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Articolo di ricerca

Identificazione di Biomarcatori Candidati Relativi ai Mitochondri del Ligustri Lucidi Fructus nella Nefropatia Diabetica

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DOI:

10.3791/71592

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15 settembre 2026

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1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

La nefropatia diabetica (DN) coinvolge un malfunzionamento mitocondriale. Utilizzando la trascrittomica, la farmacologia delle reti e l'apprendimento automatico, abbiamo identificato CAT, FABP1, MAOA e MAOB come biomarcatori mitocondriali candidati per Ligustri Lucidi Fructus. Nei topi db/db, LLF ha aumentato l'espressione di CAT e MAOA, sostenendo ulteriori indagini meccanicistiche.

Abstract

La disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo eccessivo all'interno dei mitocondri sono fattori patologici chiave che determinano il danno tubulare renale nella nefropatia diabetica (DN). Sebbene il Ligustri Lucidi Fructus (LLF) venga tradizionalmente utilizzato per trattare la DN, i meccanismi coinvolti, in particolare quelli relativi ai geni e alle vie associate ai mitocondri, rimangono poco chiari. In questo studio è stata effettuata un'analisi dell'espressione differenziale del dataset GSE142025 per identificare geni con espressione differenziale (DEG) associati alla DN. I geni caratteristici sono stati selezionati incrociando i risultati ottenuti da quattro modelli di apprendimento automatico. I geni che mostravano una differenza significativa nell'espressione e un profilo di espressione coerente in entrambi i dataset sono stati ulteriormente valutati mediante analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore). Quelli con un'area sotto la curva (AUC) > 0,7 in entrambi i dataset sono stati definiti biomarcatori candidati. Sono state eseguite analisi di arricchimento funzionale, infiltrazione immunitaria, costruzione di reti e docking molecolare. È stato utilizzato un modello murino di DN per valutare glicemia, microalbuminuria, istopatologia ed espressione mediante RT-qPCR dei biomarcatori candidati. CAT e MAOA sono risultati significativamente sovraespressi in vivo. I biomarcatori candidati erano arricchiti in vie associate alla funzione del ribosoma, alla degradazione di valina, leucina e isoleucina, alle interazioni citochina-recettore per citochine e ai perossisomi. Essi mostravano correlazione negativa con le cellule T CD8+ e i mastociti attivati, e correlazione positiva con le cellule NK attivate e le cellule B naive. La taxifolina, il beta-sitosterolo e l'eriodictiolo hanno mostrato energie di legame inferiori a -5 kcal/mol con i biomarcatori candidati. CAT e MAOA rappresentano candidati promettenti che meritano ulteriori indagini meccanicistiche.

Introduzione

La nefropatia diabetica (DN), la principale causa di malattia renale terminale in tutto il mondo, è una delle complicanze più comuni del diabete mellito. Dal punto di vista patologico, è caratterizzata da un'eccessiva accumulazione di matrice extracellulare sia nei compartimenti glomerulari che tubulari, insieme a un ispessimento e una sclerosi dei vasi sanguigni intrarenali2. La DN è comunemente associata a proteinuria e ipertensione3. Il suo sviluppo è strettamente legato a un danno delle cellule endoteliali vascolari, a una risposta infiammatoria esacerbata e a uno stress ossidativo accentuato causato da un'iperglicemia prolungata4. L'incidenza della DN è in aumento a livello globale, in particolare tra i soggetti diabetici di mezza età e anziani. Con il progredire della malattia, essa può portare a insufficienza renale terminale e persino a complicanze cardiovascolari, compromettendo significativamente la qualità della vita e la prognosi dei pazienti5. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per la DN, biomarcatori candidati precoci e accurati per la diagnosi restano ancora sfuggenti, e mancano strategie terapeutiche efficaci in grado di invertire i processi patologici. Pertanto, esiste un'urgente necessità di sviluppare nuovi farmaci specifici anti-DN.

I mitocondri sono fondamentali per la bioenergetica cellulare, la sintesi di precursori metabolici, l'omeostasi del calcio, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la segnalazione immunitaria e l'apoptosi, tutti processi essenziali per mantenere la stabilità cellulare e dell'organismo6. Essendo le centrali energetiche della cellula, i mitocondri svolgono un ruolo cruciale in processi fondamentali come la glicolisi, il ciclo dell'acido tricarbossilico e la fosforilazione ossidativa7. L'obesità altera il ciclo di Krebs e la catena respiratoria mitocondriale, portando a disfunzione mitocondriale e aumento della produzione di ROS. L'elevato livello di ROS nella catena respiratoria mitocondriale può indurre stress ossidativo, che amplifica la risposta infiammatoria associata all'obesità e promuove l'apoptosi8. Ricerche recenti hanno evidenziato il ruolo significativo della disfunzione mitocondriale nella patogenesi e nel decorso della DN, inclusi disturbi del metabolismo energetico, eccessiva generazione di ROS e potenziamento della segnalazione apoptotica9. La disfunzione mitocondriale cronica accelera il progresso della malattia renale10. Pertanto, il miglioramento della funzione mitocondriale potrebbe rappresentare una strategia protettiva fondamentale contro la DN.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) è un frutto secco e maturo della famiglia delle Luteaceae, noto per le sue proprietà nutritive per il fegato e i reni, nonché per la capacità di scurire i capelli e migliorare la vista. È stato identificato un eteropolisaccaride di origine naturale estratto dal LLF, che ha rivelato un potenziale protettivo nei confronti della fibrosi renale11. Negli ultimi anni, l'uso del LLF nel trattamento del DN ha ricevuto crescente attenzione, con effetti renoprotettivi significativi dimostrati11,12,13. Inoltre, la complessa relazione tra LLF e i mitocondri è stata ampiamente studiata e confermata. In particolare, uno studio ha dimostrato che il LLF esercita i suoi effetti benefici modulando la funzione mitocondriale attraverso l'attivazione della via di segnalazione AMPK14. Questo meccanismo protegge efficacemente i mitocondri dai danni causati dallo stress ossidativo. Questi risultati sottolineano ulteriormente il ruolo fondamentale del LLF nel mantenimento del metabolismo energetico cellulare e nel miglioramento della resistenza delle cellule allo stress ossidativo. Tuttavia, il meccanismo terapeutico preciso, in particolare riguardo al recupero della funzione mitocondriale, rimane ancora poco chiaro.

L'obiettivo di questo studio era chiarire i meccanismi biologici alla base dell'effetto terapeutico di LLF sulla funzione mitocondriale nel DN. Sono state consultate banche dati pubbliche mediante l'uso di strumenti di bioinformatica per identificare biomarcatori candidati associati agli effetti nefroprotettivi di LLF, integrando dati trascrittomici e informazioni sui principi attivi. Ulteriori analisi, tra cui infiltrazione immunitaria, associazione con caratteristiche cliniche, modificazione dell'RNA mediante m6A, arricchimento funzionale, costruzione di reti regolatorie e docking molecolare, hanno suggerito che questi biomarcatori candidati svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione mitocondriale durante il trattamento del DN. Una validazione in vivo ha ulteriormente confermato la loro importanza. Questa analisi completa approfondisce la comprensione dei meccanismi attraverso cui LLF tratta il DN e fornisce una base solida per lo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici basati sulla disfunzione mitocondriale.

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Protocollo

Raccolta dei dati
La matrice di espressione genica e i dati clinici corrispondenti per i set di dati GSE142025 e GSE96804, relativi alla DN, sono stati recuperati dal database Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. Il set di addestramento (GSE142025) include campioni di tessuto renale di 27 pazienti con DN e di nove controlli, sequenziati mediante la piattaforma GPL20301. Il set di validazione (GSE96804) comprende dati di sequenziamento di 41 pazienti con DN e 20 controlli, elaborati utilizzando la piattaforma GPL17586. Entrambi i set di dati si concentrano sul tessuto renale; il set di dati GSE96804 esamina specificamente il glomerulo, l'unità primaria di filtrazione del rene (Figura 1). Il set di dati GSE142025 (set di addestramento) comprende campioni di tessuto renale intero e fornisce una panoramica completa del paesaggio trascrittomico della DN. Il set di dati GSE96804 (set di validazione), invece, si concentra specificamente sul tessuto glomerulare, che rappresenta il sito principale del danno alla filtrazione glomerulare. Poiché questi due set di dati non sono stati direttamente uniti a causa delle differenze nella piattaforma e nel tessuto, non è stata applicata alcuna correzione per l'effetto di batch. Al contrario, è stata effettuata una validazione incrociata tra i set di dati in modo indipendente. Sono stati selezionati come candidati robusti i geni con variazioni direzionali coerenti e un'area sotto la curva (AUC) superiore a 0,7 in entrambi i set di dati, a sostegno della generalizzabilità attraverso i diversi compartimenti renali.

Un totale di 1.136 geni mitocondriali (MRGs) è stato estratto dal database MitoCarta3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). I principi attivi di LLF sono stati predetti utilizzando il database Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php), sulla base di una soglia di biodisponibilità orale (OB) ≥30% e di una soglia di somiglianza ai farmaci (DL) ≥0,18. Successivamente, i geni bersaglio potenziali per i costituenti attivi sono stati predetti utilizzando il database Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Analisi dell'espressione differenziale
L'analisi dell'espressione differenziale di GSE142025 (DN rispetto a controllo) è stata eseguita utilizzando il pacchetto limma (v3.54.1), con criteri di significatività stabiliti a P.adj < 0,05 e |log2FoldChange| > 0,516. I grafici a vulcano e le mappe termiche sono stati visualizzati rispettivamente mediante i pacchetti ggplot2 (v 3.3.6) e ComplexHeatmap (v 2.14.0)17,18. I DEG, i MRG e i geni bersaglio potenziali dei principi attivi sono stati incrociati, e i geni sovrapposti sono stati definiti come geni candidati. La rete che collega i principi attivi ai geni candidati è stata costruita utilizzando il software Cytoscape (v 3.9.0)19.

Analisi di arricchimento funzionale e costruzione della rete di interazione proteina-proteina (PPI)
Le analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) per i geni candidati sono state eseguite utilizzando il pacchetto clusterProfiler (v 4.6.2) per esplorare le loro funzioni biologiche e i percorsi di segnalazione associati (P.adjust < 0,05). I geni candidati sono stati quindi inseriti nel database STRING (https://cn.string-db.org/) per recuperare le relazioni di interazione proteina-proteina (livello di confidenza ≥ 0,4), seguite dalla costruzione di una rete PPI utilizzando Cytoscape (v 3.9.0)20.

Apprendimento automatico
Sono stati implementati quattro algoritmi di apprendimento automatico, inclusi foresta casuale (RF), k-nearest neighbor (KNN), minimi quadrati parziali (PLS) e macchina a vettori di supporto con kernel radiale (SVM), utilizzando il pacchetto caret (v6.0-93) basato sul dataset GSE142025. I geni candidati identificati nell'analisi precedente sono stati utilizzati come variabili predittive, mentre lo stato della malattia (DN o controllo) è stato utilizzato come outcome. Per il modello KNN, è stata implementata una cross-validazione a 10 ripetizioni mediante la funzione trainControl, con tuneLength = 10. Il modello RF è stato adattato con 20 alberi (ntree = 20); i modelli PLS e SVM sono stati adattati utilizzando le impostazioni previste nel flusso di lavoro originale di caret.

Le distribuzioni dei residui del modello sono state valutate utilizzando il pacchetto DALEX (v2.4.3). Successivamente, è stata eseguita un'analisi delle variabili basata sulla permutazione mediante la funzione variable_importance di DALEX, specificando l'errore quadratico medio (RMSE) come funzione di perdita. Il dropout_loss risultante rappresenta l'RMSE ottenuto dopo la permutazione della variabile corrispondente21,22. Nel flusso di lavoro analitico originale, sono state mantenute le variabili con un dropout loss < 0,281 in tutti i modelli, e i geni comuni a tutti e quattro i modelli sono stati definiti come geni caratteristici consensuali per la successiva validazione.

I quattro modelli di apprendimento automatico sono stati utilizzati principalmente per la priorizzazione delle caratteristiche piuttosto che per la costruzione di un classificatore clinico finale. Di conseguenza, la discriminazione diagnostica è stata successivamente valutata a livello di singolo gene mediante analisi ROC sia nei dati di scoperta che in quelli di convalida.

Identificazione di biomarcatori candidati
Nei dataset GSE142025 e GSE96804, le differenze di espressione nei geni caratteristici tra campioni DN e controlli sono state valutate mediante il test di Wilcoxon. Solo i geni con espressione differenziale significativa (P < 0,05) e tendenze di espressione concordanti nei due dataset sono stati selezionati per l'analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore). Il pacchetto pROC (v1.18.0) è stato utilizzato per generare le curve ROC e calcolare l'area sotto la curva (AUC); i geni con AUC > 0,7 in entrambi i dataset sono stati classificati come biomarcatori candidati23.

Analisi dell'arricchimento di gruppi di geni (GSEA)
Le funzioni biologiche e le vie di segnalazione associate ai biomarcatori candidati sono state ulteriormente analizzate mediante GSEA sul dataset GSE142025. In primo luogo, è stata eseguita un'analisi della correlazione di Spearman tra i biomarcatori candidati e tutti gli altri geni utilizzando il pacchetto psych (v2.2.9).24. I coefficienti di correlazione sono stati calcolati e ordinati (da alto a basso). L'insieme di geni di riferimento era c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt del Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Successivamente, è stata effettuata un'analisi GSEA per valutare l'arricchimento dei geni ordinati nell'insieme di geni di riferimento utilizzando il pacchetto clusterProfiler (v4.6.2). È stata applicata la correzione per confronti multipli. tramite il metodo FDR e aggiustato P-valori (indicati come P.ajustati) sono stati considerati significativi se < 0.05.

Analisi delle modifiche m6A
Per indagare le modifiche di metilazione dell'RNA dei biomarcatori candidati, è stato utilizzato il database SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp/) per prevedere i siti di modifica m6A sui biomarcatori candidati, concentrandosi su posizioni ad alta affidabilità all'interno delle loro strutture secondarie. Successivamente, il database ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) è stato impiegato per identificare le proteine modificate da m6A che interagiscono con i biomarcatori candidati, utilizzando il parametro |HepG2 (shRNA)| > 1 per selezionare le proteine chiave. Il database RPISeq (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) è stato quindi utilizzato per prevedere la probabilità di interazioni tra le proteine chiave e i biomarcatori candidati. Le sequenze di RNA di entrambi sono state caricate in formato testo semplice per generare punteggi di previsione dei classificatori RF e SVM. Un'interazione è stata considerata significativa quando il punteggio superava 0,525. L'analisi SRAMP è stata eseguita con soglia impostata su ‘High’ per la previsione dei siti m6A, utilizzando la modalità ‘Transcript’ e parametri predefiniti. L'analisi ENCORI ha utilizzato la funzione di interazione ‘miRNA-mRNA’ con il parametro ‘HepG2 (shRNA)’ > 1. L'analisi RPISeq ha impiegato il classificatore RF con parametri predefiniti; punteggi > 0,5 indicavano un'interazione positiva. Si tratta di previsioni computazionali, non di evidenze sperimentali di modifiche m6A o di interazioni RNA-proteina nel tessuto renale. Il criterio HepG2 shRNA deriva dai set di dati precalcolati di ENCORI e potrebbe non riflettere una regolazione specifica del rene.

Analisi dell'infiltrazione immunitaria
L'algoritmo CIBERSORT è stato applicato per stimare le proporzioni di 22 tipi di cellule immunitarie sia nei campioni di controllo che in quelli con DN provenienti da GSE142025, con visualizzazione tramite una mappa termica generata utilizzando il pacchetto ggplot2 (v3.3.6)26. CIBERSORT è stato eseguito utilizzando la matrice di firma LM22, con 1.000 permutazioni e normalizzazione quantilica disabilitata (come raccomandato per i dati di microarray). Sono stati mantenuti per ulteriori analisi i campioni con p di CIBERSORT < 0,05. CIBERSORT stima le frazioni di cellule immunitarie a partire dall'espressione tissutale renale bulk, il che non consente di risolvere l'infiltrazione specifica per compartimento (ad esempio, glomerulare rispetto a tubulo-interstiziale) né di distinguere i leucociti infiltranti dalle cellule immunitarie residenti. Pertanto, le correlazioni riportate sono a livello tissutale e dovrebbero essere validate mediante metodi spaziali. È stata eseguita un'analisi di correlazione di Spearman tra le cellule immunitarie differenzialmente abbondanti e i biomarcatori candidati utilizzando il pacchetto psych.

Costruzione di reti e docking molecolare
Gli microRNA (miRNA) che interagiscono con i biomarcatori candidati sono stati predetti utilizzando il database miRNet (https://www.mirnet.ca). Successivamente, gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) che bersagliano i miRNA identificati sono stati predetti attraverso i database TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) e starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/). Sono stati selezionati gli lncRNA comuni a entrambi i database per la costruzione della rete. Una rete regolatoria lncRNA-miRNA-mRNA è stata quindi costruita utilizzando il software Cytoscape. Sono stati scelti ingredienti attivi potenziali che bersagliano i biomarcatori candidati per costruire una rete tra ingredienti attivi e biomarcatori. Inoltre, gli ingredienti attivi, i biomarcatori candidati e i percorsi identificati nell'analisi GSEA sono stati incorporati in Cytoscape per creare una rete tra ingredienti attivi, biomarcatori e percorsi.

È stata eseguita un'analisi di docking molecolare per valutare l'affinità di legame tra i potenziali principi attivi e i biomarcatori candidati. Le strutture tridimensionali delle proteine biomarcatori sono state ottenute dal Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) in formato file PDB. Le strutture bidimensionali dei potenziali principi attivi sono state recuperate in formato SDF dal database PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Il docking molecolare è stato effettuato utilizzando la piattaforma CB-Dock (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Un'energia di legame inferiore a -5 kcal/mol indicava una forte affinità di legame27.

Preparazione e autenticazione di Ligustri Lucidi Fructus
In questo contesto, Ligustri Lucidi Fructus (LLF) indica il frutto secco maturo di Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Il materiale botanico è stato autenticato secondo il Farmacopea Cinese, e un esemplare depositato con numero voucher 20240506,20240911,20241103 è stato conservato presso l'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shanxi.

Per la preparazione della decottura, 200 g di fette qualificate di LLF sono state immerse in 1.000 mL di acqua distillata per 30 min a temperatura ambiente. La miscela è stata portata a ebollizione vigorosa e poi fatta sobbollire delicatamente per 60 min. È stato raccolto il filtrato, e i materiali erbacei residui sono stati sottoposti nuovamente a decottura con altri 1.000 mL di acqua distillata per 60 min. I due filtrati sono stati combinati, filtrati, centrifugati e concentrati sotto pressione ridotta per ottenere una concentrazione finale di 1 g di droga grezza/mL (volume totale di 100 mL). La decottura preparata è stata conservata a 4 °C per un uso a breve termine o a −20 °C per la conservazione a lungo termine. La qualità del LLF e della sua decottura è stata rigorosamente identificata e verificata secondo gli standard della Farmacopea Cinese per garantire affidabilità e riproducibilità sperimentale.

Per l'identificazione qualitativa, è stata eseguita una cromatografia su strato sottile. In breve, un volume appropriato di decotto preparato è stato centrifugato ed il soprannatante è stato estratto con metanolo. Dopo la filtrazione, la soluzione del campione e la soluzione standard di riferimento di specnuezhenide sono state applicate sulla stessa piastra di gel di silice G. Dopo lo sviluppo, l'essiccazione e l'ispezione sotto luce ultravioletta, la macchia della soluzione del campione ha mostrato colore e posizione coerenti con il composto di riferimento, confermando la presenza del componente bioattivo caratteristico del LLF.

Per il controllo di qualità quantitativo, è stata eseguita la rilevazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. L'analisi è stata effettuata utilizzando una colonna C18 con metanolo–acqua come fase mobile. La lunghezza d'onda di rilevazione è stata impostata a 224 nm. Il contenuto di specnuezhenide nel decotto è stato determinato in base alla curva standard. I risultati hanno dimostrato una composizione chimica stabile e uniforme del decotto preparato, garantendo una qualità costante del farmaco durante tutto l'esperimento di intervento sugli animali.

Esperimenti sugli animali
Dodici topi maschi di ceppo db/db di grado SPF (8-9 settimane di età) e sei topi db/m di pari età sono stati mantenuti presso il laboratorio animale SPF dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shanxi. Prima degli esperimenti, gli animali sono stati adattati per 7 giorni in un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore con ad libitum accesso a cibo e acqua. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanxi (Numero di approvazione: 2022DW167). Gli animali che mostravano >I topi che presentavano una perdita di peso corporeo del 20%, uno stato moribondo o un'incapacità di accedere a cibo o acqua sono stati sottoposti a eutanasia in modo umano prima del termine previsto dello studio. Al termine dello studio, tutti i topi rimanenti sono stati sottoposti a eutanasia mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbitalico seguita da dislocazione cervicale, in conformità ai protocolli istituzionali.

Al termine del periodo di acclimatamento, l'instaurazione di un modello di DN nei topi db/db è stata confermata da un livello di glucosio nel sangue prelevato dalla vena della coda ≥ 16 mmol/L e da microalbuminuria, indicata da una prova positiva con striscia reattiva per microalbuminuria urinaria. Dopo il corretto instaurazione del modello di DN, i topi db/db sono stati suddivisi casualmente in due gruppi (n = 6 per gruppo): il gruppo modello di DN (DN) e il gruppo trattato con LLF (Trattamento). Inoltre, sono stati utilizzati topi db/m (n = 6) come gruppo di controllo (Controllo). La dose è stata scelta in base a precedenti studi farmacodinamici di LLF in ratti diabetici ed è stata convertita nella dose equivalente per l'uomo utilizzando la normalizzazione per area della superficie corporea28. Ai gruppi Controllo e DN è stata somministrata acqua distillata, mentre al gruppo trattato è stata somministrata LLF a 3,5 g/kg per 8 settimane. Dopo 8 settimane di trattamento, tutti i topi sono stati soppressi per raccogliere siero, urina e tessuto renale da sottoporre ad analisi successive.

Indicatori ematici e urinari
I livelli sierici di glucosio sono stati analizzati utilizzando un analizzatore biochimico del sangue completamente automatico. La concentrazione di microalbumina urinaria è stata misurata seguendo le istruzioni del kit (File Supplementare 1).

Osservazione patologica dei tessuti renali di topo
I tessuti renali sono stati preparati per l'esame istopatologico. Dopo la fissazione in paraformaldeide al 4%, i tessuti sono stati lavati, disidratati, inclusi in paraffina e sezionati. Successivamente è stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e le sezioni colorate sono state esaminate al microscopio ottico per valutare le alterazioni patologiche.

Reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR)
La RT-qPCR è stata utilizzata per determinare l'espressione dei biomarcatori candidati nel tessuto renale di topo. L'RNA totale è stato estratto seguendo le istruzioni del produttore, dopodiché sono state valutate la concentrazione e la qualità dell'RNA (Tabella 1). Il cDNA è stato sintetizzato dall'RNA estratto utilizzando il Kit per la sintesi di cDNA. L'amplificazione è stata eseguita con le coppie di primer elencate nella Tabella 1, utilizzando GAPDH come gene di riferimento. I livelli di espressione relativi sono stati calcolati con il metodo 2−ΔΔCt13,26.

Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software R (versione 4.2.2) insieme al software necessario per le corrispondenti procedure sperimentali. A meno che non indicato diversamente, tutti i test statistici erano a due code e le differenze sono state considerate statisticamente significative per P < 0,05. L'analisi del differenziale di espressione trascrittomica è stata effettuata utilizzando il pacchetto limma. I geni con un valore di P aggiustato < 0,05 e un valore assoluto del log2fold change maggiore di 0,5 sono stati definiti come differenzialmente espressi.

Per i confronti dell'espressione dei geni candidati tra campioni indipendenti di DN e controlli, sono stati utilizzati test non parametrici di Wilcoxon rank-sum quando indicato nel flusso analitico originale. Le correlazioni tra biomarcatori candidati e frazioni di cellule immunitarie sono state valutate mediante correlazione rank di Spearman.

I dati sperimentali sono espressi come media ± DS. Il confronto tra i tre gruppi indipendenti di animali è stato effettuato mediante analisi della varianza ad un fattore quando erano soddisfatte le assunzioni dell'analisi parametrica. Per i confronti post hoc, è stato utilizzato il test della differenza minima significativa quando le varianze erano omogenee, mentre è stato impiegato il test T3 di Dunnett quando le varianze non erano omogenee. Le misurazioni farmacodinamiche alla baseline e alla settimana 8 sono state analizzate e presentate separatamente; non è stata effettuata alcuna inferenza riguardo all'interazione gruppo-per-tempo. Gli script R e i dati grezzi utilizzati per le analisi bioinformatiche e di apprendimento automatico sono forniti nel File Supplementare 1.

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Risultati

Per indagare in modo sistematico potenziali biomarcatori legati ai mitocondri per LLF nel trattamento del DN, abbiamo progettato un flusso di lavoro analitico in quattro fasi (Figura 1). Nella Fase I, abbiamo integrato dati trascrittomici del set GSE142025 (set di addestramento, rene intero, n=36) e GSE96804 (set di validazione, glomerulo, n = 61) con 1.136 geni legati ai mitocondri provenienti dal database MitoCarta 3.0 e 517 bersagli predetti di 9 ingredienti attivi del database TCMSP. L'intersezione d...

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Discussione

LLF è una medicina tradizionale cinese comunemente utilizzata, impiegata principalmente per nutrire il fegato e i reni e per trattare il diabete e le sue complicanze. Attualmente non esistono farmaci o terapie specifiche per la DN, e la sua gestione si basa principalmente su trattamenti ipoglicemizzanti, ipolipemizzanti e antiipertensivi30,31,32. Tuttavia, questi trattamenti possono rallentare la progressione del danno renale so...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Desideriamo esprimere la nostra sincera gratitudine a tutte le persone e organizzazioni che ci hanno sostenuto e assistito durante questa ricerca. Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (n. 81973486 e 82173974), dai progetti di ricerca dell'Amministrazione della Medicina Tradizionale Cinese della provincia dello Shanxi (n. 2024ZYYA021), dal progetto disciplinare dell'Università di Medicina Cinese dello Shanxi (n. 2026XK24) e dal progetto del fondo per la ricerca scientifica dell'Università di Medicina Cinese dello Shandong (n. KYZK2024Q13). Ringraziamo Qinqing Li, Professore Associato presso l'Università di Medicina Cinese dello Shanxi, che ha autenticato il materiale botanico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione fissativa per tessuti al 4% di paraformaldeideSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Etilene al 100%Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
GlucometroSinocare Inc.GA-3
Kit per saggio dell'azoto ureico nel sangue (BUN)Nanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
Topi C57BLKS/J db/dbChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
Topi C57BLKS/J db/mChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
CentrifugaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
Idrato di cloralioShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Database per la previsione della modificazione m6Ahttp://www.cuilab.cn/sramp/
Database degli ingredienti attivi nella medicina tradizionale cinesehttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Kit per colorazione con ematossilina ed eosina (HE)Servicebio C0105S
Centrifuga ad alta velocitàLabnet, USAC2500-R-230V
Strumento per l'analisi dell'infiltrazione immunitariahttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Agitatore magneticoJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MicroscopioOlympusBX53
MicrotomoLeica, GermanyRM 2016
Spettrofotometro a microvolumeHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
Pacchetto R per l'interpretazione del modellohttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Piattaforma di docking molecolarehttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Kit ELISA per microalbuminuria murinaFine TestEM0632
Striscia reattiva per microalbuminuria murinaGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Kit ELISA per creatinina sierica murinaAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
Ciclatore termico PCRRocheRoche LightCycler 480
Software R (v4.2.2) + pacchetti Rhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
Kit per estrazione dell'RNABeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
Kit RT-qPCRBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosideSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Kit per saggio della creatinina siericaNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC011-2-1
Struttura per animali SPFShanxi University of TCM
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
STRINGhttps://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
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Bacinella galleggiante per tessutiWuhan JunjieJK-6

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