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Articolo metodologico

Preparazione di innesti di nervo periferico umano decellularizzati utilizzando idrossido di sodio e desossicolato di sodio

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DOI:

10.3791/71578

⸱

1 settembre 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato di decellularizzazione assistita da alcali che combina il trattamento con idrossido di sodio a un sistema di scambio delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica, al fine di produrre innesti di nervi periferici umani decellularizzati con efficace rimozione cellulare e conservazione dell'architettura nativa della matrice extracellulare.

Abstract

Le lesioni dei nervi periferici richiedono spesso materiali di innesto in grado di fornire un supporto strutturale per la rigenerazione assonale. Sebbene l'innesto nervoso autologo rimanga lo standard clinico di riferimento, il suo utilizzo è limitato dalla morbosità del sito donatore e dalla disponibilità limitata di tessuto. Questi limiti hanno stimolato un crescente interesse verso innesti nervosi periferici umani descellularizzati come biomateriale alternativo per la rigenerazione nervosa. Tuttavia, i protocolli di descellularizzazione comunemente basati su detergenti possono alterare l'architettura della matrice extracellulare (ECM) e lasciare residui citotossici che compromettono la qualità dell'innesto. In questo articolo viene descritto un protocollo standardizzato per la preparazione di innesti nervosi periferici umani descellularizzati mediante un approccio di descellularizzazione assistita da sostanze alcaline. La procedura inizia con un trattamento con idrossido di sodio (NaOH) per favorire un'efficiente rottura cellulare, seguito da un passaggio delicato con deossicolato di sodio (SDC) che rimuove i componenti cellulari e immunogeni residui preservando l'organizzazione nativa della ECM. Questa strategia limita l'esposizione ai detergenti, favorendo al contempo il mantenimento dell'architettura nativa della ECM. Il flusso di lavoro comprende la preparazione del nervo donatore, un trattamento controllato con NaOH, un successivo trattamento delicato con SDC e lavaggi ripetuti con scambio continuo di soluzione mediante un sistema azionato da una pompa peristaltica, al fine di facilitare l'eliminazione degli agenti residui del processo. Vengono inoltre applicati ulteriori passaggi post-trattamento per mantenere l'integrità strutturale e preparare gli innesti per l'imballaggio finale e la sterilizzazione. L'efficienza della descellularizzazione viene valutata mediante analisi istologica e quantificazione del DNA residuo, mentre la conservazione della struttura della ECM viene esaminata mediante microscopia elettronica a scansione. L'assenza di residui di SDC e la biocompatibilità degli innesti trattati sono state confermate tramite test di citotossicità. Questo protocollo fornisce un approccio pratico per produrre innesti nervosi periferici umani descellularizzati destinati alla ricerca sulla rigenerazione nervosa periferica e ad applicazioni traslazionali.

Introduzione

Le lesioni dei nervi periferici possono causare un grave deficit funzionale e rappresentano tuttora una sfida clinica significativa nella medicina rigenerativa e nella chirurgia ricostruttiva. La rigenerazione di difetti nervosi segmentali richiede materiali di innesto che non solo colmino il vuoto causato dalla lesione, ma offrano anche un orientamento strutturale e segnali biochimici per sostenere la rigenerazione assonale e la reinnevazione. L'innesto nervoso autologo è ampiamente considerato il gold standard clinico poiché preserva l'architettura nativa della matrice extracellulare (ECM) e fornisce un microambiente favorevole alla rigenerazione nervosa1,2. Tuttavia, il suo utilizzo clinico è limitato dalla scarsa disponibilità di tessuto donatore, dalla necessità di interventi chirurgici aggiuntivi e dalla morbosità del sito donatore3,4. Queste limitazioni hanno spinto lo sviluppo di materiali di innesto alternativi, in particolare innesti nervosi periferici descelularizzati che mantengono l'architettura nativa della ECM riducendo al contempo i componenti cellulari immunogeni5,6,7,8.

Le prestazioni degli innesti nervosi descellularizzati dipendono fortemente dal processo di descellularizzazione. I metodi convenzionali si basano tipicamente su reagenti a base di detergenti, come il Triton X-100 e il deossicolato di sodio (SDC), che rimuovono i componenti cellulari solubilizzando le membrane lipidiche9,10,11. Tuttavia, un'esposizione prolungata a questi detergenti può alterare la microstruttura della matrice extracellulare (ECM) e lasciare residui citotossici che influiscono negativamente sulla vitalità cellulare e sui risultati rigenerativi12,13. Di conseguenza, sono in corso attive ricerche su strategie alternative di descellularizzazione che consentano una rimozione efficiente delle cellule preservando l'integrità della ECM14. La descellularizzazione alcalina mediante idrossido di sodio (NaOH) si è rivelata un approccio alternativo potenziale, poiché condizioni di pH estremo possono degradare in modo efficiente i componenti cellulari, gli acidi nucleici e i lipidi15,16,17. Tuttavia, un'esposizione non controllata a condizioni fortemente alcaline può compromettere l'integrità della ECM, sottolineando l'importanza di condizioni di lavorazione rigorosamente controllate16,18.

In questo studio viene presentato un protocollo standardizzato di descellularizzazione assistita da alcali per innesti di nervo periferico umano, che incorpora un sistema dinamico di scambio continuo delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica. Rispetto ai metodi convenzionali di immersione statica, questo processo dinamico consente uno scambio continuo delle soluzioni, facilitando l'eliminazione dei detriti cellulari e degli agenti residui di lavorazione. Questo articolo fornisce una dimostrazione visiva passo dopo passo dell'intero flusso di lavoro, inclusa la preparazione del nervo donatore, la descellularizzazione controllata assistita da alcali e lo scambio continuo delle soluzioni mediante un sistema azionato da pompa peristaltica. Gli innesti ottenuti sono stati valutati mediante analisi istologica, quantificazione del DNA residuo e microscopia elettronica a scansione (SEM) per confermare una descellularizzazione efficiente e la preservazione dell'ultrastruttura della matrice extracellulare (ECM). Permettendo una chiara visualizzazione dei passaggi tecnici critici, questo articolo fornisce un quadro ben definito per la preparazione di innesti nervosi descellularizzati e per il futuro ampliamento del processo.

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Protocollo

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

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Risultati

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

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Discussione

Questo studio presenta un protocollo standardizzato di descellularizzazione assistita da alcali per la fabbricazione di innesti nervosi periferici umani descellularizzati destinati alla rigenerazione del nervo periferico. Il protocollo integra il pretrattamento del nervo donatore, una descellularizzazione chimica controllata e un sistema di scambio delle soluzioni azionato da una pompa peristaltica in un flusso di lavoro chiaramente definito, consentendo la rimozione efficiente dei componenti cellulari e immunogeni prese...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BT100-1L Pompa peristaltica multicanalePompa più lungaBT100-1LUtilizzata per fornire circolazione continua e scambio di soluzione durante la delipidizzazione, la decellularizzazione e i lavaggi.
Colonna cromatografica Econo-Column, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Utilizzata per contenere segmenti di nervo periferico durante lo scambio continuo di soluzione.
Alcol isopropilico (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Utilizzato per la delipidizzazione del tessuto nervoso periferico.
Tubazione per pompa Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Utilizzata per collegare la pompa peristaltica, la colonna cromatografica e i serbatoi delle soluzioni per la circolazione continua delle soluzioni.
Deossicolato di sodio (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GUtilizzato come detergente nel secondo passaggio di decellularizzazione per rimuovere i componenti cellulari residui.
Idrossido di sodio, NaOHDuksan1636Per la rottura cellulare.

Riferimenti

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