Software per la Mappatura dei Parametri Microgliali (MMPS): Uno strumento open-source e facile da usare per l'analisi quantitativa della morfologia della microglia

Sommario

Microgliale Parameters Software (MMPS) è una pipeline di analisi intuitiva che non richiede competenze di codifica e che semi-automatizza l'analisi della morfologia microgliale di singola cellula da immagini di immunofluorescenza. Validata in un modello di neuroinfiammazione indotta da lipopolisaccaridi di roditori, la MMPS rileva riproducibilmente i cambiamenti morfologici associati all'attivazione e consente un fenotipaggio microgliale standardizzato e scalabile.

Abstract

Le microglie sono cellule immunitarie derivate dal sistema nervoso centrale del sistema nervoso mieloide che mediano la degradazione e la rimodellazione dei tessuti dopo lesioni neurologiche e si sono rivelate bersagli terapeutici promettenti in diverse malattie neurodegenerative. L'analisi quantitativa della morfologia microgliale può rivelare differenze sottili tra le sottopopolazioni microgliali preservando al contempo importanti informazioni in situ . Tuttavia, molte piattaforme di analisi della morfologia microgliale attualmente disponibili non sono accessibili al pubblico o richiedono competenze computazionali specializzate, limitandone così la diffusione della diffusione. Per affrontare queste limitazioni, è stata sviluppata una piattaforma open source per l'analisi della morfologia microgliale, denominata Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), utilizzando Python 3.11. MMPS è compatibile con flussi di lavoro basati su immunofluorescenza e non richiede competenze di codifica per l'installazione o il funzionamento. Il software semi-automatizza l'analisi della morfologia microgliale a singola cellula tramite un'interfaccia grafica accessibile e incorpora flussi di lavoro personalizzabili per l'elaborazione delle immagini e la generazione delle maschere. Lo studio prevede la convalidazione di MMPS utilizzando un modello di neuroinfiammazione indotto da lipopolisaccaridi di roditori (LPS). L'analisi quantitativa a livello animale ha dimostrato che la microglia degli animali trattati con LPS ha mostrato un aumento significativo dell'area del soma (p < 0,01) e una riduzione del perimetro cellulare (p < 0,05) rispetto ai controlli trattati con veicolo, coerente con caratteristiche morfologiche associate all'attivazione microgliale e alla neuroinfiammazione. Nel complesso, MMPS fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per l'analisi quantitativa della morfologia microgliale in diversi laboratori.

Introduzione

Le microglie sono cellule immunitarie innate del sistema nervoso centrale (SNC) che ispezionano continuamente l'ambiente circostante alla ricerca di patogeni e danni ai^{tessuti 1}. All'attivazione, la microglia ritrae i propri processi e passa da una morfologia omeostatica ramificata a un fenotipo ameboide ^2,3. Nelle malattie neurodegenerative come l'ictus ischemico ^4,5 e il morbo di Alzheimer ^6,7. La microglia spesso perpetua la neuroinfiammazione attraverso la produzione prolungata di citochine, la degradazione estesa dei tessuti e la^{fagocitosi 2}. Questi processi contribuiscono a disturbare l'unità neurovascolare, aggravando ulteriormente l'attivazione microgliale e la lesione del sistema nervoso^{centrale 8}, rendendo così la microglia bersaglio terapeutico^{promettente 9,10}.

Un approccio per identificare differenze sottili tra le sottopopolazioni microgliali nelle malattie neurodegenerative è attraverso l'analisi morfologica. Questo viene comunemente eseguito utilizzando animali Cx3CR1-GFP con microscopia a due fotoni in vivo ¹¹ o tramite marcatura immunofluorescenza (IF) di marcatori microgliali consolidati come la molecola ionizzata di adattamento di legame al calcio-1 (Iba1) o il recettore purinoceptor^{P2Y 12}. Sebbene la microglia spesso passi da morfologie omeostatice e ameboidi dopo lesioni, studi precedenti hanno dimostrato che la microglia può anche adottare fenotipi aggiuntivi, tra cui microglia iperramificata ^3,13, microglia a nido ^3,14, microglia reattiva¹⁵ e microglia ^{bastonciale 3,16}. Tuttavia, gli studi sulla morfologia microgliale spesso si basano sulla categorizzazione manuale dei fenotipi omeostatici e ameboidi. Questi approcci richiedono pipeline di analisi specializzate che spesso mancano di standardizzazione tra laboratori e rendono difficile differenziare tra morfologie simili, come fenotipi omeostatici e iperramificati, anche per il personale^{formato 17}. Inoltre, l'analisi basata su IF di sottili alterazioni morfologiche richiede imaging ad alta risoluzione, che può presentare ulteriori sfide tecniche.

Per affrontare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse piattaforme analitiche che rilevano microglia^{semi-automaticamente 11} o^{automaticamente 18} e generano più rappresentazioni binarie delle celle, chiamate "maschere", tra aree target definite dall'utente (ad esempio, 200–800^{μm 2}). Questi approcci riducono il bias dell'utente, migliorano la riproducibilità e aumentano l'efficienza analitica. Nonostante questi progressi, molte piattaforme software attualmente disponibili presentano limitazioni che limitano l'adozione diffusa, tra cui la mancanza di accessibilità^{open-source 17}, requisiti per la competenza di codifica 11,19,20, dipendenza da sistemi di microscopia a due fotoni in ^{vivo 11,19}, assenza di interfacce grafiche intuitive 11,21,22^, lentezza velocità di^{elaborazione 11}, o dipendenza da piattaforme software^{commerciali 12, 19, 21}. Sebbene studi recenti abbiano iniziato ad affrontare diversi di questi problemi, molte piattaforme esistenti rimangono poco adatte ai flussi di lavoro basati su IF, che restano ampiamente utilizzati per lo studio della morfologia microgliale.

Qui è presentata una piattaforma orientata all'utente per l'analisi della morfologia microgliale chiamata Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS non richiede competenze di programmazione, si integra con flussi di lavoro consolidati basati su ImageJ ed è progettato specificamente per l'uso con immagini IF. Il software è stato sviluppato in Python 3.11 e incorpora concetti provenienti da piattaforme morfologiche open-source precedentemente^{pubblicate 11}. MMPS presenta un'interfaccia grafica intuitiva che consente agli utenti di importare e processare grandi quantità di immagini IF utilizzando molteplici opzioni personalizzabili di elaborazione delle immagini. La piattaforma incorpora anche la selezione manuale delle cellule per minimizzare artefatti di sovracampionamento introdotti durante l'imaging IF, oltre a una delineazione manuale dei soma per prevenire l'inclusione di processi cellulari nelle misurazioni dei SOMA. Inoltre, MMPS include parametri personalizzabili per la generazione delle maschere e molteplici funzionalità di garanzia della qualità per migliorare la precisione delle mascherine. Il software calcola diversi parametri morfologici comunemente usati, tra cui perimetrale, distanza media del centroide, area della maschera, eccentricità, rotondità e area di Soma. Per studi più avanzati, gli output generati da MMPS sono compatibili con molteplici plugin ImageJ e possono essere ulteriormente analizzati utilizzando plugin associati per analisi frattali, scheletriche e di involucro.

La MMPS è stata convalidata utilizzando un modello di neuroinfiammazione indotto da lipopolisaccaridi di roditori (LPS) esaminando alterazioni microgliali nello strato corticale IV. L'analisi quantitativa ha dimostrato che la somministrazione di LPS ha aumentato significativamente l'area del soma microgliale riducendo il perimetro cellulare rispetto ai controlli trattati con veicolo, indicando che l'MMPS rileva con precisione sottili cambiamenti morfologici associati all'attivazione microgliale.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con il Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della West Virginia University (protocollo #2109047180) e la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio supportata dai National Institutes of Health. Le attrezzature, i reagenti e il software utilizzati in questo metodo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali sperimentali

1. Procura 10 maschi di ratti Sprague-Dawley (2-3 mesi). Una volta arrivati alla struttura per animali, i ratti dovrebbero essere ospitati in gruppo con un ciclo di 12 ore luce/buio con accesso ad libitum a cibo e acqua. All'arrivo, i ratti vengono acclimatati per 3 giorni prima dell'uso.
2. Assegnare casualmente i ratti a gruppi trattati con veicoli o LPS (n = 5 ratti/gruppo).
   NOTA: A causa del piccolo numero di ratti da utilizzare, si può adottare una semplice strategia di randomizzazione, con numeri casuali generati al computer per assegnare i ratti a un gruppo di trattamento.
3. Monitorare i ratti dopo il trattamento per il "comportamento malato": perdita di peso (>15%), secrezione di porfirina, anomalie respiratorie o riduzione dell'attività.
   NOTA: I sintomi comportamentali da nausea spesso si manifestano nelle prime 12 ore dopo la somministrazione, quindi iniettare agenti presto al mattino (6-8), monitorare il comportamento durante la giornata e riportare i ratti in struttura a tarda giornata (17-19).

2. Modello di neuroinfiammazione

1. Prepara la soluzione standard LPS (O111:B4) (10 mg/mL) dissolvendo 50 mg LPS in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato.
   NOTA: LPS è un'endotossina. I ricercatori dovrebbero seguire le procedure standard di funzionamento della propria istituzione per la gestione e lo smaltimento.
2. Pesare i ratti e poi iniettare intraperitonealmente LPS (10 mg/kg) o PBS (veicolo).
3. In base al peso dei ratti, si prevede un volume di iniezione compreso tra 150 e 300 μL.
4. Eutanasiare i ratti 24 ore dopo l'iniezione tramite perfusione cardiaca seguita dalla decapitazione.
5. Anestetizzare i ratti con isoflurano inalato (5% in_O2) per 5–10 minuti. Confermare l'anestesia in assenza del riflesso di ritiro del pedale.
6. Durante l'anestetismo, crea un'incisione toracica mediana per esporre diaframma e sterno. Clampa il processo xifoide usando emostati per rivelare la cavità toracica.
7. Taglia il diaframma e la gabbia toracica verso gli arti anteriori per esporre il cuore.
8. Clampare l'aorta discendente e la vena cava inferiore con emostati. Inserire un ago alare calibro 25 nel ventricolo sinistro.
9. Perfondere i ratti con PBS gelato (25 mL a 30 mL/min) utilizzando una pompa peristaltica. Incisci l'atrio sinistro entro pochi secondi dall'inizio della perfusione per permettere il drenaggio della perfusazione.
10. Ratti perfusi con il 4% di paraformaldeide (25 mL a 30 mL/min).
    ATTENZIONE: Maneggiare il paraformaldeide utilizzando l'attrezzatura di protezione personale appropriata in un ambiente ben ventilato. Smaltire i rifiuti di paraformaldeide secondo le normative istituzionali e locali.
11. Decapitare i ratti con una ghigliottina dopo la perfusione.
    NOTA: Segui le linee guida della tua istituzione riguardo al registro delle decapitazioni e dell'affilatura delle lame.
12. Espone il cranio ritraendo il cuoio capelluto verso il papillone spoglione.
13. Rompere l'osso frontale usando emostati o rongeurs inseriti nelle cavità orbitali.
14. Inserisci le pinze nel forame magnum e rimuovi le ossa parietali.
15. Rimuovere il cervello usando pinze sottili e incubare durante la notte in paraformaldeide al 4%.
16. Trasferire i cervelli in modo sequenziale nel 20% di saccarosio e nel 30% di saccarosio durante la notte per la crioprotezione.

3. Immunofluorescenza

1. Congela cervelli crioprotetti nel Tissue Tek O.C.T. Compound su ghiaccio secco.
2. Sezione cervello a 30 μm usando un criostato.
3. Raccogli sezioni in PBS e trasferiscile in pozzi di rete inseriti in una piastra a 12 pozzi.
4. Seleziona almeno due sezioni per ratto contenenti l'ippocampo dorsale anteriore.
5. Lava le sezioni in PBS per 5 minuti due volte mentre dondoli.
6. Permeabilizza le sezioni al 0,3% Triton X-100/PBS per 45 minuti durante il dondolo.
   NOTA: Usa 3 mL di soluzione per ogni fase di lavaggio o incubazione, salvo diversa indicazione.
7. Lava le sezioni in PBS per 5 minuti due volte.
8. Diluire la soluzione di prelievo dell'antigene a 1x in PBS e aggiungere 2 mL per pozzo.
9. Incubare le sezioni a 80°C per 20 minuti usando un bagno d'acqua.
10. Lascia raffreddare le sezioni alla temperatura ambiente prima di procedere.
11. Lava le sezioni in PBS per 5 minuti due volte.
12. Bloccare sezioni in siero di asino al 10% / 0,05% Triton X-100/PBS per 2 ore a 37°C mentre agita a 75 giri al minuto.
13. Lava le sezioni con siero di asino all'1%/0,05% Triton X-100/PBS per 5 minuti e tre volte.
14. Trasferire le sezioni in una nuova piastra a 12 pozzi senza i pozzi netti contenenti 500 μL di soluzione primaria di anticorpi anti-Iba1 preparata in siero d'asino all'1%/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Prepara controlli negativi omettendo l'anticorpo primario dalla soluzione di incubazione.
16. Incubare tutte le sezioni durante la notte a 4°C su un oscillatore orbitale
17. Riportare le sezioni ai pozzi delle reti.
18. Lava le sezioni con siero di asino all'1%/0,05% Triton X-100/PBS per 10 minuti e tre volte.
19. Incubare sezioni con anticorpo secondario anti-coniglio (diluizione 1:1000) in siero di asino all'1%/0,05% Triton X-100/PBS per 1,5 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: Minimizzare l'esposizione alla luce durante tutte le procedure successive e avvolgere le piastre in carta stagnola per prevenire la degradazione del fluoroforo.
20. Lava le sezioni in PBS per 5 minuti due volte.
21. Monta le sezioni su vetri per microscopio.
22. Asciugare all'aria al buio per >2 ore.
23. Sezioni di copertura usando composti solubili in acqua.
24. Prepara le scontri di controllo negativo utilizzando un mezzo di montaggio.
25. Conserva i vetrini in una scatola per slide a temperatura ambiente in un ambiente buio.

4. Imaging

1. Identifica la dimensione dei pixel di un sistema di imaging a un ingrandimento di 40x. Se la scala non viene trovata, aggiungi una barra di scala a ogni immagine.
2. Utilizzare la colorazione DAPI per identificare una banda densa di nuclei corticali a basso ingrandimento corrispondente allo strato corticale IV.
3. Focali l'immagine sulla regione corticale identificata.
4. Passa all'ingrandimento 40x.
5. Regola le impostazioni di esposizione del canale per massimizzare la separazione tra segnali DAPI e Iba1 dalla fluorescenza di fondo.
6. Acquisire immagini Z-stack (> 30 passaggi) che coprono tutta la profondità della microglia.
7. Genera e salva un'immagine composita di proiezione a massima intensità dallo stack Z acquisito di entrambe le colorazioni.
   NOTA: Ottimizzare le impostazioni di esposizione e Z-stack per ogni immagine per massimizzare la separazione del segnale tra DAPI/Iba1 e fluorescenza di fondo. Una scarsa separazione del segnale riduce la precisione della generazione delle maschere.

5. Software per la mappatura dei parametri microgliali (MMPS)

1. Conserva tutte le immagini composite in una singola directory di immagini.
2. Crea una directory di output separata per i risultati generati da MMPS.
3. Scarica il pacchetto standalone MMPS o MMPS.py script dal repository GitHub.
4. Installa tutte le dipendenze elencate nel file requirements.txt se avvii MMPS tramite MMPS.py.
5. Apri il pacchetto MMPS o esegui MMPS.py script.
6. Seleziona "Seleziona la cartella immagini" e scegli la cartella immagini.
7. Seleziona "Seleziona cartella di output" e scegli la cartella di output.
8. Concedere permessi di accesso alle cartelle se richiesto dal sistema operativo.
   NOTA: Istruzioni di installazione aggiuntive, linee guida per la risoluzione dei problemi ed esempi di utilizzo sono forniti nella documentazione supplementare e nel repository GitHub.
9. Seleziona "Etichettatura immagine" e assegna identificatori animali e gruppi di trattamento a ciascuna immagine.
   NOTA: Se l'etichettatura delle immagini viene saltata, MMPS richiede identificatori per gruppi di trattamento e animali prima dell'esportazione dei dati.
10. Inserisci la dimensione del pixel nella scheda "Parametri".
11. Seleziona "Calibra dalla barra della scala" se la dimensione del pixel è sconosciuta. Seleziona i punti di inizio e fine della barra della scala quando richiesto. Entra in scena la distanza nota della barra di scala in micrometri.
12. Seleziona il canale di fluorescenza contenente il segnale microgliale.
13. Seleziona le immagini per l'elaborazione selezionando la casella accanto a ogni nome di immagine. Elaborare le immagini individualmente quando la fluorescenza di fondo differisce sostanzialmente tra le immagini.
14. Rivedi le schede "Originale", "Anteprima", "Elaborato" e "Maschere" per confrontare le fasi di elaborazione delle immagini.
15. Seleziona "Anteprima immagine corrente" per valutare le impostazioni di elaborazione delle immagini.
16. Regolare le impostazioni di sottrazione dello sfondo a palla rotolante, riduzione del rumore e nitidezza secondo necessità.
17. Usa valori di rotolamento tra 5 e 150 pixel per la sottrazione dello sfondo.
18. Usa valori di denoising tra 3 e 7 pixel per ridurre gli artefatti di illuminazione disomogenei.
19. Usa valori di affilatura tra 1 e 2 per migliorare la definizione dei bordi.
20. Seleziona "Processa immagini selezionate" dopo aver ottimizzato le impostazioni di elaborazione delle immagini.
    NOTA: Il tempo di elaborazione dell'immagine varia a seconda del numero di immagine e dei parametri selezionati.
21. Seleziona "Scegli Somas (Tutte le Immagini)."
22. Seleziona "Mostra colore (C)" per visualizzare immagini composite RGB. Seleziona "Canali..." e deselezionare i canali non utilizzati se la colorazione dell'immagine appare distorta.
23. Seleziona i soma microgliali che mostrano la localizzazione DAPI e Iba1. Evita di selezionare celle che toccano i bordi dell'immagine. Rimuovi i marcatori soma selezionati in modo errato usando il tasto "Backspace" o "Delete".
24. Premi "Invio" o "Invio" per passare all'immagine successiva.
25. Seleziona "Outline Somas (All)" dopo aver completato la selezione del soma.
26. Definire il perimetro soma di ciascuna cellula microgliale selezionata. Escludere i processi cellulari dal contorno del soma e utilizzare almeno otto punti di contorno per ogni soma. Rimuovi i punti di contorno posizionati in modo errato usando "Annulla l'ultimo punto", "Elimina" o "Ritorno indietro".
27. Stampa "Entra", "Ritorno", doppio clic o clic destro per finalizzare ogni schema di soma.
28. Seleziona "Rifare l'ultimo schema" per ripetere il precedente schema SOMA se necessario.
29. Seleziona "Genera tutte le maschere" dopo aver completato la scaletta del SOMA.
30. Applicare un valore di soglia minimo per limitare l'incorporazione di pixel di fondo a bassa intensità nelle maschere.
    NOTA: Valori più alti preservano la precisione del soma a scapito del ramificamento, mentre valori più bassi mantengono la precisione del ramo a scapito del soma. I valori di soglia tra il 10 e il 30% tipicamente forniscono una soppressione di fondo equilibrata e la conservazione dei rami.
    NOTA: Il tempo di generazione della maschera varia a seconda del numero di celle selezionate.
31. Seleziona "QA All Masks" per iniziare il controllo della qualità delle mascherine.
32. Revisiona le maschere presentate dalla più grande (800^{μm 2}) alla più piccola (200^{μm 2}).
33. Confronta ogni maschera con la microglia corrispondente usando le schede "Processed" e "Mask".
34. Accetta le maschere usando la scorciatoia "A". Rifiuta le maschere usando la scorciatoia da tastiera "R". Premi "B" per annullare un'accettazione o un rifiuto. Naviga tra le dimensioni delle maschere usando i tasti freccia della tastiera.
35. Seleziona la maschera più grande accettabile che catturi con precisione la ramificazione microgliale senza includere cellule vicine, sfondo eccessivo, bordi dell'immagine o barre di scala.
    NOTA: Rifiuta le mascherine se c'è incertezza sulla loro accuratezza.
    NOTA: Seleziona "Cancella tutte le maschere", poi rigenera le maschere con un valore soglia diverso se la maggior parte è inaccurata.
36. Seleziona "Calcola caratteristiche semplici" dopo che la garanzia qualità della maschera è completata per
    Calcola la distanza media del baricentro, l'area della maschera, il perimetro, l'eccentricità, la rotondità e la dimensione del Soma utilizzando maschere accettate e contorni del SOMA.
37. Consultare la Tabella 1 per le definizioni dei parametri e le tendenze microgliali nella neuroinfiammazione.
38. Scarica "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" e "SkeletonAnalysisImageJ.py" per effettuare ulteriori analisi.
39. Apri "FractalAnalysis_ImageJ.py" come plugin Fiji per analisi frattali e di scafo.
40. Inserisci la posizione della directory di output e la dimensione del pixel quando richiesto. Seleziona l'opzione "maschera più grande" se si desidera l'analisi solo della maschera più grande accettata.
41. Apri "Sholl.py" come plugin Fiji per l'analisi di Sholl.
42. Inserisci la posizione della directory di output e la dimensione del pixel quando richiesto.
43. Inserisci la dimensione desiderata del passo per l'analisi di Sholl. Seleziona "Usa raggio soma come raggio di partenza" per usare i raggi soma derivati da MMPS come raggio di partenza per l'analisi di Sholl. Inserisci un valore fisso di raggio soma se non si usano raggi soma derivati da MMPS.
44. Apri "SkeletonAnalysisImageJ.py" come plugin Fiji per l'analisi degli scheletri.
45. Inserisci la posizione della directory di output, la dimensione dei pixel e la posizione della cartella maschere quando richiesto.
46. Esporta tutti i risultati generati dal plugin come file CSV nella cartella di output una volta terminato.

6. Formule utilizzate in MMPS per i calcoli della morfologia della microglia

NOTA: Tutti i calcoli vengono eseguiti automaticamente da MMPS quando si preme "Calcola caratteristiche semplici". I calcoli dei parametri sono mostrati di seguito.

1. Perimetro
   1. Calcola il perimetro usando la seguente equazione:
      
   2. Definisci come perimetro, come il numero di pixel di bordo e come dimensione dei pixel in μm.
2. Distanza media del centroide
   NOTA: La distanza media del centroide è anche chiamata diffusione^{cellulare 11}.
   1. Identificare quattro punti finali di ramo basandosi sulle coordinate della cella:
      ramo superiore: coordinata Y minima,
      Ramo inferiore: massima coordinata Y,
      ramo sinistro: coordinata x minima,
      Ramo destro: Massima coordinata X.
   2. Calcola le coordinate del centroide utilizzando le seguenti equazioni:
      
      
   3. Definisci c_x e _{c y} come coordinate del centroide, x_i e _{y i} come coordinate dei pixel, e come il numero totale di pixel.
   4. Calcola la distanza del ramo usando la seguente equazione:
      
   5. Definiamo d come distanza di ramo, x_i e _{y i} come coordinate di fine ramo, e c_x e _{c y} come coordinate del centroide.
   6. Calcola la distanza media del centroide usando la seguente equazione:
      
   7. Si definisce come la distanza media del centroide, come distanza di ramo, d_i e come dimensione del pixel in μm.
3. Area della mascherina
   1. Calcola l'area della maschera usando la seguente equazione:
      
   2. Definisci come area della maschera in μm², come il numero di pixel all'interno della maschera e come dimensione dei pixel in μm.
4. Eccentricità
   1. Calcola i secondi momenti centrali usando le seguenti equazioni:
      
      
      
   2. Definiamo μ₂₀, μ₀₂ e μ₁₁ come secondi momenti centrali, x_i e _{y i} come coordinate dei pixel, c_x e _{c y} come coordinate del centroide, e N come numero totale di pixel.
   3. Calcola i valori propri della matrice di covarianza usando la seguente equazione:
      
   4. Definiamo λ₁ ≥ λ₂.
   5. Calcola la lunghezza degli assi maggiore e minore usando le seguenti equazioni:
      
   6. Definiamo a come lunghezza dell'asse maggiore e b come lunghezza dell'asse minore.
   7. Calcola l'eccentricità usando la seguente equazione:
      
   8. Definisci eccentricità.
5. Rotondità
   1. Calcola la rotondità usando la seguente equazione:
      
   2. Si definisce rotondità, lunghezza dell'asse maggiore e lunghezza dell'asse minore.
6. Dimensione Soma
   1. Calcola l'area soma usando la seguente equazione:
      
   2. Definisci Sa come area soma in μm², come il numero di pixel all'interno della maschera Soma, e S come dimensione del pixel in μm.

7. Analisi statistica

1. Esegui tutte le analisi statistiche utilizzando la versione 4.3.2 di R.
2. Filtrare i dataset utilizzando la maschera accettata più grande per ogni cellula.
3. Parametri cellulari medi a livello animale prima dell'analisi statistica.
4. Valutare normalità e varianza utilizzando i test di Shapiro–Wilk e Levene.
5. Eseguire test t di Student o ANOVA a medie ripetute con test t accoppiati corretti da Holm post-hoc quando i dataset soddisfano assunzioni parametriche.
6. Eseguire test di Wilcoxon a somma dei rangi o di Friedman con test Wilcoxon a rango segnato corretti da Holm quando i dataset non soddisfano le assunzioni parametriche.
7. Definisci la significanza statistica come p < 0,05 .

Risultati

È stata sviluppata una piattaforma open-source e autonoma per l'analisi della morfologia microgliale, denominata Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), per fornire un flusso di lavoro accessibile e standardizzato per l'analisi della morfologia microgliale basata su IF. La piattaforma si basa su precedenti metodologie di analisi morfologica, non richiede competenze di programmazione e incorpora un'interfaccia grafica accessibile. MMPS è stato progettato per migliorare la rilevazione di ramificazioni microgliali sottili, incorporando al contempo molteplici misure di sicurezza per minimizzare la sovrastima delle maschere microgliali.

MMPS è stato convalidato utilizzando un modello di neuroinfiammazione dei roditori indotto da LPS. Dopo l'elaborazione del tessuto e l'acquisizione dell'immagine (Figura 1), la specificità del IF è stata confermata utilizzando sezioni di controllo negative prive di colorazione primaria degli anticorpi (Figura supplementare 1). L'elaborazione MMPS inizia con l'importazione delle immagini IF nell'interfaccia software (Figura 2A). Il software offre molteplici opzioni di elaborazione delle immagini per migliorare la rilevazione del segnale microgliale e la separazione dello sfondo. La sottrazione obbligatoria dello sfondo viene eseguita utilizzando l'algoritmo rolling-ball implementato nel pacchetto Scikit-image, mentre filtri opzionali per la riduzione del rumore e la nitidezza sono disponibili tramite filtraggio gaussiano basato su SciPy. Dopo l'elaborazione delle immagini, i soma microgliali vengono selezionati manualmente e identificati tramite marcatori rossi di selezione (Figura 2B). I confini del soma vengono successivamente delineati manualmente per i calcoli morfologici a valle (Figura 2C).

Figura 1: Panoramica grafica del modello e dell'elaborazione della neuroinfiammazione. I ratti sono stati iniettati con LPS o PBS e hanno raccolto 24 ore con una perfusione cardiaca seguita dalla decapitazione. I cervelli venivano estratti e tagliati in sezioni da 30 μm per poi essere utilizzati nel FI per il marcatore microgliale Iba1, che veniva poi processato con MMPS. Creato con Biorender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica dell'uso di MMPS. (A) Esempio di un'immagine della microglia corticale (rossa, Iba1) con nuclei cellulari (blu, DAPI) da fare riferimento in MMPS (barra della scala = 75 μm, 40x). Dopo l'elaborazione dell'immagine tramite MMPS, lo sfondo verrà ridotto e le morfologie accurate saranno valutate (B). Dopo l'elaborazione dell'immagine in MMPS, i soma vengono selezionati manualmente con un cerchio rosso da utilizzare nei passaggi successivi dettagliati nei metodi (barra di scala = 75 μm, 40x). (C) Due microglie rappresentative sono state delineate manualmente, e le immagini di contorno SOMA salvate sono mostrate di seguito. (D) La generazione di maschere di cellule selezionate traccia automaticamente i rami microgliali fino a 800^μm2, ma richiede una garanzia manuale della qualità. Qui mostriamo la maschera inaccurata da 800^{μm 2} seguita dalla più precisa maschera da 700^{μm 2} . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo la delineazione del SOMA, MMPS genera maschere iterativamente su un intervallo di dimensioni da 200–800^μm2 utilizzando una soglia adattativa vincolata da soglie di intensità minima definite dall'utente. Le maschere più piccole seguono più da vicino la soglia definita dall'utente, mentre le maschere più grandi allentano progressivamente le restrizioni sulle soglie per massimizzare l'incorporazione delle filiali. Le maschere generate sono sottoposte a una revisione manuale di controllo qualità per evitare l'inclusione di celle vicine, un'incorporazione eccessiva dello sfondo o la troncatura da bordi dell'immagine o barre di scala. Come mostrato nella Figura 2D, la maschera da 800^{μm 2} per una cellula microgliale rappresentativa si estese in una cellula vicina. Il rifiuto della maschera da 800^μm2 e la selezione della maschera da 700^μm2 hanno corretto l'errore di segmentazione preservando la delineazione accurata delle microglie bersaglio.

Dopo l'elaborazione MMPS, l'attivazione microgliale è stata valutata utilizzando la maschera più grande accettata per ciascuna cellula, poiché queste maschere hanno catturato con maggiore precisione la ramificazione distale minimizzando l'incorporazione di fondo. I parametri morfologici calcolati sono riassunti nella Tabella 1 e rappresentati nella Figura 3. La somministrazione LPS ha significativamente ridotto la distanza media del centroide e il perimetro cellulare rispetto ai controlli trattati con veicoli (p < 0,05; Figura 3A,B), coerente con la retrazione dei processi microgliali durante l'attivazione. Non sono state osservate differenze significative nell'area della maschera, nella rotondità o nell'eccentricità tra i gruppi di trattamento (Figura 3C–E), nonostante precedenti rapporti associano questi parametri ai fenotipi microgliali^{attivati 3,23}. Il presente studio non è stato statisticamente validato per rilevare differenze sottili nella forma del soma o nell'area della maschera, e le sottopopolazioni microgliali possono adottare morfologie infiammatorie eterogenee che non seguono uniformemente queste^{tendenze 3}. Al contrario, l'area del soma è stata significativamente aumentata negli animali trattati con LPS rispetto ai controlli dei veicoli (p < 0,01; Figura 3F), che supporta ulteriormente la rimodellazione morfologica associata^{all'attivazione 22}.

Figura 3: Confronto dei parametri morfologici microgliali. Per tutti i panel, sono stati effettuati test di normalità (Shapiro-Wilk e Levene) con valori non significativi riscontrati in tutti i casi (p>0,05), portando all'uso dei test t per Student. I punti rappresentano singoli animali (n=5 per trattamento) (A) La distanza media del centroide era significativamente maggiore nel gruppo veicolo rispetto al gruppo trattato LPS. (B) Il perimetro delle cellule microgliali era significativamente maggiore nel gruppo veicolo rispetto al gruppo trattato con LPS. (C) Non c'era differenza significativa nell'area della maschera tra i gruppi di trattamento. (D) Non c'era differenza significativa nell'eccentricità dei soma tra i gruppi. (E) Non vi è differenza significativa nella rotondità del soma tra i gruppi di trattamento. (F) C'è stato un aumento significativo dell'area soma nel gruppo LPS * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro	Definizione	Relazione con l'attivazione microgliale
Distanza media del centroide	Distanza media del ramo più lontano nelle posizioni superiore, destra, inferiore e sinistra	Diminuzioni
Perimetro	Misurazione del perimetro della cella	Diminuzioni
Area Maschera	L'area effettiva della cellula, non l'area della maschera bersaglio	Diminuzioni
Eccentricità	Una misurazione dell'allungamento approssimativo del soma cellulare (0: circolare, 1: altamente allungato)	Diminuzioni
Rotondità	Misurazione della circolarità approssimativa del soma cellulare (0: allungato, 1: circolare)	Aumenti
Dimensione Soma	L'area della cella soma	Aumenti

Tabella 1: Calcolare i parametri da MMPS e la variazione prevista nella risposta all'attivazione della microglia. La tabella riassume i parametri morfologici calcolati dal software di Mappatura dei Parametri Microgliali (MMPS), inclusi perimetro, distanza media del baricentro, area della maschera, eccentricità, rotondità e area del soma.

La riproducibilità tra utenti è stata successivamente valutata fornendo lo stesso set di immagini a utenti accecati, precedentemente non addestrati, per un'analisi indipendente (Figura Supplementare 2). Non sono state rilevate differenze statisticamente significative tra gli utilizzatori, e tutti gli utilizzatori hanno riprodotto tendenze morfologiche coerenti con l'attivazione microgliale negli animali trattati con LPS.

MMPS supporta inoltre analisi morfologiche avanzate a valle. L'analisi correlativa dei parametri generati dalla Figura 3 ha mostrato le relazioni tra caratteristiche morfologiche distinte. I ratti trattati con veicoli hanno mostrato solo una debole correlazione tra rotondità della microglia e perimetro (R² = 0,17), mentre quelli trattati con LPS hanno mostrato una correlazione più forte (R² = 0,64), suggerendo che un aumento dell'attivazione microgliale fosse associato a riduzioni simultanee di rotondità e perimetro (Figura 4A). Inoltre, l'area della maschera ha mostrato forti correlazioni positive con la distanza media del centroide sia nei gruppi con veicolo che in quelli trattati con LPS (R² = 0,71 e 0,88, rispettivamente), coerenti con variazioni nella complessità di ramificazione associate allo stato di attivazione microgliale (Figura 4B).

Figura 4: Analisi avanzata dei parametri microgliali. Tutti i pannelli sono linee a livello animale di miglior adattamento, calcolate con il metodo dei minimi quadrati ordinari, visualizzate con il loro coefficiente di determinazione (R²) e ombreggiate con il loro intervallo di confidenza del 95%. (A) La rotondità del soma microgliale e la lunghezza totale del perimetro tendono debolmente nella microglia a formare il gruppo del veicolo (R² = 0,17) ma hanno una correlazione più forte dopo l'esposizione al LPS (R² = 0,64). (B) La distanza media del centroide è correlata con l'area della microglia nel veicolo (R² = 0,71) e dei gruppi LPS (R² = 0,88). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Validazione del protocollo IF tramite controllo negativo. Una fetta cerebrale della stessa regione per ogni ratto ha seguito il protocollo IF senza aggiunta primaria di anticorpi per confermare la mancanza di autofluorescenza (barra della scala = 75 μm) (A) Immagine rappresentativa del tessuto colorato da veicolo per DAPI (blu). (B) Immagine rappresentativa del tessuto colorato da veicoli per Iba1 (rosso). (C) Immagine rappresentativa del tessuto colorato con veicoli per DAPI (blu) e Iba1 (rosso). (D) Immagine rappresentativa del tessuto colorato con LPS per DAPI (blu). (E) Immagine rappresentativa del tessuto colorato con LPS per Iba1 (rosso). (F) Immagine rappresentativa del tessuto colorato con LPS per DAPI (blu) e Iba1 (rosso). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Valutazione della variazione inter-utente MMPS. Diversi utenti ciechi hanno utilizzato MMPS sugli stessi campioni della Figura 3 e sono stati confrontati i risultati a livello animale. Per tutti, i test di normalità (Shapiro-Wilk e Levene) sono risultati non significativi (p>0,05), portando all'utilizzo di una ANOVA a medie ripetute con il test t accoppiato corretto da Holm post-hoc (p>0,05). (A) Non c'è stata differenza significativa in ciascun gruppo tra gli utenti per la distanza media del centroide (p>0,05). (B) Non c'era differenza significativa in ciascun gruppo tra gli utenti per il perimetro (p>0,05). (C) Non c'è stata differenza significativa in ciascun gruppo tra gli utilizzatori per l'area della mascherina (p>0,05). (D) Non c'erano differenze significative in ciascun gruppo tra gli utenti per eccentricità (p>0,05). (E) Non c'era differenza significativa in ciascun gruppo tra gli utenti per la rotondità (p>0,05). (F) Non c'è stata differenza significativa in ciascun gruppo tra gli utenti dell'area Soma (p>0.05). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'obiettivo principale di questa metodologia è ampliare l'accessibilità all'analisi della morfologia microgliale riducendo le barriere tecniche comuni e preservando i punti di forza degli approcci morfologici consolidati. MMPS consente il rilevamento di sottili alterazioni morfologiche microgliali mantenendo la compatibilità con analisi avanzate, incluse analisi frattali, scheletro, scafo e Sholl. Rispetto agli approcci precedentemente pubblicati, MMPS offre un'interfaccia grafica accessibile, calcoli integrati per parametri morfologici comunemente usati e l'eliminazione dei requisiti di codifica, mantenendo al contempo la compatibilità con analisi a valle più avanzate.

Diversi passaggi metodologici critici influenzano fortemente l'accuratezza analitica e la riproducibilità. L'imaging immunofluorescenza (IF) di alta qualità è essenziale per la generazione e i calcoli morfologici affidabili delle mascherine. La specificità degli anticorpi rappresenta un fattore determinante importante della qualità dell'immagine, poiché l'etichettatura non specifica aumenta la fluorescenza di fondo e riduce la separazione del segnale tra la microglia e i tessuti circostanti. Analogamente, concentrazioni subottimali di anticorpi possono ridurre l'intensità della fluorescenza e diminuire la risoluzione dell'immagine. L'acquisizione di immagini Z-stack è anche fondamentale, poiché l'omissione dell'imaging Z-stack può alterare artificialmente la complessità apparente di ramificazione microgliale e la diffusione del processo, bias così i calcoli morfologici.

Diverse considerazioni aggiuntive sono importanti durante l'elaborazione MMPS. Sebbene MMPS supporti l'elaborazione delle immagini in batch, l'ottimizzazione individuale delle immagini è spesso preferibile perché le caratteristiche dello sfondo e la qualità delle colorazioni possono variare notevolmente tra le immagini. La qualità dell'immagine influenza direttamente l'accuratezza della generazione delle maschere; Pertanto, l'ottimizzazione durante la pre-elaborazione dell'immagine migliora notevolmente la riproducibilità e la robustezza delle analisi a valle. È importante anche una selezione attenta dei soma microgliali, in particolare evitando che le cellule entrino in contatto con i bordi delle immagini, poiché la selezione parziale può ridurre artificialmente le misurazioni dei soma e distorcere la generazione delle maschere. Durante la revisione della qualità delle mascherine, le maschere che incorporano cellule vicine, sfondi eccessi o bordi di immagini dovrebbero essere respinte. Al contrario, maschere più piccole non dovrebbero essere rifiutate solo perché non riescono a catturare tutti i processi distali, poiché l'algoritmo iterativo di generazione delle maschere regola intenzionalmente i parametri locali di soglia in base alla dimensione della maschera e all'intensità regionale dei pixel.

Questa metodologia è altamente adattabile e può essere modificata per soddisfare specifici requisiti sperimentali. Poiché MMPS è open source, la piattaforma può essere ampliata per analizzare singoli frame Z-stack o incorporare algoritmi automatizzati di rilevamento cellulare per generare una pipeline di analisi morfologica completamente automatizzata. Inoltre, maschere generate e contorni soma rimangono compatibili con i flussi di lavoro basati su ImageJ per analisi frattali, di involucro, scheletro e di Sholl. Poiché MMPS è stato sviluppato in Python 3.11, ulteriori analisi possono essere incorporate direttamente nel software utilizzando pacchetti scientifici Python comunemente disponibili senza richiedere piattaforme software esterne.

Nonostante questi vantaggi, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. La MMPS è stata convalidata utilizzando un modello di neuroinfiammazione in una specifica regione cerebrale di maschi di ratti di Sprague-Dawley, e diverse regioni cerebrali, modelli di malattia, specie o sesso biologico possono influenzare gli esiti morfologici. L'applicabilità di MMPS a paradigmi sperimentali alternativi dovrebbe quindi essere validata tramite studi pilota o supportata da confronti di letteratura precedente. Inoltre, l'imaging basato su IF cattura incompletamente le strutture di ramificazione tridimensionale perché i processi che si estendono direttamente sopra o sotto il piano focale potrebbero non essere rilevati nelle immagini a proiezione massima. Aumentare il numero di cellule analizzate può aiutare a mitigare questa limitazione. MMPS rimane inoltre dipendente dalla qualità dell'acquisizione dell'immagine e richiede quindi ottimizzazione per i singoli sistemi di imaging, protocolli di colorazione e preparazioni di anticorpi. Le immagini a bassa risoluzione possono gonfiare artificialmente la dimensione della maschera a causa dei confini sfocati che circondano i soma e dei rami molto compatti. Per questo motivo, il presente protocollo incorpora metodi IF free-floating e molteplici opzioni di elaborazione delle immagini per massimizzare la qualità dell'immagine.

MMPS mantiene inoltre un certo potenziale di variabilità dipendente dall'utente perché gli utenti selezionano manualmente le celle e delineano i soma. Tuttavia, l'uso della colocalizzazione DAPI e Iba1 riduce sostanzialmente l'ambiguità durante la selezione delle cellule. Inoltre, l'analisi inter-utente cieca ha dimostrato una variabilità minima tra utenti precedentemente non addestrati, supportando la riproducibilità del flusso di lavoro analitico.

A differenza di diverse piattaforme di morfologia microgliale pubblicate in precedenza, MMPS non è completamente automatizzata. Tuttavia, questo design è stato scelto per dare priorità all'accuratezza della segmentazione e alla garanzia della qualità delle mascherine. I flussi di lavoro automatizzati potrebbero essere incorporati modificando il codice sorgente Python per abilitare il rilevamento automatizzato della colocalizzazione DAPI/Iba1, la schematizzazione soma basata su contorni e l'accettazione o il rifiuto delle maschere basato su apprendimento automatico. Inoltre, MMPS richiede una notevole capacità di archiviazione su disco perché maschere generate e contorni soma vengono automaticamente salvati come file .tiff per analisi a valle e garanzia qualità. I requisiti di memoria potrebbero essere ridotti modificando il software per generare maschere in sequenza cellula per cella, seguita da una valutazione immediata della qualità e dall'estrazione dei parametri.

In conclusione, MMPS amplia l'accesso all'analisi quantitativa della morfologia microgliale fornendo una piattaforma standardizzata e open-source che non richiede competenze di codifica né capacità di imaging in vivo . La piattaforma facilita l'analisi riproducibile della morfologia microgliale basata su IF mantenendo la compatibilità con approcci analitici avanzati a valle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Piastra utilizzata per l'incubazione e il lavaggio delle sezioni di tessuto.
Foglio di alluminio	Fisher Scientific	01-213-101	Usato per proteggere campioni fluorescenti dall'esposizione alla luce.
Buffer di recupero dell'antigene (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Usato per migliorare l'accessibilità agli antigeni durante la colorazione immunofluorescente.
Anticorpo primario anti-Iba1	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Anticorpo primario utilizzato per la marcatura immunofluorescente delle microglia.
Criostato	Fisher Scientific	95-710-0L	Strumento utilizzato per sezionare il tessuto cerebrale congelato a spessori definiti.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Anticorpo secondario fluorescente utilizzato per la visualizzazione degli anticorpi primari conigli.
Siero di asino	Fisher Scientific	50-413-115	Reagente di blocco utilizzato per ridurre il legame non specifico degli anticorpi.
Sistema di imaging EVOS FL Auto 2	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscopio a fluorescenza utilizzato per l'acquisizione delle immagini.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Piattaforma di elaborazione delle immagini utilizzata per le analisi della morfologia a valle e i plugin.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Medium di montaggio utilizzato per preservare la fluorescenza e fissare le lamelle.
Isoflurano	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Anestetico inalatorio utilizzato durante le procedure sugli animali.
Lipopolisaccaride	Millipore Sigma	L2630	Usato per indurre neuroinfiammazione sistemica e attivazione microgliale nei roditori.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Libreria di plotting Python utilizzata per la visualizzazione dei dati e la generazione di figure.
MMPS (Software per la mappatura dei parametri microgliali) v1.00	Questo lavoro	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Piattaforma software open-source sviluppata per l'analisi della morfologia microgliale.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Inserti utilizzati per contenere sezioni di tessuto libere durante le procedure di colorazione.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Libreria Python utilizzata per i calcoli numerici all'interno di MMPS.
Obiettivo (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Obiettivo a bassa magnificazione utilizzato per l'orientamento anatomico e l'identificazione della regione.
Obiettivo (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Obiettivo ad alta magnificazione utilizzato per l'imaging della morfologia microgliale.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Libreria di visione artificiale utilizzata per le funzioni di elaborazione delle immagini all'interno di MMPS.
Paraformaldeide	ThermoFisher Scientific	169650025	Fissativo utilizzato per la perfusione e la conservazione del tessuto prima della sezione.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Medium di montaggio permanente utilizzato per la conservazione delle diapositive.
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher Scientific	BP3991	Soluzione tampone utilizzata per il lavaggio dei tessuti e la preparazione dei reagenti.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Libreria di imaging Python utilizzata per le operazioni di elaborazione delle immagini.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Framework GUI Python utilizzato per generare l'interfaccia utente grafica di MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Ambiente di linguaggio di programmazione utilizzato per sviluppare ed eseguire MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Software statistico utilizzato per l'analisi dei dati e la generazione di grafici.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Libreria di analisi delle immagini Python utilizzata per l'elaborazione delle immagini e la segmentazione.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Pacchetto di calcolo scientifico Python utilizzato per il filtraggio e le operazioni di elaborazione delle immagini.
Ratti Sprague-Dawley	Evingo	002	Animali sperimentali utilizzati per la validazione del modello di neuroinfiammazione.
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-3	Crioprotettore utilizzato prima del congelamento del tessuto cerebrale.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Pacchetto Python utilizzato per leggere e scrivere file di immagini TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Medium di incorporazione utilizzato per la criosezionalizzazione di campioni di tessuto congelato.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergente utilizzato per la permeabilizzazione della membrana durante l'immunofluorescenza.