tra cui basso rendimento, contaminazione proteica e potenziale anomalo della membrana, sono proposte diverse strategie di risoluzione dei problemi.

La bassa resa mitocondriale è comunemente causata da un'insufficiente omogeneizzazione, quantità tissutali insufficienti o perdita centrifuga. Questi problemi possono essere minimizzati garantendo un'adeguata predigestione, eseguendo una delicata omogeneizzazione (10-15 passate con un omogeneizzatore ben adatto), utilizzando almeno 100-150 mg di tessuto muscolare scheletrico fresco, controllando rigorosamente le condizioni di centrifugazione (1.000 × g per la rimozione dei detriti e 10.000-12.000 g × per la pellet mitocondriale) e risospendendo i campioni con punte a pipetta a larga alarginazione. La contaminazione proteica deriva principalmente da rimozione incompleta di detriti o interferenze lipidiche; Pertanto, si raccomanda di ripetere la fase di centrifugazione da 1.000 × g, incorporando due ulteriori passaggi di lavaggio da 12.000 × g e rimuovendo con cura il tessuto adiposo. Un potenziale anomalo della membrana mitocondriale è spesso associato a danni meccanici o fluttuazioni di temperatura. Dovrebbe quindi evitare un'omogeneizzazione eccessiva, l'intera procedura deve essere eseguita su ghiaccio e completata entro 60-90 minuti, e i buffer di isolamento dovrebbero essere integrati con EGTA e 0,5% di BSA. L'omogeneizzazione incompleta può essere migliorata garantendo una digestione enzimatica adeguata, selezionando un omogeneizzatore appropriato ed eseguendo la filtrazione post-omogeneizzazione.

Sebbene l'attuale protocollo migliori significativamente l'efficienza e la purezza dell'isolamento mitocondriale, permangono diverse limitazioni. Innanzitutto, la procedura dipende fortemente dalla freschezza dei tessuti; Idealmente, i campioni di tessuto dovrebbero essere processati entro 1 ora dall'autopsia. In secondo luogo, la tripsina residua può degradare le proteine superficiali mitocondriali, incluse quelle correlate alla translocase, se non adeguatamente rimossa durante il lavaggio, influenzando potenzialmente l'efficienza dell'assorbimento cellulare successivo. In terzo luogo, il tempo di conservazione mitocondriale rimane limitato, poiché la conservazione prolungata a 4 °C o la crioconservazione riducono sostanzialmente l'attività mitocondriale.

A livello traslazionale, permangono ulteriori sfide, tra cui il miglioramento dell'efficienza della consegna in vivo , la comprensione dei meccanismi a lungo termine dell'integrazione mitocondriale e la chiarezza delle potenziali interazioni tra i mitocondri trapiantati e il genoma dell'ospite. Con i continui progressi nelle tecnologie di isolamento e purificazione mitocondriale, si prevede ulteriori innovazioni metodologiche che accelereranno la traduzione clinica della terapia di trapianto mitocondriale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Caratterizzazione mitocondriale
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Ridurre la fotobleaching dei coloranti fluorescenti
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Assay di concentrazione proteica
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	L'anticorpo Beta-actin è stato utilizzato per rilevare la purezza dei mitocondri isolati
BSA	Sigma	A6003	Durante l'isolamento, si lega agli acidi grassi liberi per proteggere l'attività mitocondriale.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugazione a 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	per disaccoppiare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e indurre la massima perdita di protoni
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Osservazione di colorazione immunofluorescente
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Caratterizzazione mitocondriale
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Per controtinta nucleare
D-mannitol	Solarbio	IM00402	mantenere l'equilibrio osmotico e prevenire il gonfiore mitocondriale durante l'isolamento
EGTA	Sigma	E4378	Comunemente utilizzato nei buffer di isolamento mitocondriale per proteggere la funzione mitocondriale legando specificamente Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Coltura di cellule L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Usato per afferrare, tenere e sollevare i tessuti
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Usato per l'omogeneizzazione tissutale e l'isolamento dei mitocondri
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	Fissazione rapida e stabilizzazione dell'ultrastruttura cellulare attraverso la reticolazione delle proteine, prevenendo l'autolisi per preservare la morfologia naturale degli organuli.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Fornisce un ambiente di pH stabile.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Coltura di cellule L929
JC-1	Solarbio	M8650	Rilevamento delle variazioni nel potenziale di membrana dei mitocondri purificati.
L929 cell line	Procell	CL-0137	Per il saggio di endocitosis mitocondriale
Lead citrate	Sigma	15326	per colorare sezioni ultrasottili per l'osservazione della struttura subcellulare fine.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Coltura di cellule L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	Come componente del buffer di trasferimento, viene utilizzato per rimuovere SDS e facilitare il trasferimento di proteine dal gel alla membrana in fase solida.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Misurare l'assorbanza dei mitocondri colorati con JC-1
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Rilevamento del potenziale di membrana mitocondriale nel muscolo scheletrico
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kit per l'estrazione basati sulla centrifugazione differenziale
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	Per la conservazione dei mitocondri
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Caratterizzazione mitocondriale
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	Come buffer nella preparazione della soluzione
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 si rivolge a IgG di topo (H+L) nel Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 si rivolge a IgG di coniglio (H+L) in ELISA e Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	Viene utilizzato principalmente come agente di bloccaggio per ridurre il segnale di fondo occupando i siti di legame non specifici sulla membrana.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Determinare la funzione respiratoria mitocondriale e il metabolismo dell'ossigeno.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	o postfissare per preservare i lipidi e migliorare il contrasto delle membrane nei campioni TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Pulizia del tessuto muscolare
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Coltura di cellule L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Etichettare l'F-actin del citoscheletro per l'imaging microscopico a fluorescenza
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	Per la separazione delle proteine mediante elettroforesi SDS-PAGE
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Usato per la separazione SDS-PAGE delle proteine mitocondriali e cellulari totali
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inibisce l'attività delle proteasi endogene ed esogene, prevenendo la degradazione delle proteine bersaglio durante l'elaborazione del campione.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Usato per l'estrazione totale delle proteine di tessuti animali e cellulari
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Numero di approvazione H61020014	Buffer, risciacquo e mantenimento della pressione osmotica per cellule/tessuti sperimentali
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isolare la contaminazione e proteggere operatori e campioni sperimentali
Sucrose	Sucrose	S818048	Fornisce supporto osmotico e