Preparazione di innesti di nervo periferico umano decellularizzati utilizzando idrossido di sodio e desossicolato di sodio

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato di decellularizzazione assistita da alcali che combina il trattamento con idrossido di sodio a un sistema di scambio delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica, al fine di produrre innesti di nervi periferici umani decellularizzati con efficace rimozione cellulare e conservazione dell'architettura nativa della matrice extracellulare.

Abstract

Le lesioni dei nervi periferici richiedono spesso materiali di innesto in grado di fornire un supporto strutturale per la rigenerazione assonale. Sebbene l'innesto nervoso autologo rimanga lo standard clinico di riferimento, il suo utilizzo è limitato dalla morbosità del sito donatore e dalla disponibilità limitata di tessuto. Questi limiti hanno stimolato un crescente interesse verso innesti nervosi periferici umani descellularizzati come biomateriale alternativo per la rigenerazione nervosa. Tuttavia, i protocolli di descellularizzazione comunemente basati su detergenti possono alterare l'architettura della matrice extracellulare (ECM) e lasciare residui citotossici che compromettono la qualità dell'innesto. In questo articolo viene descritto un protocollo standardizzato per la preparazione di innesti nervosi periferici umani descellularizzati mediante un approccio di descellularizzazione assistita da sostanze alcaline. La procedura inizia con un trattamento con idrossido di sodio (NaOH) per favorire un'efficiente rottura cellulare, seguito da un passaggio delicato con deossicolato di sodio (SDC) che rimuove i componenti cellulari e immunogeni residui preservando l'organizzazione nativa della ECM. Questa strategia limita l'esposizione ai detergenti, favorendo al contempo il mantenimento dell'architettura nativa della ECM. Il flusso di lavoro comprende la preparazione del nervo donatore, un trattamento controllato con NaOH, un successivo trattamento delicato con SDC e lavaggi ripetuti con scambio continuo di soluzione mediante un sistema azionato da una pompa peristaltica, al fine di facilitare l'eliminazione degli agenti residui del processo. Vengono inoltre applicati ulteriori passaggi post-trattamento per mantenere l'integrità strutturale e preparare gli innesti per l'imballaggio finale e la sterilizzazione. L'efficienza della descellularizzazione viene valutata mediante analisi istologica e quantificazione del DNA residuo, mentre la conservazione della struttura della ECM viene esaminata mediante microscopia elettronica a scansione. L'assenza di residui di SDC e la biocompatibilità degli innesti trattati sono state confermate tramite test di citotossicità. Questo protocollo fornisce un approccio pratico per produrre innesti nervosi periferici umani descellularizzati destinati alla ricerca sulla rigenerazione nervosa periferica e ad applicazioni traslazionali.

Introduzione

Le lesioni dei nervi periferici possono causare un grave deficit funzionale e rappresentano tuttora una sfida clinica significativa nella medicina rigenerativa e nella chirurgia ricostruttiva. La rigenerazione di difetti nervosi segmentali richiede materiali di innesto che non solo colmino il vuoto causato dalla lesione, ma offrano anche un orientamento strutturale e segnali biochimici per sostenere la rigenerazione assonale e la reinnevazione. L'innesto nervoso autologo è ampiamente considerato il gold standard clinico poiché preserva l'architettura nativa della matrice extracellulare (ECM) e fornisce un microambiente favorevole alla rigenerazione nervosa^1,2. Tuttavia, il suo utilizzo clinico è limitato dalla scarsa disponibilità di tessuto donatore, dalla necessità di interventi chirurgici aggiuntivi e dalla morbosità del sito donatore^3,4. Queste limitazioni hanno spinto lo sviluppo di materiali di innesto alternativi, in particolare innesti nervosi periferici descelularizzati che mantengono l'architettura nativa della ECM riducendo al contempo i componenti cellulari immunogeni^5,6,7,8.

Le prestazioni degli innesti nervosi descellularizzati dipendono fortemente dal processo di descellularizzazione. I metodi convenzionali si basano tipicamente su reagenti a base di detergenti, come il Triton X-100 e il deossicolato di sodio (SDC), che rimuovono i componenti cellulari solubilizzando le membrane lipidiche^9,10,11. Tuttavia, un'esposizione prolungata a questi detergenti può alterare la microstruttura della matrice extracellulare (ECM) e lasciare residui citotossici che influiscono negativamente sulla vitalità cellulare e sui risultati rigenerativi^12,13. Di conseguenza, sono in corso attive ricerche su strategie alternative di descellularizzazione che consentano una rimozione efficiente delle cellule preservando l'integrità della ECM¹⁴. La descellularizzazione alcalina mediante idrossido di sodio (NaOH) si è rivelata un approccio alternativo potenziale, poiché condizioni di pH estremo possono degradare in modo efficiente i componenti cellulari, gli acidi nucleici e i lipidi^15,16,17. Tuttavia, un'esposizione non controllata a condizioni fortemente alcaline può compromettere l'integrità della ECM, sottolineando l'importanza di condizioni di lavorazione rigorosamente controllate^16,18.

In questo studio viene presentato un protocollo standardizzato di descellularizzazione assistita da alcali per innesti di nervo periferico umano, che incorpora un sistema dinamico di scambio continuo delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica. Rispetto ai metodi convenzionali di immersione statica, questo processo dinamico consente uno scambio continuo delle soluzioni, facilitando l'eliminazione dei detriti cellulari e degli agenti residui di lavorazione. Questo articolo fornisce una dimostrazione visiva passo dopo passo dell'intero flusso di lavoro, inclusa la preparazione del nervo donatore, la descellularizzazione controllata assistita da alcali e lo scambio continuo delle soluzioni mediante un sistema azionato da pompa peristaltica. Gli innesti ottenuti sono stati valutati mediante analisi istologica, quantificazione del DNA residuo e microscopia elettronica a scansione (SEM) per confermare una descellularizzazione efficiente e la preservazione dell'ultrastruttura della matrice extracellulare (ECM). Permettendo una chiara visualizzazione dei passaggi tecnici critici, questo articolo fornisce un quadro ben definito per la preparazione di innesti nervosi descellularizzati e per il futuro ampliamento del processo.

Protocollo

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
   CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
   NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
   NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
   NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
6. Drain the solution from the column.
7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
   NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
   NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Risultati

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)	IPA treatment (h)	NaOH treatment (h)	SDC treatment (h)
2–3	1.5	6	6
>3–4	2	8	8
>4–5	2.5	10	10

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Discussione

Questo studio presenta un protocollo standardizzato di descellularizzazione assistita da alcali per la fabbricazione di innesti nervosi periferici umani descellularizzati destinati alla rigenerazione del nervo periferico. Il protocollo integra il pretrattamento del nervo donatore, una descellularizzazione chimica controllata e un sistema di scambio delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica in un flusso di lavoro chiaramente definito, consentendo la rimozione efficiente dei componenti cellulari e immunogeni preservando al contempo l'architettura nativa della matrice extracellulare (ECM).

Una caratteristica fondamentale di questo metodo è l'integrazione del trattamento alcalino con un'esposizione ridotta ai detergenti. I protocolli convenzionali basati su detergenti, come quello di Sondell (3% Triton X-100 e 4% SDC) e il metodo Hudson (sulfobetaine-10, sulfobetaine-16 e Triton X-200), si basano su trattamenti prolungati e multistep con detergenti per ottenere una efficace decellularizzazione^9,10. Sebbene questi approcci rimuovano efficacemente i componenti cellulari, un'esposizione prolungata ai detergenti può compromettere l'integrità della matrice extracellulare (ECM) e contribuire a citotossicità residua legata ai detergenti^19,20,21. Al contrario, il presente protocollo incorpora NaOH per potenziare la rimozione cellulare limitando al contempo l'esposizione all'SDC, riducendo così il carico complessivo di detergenti e favorendo la preservazione dell'architettura nativa della ECM.

Un altro aspetto fondamentale di questo protocollo è il sistema di scambio della soluzione azionato da una pompa peristaltica. A differenza degli approcci basati sulla perfusione, che possono esercitare una pressione interna sul tessuto e comportare il rischio di alterazioni strutturali²¹, questo sistema consente uno scambio continuo e controllato della soluzione all'interno di una colonna cromatografica. L'efficacia di questo approccio è confermata da diversi risultati analitici. L'analisi istologica e la quantificazione del DNA residuo hanno confermato una rimozione efficiente dei componenti cellulari, mentre l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) ha dimostrato il mantenimento dell'architettura nativa della matrice extracellulare (ECM). Inoltre, i bassi livelli residui di SDC e i risultati favorevoli relativi alla citocompatibilità hanno confermato la biocompatibilità dell'innesto ottenuto. Nel complesso, questi risultati indicano che il protocollo raggiunge un equilibrio tra una efficace descellularizzazione e la preservazione della struttura.

Diversi passaggi tecnici sono fondamentali per ridurre al minimo la variabilità procedurale e mantenere condizioni di lavorazione controllate. In primo luogo, è essenziale un'accurata manipolazione del segmento nervoso durante il taglio, il trasferimento e il lavaggio. Il tessuto nervoso periferico è meccanicamente fragile e una compressione, piegatura o tensione eccessiva possono alterare la struttura interna e compromettere la conservazione della matrice extracellulare^19,20. Pertanto, i tessuti devono essere mantenuti umidi e manipolati con delicatezza per tutta la durata della procedura. In secondo luogo, lo scambio uniforme delle soluzioni all'interno della colonna è un fattore chiave per le prestazioni del processo. Le bolle d'aria all'interno della colonna devono essere ridotte al minimo e il tessuto deve rimanere completamente immerso e sospeso nella soluzione, evitando l'adesione alle pareti della colonna o al filtro. L'adesione del tessuto può causare uno scambio di soluzione non uniforme, riducendo l'efficienza del lavaggio e provocando un'esposizione incoerente ai reagenti di lavorazione^21,22. In terzo luogo, il sistema azionato da pompa peristaltica deve funzionare in modo stabile per tutta la durata della procedura. È necessaria una circolazione continua per la delipidizzazione, la decellularizzazione e il lavaggio; pertanto, tutte le connessioni dei tubi devono essere fissate saldamente per evitare scollegamenti dovuti alla pressione o alle vibrazioni generate dalla pompa. Durante il recupero del campione, si deve evitare lo svuotamento completo della colonna. Mantenere un volume sufficiente di liquido aiuta a prevenire l'adesione del tessuto e facilita una manipolazione delicata durante il recupero.

Segmenti nervosi di lunghezza compresa tra 2 e 3 cm sono stati trattati con IPA, NaOH e SDC rispettivamente per 1,5, 6 e 6 h. I segmenti di lunghezza compresa tra >3 e 4 cm sono stati processati per 2, 8 e 8 h rispettivamente, mentre quelli di lunghezza compresa tra >4 e 5 cm sono stati trattati per 2,5, 10 e 10 h rispettivamente. Pertanto, la durata del trattamento è variata da 1,5 a 2,5 h per la delipidizzazione con IPA e da 6 a 10 h per ciascun passaggio di descellularizzazione. Tutti gli altri parametri di lavorazione, inclusi le concentrazioni dei reagenti, i volumi delle soluzioni e le procedure di lavaggio, sono stati mantenuti costanti tra i diversi gruppi di lunghezza. A seconda della configurazione del tubo, la portata è stata impostata entro il range specificato e mantenuta costante durante ogni ciclo di lavorazione. Le condizioni di processamento specifiche per la lunghezza sono riassunte nella Tabella 1. Le eventuali modifiche basate sul diametro del nervo, sullo spessore, sulla struttura fascicolare o sulla composizione cellulare e della matrice non sono state valutate sistematicamente e richiedono ulteriori studi^23,24. Per applicazioni su scala maggiore, un sistema di pompa peristaltica multicanale potrebbe migliorare la produttività; tuttavia, è necessario verificare attentamente che le condizioni di flusso siano uniformi tra i diversi canali per garantire un trattamento omogeneo.

Restano diverse considerazioni per un'ulteriore ottimizzazione. Sebbene questo protocollo riduca sostanzialmente l'esposizione complessiva al detergente, il SDC è ancora incluso e futuri miglioramenti potrebbero concentrarsi sulla riduzione o sulla sostituzione dell'uso di detergenti, mantenendo al contempo l'efficienza della decellularizzazione e la preservazione della matrice extracellulare^25,26. Inoltre, il tessuto del nervo periferico è per sua natura difficile da standardizzare a causa della variabilità nella struttura fascicolare, nel diametro, nello spessore e nella composizione cellulare e della matrice^23,24. Durante la produzione su larga scala, queste differenze, insieme alle variazioni nel carico del tessuto e nelle condizioni di flusso, potrebbero contribuire alla variabilità tra lotti. Tuttavia, la riproducibilità da donatore a donatore e da lotto a lotto non è stata valutata sistematicamente nel presente studio. Pertanto, sarà necessaria un'ulteriore validazione mediante tessuti provenienti da più donatori e da lotti di produzione indipendenti, al fine di stabilire criteri appropriati di accettazione del tessuto, standardizzare i processi e garantire la riproducibilità tra i lotti.

Un'ulteriore limitazione riguarda la lunghezza dell'innesto. La capacità rigenerativa diminuisce all'aumentare della lunghezza dell'innesto, e questa limitazione dipendente dalla lunghezza potrebbe essere più marcata negli innesti nervosi acellulari rispetto agli autotrapianti^3,27. Poiché gli innesti nervosi acellulari non contengono cellule di Schwann vitali residenti, dipendono dalla migrazione e proliferazione delle cellule di Schwann dell'ospite per sostenere la rigenerazione assonale²⁷. Saheb-Al-Zamani et al. hanno riportato che una rigenerazione limitata nei lunghi innesti nervosi acellulari era associata a un aumento della senescenza delle cellule di Schwann²⁷.

Tuttavia, uno studio in vivo precedente ha dimostrato che innesti nervosi umani descellularizzati a base di NaOH supportano un recupero funzionale e strutturale paragonabile a quello degli innesti autologhi in un difetto del nervo sciatico del coniglio di 15 mm²⁸. Contreras et al. hanno inoltre dimostrato la rigenerazione assonale e il recupero funzionale utilizzando un innesto nervoso allogenico descellularizzato in un difetto del nervo peroneo di 70 mm in pecore²⁹. Questi studi confermano il potenziale rigenerativo degli innesti nervosi descellularizzati, sebbene sia necessaria un'ulteriore valutazione degli innesti preparati mediante il presente protocollo su lunghezze clinicamente rilevanti. Gli innesti autologhi sono inoltre limitati dalla disponibilità del nervo donatore e richiedono una procedura aggiuntiva di prelievo, determinando un secondo sito operatorio e una morbosità del sito donatore⁴. Gli innesti nervosi allogenici acellulari potrebbero quindi rappresentare un'alternativa clinicamente rilevante quando non è disponibile un tessuto autologo sufficiente o quando il prelievo del nervo donatore risulta impraticabile.

In sintesi, questo protocollo fornisce un quadro pratico e adattabile per la preparazione di innesti nervosi periferici descellularizzati. L'attenzione posta sulla riduzione dell'esposizione ai detergenti, sullo scambio controllato delle soluzioni e sulla standardizzazione del processo supporta sia le applicazioni di ricerca sia un potenziale utilizzo traslazionale nella rigenerazione dei nervi periferici. Studi futuri dovrebbero concentrarsi ulteriormente su approcci privi di detergenti, sulla scalabilità del sistema e su una valutazione completa in vivo delle prestazioni rigenerative.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BT100-1L Pompa peristaltica multicanale	Pompa più lunga	BT100-1L	Utilizzata per fornire circolazione continua e scambio di soluzione durante la delipidizzazione, la decellularizzazione e i lavaggi.
Colonna cromatografica Econo-Column, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Utilizzata per contenere segmenti di nervo periferico durante lo scambio continuo di soluzione.
Alcol isopropilico (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Utilizzato per la delipidizzazione del tessuto nervoso periferico.
Tubazione per pompa Masterflex Tygon E-LFL	Thermo Scientific	06440-16	Utilizzata per collegare la pompa peristaltica, la colonna cromatografica e i serbatoi delle soluzioni per la circolazione continua delle soluzioni.
Deossicolato di sodio (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Utilizzato come detergente nel secondo passaggio di decellularizzazione per rimuovere i componenti cellulari residui.
Idrossido di sodio, NaOH	Duksan	1636	Per la rottura cellulare.