Generazione di Cybridi Trans-Mitocondriali da piastrine di pazienti con mtDNA: un protocollo efficiente che ottimizza la selezione delle colonie e la validazione funzionale

Sommario

Descriviamo un protocollo ottimizzato di generazione di cybridi trans-mitocondriali a partire da piastrine di pazienti con mtDNA, enfatizzando parametri di crescita e isolamento delle colonie. Questo approccio consente lo studio di varianti del DNA mitocondriale a livelli di eteroplasmia variabili in un comune fondo nucleare per quantificarne il significato funzionale sulle attività enzimatiche della catena di trasporto elettronico e sulla capacità respiratoria integrata.

Abstract

La generazione di linee cellulari transmitocondriali di cybridi rappresenta il metodo di riferimento per determinare la patogenicità, consentendo analisi biochimiche di una variante specifica del DNA mitocondriale (mtDNA) di interesse a percentuali elevate e basse (livelli di eteroplasmia) all'interno di un background altrimenti identico al DNA mitocondriale e al genoma nucleare. Storicamente, il processo di generazione dei cybridi è stato tedioso e poco efficiente. Qui descriviamo un protocollo altamente efficiente ed efficace per generare linee cellulari cybridi trans-mitocondriali fondendo piastrine umane con una linea cellulare standard osteosarcoma 143B per fornire un fondo nucleare isogenico impoverito di mtDNA (cellule Rho⁰ ). Gli isolati cellulari catturano un dato genoma mtDNA di interesse per stabilire linee cellulari stabili che ospitano diversi gradi di eteroplasmia, o per confrontare gli effetti divergenti di diversi aplogruppi mitocondriali. Poiché i cybridi provenienti da pazienti mitocondriali possono essere più difficili da stabilire con protocolli standard, questa metodologia attuale si concentra sull'isolamento delle varianti del mtDNA in cui l'attività della catena di trasporto elettronico è influenzata. Qui dimostriamo che le tecniche di selezione delle colonie riducono i tempi e migliorano la resa nella generazione di linee cybrid mutanti di mtDNA ad alto livello eteroplasmatico. Viene fornito uno studio di caso sulla generazione di cipridi per una variante di rilevanza sconosciuta in MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). Analizziamo l'efficienza del processo di generazione dei cybridi utilizzando questo protocollo e conduciamo studi funzionali condotti tramite respirometria ad alta risoluzione. MT-ND1 di alto livello in eteroplasmia MT-ND1 m.3985G>A i mutanti cybridi generati da questo protocollo hanno una respirazione mitocondriale dipendente da I-A complessa compromessa rispetto al controllo di tipo selvatico, dimostrando che m.3985G>A è probabilmente patogeno.

Introduzione

Stabilire la patogenicità delle mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) è difficile a causa della loro rarità, dell'eteroplasmia che coinvolge livelli variabili di genomi mutati e di tipo selvatico in diversi tessuti, dei diversi meccanismi fisiopatologici e delle complesse interazioni con i fondi genomici^nucleari 1,2,3,4 . Per questi motivi, le linee cellulari cybridi transmitocondriali rimangono il metodo di riferimento per stabilire la patogenicità delle varianti mtDNA, dove i "cybridi" rappresentano la fusione del nucleo di una cellula con i mitocondri di un'altra^cellula 5,6,7,8,9,10 (Figura 1 ). Le linee cellulari cybridi contengono un fondo nucleare isogenico e mitocondri con una percentuale specificata di eteroplasmia per la variante mtDNA sotto studio^11,12. In questo modo, test funzionali come la respirometria (tramite polarografia) o l'attività enzimatica di trasporto elettronico (tramite spettrofotometria) possono essere eseguiti su linee di cybridi con livelli di eteroplasmia compresi tra lo 0% e il 100% per determinare i potenziali effetti patogeni di una data variante mtDNA, nonché l'influenza relativa degli aplogruppi mitocondriali che possono differire tra le linee^{cybridi 1}. Altri tipi cellulari possono essere utilizzati per studiare la patogenicità e sono meglio utilizzati per integrare la generazione di cibridi e l'analisi funzionale, poiché ogni tipo cellulare ha i propri vantaggi e svantaggi. I fibroblasti del paziente provengono direttamente dal paziente ma sono limitati nell'eteroplasmia ereditaria e non hanno un controllo nucleare isogenico per eliminare gli effetti genici nucleari. Il montaggio mtDNA sta diventando più popolare ma soffre di modifiche off-target e di siti modificabili limitati nel^{mtDNA 13}. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere differenziate per studiare l'effetto di una mutazione su diversi tipi cellulari, come neuroni e cellule gangliari retiniche, ma l'induzione della pluripotenza può portare alla perdita della variante mtDNA di interesse o a ulteriori varianti de novo ¹⁴. Lo studio Cybrid prevede la generazione di un sistema più artificiale basato su uno sfondo nucleare di una linea cellulare tumorale (classicamente osteosarcoma 143B), ma che classicamente cresce bene, rendendolo adatto all'uso in studi di screening ad alto rendimento di interventi candidati. Le limitazioni alla generazione di cybridi ad alto livello di eteroplasmia includono la qualità delle piastrine, l'eteroplasmia iniziale e gli svantaggi selettivi dei mitocondri mutanti, che vengono discussi ampiamente in questo protocollo.

Sebbene la generazione di cybridi sia il punto di riferimento per la determinazione funzionale della patogenicità delle varianti mtDNA, pochi laboratori generano cybridi per lo studio della malattia mitocondriale 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Piuttosto, vengono generati più cibridi per studiare il cancro e l'invecchiamento^28,29. Qui, utilizziamo uno studio di caso su un paziente sospetto di malattia mitocondriale per dimostrare strategie di ottimizzazione sviluppate per facilitare la generazione di cybridi da piastrine di pazienti con mtDNA, inclusi processi di selezione e preparazioni cellulari necessarie per stabilire linee cellulari di cybridi con livelli elevati rispetto a bassi di eteroplasmia per la variante mtDNA bersaglio. In particolare, dimostriamo la metodologia per generare linee cellulari di cybridi per una subunità complessiva I (CI) MT-ND1 variante m.3985G>A, in cui conduciamo studi biochimici che dimostrano la natura patogena di questa variante. La Figura 2 mostra la timeline per la generazione dei cybridi, dove i principali passi metodologici includono fusione, selezione e metodi di isolamento per ottenere colonie distinte.

Protocollo

Le piastrine ematiche sono state prelevate secondo lo studio IRB 08-6177 del Children's Hospital of Philadelphia (CHOP).

1. Preparazione delle piastrine

1. Giorno 1: Preleva il sangue nei tubi acido-citrato-destrosio al momento del prelievo.
   NOTA: Il sangue deve essere applicato immediatamente al rotatore. Le piastrine vengono idealmente prelevate al massimo 4 ore dopo il prelievo di sangue.
2. Annota il volume del sangue. Si raccomanda un volume di 5–6 mL di sangue.
3. Centrifuga il sangue a 200 × g per 20 minuti a 12 °C.
   NOTA: La centrifugazione a 12 °C preserva l'integrità del campione e previene l'attivazione delle piastrine.
4. Trasferire il sovrantantante (plasma) su un nuovo tubo centrifuga.
5. Registra il volume del plasma.
6. Centrifugare il plasma a 1500 × g per 20 minuti a 12 °C.
7. Annota il volume stimato dei pellet piastrinosi.
   NOTA: Troppe piastrine possono risultare ingombranti in questo protocollo. Dopo la fusione, durante la placcatura^{delle cellule} Rho 0 e delle piastrine, un eccesso di piastrine può attaccarsi al fondo della fiaschetta e impedire l'adesione delle cellule Rho⁰ . Si raccomanda di utilizzare meno di 50 μL del volume del pellet delle piastrine per la fusione. Le piastrine in eccesso possono essere congelate dividendole nei passaggi successivi.
8. Rimuovi il soprannatante.
   NOTA: Se il pellet è grande, la rimozione può essere effettuata tramite aspirazione. Le piastrine dei pazienti a volte sono drasticamente ridotte in numero e non sono molto appiccicose. Se è così, usa una pipetta per rimuovere lentamente il plasma.
9. Se si continua con piastrine fresche, risospendere il pellet con 1 mL di modifica spinner del mezzo essenziale minimo di Eagle (SMEM), e trasferire in un tubo microcentrifuga.
10. In caso di congelamento, risospendere la pellet (piastrine) in 1,05 mL di SMEM e 450 μL di soluzione di congelamento piastrinico (350 μL di siero bovino fetale [FBS] + 100 μL di dimetilsolfosida [DMSO]).
    NOTA: Alcune piastrine dei pazienti non sono stabili durante la procedura di congelamento e un cybride mutante ad alto livello non può essere ottenuto dopo il congelamento. Si consiglia di usare la preparazione fresca.
11. Se le cellule Rho⁰ non sono pronte in tempo, posizionare le piastrine a 37 °C con lievi scuotiti a 60 giri al minuto.
    NOTA: In definitiva, è meglio sincronizzare le piastrine e le cellule Rho⁰ per essere pronte contemporaneamente. Non si consiglia di aspettare più di 2 ore.

2. Preparazione delle celle Rho ⁰

1. Usa cellule^{Rho 0} osteosarcoma 143B appena scongelate o cellule Rho⁰ che stavano crescendo fino a quasi confluenza.
   NOTA: Si raccomanda di utilizzare cellule Rho⁰ che crescevano nell'incubatore fino a quasi confluenza. Si possono usare cellule Rho⁰ appena scongelate, e si consiglia di utilizzare una fiala congelata di celle Rho⁰ con alta densità cellulare. Lascia che le cellule si attacchino per due o più ore prima della fusione.
2. Lava la fiaschetta T75 con 5 mL di PBS.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,25% per coprire le cellule Rho⁰ .
4. Incubare per 5 minuti a 37 °C.
5. Dopo aver dondolato la fiaschetta, lava il fondo con 5 mL di SMEM.
6. Raccogli le celle Rho⁰ in un tubo conico da 15 mL.
7. Centrifuga a 200 × g per 5 minuti per concentrarsi nella misurazione del conteggio cellulare.
8. Rimuovere il sovrantantante e risospendere 1 mL di SMEM.
9. Conta le cellule.
   NOTA: Idealmente, dovrebbero esserci 1,5 milioni di celle per ogni fusione; tuttavia, fusioni riuscite sono state effettuate con appena 30.000 cellule.
10. Aliquota 1,5 milioni di celle in 1,5 tubi microcentrifughe e porta il volume a 1 mL.
    NOTA: Assicurati di avere un tubo extra a "fusione simulata". Questo tubo conterrà solo celle Rho⁰ e sarà utilizzato per aiutare a guidare il processo di selezione.
11. Centrifuga le piastrine a 1700 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Le cellule Rho⁰ sono sensibili alle temperature fredde.
12. Rimuovi il soprantantante dalle piastrine.
13. Aggiungi 1 mL di cellule Rho⁰ sopra il pellet piastrinico.
14. Centrifuga le cellule Rho⁰ e le piastrine a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.

3. Fusione

1. Rimuovi il soprantantante dalle cellule Rho⁰ e dal pellet piastrinico.
2. Aggiungi 150 μL di tampone di fusione (50% polietilenglicole [PEG]/10% DMSO) e triturato per 90 secondi per risospendere.
   NOTA: Alcuni pellet sono piuttosto appiccicosi e devono essere mescolati e spezzati manualmente oltre a pipettare su e giù. Registra se il pellet era appiccicoso.
3. Aggiungi 12 mL di mezzo Cybride (DMEM) + 10% FBS + 50 μg/mL uridina in una fiaschetta di T75.
4. Aggiungi 1 mL di piastrine fuse e cellule Rho⁰ alla fiaschetta.
5. Le cellule vengono incubate a 37 °C con il 5% di CO₂ in condizioni di alta umidità.
   NOTA: Tutte le fasi di crescita cellulare avvengono in queste condizioni.

4. Crescita

1. Giorno 2: Rimuovere il substrato Cybrid e aggiungere 12 mL freschi di substrato Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL uridina.
   NOTA: Le cellule Rho⁰ impiegano circa una settimana per incorporare il DNA mitocondriale.
2. Giorno 5: Rimuovere il substrato Cybrid e aggiungere 12 mL freschi di substrato Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL uridina.
   NOTA: Se le cellule Rho⁰ sono all'80% di confluenza, dividere le cellule in due fiasche.

5. Selezione

1. Giorno 8: Rimuovere il substrato e lavare le cellule con 5 mL di PBS.
2. Rimuovi il PBS e aggiungi 1 mL di tripsina.
3. Copri il fondo della fiaschetta con tripsina e incuba per 5 minuti a 37 °C.
4. Aggiungi 5 mL di substrato Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL uridina.
5. Conta le cellule.
   NOTA: La selezione dovrebbe iniziare dalla confluenza del 10%, cioè 125.000 cellule in una piastra di Petri trattata con T75 o coltura tissutale. Si consiglia di utilizzare piastre di Petri se si preferisce il metodo di raccolta della colonia. Usa un T75 se usi il metodo di diluizione.
6. Aggiungi 125.000 celle nel contenitore appropriato e aggiungi il resto del volume fino a 12 mL con il mezzo di selezione (DMEM).
   NOTA: Il mezzo di selezione è progettato per separare le cellule 143B fuse con i mitocondri dalle cellule Rho⁰ . Le cellule Rho⁰ richiedono piruvato e uridina per sopravvivere. La FBS dialitica non contiene piruvato e uridina e dovrebbe essere utilizzata solo per la selezione. Usa due diversi supporti di selezione se possibile. Uno dovrebbe essere FBS dialiticato al 10%, l'altro meno restrittivo sulla crescita, come il 20% FBS dializzato + 50 μg/mL uridina. Un mezzo di selezione meno restrittivo è suggerito in parallelo per i mutanti gravi.
7. Congelare le cellule rimanenti in due cryovial con 1 mL di soluzione congelante ciascuna.
   NOTA: Queste sono celle di preselezione e diverse selezioni possono essere provate in futuro.
8. Cambia media a giorni alterni per circa una settimana.
   NOTA: Le cellule Rho⁰ galleggiano quando muoiono e si spazzano via dopo il cambiamento del mezzo. Usa le celle di fusione "simulate" per determinare quando la selezione è completa (non più cellule nella fiaschetta). Questa fiaschetta sarà completamente vuota perché tutte le celle Rho⁰ saranno state lavate via. È una buona idea aspettare un altro giorno, anche quando la fiaschetta finta è vuota, perché le cellule fuse possono fornire i nutrienti nel mezzo per aiutare altre cellule Rho⁰ a persistere nella fiaschetta. Se le cellule crescono fino a una confluenza superiore al 20%, si dividono e si riplaccano. Una crescita maggiore maschererà la selezione.

6. Metodo di selezione della colonna

1. Fai crescere le colonie finché non sono visibili a occhio libero con mezzo Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL uridina.
   NOTA: Inclina il piatto e tienilo verso la luce. Le colonie appaiono come cerchi nuvolosi. Al microscopio, non dovrebbero esserci molte cellule di fondo tra le colonie.
2. Cerchia colonie indipendenti non sovrapposte con un marcatore sul fondo della fiaschetta, tenendole verso la luce.
3. Usa un P20 sia per raschiare (disturbare meccanicamente le cellule attaccate al fondo della fiaschetta) sia per aspirare contemporaneamente 20 μL all'interno del cerchio tracciato per posizionare le cellule della colonia selezionata nella punta del P20.
   NOTA: Lo scraping manualmente stacca le celle e tirando su 20 μL si accumulano le celle nella punta della pipetta.
4. Impreziosi ogni colonia nel proprio pozzo in una piastra da 96 pozzi.
   NOTA: Il vantaggio di questo metodo è che le cellule 143B tendono a crescere bene insieme, quindi non si dovrebbe avere problemi di crescita e si otterranno risultati più rapidi. Lo svantaggio è che si potrebbe avere una popolazione mista.

7. Metodo di crescita per diluizione

1. Quando le cellule raggiungono il 75% di confluenza nel mezzo Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL di uridina, lavare le cellule con 5 mL di PBS.
2. Rimuovi il PBS e aggiungi 1 mL di tripsina.
3. Copri il fondo della fiaschetta con tripsina e incuba per 5 minuti a 37 °C.
4. Aggiungi 5 mL di substrato Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL uridina.
5. Conta le cellule.
6. Aggiungere 1 × 10⁵ cellule in 20 mL di mezzo Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL uridina a 50 mL tubo conico 1.
   NOTA: Si tratta di 5000 celle/mL, che saranno 500 celle in 100 μL quando placcate in una piastra a 96 pozzi.
7. Prepara una provetta conica da 50 mL con una diluizione di 100 volte (200 μL dal tubo 1 su 20 mL di mezzo Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Si tratta di circa 5 celle per pozzo.
8. Prepara un tubo conico 3 da 50 mL con diluizione 1:1 (10 mL dal tubo 2 in 10 mL di mezzo Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Si tratta di circa 2,5 celle per pozzo.
9. Preparare un tubo conico 4 da 50 mL con diluizione 1:1 (10 mL del tubo 3 in 10 mL di mezzo Cybride + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Si tratta di circa 1 cella per pozzo.
10. Tubi a piastra 2, 3 e 4 in piastre a 96 pozzi ciascuno da 100 μL.
    NOTA: Assicurati di mescolare le celle prima di impiattirare. È difficile controllare il giorno stesso se c'è una cella in ogni pozzo perché le celle devono affondare sul fondo e attaccarsene. Il vantaggio di questo metodo è che una singola cellula cresce fino a diventare una colonia, garantendo l'assenza di un fondo misto. Lo svantaggio è che i mutanti gravi potrebbero non sopravvivere se isolati.
11. Il giorno dopo, cancella i pozzi che chiaramente hanno più di una cella per pozzo.
12. Dopo qualche giorno, controlla di nuovo i pozzi.
    NOTA: Ora dovrebbero esserci colonie, ed è più evidente se ci sono cellule singole vicino ai bordi dei pozzi. Se ci sono più di una colonia, rimuovi quei pozzi. Se non c'è una cella, rimuovi il pozzo.

8. Crescita

1. Inizia dalla piastra a 96 pozzi e trasferisci le celle su piastre più grandi passo a passo secondo necessità.
   NOTA: Queste cellule tendono a crescere meglio con un'alta densità cellulare, e non trasferire abbastanza cellule potrebbe causare la morte. Tieni sempre la lastra precedente con alcune celle e segna da dove proviene il pozzo, così da poter sempre tornare indietro se necessario. È importante sottolineare che le cellule 143B muoiono e si staccano se sovraconfluenti, quindi controlla queste cellule ogni giorno.

9. Conferma genetica

1. Centrifuga le celle aliquotate a 450 ×g per 5 minuti.
2. Rimuovi i media.
3. Aggiungi 5 μL di buffer di estrazione del DNA (50 mM NaOH).
   NOTA: Questo numero può cambiare se ci sono molte cellule. I pellet cellulari significativi possono trovarsi in 10 μL di tampone.
4. Incubare a 95 °C per 30 minuti.
5. Aggiungere un volume equivalente di tampone di stabilizzazione del DNA (0,1 M Tris-HCl; pH 8) al tampone di estrazione.
6. Esegui la reazione a catena della polimerasi (PCR) secondo le linee guida dell'enzima.
   NOTA: Alcuni mutanti puntuali possono usare enzimi di restrizione per distinguere tra cellule di controllo e cellule del paziente. Altre mutazioni puntuali non possono essere distinte e richiedono sequenziamento. In questo caso, è importante utilizzare miscele PCR senza coloranti per ottenere risultati di alta qualità. Si possono utilizzare il sequenziamento Sanger e il sequenziamento di nuova generazione. 2,5 μL di DNA sono sufficienti per una reazione di 25 μL.
7. Usa amplicon PCR specifici per questa mutazione per il sequenziamento di Sanger.
   NOTA: Gli amplicon PCR sono stati inviati per il sequenziamento di Sanger. Il livello di eteroplasmia della mutazione è stato confermato sia dopo l'espansione del clone sia dopo l'analisi funzionale.

10. Respirometria ad alta risoluzione utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

1. Esegui la calibrazione dell'aria secondo le linee guida del respirometro (ad esempio, Oroboros Instruments).
2. Lava i cybridi in una fiaschetta T75 con PBS.
   NOTA: Le celle non devono essere sovraconfluenti; Ideale è un 70%–80% di confluente.
3. Aggiungi 1 mL di tripsina e incuba per 4 minuti.
4. Aggiungi 5 mL di mezzo Cybride e conta le cellule.
5. Aggiungi 500.000 celle a un tubo per centrifugare a 450 × g per 5 minuti.
   NOTA: Il numero di cellule e i volumi del respirometro sono nella camera da 0,5 mL.
6. Lavare le celle risospendendo con PBS e centrifugando di nuovo.
7. Risospendere le celle in 510 μL di buffer MiR05 e aggiungerle a una camera vuota.
8. Dopo la stabilizzazione, aggiungere 0,65 μL di digitonina (50 mg/mL), 0,8 μL di malato (2,5 M) e 2 μL di piruvato (2,5 M).
   NOTA: Prima dell'aggiunta della digitonina, qui viene effettuata la misurazione della respirazione basale. Ogni passaggio successivo dovrebbe essere eseguito dopo la stabilizzazione.
9. Aggiungere 12 μL di adenosina difosfato (ADP) (0,25 M).
10. Aggiungi 4 μL di glutammato (2,5 M).
11. Aggiungi 12 μL di succinato (1,25 M).
12. Aggiungi 1 μL di oligomicina (1 mg/mL).
13. Aggiungere 1 μL di cianuro di carbonile-p-trifluorometossifenilidrazone [FCCP] (0,2 mM).
    NOTA: Titolare con aggiunte multiple finché non si osserva alcun ulteriore aumento (tipicamente 3–5).
14. Aggiungi 1 μL di rotenone (2 mM).
15. Aggiungi 1 μL di antimicina A (1 mg/mL).
16. Aggiungere 0,5 μL di ascorbato (0,8 M) e 0,5 μL di tetrametilfenilenamina [TMPD] (0,2 M).
17. Apri la camera con un distanziatore per 20 minuti.
18. Chiudi la camera e stabilizza per 5 minuti.
19. Aggiungi 22,5 μL di azide (4 M).
20. Raccogliere cellule per la quantificazione delle proteine utilizzando un kit di analisi per l'acido bicinconinico (BCA).
21. Eseguire calcoli dopo la stabilizzazione del tasso di consumo di ossigeno e normalizzare per proteina. La respirazione basale è il tasso stabilizzato di consumo di ossigeno dopo l'aggiunta delle cellule alla camera.
    NOTA: Tutte le altre misurazioni vengono effettuate dopo il substrato o inibitore indicato.
22. Calcola_l'IC di OXPHOS: (glutamato-antimicina A)/(FCCP-antimicina A).
23. Calcolare_{OXPHOS CI+CII}: (Succinato-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
24. Calcolare ETS_CI+CII: (FCCP-Antimicina A).
25. Calcolare ETS_CII: (Rotenone-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
26. Calcolare_CI+CII di perdita: (Oligamicina-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
27. Calcolare_{OXPHOS CIV}: (TMPD/ASC-Azida)/(FCCP-Antimicina A).
28. Utilizzare almeno 4–6 repliche biologiche per le misurazioni della respirometria.

Risultati

Per dimostrare le differenze metodologiche e il percorso verso l'ottimizzazione del protocollo, presentiamo i risultati della generazione di cybridi da un paziente con sospetta malattia mitocondriale che ospita una variante di significato sconosciuto (VUS) in MT-ND1 del complesso I (CI) nella catena di trasporto elettronico. Dopo il sequenziamento clinico del genoma mtDNA di nuova generazione in più tessuti in due diversi laboratori diagnostici clinici approvati dalla CLIA, l'un...

Discussione

Qui presentiamo un protocollo altamente efficiente per la generazione di linee cellulari cybridi transmitocondriali da piastrine di pazienti con mtDNA. Dimostriamo l'applicabilità con uno studio di caso di una variante MT-ND1 di significato incerto, l'importanza di considerare attentamente i parametri di crescita e selezione. Una volta ottimizzati questi principali problemi, si seleziona con successo i cybridi che ospitano varianti del mtDNA che potrebbero compromettere la funzi...

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbato	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
FBS dializzato	Fisher Scientific	35071CV
Digitonina	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Selection media
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutammato	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	buffer di fusione
Malato	Sigma Aldrich	M1000-100G
Buffer MiR05	Oroboros Instruments	60101-01
Respirometro O2K	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomicina	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Piruvato	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinato	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Tripsina-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Uridina	Sigma Aldrich	U3750-25G

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