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Articolo metodologico

Induzione di spostamenti di fase circadiani diurni utilizzando approcci chemogenetici e spettrali

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DOI:

10.3791/71594

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12 giugno 2026

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1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

In questo articolo

Sommario

Questo studio introduce strategie chemogenetiche e basate sulla luce viola per consentire uno spostamento di fase circadiano diurno affidabile.

Abstract

Nei mammiferi, lo spostamento di fase circadiano durante il giorno è limitato dalla ridotta reattività fotica del nucleo suprachiasmatico (SCN), limitando la capacità di manipolare sperimentalmente l'orologio circadiano durante questa fase. Metodi affidabili per indurre spostamenti di fase diurni sono quindi essenziali per indagare i meccanismi di plasticità circadiana e di trainamento fotico. Vengono descritte strategie genetiche e spettrali complementari per consentire una manipolazione robusta e temporalmente precisa dell'orologio circadiano durante il giorno. Il primo approccio, attualmente limitato ai topi, impiega una strategia chemogenetica che prevede la somministrazione intravitreale di Recettori Designati Attivati Esclusivamente da Farmaci Designati (DREADDs) per attivare selettivamente le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (ipRGC). Questo approccio consente un'attivazione controllata della via retinoipotalamica e induce spostamenti di fase diurni riproducibili indipendentemente dalle condizioni di luce ambientale. Il secondo approccio utilizza la stimolazione ottica specifica per lunghezza d'onda come alternativa non invasiva. L'esposizione alla luce viola sfrutta la sensibilità spettrale degli ipRGC per ridurre il blocco di depolarizzazione e promuovere un'attivazione prolungata, consentendo un reset di fase affidabile durante la giornata soggettiva. Questo metodo è ampiamente applicabile a tutti i sistemi mammiferi e non richiede manipolazione genetica né interventi farmacologici. Sono forniti protocolli dettagliati per la preparazione sperimentale, il timing della stimolazione, la validazione degli spostamenti di fase tramite attività locomotoria e la valutazione dell'attivazione neuronale tramite immunoistochimica c-Fos. Sono delineate considerazioni chiave, tra cui il tempismo circadiano, i parametri di stimolo e i controlli sperimentali, per facilitare la riproducibilità. Insieme, questi approcci forniscono strumenti versatili e sperimentalmente trattabili per indurre spostamenti di fase circadiani diurni e consentono un'indagine diretta dei meccanismi alla base della risposta circadiana diurna.

Introduzione

Il nucleo suprachiasmatico (SCN), l'orologio circadiano principale del cervello dei mammiferi, coordina i ritmi quotidiani essenziali nella fisiologia e nel comportamento, inclusi i cicli sonno-veglia e i modelli alimentari. Per mantenere l'allineamento con l'ambiente esterno, il SCN riceve input fotico diretto da cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (ipRGC), che trasmettono informazioni sulla luce retinica per sincronizzare i ritmi circadiani interni con il giornosolare 1,2.

Una caratteristica distintiva dei sistemi circadiani tra gli organismi è la reattività dipendente dalla fase: lo stesso stimolo fornito in momenti circadiani diversi può produrre effetti marcatamente differenti. Nei mammiferi, la luce notturna induce in modo affidabile spostamenti di fase dell'orologio SCN, mentre l'esposizione durante il giorno soggettivo produce poco o nessun reset 3,4. Questa apparente insensibilità diurna è stata costantemente osservata sia in preparazioni in vivo che in vitro, dove i tentativi di imitare input fotici non riescono a provocare spostamenti di fasesignificativi 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

L'insensibilità diurna è stata attribuita, almeno in parte, a una mancanza di impulso retinico per attivare i meccanismi di ripristino della fase, insieme ai meccanismi di gating circadiano all'interno del SCN. In linea con questa idea, gli ipRGC non sono uniformmente reattivi in condizioni fotopiche; Un sottoinsieme entra nel blocco di depolarizzazione, limitando il potenziale di azione sostenuta a17, 18 e 19. Questo vincolo fisiologico può ridurre l'efficacia della stimolazione fotica convenzionale durante il giorno. Superare questa limitazione permetterebbe di interrogare direttamente la plasticità degli orologi diurni, una fase tradizionalmente considerata refrattaria al reset fotico.

Sono descritte due metodologie complementari per consentire uno spostamento di fase robusto dell'orologio circadiano durante il giorno soggettivo. Il primo approccio impiega una strategia chemogenetica per attivare selettivamente gli ipRGC indipendentemente dalle condizioni di illuminazione ambientale. In particolare, i topiOpn4 Cre/+ ricevono iniezioni intravitree di un virus adeno-associato (AAV) che codifica il recettore eccitatorio Designer Exclusively Activated by Synthetic Drugs (DREADD), hM3Dq, in modo dipendente da Cre. La somministrazione di clozapina-N-ossido (CNO) al tempo circadiano 4 (CT4) induce un'attivazione rapida di ipRGC, fornendo un'attivazione sostenuta della via retinoipotalamica19. Gli spostamenti di fase vengono quantificati tramite registrazioni dell'attività locomotoria, e l'attivazione molecolare all'interno del SCN viene valutata dall'immunoistochimica del c-Fos.

Il secondo approccio utilizza la stimolazione ottica specifica per lunghezza d'onda come strategia non invasiva per un'applicabilità più ampia. I topi di tipo selvatico sono esposti alla luce viola (385 nm) al tempo circadiano 6 (CT6), durante la metà della giornata soggettiva. La luce viola produce un blocco di depolarizzazione ridotto e supporta un'attivazione sostenuta di ipRGC rispetto alla luce blu obianca 19. Gli spostamenti di fase sono quantificati come descritto sopra.

Entrambi gli approcci mirano a migliorare la segnalazione guidata da ipRGC al SCN, superando così la ridotta reattività fotica caratteristica del giorno soggettivo. Insieme, queste metodologie forniscono strategie robuste e sperimentalmente gestibili per manipolare l'orologio circadiano durante una fase tradizionalmente resistente al reset fotico.

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Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate e eseguite in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali del National Institute of Mental Health (NIMH) (ASP-SLCR-01). Furono fatti tutti gli sforzi per minimizzare il dolore e ridurre il numero di animali utilizzati. Gli strumenti di ricerca utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Strategia chemogenetica

  1. Iniezione intravitrea del virus adeno-associato in topi Opn4Cre/+
    1. Pulire e sterilizzare la fase stereotassica e tutti gli strumenti chirurgici utilizzando procedure di sterilizzazione appropriate. Installa l'apparato di iniezione e attacca un ago di vetro per capillare.
    2. Anestesia il topo usando isoflurano. Imposta la portata di ossigeno a circa 1,5 L/min. Regolare l'isoflurano al 3%–5% per l'induzione e ridurre all'1–3% per il mantenimento durante tutta la procedura.
    3. Verifica un'anestesia adeguata usando una pizzicatura per le dita dei piedi. Considera l'animale completamente anestetizzato quando non si osserva alcun riflesso di astinenza o di sbalzo.
    4. Posiziona il mouse su una borsa riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante tutta la procedura.
    5. Tira gli aghi capillari di vetro. Gli aghi venivano marcati a ~1,5 mm dalla punta usando un marcatore fine sotto uno stereomicroscopio per garantire una consegna costante della profondità di penetrazione.
    6. Applicare delicatamente pressione sulla palpebra inferiore con una pinza a punta smussata per far sporgere leggermente il bulbo oculare ed esporre il limbo dorsale. Utilizzando un approccio dorsale, inserire l'ago tangenzialmente alla superficie dell'occhio e penetrare la sclera 0,5–1 mm a posteriore al limbo evitando le regioni vascolarizzate del limbo.
    7. Inserire l'ago nella camera vitrea alla profondità prestabilita. Ritira leggermente per alleviare la pressione intraoculare e prevenire l'ostruzione della punta dell'ago da parte del tessuto.
    8. Iniettare un volume totale di 1,5 μL di soluzione AAV (a 2,4 x 1013 GC/ml), somministrata in cinque iniezioni sequenziali da 300 nL ciascuna (al ritmo di 50 nl/s). Pausa di 5 secondi tra un'iniezione e l'altra per permettere la diffusione e minimizzare il reflusso. Dopo l'iniezione finale, attendi 30 secondi prima di ritirare lentamente l'ago. Ripeti la stessa procedura nell'occhio controlaterale usando parametri identici, facendo attenzione a minimizzare traumi e reflusso.
    9. Somministrare ketoprofene (10 mg/kg, sottocutaneo) immediatamente dopo l'intervento.
    10. Lascia i topi riprendersi per almeno 2 settimane per garantire un'adeguata espressione virale prima di trasferirli alla struttura comportamentale.
  2. Attività di guida delle ruote e amministrazione del CNO (Figura 1A)
    1. I topi domestici singolarmente in gabbie dotate di ruote da corrida. Registrare l'attività di esecuzione della ruota utilizzando un sistema automatizzato di acquisizione dati.
    2. Topi abituati a un ciclo chiaro-buio di 12:12 ore per 4–7 giorni. Confermare l'entrainement stabile e poi far passare gli animali all'oscurità costante (DD).
    3. Determina l'inizio dell'attività utilizzando software di analisi. Definisci l'inizio dell'attività come CT12 nei roditori notturni. Calcola CT4 di conseguenza.
    4. All'ottavo giorno in DD, i topi ricevono iniezioni intraperitoneali di CNO (1 mg/kg) o soluzione salina a CT4 sotto una luce rossa debolita.
    5. Riporta gli animali nelle loro gabbie domestiche e tienili in costante oscurità. Registra l'attività locomotoria in modo continuo per 8 giorni.
    6. Determinare l'esordio dell'attività ed eseguire analisi di regressione nei periodi pre- e post-iniezione. Calcola gli spostamenti di fase come la differenza tra l'inizio dell'attività proiettato e quello osservato.
  3. Immunoistochimica SCN c-Fos dopo l'attivazione chemogenetica
    1. Topi abituati a un ciclo chiaro-oscuro di 12:12 ore e rilasciati in un'oscurità costante. Il secondo giorno in DD, somministrare il CNO al CT6. Animali perfusi 30 minuti dopo l'iniezione.
      Nota: CT4 è stato utilizzato in esperimenti comportamentali per minimizzare la possibilità che gli effetti del CNO si estendano anche alla notte soggettiva, poiché il CNO può rimanere attivo per diverse ore. Al contrario, CT6 è stato utilizzato per esperimenti di immunocolorazione per valutare gli effetti acuti del CNO sull'orologio circadiano, con animali perfusi 30 minuti dopo l'iniezione.
    2. Dissezionare il cervello e post-fissare con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 °C. Crioprotect al 30% di saccarosio finché il tessuto non affonda. Taglio coronale a 40 μm.
    3. Incubare le sezioni in soluzione bloccante, seguita da incubazione primaria degli anticorpi durante la notte a 4 °C. Lavare e incubare con anticorpi secondari per 1 ora. Controtingi con DAPI e monta sezioni.
    4. Acquisire immagini usando impostazioni coerenti al microscopio. Processa le immagini usando software di analisi. Identificare le regioni infettate da AAV tramite cellule mCherry-positive.

2. Strategia spettrale

  1. Trasferire i topi selvatici nella struttura comportamentale e ospitarli individualmente in gabbie dotate di ruote da corrida, come descritto sopra. Mantenere gli animali in costante oscurità (DD) per monitorare l'attività circadiana libera.
  2. Al giorno 8 nella DD, al tempo circadiano 6 (CT6), rimuovere la gabbia dall'armadietto a tenuta luce ed esporre il topo a un impulso luminoso di 15 minuti.
  3. Espone i topi a un impulso di luce blu (λmax = 470 nm; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 fotoni/cm2/s) oppure a un impulso di luce viola (λmax = 385 nm; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 fotoni/cm2/s), con intensità misurata al centro e in tutti e quattro gli angoli della gabbia all'altezza degli occhi degli animali.
  4. Per entrambe le condizioni di lunghezza d'onda, tieni i topi nelle loro gabbie domestiche con la parte superiore della gabbia rimossa. Posiziona le gabbie direttamente sotto una sorgente luminosa fissa in modo che il centro del fascio luminoso sia allineato con il centro della gabbia per garantire un'illuminazione uniforme.
  5. Riportare immediatamente le gabbie alla loro posizione originale in costante oscurità dopo l'esposizione alla luce. Continuare la registrazione dell'attività di movimento delle ruote senza interruzioni per l'analisi dello spostamento di fase.

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Risultati

I topiOpn4 Cre/+ che esprimono AAV-DREADD e ricevono soluzione salina a CT4 non mostrano uno spostamento di fase significativo nell'attività di movimento delle ruote (n = 5; Figura 1B). Al contrario, la somministrazione del CNO a CT4 ha prodotto un significativo ritardo di fase nell'inizio dell'attività (media ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Figura 1C, D), dimostrando che l'attivazione di DREADD in quest...

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Discussione

I risultati dimostrano che l'attivazione degli ipRGC durante la giornata soggettiva può indurre spostamenti di fase circadiani nei topi, un periodo tipicamente caratterizzato da una minore sensibilità alla stimolazione fotica. Un approccio chemogenetico ha permesso l'attivazione selettiva degli ipRGC indipendentemente dalla luce esterna e ha prodotto robusti ritardi di fase nel comportamento della ruota. Questa attivazione ha anche indotto un'espressione acuta di c-Fos nel SCN, conferman...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano i membri dello SLCR del NIMH e del Johns Hopkins Biology Mouse Tri-Lab per le discussioni utili. Fonti di finanziamento: National Institute of Mental Health Grant  ZIAMH002964 (S.H.)

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Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Vettori virali dipendenti da Cre che codificano il DREADD eccitatorio (hM3Dq) fusi a mCherry per l'attivazione selettiva degli ipRGC
Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology2250SAnticorpo primario utilizzato per rilevare c-Fos come marcatore dell'attivazione neuronale
Anti-tdTomato antibody (goat)LSBioLS-C340696Anticorpo primario utilizzato per rilevare l'espressione del reporter mCherry/tdTomato
Blue LED driverThorlabsLEDD1BAlimentatore per il controllo dell'intensità e dell'uscita del LED blu
Blue LED light sourceThorlabsM470L5Sorgente LED che emette luce blu (λmax ~ 470 nm) per la stimolazione fotica
ClockLab softwareActimetricsVersione 6.0.53Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati di attività locomotoria circadiana
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGLigando utilizzato per attivare i recettori hM3Dq DREADD in vivo
DAPIInvitrogen62248Colorante nucleare fluorescente per la marcatura dei nuclei cellulari
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555InvitrogenA21432Anticorpo secondario fluorescente per il rilevamento di anticorpi primari caprini
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Anticorpo secondario fluorescente per il rilevamento di anticorpi primari conigli
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02Medium di montaggio utilizzato per preservare la fluorescenza nelle sezioni tissutali
ImageJ (Fiji) softwareNIHVersione 2.16.0/1.54gSoftware open-source per l'elaborazione delle immagini e l'analisi quantitativa
Opn4cre MiceThe Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:035925Topi utilizzati per l'attivazione chemio-genetica
Violet LED driverMightexSLA-1000-2Alimentatore per il controllo dell'uscita del LED viola
Violet LED light sourceMightexBLS-LCS-0385-04-22Sorgente LED che emette luce viola (λmax ~ 385 nm) per la stimolazione specifica della lunghezza d'onda
Wild-type miceThe Jackson LaboratoryJackson strain #101043Topi utilizzati per l'esperimento con luce viola
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Riferimenti

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