Quantificazione del tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans

Sommario

Questo protocollo fornisce una procedura semplice e a basso costo per quantificare il tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans. Consente una semplice rilevazione di anomalie embrionali tra le popolazioni senza attrezzature specializzate o competenze nel picking di vermi. Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli effetti delle mutazioni genetiche, delle eliminazioni genetiche mediate dall'interferenza dell'RNA e della dieta.

Abstract

La letalità embrionale è un fenotipo fondamentale utilizzato nella ricerca su Caenorhabditis elegans per caratterizzare difetti dello sviluppo derivanti da fattori come esposizioni tossiche e mutazioni genetiche. Pertanto, quantificare accuratamente la penetranza della letalità embrionale è fondamentale per comprendere i meccanismi e l'impatto di queste perturbazioni sullo sviluppo animale. Sebbene esistano piattaforme di punteggio automatizzate, questi approcci spesso richiedono investimenti finanziari sostanziali e hardware o software specializzati. Questo articolo descrive un saggio a bassa tecnologia e basso costo che quantifica la letalità embrionale misurando la percentuale di embrioni che non riescono a schiudersi. È importante notare che questa versione del test elimina la necessità di un puntetto per vermi, rendendolo eccezionalmente adatto ai principianti. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che ogni tecnico replica la progenie degli saghi da più animali, evitando i potenziali bias dei saghi a vermi singoli. Questo protocollo include una discussione di parametri critici, come il numero minimo di progenie necessario per catturare accuratamente la penetranza fenotipica e la motivazione della metodologia. Infine, forniamo indicazioni sull'adattamento del saggio per valutare gli effetti del knockdown genico tramite interferenza con RNA, trattamenti farmacologici o integrazione nutrizionale, aggiungendo uno strumento versatile e accessibile al kit degli attrezzi dei ricercatori di C. elegans .

Introduzione

La letalità embrionale è un fenotipo critico per valutare i ruoli dei geni e dei fattori ambientali nello sviluppo precoce. C. elegans è un modello potente per studiare i processi di sviluppo grazie alla sua linea cellulare invariante, al corpo trasparente e al rapido ciclo^{vitale 1}. La letalità embrionale di C. elegans può essere utilizzata per valutare l'integrità dello sviluppo sotto perturbazioni chimiche, farmacologiche, nutrizionali e^genetiche 2,3,4,5. Pertanto, metodi accessibili e versatili per quantificare con precisione il tasso di letalità embrionale sarebbero utili per la comunità scientifica.

Metodi avanzati ad alta produttività e alto contenuto che studiano l'embriogenesi si basano su sistemi di imaging specializzati e software, spesso richiedendo un investimento finanziario ^{sostanziale 4,6,7}, mentre approcci più semplici ad alto rendimento forniscono principalmente letture qualitative ^8,9. I metodi classici, al contrario, utilizzano un approccio manuale e a basso costo che tipicamente prevede il trasferimento ripetuto di singoli ermafroditi con un lombriche per valutare la letalità embrionale dell'intera^{covata 2,10}. Tuttavia, questo metodo può essere tecnicamente impegnativo per i principianti e ha una scalabilità limitata. Inoltre, i saggi classici basati sulla dimensione della covata quantificano la vitalità embrionale nella progenie di una madre singola, il che può introdurre un bias involontario.

L'obiettivo generale di questo metodo è fornire un approccio alternativo, semplice, conveniente e versatile per quantificare la vitalità embrionale a portata media. Questo metodo misura i tassi di letalità embrionale nei progenitori di più animali per replica, non richiede l'uso di un puntettore di vermi ed evita qualsiasi attrezzatura specializzata o costosa. Lo studio mostra anche come il metodo possa essere applicato a perturbazioni comuni, come l'interferenza dell'RNA e i test su farmaci o nutrienti.

Protocollo

1. Manutenzione di C. elegans

NOTA: Indicazioni dettagliate sull'allevamento di C. elegans si trovano in WormBook¹¹.

1. Preparare le piastre di manutenzione con Mezzo di Crescita Nematode (NGM).
   1. Per ottenere 1 L di NGM, si combinano 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone batteriologica e 17 g di agar in una bottiglia da 2 L. Aggiungi 975 mL di acqua distillata e una barra per mescolare, poi usa l'autoclave per 20 minuti a 121 °C.
   2. Lascia raffreddare il substrato a 55 °C in un bagno d'acqua. Posiziona la bottiglia su un piatto per mescolare e, utilizzando la tecnica asettica, aggiungi 25 mL di 1 M tampone fosfato di potassio e 1 mL ciascuno dei seguenti elementi: 1 M_{MgSO 4}, 1 M_{CaCl 2} e 5 mg/mL di colesterolo. Versare circa 25 mL in ciascuna lastra da 100 mm.
2. Prepara durante la notte colture di E. coli OP50.
   1. Utilizzando la tecnica asettica, riempi una fiaschetta Erlenmeyer da 1 L fino a un quinto del suo volume (200 mL) con mezzo LB. Inocula il mezzo con una singola colonia di E. coli OP50 utilizzando un annello inoculante sterile. Incubare durante la notte a 37 °C su uno shaker orbitale a 200 giri/min.
3. Seme piastre di manutenzione NGM con E. coli OP50 (Figura 1A).
   1. Trasferire la cultura E. coli OP50 in bottiglie centrifughe autoclaviate e centrifugare per 30 minuti a 3.500 x g a temperatura ambiente. Risospendere la pellet batterica in un ventesimo del volume originale. Utilizzare 1–1,5 mL di coltura concentrata per seminare ogni piastra NGM da 100 mm.
   2. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente per permettere ai batteri di crescere.
      NOTA: Queste piastre di manutenzione hanno un'alta densità di batteri per supportare fino a 4.000 vermi per placca, cosa desiderabile quando si effettuano un gran numero di saggi o si lavora con un ceppo a crescita lenta di C. elegans. I piatti di manutenzione a seme possono essere conservati in frigorifero a 4 °C per un massimo di 1 mese.
4. Stabilire una coltura primaria di C. elegans (Figura 1A).
   1. Usa una punta sterile per tagliare un piccolo pezzo di agar contenente ~1.000 vermi da una piastra di manutenzione affamata. Posiziona il pezzo di agar su una piastra NGM con semi.
   2. Metti il nuovo piatto in un contenitore di plastica e incuba a 20 °C per 3 giorni, finché i vermi non sono gravidi e depongono le uova. Assicurati che il prato batterico sia sufficiente e che la popolazione di vermi non muoia di fame. A questo punto, la popolazione di vermi è pronta per l'esperimento.

2. Preparazione di mezzi sperimentali e colture batteriche

NOTA: In questo passo, procedere con il Metodo 1 per testare l'effetto del knockdown genetico mediato dall'RNAi oppure con il Metodo 2 per indagare gli integratori alimentari.

1. Metodo 1: Preparare le piastre sperimentali NGM per RNAi tramite alimentazione.
   1. Prepara 1 L di NGM come descritto nel passo 1.1, poi, utilizzando la tecnica asettica, aggiungi 1 mL di 1 M IPTG e 1 mL di 50 mg/mL di ampicillina. Versare circa 5 mL in ciascun piatto da 35 mm.
   2. Inoculare il numero desiderato di cloni che si nutrono con RNAi con E. coli HT115 portanti plasmidi L4440 e che prendono di mira i geni di interesse di C. elegans , insieme al controllo del vettore vuoto. Scegli una singola colonia con un anello inoculante e trasferiscila in 1,5 mL di LB contenenti 50 μg/mL di ampicillina. Incubare per 18 ore a 37 °C su uno shaker orbitale a 200 giri/min.
   3. Semi lastre NGM da 35 mm contenenti ampicillina e IPTG con 100 μL di coltura notturna di E. coli HT115, preparando due repliche tecniche per ogni condizione. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente per permettere la crescita batterica e indurre la produzione di RNA a doppio filamento. Conserva un numero uguale di piatti non seminati a 4 °C per un uso successivo nel trasferimento delle uova.
2. Metodo 2: Preparare piastre sperimentali NGM con un integratore nutrizionale o farmacologico.
   1. Prepara 1,5 volte la concentrazione NGM seguendo le istruzioni del passo 1.1, ma aggiungi 642 mL di acqua distillata invece di 975 mL. Tieni il mezzo preparato in un bagno d'acqua a 55 °C.
   2. Prepara un stock a base d'acqua del supplemento di interesse a 3 volte la concentrazione target (ad esempio, per preparare piastre contenenti 40 mM di sodio di sodio, fare un stock da 120 mM). Calcola il volume di stock richiesto moltiplicando il numero di lastre sperimentali per 1,666 mL (un terzo del volume della placca). Usa un filtro a siringa per sterilizzare il brodo, poi riscaldalo a 55 °C in un bagno d'acqua.
   3. In un tubo conico da 50 mL, miscela 2 parti 1,5x NGM con 1 parte di materiale supplementare. Per evitare il controllo degli integratori, mescola 2 parti di 1,5x NGM con 1 parte di acqua calda sterile. Mescola delicatamente invertendo il tubo 10 volte, poi, usando la tecnica asettica, versa rapidamente circa 5 mL di substrato in ciascuna piastra da 35 mm.
      NOTA: 1,5x NGM viene usato per compensare la diluizione media quando si aggiungono grandi quantità di integratori. Tuttavia, se il farmaco o il metabolito è concentrato fino al 100× o più della concentrazione finale, si può usare il normale NGM invece di 1,5× NGM. Quando si integra con un acido organico, l'uso della sua forma di sale di sodio aiuta a prevenire un calo del pH medio.
   4. Utilizzando la tecnica asettica, riempi una fiaschetta Erlenmeyer da 50 mL fino a un quinto del suo volume (10 mL) con mezzo LB. Inoculare con una colonia di E. coli OP50 e incubare durante la notte a 37 °C su uno shaker orbitale a 200 giri al minuto.
   5. Seminare lastre NGM da 35 mm con 100 μL di coltura notturna di E. coli OP50, preparando due repliche tecniche per ogni condizione. Incuba le piastre durante la notte a temperatura ambiente. Conserva un numero uguale di piatti non seminati a 4 °C per un uso successivo nel trasferimento delle uova.

3. Ottenere una popolazione sincronizzata di larve L1

1. Prepara la soluzione alcalina di candeggina combinando 7 mL di acqua sterile, 2 mL di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e 1 mL di NaOH al 5 N.
2. Prepara il tampone M9 sciogliendo 3 g di_{KH 2}PO₄, 6 g di Na_{2HPO 4} e 5 g di NaCl in 1 L di acqua distillata, poi regola il pH a 6,5. Autoclave per 20 minuti a 121 °C, lascia raffreddare la soluzione, poi aggiungi asepticamente 1 mL di 1 M MgSO4.
3. Lava i vermi adulti gravidi (passo 1.4.2) dalla piastra con il tampone M9 e trasferiscili in un tubo conico da 15 mL. Centrifuga a 350 x g per 2 minuti, aspira il soprantantante e riempi il tubo con un tampone M9 fresco. Ripeti il lavaggio due volte.
4. Aggiungi 2 mL di tampone M9 e 2 mL di soluzione di candeggina alcalina al pellet per i vermi. Vortice e scuotono vigorosamente, controllando periodicamente al microscopio finché quasi tutti i vermi non si sono dissolti.
5. Riempi il tubo con il tampone M9 e centrifuga a 350 x g per 2 minuti. Rimuovere il sovrantato invertendo il tubo, poi lavare quattro volte con il buffer M9. Assicurati che il primo lavaggio venga eseguito subito dopo che i vermi sono stati lisati per evitare l'eccessiva sbiancatura. Dopo l'ultimo lavaggio, riempi il tubo con 8 mL di tampone M9 e incuba su un dondolo per 18–20 ore, fino alla schiusa delle uova.

4. Coltivazione delle popolazioni materne

1. Posizionare cinque gocce da 3 μL di sospensione di vermi su un vetrino di vetro e contare il numero di larve L1 schiuse al microscopio. Dividere il conteggio totale per 15 per ottenere la concentrazione per microlitro.
2. Placcare 30 larve L1 su ciascuna piastra seminata da 35 mm e incubare a 20 °C per 72 ore. Se le condizioni sperimentali inducono ritardi nello sviluppo, estendere il tempo di incubazione finché i vermi non diventano gravidi e iniziano a deporre le uova (Figura 1B).

5. Trasferimento degli embrioni alle placche di schiusa

1. Rimuovi i piatti da 35 mm non seminati dal frigorifero e lasciali raggiungere la temperatura ambiente.
2. Esaminare le placche vermiche al microscopio e confermare che contengono più di 100 embrioni, senza larve di L1 schiuse.
3. Riempi con cura il piatto con il buffer M9. Usa una linea a vuoto per aspirare il liquido e rimuovere la popolazione materna. Assicurati che non rimangano vermi adulti sul piatto.
4. Riempi la punta della micropipetta con 200 μL di tampone M9 e pipetta su e giù con forza per staccare gli embrioni dal prato batterico. Mentre osserva al microscopio, guida la punta della pipetta verso le aree dense di embrioni.
5. Prendi un piatto non seminato e pipetta una goccia di sospensione embrionale al centro. Esamina la goccia al microscopio. Se non contiene 100–300 embrioni, aggiungere altra sospensione embrionale fino a raggiungere questo intervallo. Assicurati che nessun verme della popolazione genitoriale venga trasferito insieme agli embrioni.
6. Lascia asciugare il liquido, poi incuba le piastre di trasferimento a 20 °C per almeno 24 ore.
   NOTA: Se le larve di L1 sono già presenti sulla piastra sperimentale, utilizzare una linea di vuoto invece di un lavaggio M9 per rimuovere l'intera popolazione materna una ad una. Questo impedisce di lavare via i piccoli di L1, che non si attaccano al prato batterico come fanno gli embrioni. Procedere con il trasferimento della progenie, che ora includerà sia embrioni che larve di L1. Assicurati che lo stesso approccio venga applicato a tutte le condizioni.

Figura 1: Cronologia sperimentale e schema dei passaggi chiave nel saggio di letalità embrionale. (A) Cronologia del diagramma di flusso che rappresenta l'intera durata del protocollo sperimentale, dalla preparazione del supporto di manutenzione alla puntuazione delle piastre di trattonatura. Le procedure chiave sono indicate per i giorni corrispondenti dell'esperimento. (B) Schema del saggio di letalità embrionale (passaggi 4–6). Al quarto giorno, le larve L1 sincronizzate vengono aggiunte alle piastre sperimentali di RNAi o integratori per stabilire una popolazione materna. Dopo 72 ore, al settimo giorno, una volta che i vermi hanno deposto le uova, la popolazione materna viene lavata via mentre gli embrioni rimangono attaccati al prato batterico. Gli embrioni vengono poi lavati via dal prato con una pipetta e trasferiti su una piastra di schiusa, con almeno 100 embrioni per piatta. Dopo 24 ore di incubazione vengono conteggiate le larve schiuse e gli embrioni non schiusi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Placche di punteggio

1. Usa un pennarello inattivo per disegnare una griglia di circa 4 mm × 4 mm sul coperchio di una piastra di Petri da 35 mm, poi posiziona il coperchio sotto la placca. Usa la griglia come guida e, al microscopio, conta il numero di larve L1 ed embrioni non schiusi con un contatore di clic portatile.
2. Combina il conteggio delle repliche tecniche per garantire un peso appropriato di ogni replica in base al numero dei suoi discendenti. In particolare, somma il numero di embrioni non schiusi e larve eclose tra repliche tecniche.
3. Calcola un tasso di letalità embrionale per ogni replica biologica dividendo il numero di embrioni (vermi non schiusi) per il numero totale di vermi ed embrioni, poi moltiplicando per 100 per esprimere il valore in percentuale.
   NOTA: Se una piastra contiene solo larve schiuse o solo embrioni, questa fase di conteggio può essere saltata, poiché il tasso di letalità embrionale è rispettivamente 0 (0%) o 1 (100%).

7. Analisi statistica

1. Ripeti l'intero esperimento almeno tre volte per ottenere repliche biologiche indipendenti. Per ogni replica biologica, si utilizzano due piastre di replicazione tecnica per condizione, con un minimo di 100 embrioni per ogni replica tecnica.
2. Determinare se i tassi di letalità embrionale differiscono significativamente tra le condizioni utilizzando ANOVA unidirezionale, seguiti da test t di Student a coppie a coppie con correzione a test multiplo, come il metodo di Benjamini-Hochberg.
   NOTA: Combinando due repliche tecniche si ottiene almeno 200 embrioni per ogni replica biologica. Questo soddisfa il requisito di dimensione del campione (~184 embrioni/condizione) stimato dal test power.prop.test della funzione base R per rilevare una differenza del 15 percento nella letalità (ad esempio, 20% contro 35%) con il 90% di potenza e un livello di significatività di α = 0,05.

Risultati

Il test di letalità embrionale è stato eseguito in due ceppi: di tipo selvatico N2 e ceppo RNAi-ipersensibile rrf-3(pk1426). Utilizzando RNAi tramite alimentazione, abbiamo eliminato geni precedentemente segnalati come causa di letalità embrionale in screening ad alta^{produttività 9,12}. La Figura 2 fornisce una dimostrazione rappresentativa delle prestazioni del saggio. Il knockdown T04G9.4 ha prodotto una letalità embrionale...

Discussione

Diversi passaggi sono fondamentali per la riproducibilità e l'accuratezza del saggio. Innanzitutto, la fase di sbiancamento deve essere accuratamente sincronizzata per sciogliere i vermi adulti senza danneggiare gli embrioni. Un altro punto importante è trasferire un numero sufficiente di embrioni per il conteggio: troppo pochi ridurranno la precisione, mentre troppi diventeranno il conteggio inutilmente noioso. Successivamente, il trasferimento embrionale dovrebbe essere eseguito prima ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi ipersensibile
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	Per preparare il terreno LB sciogliere 25 g di polvere LB in 1 L di acqua distillata. Autoclavare per 20 min a 121.1 °C.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			Per preparare il buffer fosfato di potassio (1 M), sciogliere 98 g di fosfato di potassio monobasico e 48 g di fosfato di potassio dibasico in 1 L di acqua distillata. Regola il pH a 6. Autoclavare per 20 min a 121 °C.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401