Articolo metodologico

Un modello murino cardio-oncologico di cardiotossicità indotta da antracicline in topi immunocompetenti portatori di tumore al seno

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DOI:

10.3791/71633

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1 ottobre 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I modelli murini clinicamente rilevanti di cardiotoxicità indotta da antracicline sono scarsi. In questo studio viene proposto un modello che utilizza topi immunocompetenti portatori di un tumore sottoposti a trattamento antitumorale, simile ai protocolli clinici impiegati nei pazienti oncologici.

Abstract

L'aggiornamento recente della Società Europea di Cardiologia sui modelli preclinici di disfunzione cardiaca correlata alla terapia antitumorale sottolinea la necessità fondamentale di modelli più rappresentativi e traslazionali in vivo modelli. Si evidenzia la necessità di sviluppare modelli che utilizzino animali immunocompetenti portatori di tumore, includendo diverse linee genetiche e entrambi i sessi, al fine di riprodurre in modo più accurato l'eterogeneità osservata nelle popolazioni cliniche. Pertanto, è stato sviluppato un modello clinicamente rilevante di cardiotoxicità indotta da antracicline (AIC) in animali portatori di tumore mammario. In base al background genetico dei topi, cellule 4T1Luc (200.000 cellule) o cellule PY8119 (200.000 cellule) sono state inoculate rispettivamente nei topi Balb/c o C57Bl/6J, per via sottocutanea nella ghiandola mammaria inferiore, in animali maschi e femmine. La crescita tumorale è stata monitorata mediante bioluminescenza e palpazione. Una volta che la massa tumorale è risultata palpabile, due settimane dopo l'iniezione delle cellule tumorali, gli animali hanno ricevuto il trattamento antitumorale con doxorubicina. La tolleranza alla doxorubicina nei topi è risultata dipendente dalla linea genetica. La funzione cardiaca è stata valutata prima dell'inizio del protocollo (valore basale) e settimanalmente in seguito mediante ecocardiografia su topi anestetizzati con ketamina. La cardiotoxicità è stata definita come una riduzione della frazione di accorciamento del ventricolo sinistro pari almeno al 10% rispetto al valore basale, oppure come un valore assoluto <50% e una frequenza cardiaca >300 BPM. Il protocollo è stato riproducibile con un successo del 99% nello sviluppo del tumore e un >80% di sopravvivenza nei topi. È stata osservata cardiotoxicità in >90% dei topi trattati con tumore e doxorubicina.

Introduzione

La cardio-oncologia mira a migliorare gli esiti cardiovascolari nei pazienti oncologici prima, durante e dopo la chemioterapia. I modelli preclinici hanno svolto un ruolo fondamentale per comprendere meglio l'interazione tra queste due malattie. Recentemente, uno studio innovativo ha osservato che topi geneticamente predisposti a sviluppare polipi intestinali spontanei ne sviluppavano un numero maggiore dopo un infarto miocardico e un periodo di scompenso cardiaco (HF), dimostrando l'impatto diretto di un evento cardiovascolare sulla crescita tumorale1. Da allora, numerosi studi hanno riportato risultati coerenti in diversi tipi di tumore e ceppi murini, indicando spesso specifici percorsi molecolari o proteine, rafforzando così il concetto che la progressione del cancro sia indotta da malattie cardiovascolari (CVDs)2,3,4,5.

Al contrario, l'impatto del cancro sul rischio di sviluppare malattie cardiovascolari (CVD) è stato studiato per diversi decenni. Dati epidemiologici mostrano che i sopravvissuti al cancro soffrono di un maggior numero di CVD, sia a causa dei fattori di rischio comuni a queste due malattie, sia per le note tossicità di diversi trattamenti antitumorali trattamenti6,7,8,9,10. Negli studi preclinici si sono comunemente utilizzati modelli di cachessia indotta dal cancro per identificare specifici bersagli suscettibili di modulazione nell'uomo al fine di migliorare gli esiti cardiovascolari a lungo termine11,12,13,14Tuttavia, si potrebbe sostenere che questi modelli riflettano difficilmente una situazione clinica comune, poiché i pazienti spesso vengono trattati prima di raggiungere questo stadio avanzato del carcinoma; tuttavia, si sospetta che la cachessia globale contribuisca in larga misura alla mortalità generale nei casi di cancro15.

Nelle prime linee guida di cardio-oncologia della Società Europea di Cardiologia (ESC), si conclude che sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere meglio la relazione tra cancro e malattie cardiovascolari16. Più precisamente, in un recente aggiornamento del gruppo di lavoro dell'ESC sulla cardio-oncologia, si afferma che la ricerca preclinica è di fondamentale importanza per colmare questa lacuna conoscitiva, in particolare utilizzando modelli con animali portatori di tumore17. Inoltre, è necessaria una migliore correlazione tra studi preclinici e clinici, poiché la maggior parte degli studi clinici oggi viene condotta su trattamenti antitumorali poco studiati in contesti preclinici18.

Gli antraciclinici (AC), come la doxorubicina (Dox), sono comunemente utilizzati nella chemioterapia per un gran numero di tumori solidi e ematologici. Anche se oggi sono disponibili terapie più moderne, la loro economicità, gli effetti collaterali ben documentati e l'evidente efficacia porteranno a un ulteriore utilizzo di questi farmaci per molti anni ancora19,20. Una grande quantità di evidenze suggerisce che gli AC provocano una cardiotoxicità dipendente dalla dose, manifestata principalmente come disfunzione del ventricolo sinistro, che rappresenta oggi uno dei principali fattori limitanti per il loro impiego clinico e spesso costituisce un aspetto preoccupante per il cardio-oncologo21,22. Questa letteratura proviene principalmente da studi sul cancro al seno a causa dell'elevata incidenza nella popolazione umana, ma studi clinici su linfomi, cancro del polmone e leucemie riportano osservazioni simili23. Pertanto, la ricerca preclinica è stata condotta per diversi decenni al fine di comprendere i meccanismi fisiopatologici sottostanti alla cardiotoxicità indotta dagli antraciclinici (AIC), dimostrando che lo stress ossidativo, i danni diretti e indiretti al DNA, la ferroptosi e il danno mitocondriale sono comunemente coinvolti23,24.

Tuttavia, esistono attualmente prove limitate su come prevenire o trattare la CIAn. I comuni farmaci per lo scompenso cardiaco sono stati testati in studi clinici con risultati contrastanti, e il momento ottimale per l'uso delle poche opzioni potenzialmente efficaci è stato difficile da determinare21,23,25,26,27,28. La dexrazoxana, un farmaco che modula il ferro, ha mostrato risultati promettenti nella prevenzione della CIAn, ma oggi non viene utilizzata sistematicamente21. L'uso di AC in forme diverse dallo stato libero nel sangue, ad esempio incapsulati in liposomi, ha anch'esso mostrato risultati promettenti, ma incontra ancora difficoltà nell'essere adottato al posto degli AC convenzionali, anche a causa dei costi elevati21.

Una spiegazione di questa situazione è la mancanza di modelli animali clinicamente rilevanti per lo studio della cardiotoxicità indotta da antracicline (AIC)17. Negli esseri umani, la doxorubicina (Dox) viene somministrata nel tempo mediante iniezioni ripetute e la maggior parte dell'AIC viene osservata durante il primo anno successivo al trattamento. Tuttavia, nella letteratura scientifica si osserva una grande variabilità nei protocolli sperimentali sugli animali, come mostrato in una recente revisione pubblicata29. Un esempio classico di modello di cardiotoxicità acuta prevede topi liberi da tumore che ricevono un'unica iniezione di 20 mg/kg di Dox30. In un modello tipico di cardiotoxicità cronica, molti studi descrivono topi liberi da tumore che ricevono un'iniezione settimanale di 5 mg/kg di doxorubicina per una dose cumulativa totale di 20 mg/kg29,31. Questo modello di cardiotoxicità cronica può essere osservato anche in animali con tumore alla stessa dose di Dox; tuttavia, ciò rimane molto raro nella letteratura scientifica29,32.

Per contribuire a ridurre questa lacuna conoscitiva, è stato sviluppato un modello pragmatico e clinicamente rilevante di topi immunocompetenti con tumore al seno per lo studio dell'AIC, in particolare in topi Balb/c con tumore 4T1, e la sua robustezza è stata confermata in topi C57Bl/6J con tumore PY8119, rappresentando, per quanto a conoscenza degli autori, la prima volta che un modello cardio-oncologico viene realizzato con un carcinoma mammario triplo negativo in una linea C57Bl/6J. È stata ottenuta una buona rilevazione della crescita tumorale mediante quantificazione della bioluminescenza prima del trattamento degli animali con Dox, che ha dimostrato cardiotoxicità, ed è stato implementato un protocollo di raccolta degli organi per studiare contemporaneamente il microambiente tumorale e l'esperimento cardio-oncologico. Inoltre, sono stati osservati risultati simili a quelli descritti in letteratura riguardo alla sensibilità tra ceppi e sessi. Si prevede che questo lavoro contribuisca alla standardizzazione e al miglioramento dei protocolli animali nei futuri studi cardio-oncologici, poiché i topi C57Bl/6J sono particolarmente preziosi per la loro elevata sopravvivenza negli esperimenti sull'AIC29.

Il vantaggio del metodo proposto è l'utilizzo del ceppo C57Bl/6J, che è facile da ingegnerizzare geneticamente, ha un genoma ben caratterizzato, è economico da ottenere ed è tollerante a dosi cumulative elevate di AC29,33,34. Se per uno studio specifico con AC è necessario inattivare un gene, questo modello è particolarmente adatto a tale scopo. Inoltre, l'uso di un carcinoma mammario triplo negativo derivato da questo ceppo ha un interesse traslazionale, poiché le donne con carcinoma mammario triplo negativo sono i pazienti che molto probabilmente ricevono AC e che hanno la prognosi peggiore35. L'utilizzo di questo modello probabilmente migliorerà la conoscenza sull'AIC specificamente per questi pazienti.

Il punto di forza di questo modello risiede anche nel fatto che i topi vengono pre-condizionati con un tumore, il che può influenzare realmente il rimodellamento cardiovascolare36,37. Inoltre, questo modello si colloca tra i modelli acuti e quelli cronici completi di AIC, con la possibilità di estendere la durata del monitoraggio degli animali grazie alla loro elevata sopravvivenza, il che può risultare di grande valore qualora si considerino ulteriori cicli di AC.

Tuttavia, questo modello probabilmente non è il più adatto per la caratterizzazione specifica del tumore al termine del protocollo, a causa del suo approccio pragmatico all'inoculazione tumorale. Dovrebbe essere eseguita una versione adattata dell'iniezione tumorale se questo aspetto è centrale nell'ipotesi scientifica. Inoltre, l'iniezione di cellule 4T1 in topi Balb/c rappresenta un modello ben consolidato per un approccio più oncologico, ad esempio per lo studio delle metastasi, argomento non descritto in questo lavoro e da considerare qualora le metastasi siano fondamentali per la domanda scientifica38. Questo modello viene eseguito in topi adulti; tuttavia, se l'obiettivo è studiare l'AIC in un contesto pediatrico, andrebbero considerati topi più giovani, per i quali la risposta al protocollo non è stata studiata nel presente lavoro.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il comitato locale per l'etica sugli animali (Lariboisière-Villemin) e sono stati approvati dal Ministero francese dell'Istruzione Superiore e della Ricerca (MESRI) con il numero di protocollo APAFIS 46086. Le regole delle 3R sono state rispettate durante la progettazione del protocollo. I topi Balb/c e C57Bl/6J sono stati acquistati da fornitori specializzati come Janvier Labs o Envigo. Per questo protocollo, i topi avevano un'età compresa tra le 10 e le 18 settimane al momento dell'inclusione, corrispondente a giovani adulti, simili alle donne affette da carcinoma mammario triplo negativo. Gli animali sono stati mantenuti in gruppi di 2–5 individui in un ambiente con cicli luce/buio di 12 ore, temperatura tra 20 °C e 24 °C e umidità compresa tra il 30% e il 70%. Acqua e cibo sono stati forniti ad libitum. Durante il protocollo, si è prestata attenzione a rispettare i criteri umani prefissati prima dell'inizio del protocollo, come descritto in Tabella Supplementare 1. Assicurarsi di utilizzare un filtro per isoflurano per raccogliere i gas in eccesso, a garanzia della sicurezza dell'operatore. Gli animali devono essere maneggiati con cura, indossando guanti e occhiali protettivi in ogni fase del protocollo. Tutti i materiali pericolosi devono essere smaltiti secondo le normative locali dell'istituto; in questo caso, tutti i campioni contaminati (sangue, aghi, fiale contenenti dox, ecc.) sono stati smaltiti nei contenitori per rifiuti sanitari pericolosi. L'overview del protocollo è mostrato in Figura 1A. I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Settimana 0: Preparazione delle cellule e iniezione nell'animale

NOTA: I seguenti passaggi sono descritti per cellule 4T1Luc e sono stati identici per l'uso di cellule PY8119. Tuttavia, ciò dovrebbe essere adattato per ogni linea cellulare, in base alle raccomandazioni del produttore. Per ottimizzare il protocollo, una persona può occuparsi della preparazione delle cellule, mentre l'altra si occupa della preparazione degli animali.

  1. Quando si ottiene un flacone di coltura cellulare confluenziale (confluenza 80%–90%), applicare 3 mL di tripsina per 5 min a 37 °C e 5% CO2.
  2. Battere leggermente sul flacone per staccare tutte le cellule, evitare la formazione di grumi cellulari e risospendere nel mezzo di coltura cellulare.
  3. Contare le cellule utilizzando una camera di Malassez (o un'altra tecnica, a seconda di ciò che è disponibile).
  4. Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 min, quindi risospendere in un volume uguale di PBS per iniettare 200.000 cellule in 100 µL.
    NOTA: Il numero di cellule è stato scelto dopo una revisione della letteratura (vedere Tabella Supplementare 2).
  5. Aspirare delicatamente con una siringa da 26 G un volume di 500 µL della sospensione cellulare. Per evitare tempi eccessivi con la sospensione cellulare nella siringa, si raccomanda di riempire la siringa con un volume inferiore a quello necessario per 5 animali.
  6. Simultaneamente (se possibile), posizionare i topi in una camera per isoflurano e indurre rapidamente l'anestesia con isoflurano al 3% a 1 L/min in aria ambiente. Non appena l'animale è addormentato, posizionarlo in posizione supina con il muso in un cono contenente isoflurano all'1%.
  7. Applicare una crema depilatoria delicata con un bastoncino di cotone sulla parete toracica e inferiore sinistra dell'animale per 1 min. Rimuovere i peli e la crema con acqua, quindi asciugare la pelle con un fazzoletto.
  8. Verificare un'adeguata anestesia mediante pinzatura del dito del piede.
  9. Individuare il capezzolo mamario superiore sinistro dell'addome. Afferrarlo delicatamente con una pinzetta e sollevarlo verso l'alto (vedere Figura 1B).
  10. Introdurre l'ago della siringa nel sottocute e inserirlo fino a quando l'ago si trova al di sotto della ghiandola mammaria.
  11. Iniettare 100 µL della sospensione cellulare. Dovrebbe formarsi una bolla sottocutanea sotto il capezzolo (vedere Figura 1C). Gli animali di controllo dovrebbero ricevere PBS. La randomizzazione può essere effettuata utilizzando un software di randomizzazione (ad esempio RandoMice, uno strumento online gratuito) oppure assegnando il trattamento ai topi secondo un rapporto predeterminato 1:1 o 2:2 (o superiore).
  12. Rimuovere delicatamente l'ago e rilasciare il capezzolo precedentemente afferrato con la pinzetta.
  13. Pesare l'animale per ottenere un valore di peso di base per il protocollo.
  14. Lasciare che l'animale si risvegli in aria ambiente prima di riposizionarlo nella gabbia.

2. Settimana 1: Controllo della crescita tumorale mediante bioluminescenza

NOTA: Questa procedura può essere eseguita in qualsiasi giorno successivo all'iniezione per controllare la crescita. Inoltre, potrebbe essere effettuata in più punti temporali qualora si fosse interessati alla velocità di crescita del tumore. Tuttavia, dopo 10–14 giorni, il segnale potrebbe attenuarsi a causa della selezione naturale delle cellule tumorali durante la crescita del cancro. Inoltre, la ricrescita del pelo non dovrebbe rappresentare un problema per una corretta acquisizione dei fotoni, se il protocollo viene eseguito correttamente fin dall'inizio. Si vedano Figura 2A,B per risultati rappresentativi della quantificazione della bioluminescenza ai giorni 2, 5, 8 e 11 dopo l'iniezione del tumore.

  1. Posizionare gli animali in una camera per isoflurano e indurre rapidamente l'anestesia con isoflurano al 3%.
  2. Una volta che gli animali sono addormentati, iniettare 10 µL/g di peso corporeo di luciferina per via intraperitoneale (IP) utilizzando una siringa da 26 G. Evitare di iniettare la luciferina sul lato sinistro a causa della presenza del tumore, che talvolta può già essere palpabile dopo alcuni giorni.
  3. Posizionare i topi nell'imager a fotoni in posizione supina per ottimizzare la cattura dei fotoni, poiché il tumore si trova sul lato addominale. Inserire il muso nel cono nasale e ridurre l'isoflurano all'1%.
    NOTA: Posizionare correttamente 5 animali in un catturatore di fotoni richiede del tempo; iniziare a posizionarli almeno 2 minuti prima dell'inizio dell'acquisizione.
  4. Iniziare l'acquisizione dell'attività luminosa 10 minuti dopo l'iniezione di luciferina e proseguire per 5 minuti (vedere Figura 2A). La modalità di acquisizione per il dispositivo utilizzato era BLI a 89 ms per fotogramma, con una dimensione dell'immagine di 220 mm x 165 mm e una dimensione del pixel BVR di 153 µm.
  5. Al termine dell'acquisizione, lasciare che l'animale si risvegli in aria ambiente prima di riporlo nella gabbia.
  6. Utilizzare un software di quantificazione adatto all'imager a fotoni, seguendo le raccomandazioni del produttore.

3. Settimana 2: Trattamento con doxorubicina

NOTA: La valutazione ecocardiografica deve essere eseguita prima dell'inizio delle iniezioni di Dox. Pertanto, utilizzare l'anestesia indotta dopo l'ecocardiografia per somministrare l'iniezione mentre l'animale è addormentato, al fine di ridurre al minimo lo stress legato alla prima iniezione di Dox. Inoltre, la dose cumulativa deve essere adattata a ciascun ceppo di topo. In questo caso, sono state utilizzate 16 mg/kg per topi Balb/c e 24 mg/kg per topi C57Bl/6J, in base a dati precedenti ottenuti in laboratorio e alla letteratura29 (vedere Figura 3A–C).

  1. Risospendere e diluire la polvere di doxorubicina con soluzione fisiologica. La diluizione deve essere preparata in modo che 4 mg/kg di Dox corrispondano a un volume di 240–360 µL. Pertanto, si consiglia di preparare una soluzione a 2 mg/mL, quindi effettuare una diluizione 6 volte con soluzione fisiologica (concentrazione finale 0,33 mg/mL).
  2. Dopo due settimane dall'iniezione del tumore, verificare che il tumore sia palpabile nella parte inferiore sinistra dell'addome, ma con dimensioni inferiori a 1 cm.
  3. Pesare l'animale per monitorare la perdita di peso dopo il trattamento con Dox.
  4. Utilizzando una siringa da 26 G, iniettare il volume corrispondente per raggiungere 4 mg/kg per via intraperitoneale nella parte inferiore destra dell'addome. Gli animali di controllo devono ricevere soluzione fisiologica. La randomizzazione può essere effettuata come descritto al passaggio 1.11.
  5. Ripetere questa procedura quotidianamente per 4 giorni per raggiungere una dose cumulativa di 16 mg/kg (aggiungere 2 giorni per raggiungere 24 mg/kg nei topi C57Bl/6J).

4. Settimana 2–5: Monitoraggio della cardiotoxicità

NOTA: Questa procedura può essere eseguita su base settimanale. Valutazioni più frequenti richiederanno cautela, poiché gli animali sono spesso più vulnerabili durante le settimane 3 e 4 del protocollo e perché alcuni ceppi di topi sono sensibili all'anestesia generale, il che potrebbe portare a una maggiore mortalità. L'ecocardiografia viene eseguita sotto anestesia con ketamina per ottimizzare la possibilità di registrare disfunzioni cardiache, poiché l'isoflurano induce depressione miocardica, utilizzando 40 mg/kg per topi Balb/c e 80 mg/kg per topi C57Bl/6J39. Si raccomanda di effettuare un'ecografia prima dell'iniezione del tumore per quantificare l'eventuale effetto della crescita tumorale sulla funzione cardiaca prima dell'inizio della chemioterapia.

  1. Pesare l'animale. Se si osserva una perdita di peso significativa, seguire la Tabella Supplementare 1.
  2. Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale con una siringa da 26 G di ketamina a 40 mg/kg (topi Balb/c) o 80 mg/kg (topi C57Bl/6J) per ottenere un'anestesia leggera.
  3. Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia.
  4. Una volta che l'animale è addormentato, rasare l'animale come descritto al punto 1.7 per ottenere una zona toracica priva di peli.
  5. Dieci minuti dopo l'iniezione di ketamina, eseguire l'ecocardiografia per un massimo di 5 min. Utilizzare gel ecografico preriscaldato. A seconda del dispositivo utilizzato, concentrarsi sulla modalità M e/o effettuare la quantificazione della deformazione (strain).
  6. Se si utilizza la modalità M, registrare sezioni mediocardiache in vista paraesternale lungo l'asse, registrando almeno 4 s di battito cardiaco, almeno 3 volte, per ottenere una media rappresentativa della funzione cardiaca del topo (vedere Figura 4A,B). In questo caso, la velocità di acquisizione è stata impostata a 100 fotogrammi/s, la frequenza di trasmissione a 38,4 MHz al 100% di potenza, la frequenza di ricezione a 96 MHz, la velocità del suono a 1538 m/s e la velocità di scansione a 1200 Hz.
  7. Dopo circa 5 minuti, l'animale sarà troppo sveglio per permettere l'ecocardiografia. Riposizionarlo nella gabbia dopo aver rimosso il gel utilizzato per l'ecografia.
  8. Quantificare in cieco la funzione cardiaca39,40. Una disfunzione rilevante in questo modello è definita come un valore inferiore del 10% rispetto al valore basale e un valore assoluto <50% della frazione di accorciamento del ventricolo sinistro (FS), mentre la frequenza cardiaca rimane >300 BPM. Se il valore di FS pre-trattamento è troppo basso, si consiglia di escludere l'animale dall'analisi.
    NOTA: Per ogni quantificazione, sono necessari almeno 3 cicli cardiaci dai frammenti di 4 s, ma è possibile utilizzare più cicli quando disponibili. Se possibile, utilizzare lo stesso sperimentatore per tutte le ecocardiografie e una persona diversa per la quantificazione, al fine di rendere cieca l'analisi. Le raccomandazioni riguardo al controllo di qualità dell'ecocardiografia sono pubblicate altrove40.
  9. Eseguire l'analisi statistica (vedere passaggio 6). Il test consigliato per analizzare due gruppi lungo l'intero protocollo è l'ANOVA a due vie, poiché si stanno confrontando due fattori: tempo e trattamento.
  10. Eseguire questa procedura su base settimanale. La disfunzione compare già dopo una sola settimana di trattamento con doxorubicina.
    NOTA: Se è necessario prelevare sangue in un determinato momento dopo la somministrazione di Dox, ad esempio per misurare biomarcatori cardiaci, prelevare il sangue immediatamente dopo l'ecocardiografia per evitare un'ulteriore iniezione anestetica, minimizzare lo stress sull'animale e ottimizzare i tempi.

5. Settimana 5: Procedura di sacrificio

NOTA: idealmente, questo protocollo di raccolta degli organi dovrebbe essere eseguito da due persone.

  1. Dopo l'ultima ecocardiografia alla settimana 5, reiniettare gli animali con ketamina per via intraperitoneale a 100 mg/kg. Applicare un'anestesia locale con una goccia di Tetracaïne al 1% sull'occhio che verrà utilizzato per il prelievo ematico.
  2. Mediante una capillare eparinizzata, effettuare un prelievo ematico retro-orbitale per raccogliere la maggior quantità possibile di sangue in un tubo eparinato (oppure utilizzare una capillare EDTA in un tubo EDTA).
  3. Quando non è più possibile ottenere sangue, eseguire la dislocazione cervicale seguendo i protocolli approvati a livello istituzionale. Posizionare immediatamente il sangue raccolto sul ghiaccio fino alla successiva lavorazione, proseguendo con il protocollo di sacrificio descritto al punto 5.5.
  4. Centrifugare il sangue a 2000 x g per 10 minuti a 4 °C per separare le cellule ematiche dal plasma. Congelare rapidamente il tubo del plasma con azoto liquido e conservarlo a -80 °C fino all'analisi successiva.
  5. Posizionare l'animale su un coperchio di polistirolo ricoperto con carta assorbente e fissare le quattro zampe con dei perni.
  6. Il tumore dovrebbe avere dimensioni rilevanti (almeno 2 cm). Effettuare un'ampia escissione intorno al tumore per staccarlo. Un'ulteriore dissezione può essere eseguita dopo il prelievo degli organi residui descritto al punto 5.15.
  7. In un'area separata, dissezionare delicatamente il tumore utilizzando forbici piccole e affilate, tenendolo con una pinzetta. Per aumentare la tensione senza danneggiare il tumore, fissare l'eccesso di pelle al coperchio. Questo renderà la dissezione più agevole.
  8. Una volta completata la dissezione, pulire accuratamente il tumore con PBS per rimuovere sangue, peli e altri detriti non aderenti. Pesare il tumore.
  9. Posizionare una maglia in nylon da 22 µm in un tubo da centrifuga da 5 mL, appoggiare delicatamente il tumore su di essa e mantenerla sul ghiaccio fino alla centrifugazione.
  10. Centrifugare il tubo a 100 x g per 10 minuti a 4 °C per raccogliere il fluido interstiziale (vedere Figura 5A). Il volume ottenuto varia da 1 a 20 µL ed è spesso di colore rosso (Figura 5B). Trasferirlo in un tubo microcentrifuga da 200 µL e conservarlo a -80 °C fino all'analisi successiva.
    NOTA: Il resto del tumore può essere tagliato in pezzi più piccoli, posto in tubi di conservazione, congelato rapidamente con azoto liquido e conservato a –80 °C fino all'analisi successiva.
  11. Per raccogliere il midollo osseo, tagliare la zampa destra con le forbici, quindi dissezionare femore e tibia con un bisturi e una pinzetta, rimuovendo completamente muscolo, tessuto connettivo e grasso. Tagliare le epifisi su entrambi i lati delle due ossa con un bisturi. Posizionare le ossa pulite in PBS all'interno di piastre colturali a 12 pozzetti, completando il prelievo degli organi dei topi come descritto al punto 5.15.
    NOTA: Dettagli più approfonditi sull'isolamento del midollo osseo sono disponibili altrove41.
  12. Bucare il fondo di tubi microcentrifuga da 500 µL con un ago da 18 G, inserire le due ossa al loro interno e posizionare il tubo all'interno di un tubo da centrifuga da 1,5 mL contenente 400 µL di PBS.
  13. Centrifugare i tubi a 10.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Sul fondo del tubo da 1,5 mL si osserva un pellet cellulare; tutte le cellule presenti sono cellule del midollo osseo, mentre lo stroma del midollo osseo si trova in sospensione nel PBS. Aspirare tutto il soprannatante (stroma del midollo osseo) in un tubo di conservazione separato, congelare rapidamente il materiale con azoto liquido e conservarlo a -80 °C.
  14. Con le forbici, effettuare un'incisione trasversale sotto il torace a livello del diaframma e tagliare lo sterno lungo l'asse longitudinale per esporre polmoni e cuore.
    NOTA: Se necessario per analisi successive, in questo punto può essere eseguita una rimozione completa del sangue mediante soluzione salina.
  15. Raccogliere tutti gli organi necessari per l'analisi biomolecolare e istologica. Pesare gli organi e tagliarli in pezzi più piccoli per facilitare le successive analisi biomolecolari. Congelare immediatamente tutti i tubi con azoto liquido non appena l'organo è stato tagliato in pezzi più piccoli, quindi conservarli a -80 °C.
  16. Per il cuore, separare l'apice dalla parte superiore del cuore e posizionarlo su stampi di plastica riempiti con OCT. Una volta immerso nell'OCT, immergere lo stampo in isopentano freddo prima di congelarlo rapidamente con azoto liquido e conservarlo a -80 °C.

6. Analisi statistica

NOTA: Tutte le analisi statistiche e i grafici sono stati eseguiti utilizzando software statistici e di grafica e seguono le raccomandazioni della guida statistica42.

  1. I dati presentati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM).
  2. Utilizzare la stessa scala per tutti i grafici del frazionario di accorciamento.
  3. Visualizzare ogni singola unità sperimentale (topo) su ciascun grafico.
  4. Eseguire il test di Shapiro-Wilk per valutare la normalità delle distribuzioni di ciascun gruppo sperimentale, con un livello di significatività alfa stabilito a p = 0,05.
  5. Per il confronto tra due gruppi, utilizzare il test di Welch o il test di Mann-Whitney a seconda della normalità della distribuzione (test di Welch per distribuzioni normali in entrambi i gruppi, test di Mann-Whitney se uno o entrambi i gruppi presentano distribuzioni non normali). Scegliere l'opzione a due code, con un livello di confidenza stabilito al 95%.
  6. Per il confronto tra più di due gruppi in un determinato punto temporale, verificare nuovamente se le distribuzioni dei gruppi sono normali come indicato al punto 6.4. Eseguire un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dalla correzione di Holm-Sidak per confronti multipli se la distribuzione è normale.
    NOTA: Se la distribuzione non è normale, si dovrebbe invece eseguire il test di Kruskal-Wallis con correzione di Dunn per confronti multipli. La soglia alfa familiare è stabilita a 0,05 per determinare la significatività.
  7. Per i dati longitudinali, è stata utilizzata un'ANOVA bidirezionale a misure ripetute seguita dalla correzione di Sidak per confronti multipli per esaminare le differenze tra gruppi in un determinato punto temporale. La soglia alfa familiare è stabilita a 0,05 per determinare la significatività.

Risultati

Questo protocollo, come mostrato in Figura 1A, è un protocollo della durata di 5 settimane che porta alla formazione dei seguenti gruppi sperimentali: topi senza tumore non trattati con doxiciclina, topi senza tumore trattati con doxiciclina, topi con tumore non trattati con doxiciclina e topi con tumore trattati con doxiciclina. Il numero di gruppi può raddoppiare a seconda che vengano utilizzati entrambi i sessi. Le prime 2 settimane di crescita tumorale, prima dell'inizio del trattamento con Dox, sono sufficienti affinché il tumore si sviluppi dopo l'iniezione di 200.000 cellule nel 4th glandola mammaria sinistra degli animali (Figura 1B). La conferma dell'iniezione sottocutanea deve essere ottenuta osservando la comparsa di una bolla sotto il capezzolo durante l'iniezione delicata della sospensione di cellule tumorali (Figura 1C). Tabella 1 riassume brevemente i parametri chiave del protocollo per ciascun ceppo murino, insieme ai risultati principali che verranno discussi in seguito.

Figura 2A è un'immagine rappresentativa del segnale bioluminescente ottenuto quando un topo senza tumore (a sinistra) e un topo con tumore (a destra) vengono iniettati con luciferina e i fotoni vengono raccolti per 5 min. Questa analisi richiede tumori che esprimono il gene della luciferasi per generare fotoni dopo l'iniezione di luciferina. In totale, 33 topi Balb/c inoculati con cellule 4T1Luc sono stati monitorati per 11 giorni mediante bioluminescenza, mentre sono stati utilizzati 9 controlli. Figura 2B conferma che il tumore cresce rapidamente, ma che l'intensità del segnale inizia a stabilizzarsi dopo il giorno 8, e sembra che la crescita tumorale iniziale sia più rapida nelle femmine rispetto ai maschi di topi Balb/c, come mostrato in Figura 2C. Solo 1 su 45 topi Balb/c non presentava un tumore dopo 5 settimane, mentre tutti i topi C57Bl/6J presentavano un tumore dopo 5 settimane (Figura 2D).

Figura 3A  e Figura 3B dimostrano che una riduzione cumulativa della dose di Dox determina un miglioramento della sopravvivenza a tre settimane dall'inizio del trattamento con Dox: mentre nessun topo Balb/c portatore di tumore è sopravvissuto alla dose di 24 mg/kg, il 50% è sopravvissuto alla dose di 16 mg/kg. Tuttavia, i topi C57Bl/6J portatori di tumore sono più resistenti, anche alla dose di 24 mg/kg di Dox, poiché >l'80% di essi sopravvive 3 settimane dopo l'inizio della chemioterapia (Figura 3D). Il sesso ha avuto un impatto importante sull'esito: le femmine hanno mostrato una sopravvivenza molto migliore rispetto ai maschi nei topi Balb/c (16 femmine su 29 sono sopravvissute rispetto a 3 maschi su 16). Figura 3C dimostra le differenze di sesso in topi Balb/c trattati con 16 mg/kg di Dox (nessun test statistico è stato eseguito a causa del ridotto numero di maschi). Nei topi C57Bl/6J, non sono state osservate differenze statisticamente significative nella sopravvivenza tra i due sessi (vedere Figura 3E).

Un'immagine rappresentativa della funzione cardiaca sana di un topo, valutata mediante ecocardiografia prima del trattamento con Dox, è mostrata nella Figura 4A, e un'immagine di un topo con disfunzione cardiaca dopo Dox è mostrata nella Figura 4B. La frazione di accorciamento quantificata in modalità M in 17 topi C57Bl/6J con tumore trattati con 24 mg/kg di Dox mostra una diminuzione significativa due settimane dopo (59,3% pre-Dox vs 44,3% post-Dox, p < 0,0001, Figura 4C). Solo 1 dei 12 topi sopravvissuti (8%) non ha soddisfatto i criteri predeterminati di cardiotoxicità. La frequenza cardiaca diminuisce leggermente ma significativamente da 623 BPM pre-Dox a 569 BPM post-Dox (p < 0,05, Figura 4D). Tutti i parametri quantificati mediante modalità M sono riportati nella Tabella Supplementare 3.

La conferma dell'effetto cardiotossico della doxorubicina si ottiene mediante analisi macroscopiche e microscopiche. Figura 6A,B dimostra che il peso assoluto del cuore è significativamente ridotto dopo il trattamento con Dox nei pochi topi femmine Balb/c portatori di tumore sopravvissuti, ma la normalizzazione del peso cardiaco rispetto al peso corporeo totale mostra soltanto una tendenza. In un esperimento condotto su topi C57Bl/6 non portatori di tumore, 24 mg/kg di Dox hanno indotto i cambiamenti attesi nell'mRNA cardiaco dei seguenti geni una settimana dopo l'inizio del trattamento con Dox: Atrogin e Murf1 aumentati, a favore dell'atrofia; NQO1 aumentato, a favore dello stress ossidativo; e Bax aumentato, a favore di una condizione pro-apoptotica (Figura 6C–F).

Figura 5A è una rappresentazione schematica del protocollo relativo al liquido interstiziale tumorale. Un'immagine rappresentativa del liquido raccolto è mostrata in Figura 5B: il volume ottenuto è ridotto.

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Figura 1: Illustrazioni rappresentative del protocollo sperimentale. (A) Panoramica schematica del protocollo sperimentale. Creata con BioRender (licenza n. JE29USE7LU). (B) Rappresentazione schematica dell'inoculazione sottocutanea del tumore. Creata con BioRender (licenza n. SO29JHW7R6). (C) Rappresentazione schematica dell'impianto tumorale sottocutaneo riuscito. Creata con BioRender (licenza n. SO29JHW7R6). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Imaging della bioluminescenza e tasso di impianto tumorale. (A) Immagini rappresentative di bioluminescenza di un topo controllo (a sinistra) e di un topo con tumore (a destra). (B) Segnale di bioluminescenza nel tempo (media ± errore standard della media; analisi della varianza a due vie con misure ripetute [ANOVA]; *P < 0,05). (C) Confronto dei segnali di bioluminescenza tra topi Balb/c maschi e femmine (media ± errore standard della media). (D) Tassi di successo dell’impianto tumorale in entrambe le linee di topi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Analisi della sopravvivenza di topi con tumore. (A) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier di topi Balb/c trattati con 24 mg/kg di doxorubicina (Dox). (B) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier di topi Balb/c trattati con 16 mg/kg di Dox. (C) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che confronta topi maschi e femmine Balb/c trattati con 16 mg/kg di Dox. Nessuna analisi statistica è stata eseguita a causa del numero limitato di topi maschi. (D) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier di topi C57BL/6J trattati con 24 mg/kg di Dox. (E) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier che confronta topi maschi e femmine C57BL/6J trattati con 24 mg/kg di Dox (test del log-rank, P = 0,86). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Valutazione ecocardiografica della cardiotoxicità indotta da doxorubicina. (A) Ecocardiogramma in modo M rappresentativo di un topo sano. (B) Ecocardiogramma in modo M rappresentativo di un topo con cardiotoxicità indotta da doxorubicina. (C) Accorciamento frazionario (FS) nei topi C57BL/6J prima e 14 giorni dopo il trattamento con doxorubicina. (D) Frequenza cardiaca (HR) nei topi C57BL/6J prima e 14 giorni dopo il trattamento con doxorubicina. I dati sono mostrati per n = 17 topi. I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il t-test di Welch. *P < 0,05; ****P ≤ 0,0001. Abbreviazioni: FS, accorciamento frazionario; HR, frequenza cardiaca. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Protocollo di campionamento degli organi. (A) Rappresentazione schematica del protocollo di raccolta del liquido interstiziale tumorale. Creato con BioRender (licenza n. HV29USD91R). (B) Immagine rappresentativa che mostra la raccolta del liquido interstiziale tumorale durante il campionamento degli organi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Cardiotoxicità indotta da doxorubicina. (A) Peso cardiaco misurato 3 settimane dopo l'inizio del trattamento con 16 mg/kg di doxorubicina in topi Balb/c con tumore. (B) Peso cardiaco normalizzato rispetto al peso corporeo totale, misurato 3 settimane dopo l'inizio del trattamento con 16 mg/kg di doxorubicina in topi Balb/c con tumore. (C) Espressione dell'mRNA di Atrogin nel miocardio di topi C57BL/6J una settimana dopo l'inizio del trattamento con 24 mg/kg di doxorubicina. (D) Espressione dell'mRNA di Murf1 nel miocardio di topi C57BL/6J una settimana dopo l'inizio del trattamento con 24 mg/kg di doxorubicina. (E) Espressione dell'mRNA di NQO1 nel miocardio di topi C57BL/6J una settimana dopo l'inizio del trattamento con 24 mg/kg di doxorubicina. (F) Espressione dell'mRNA di BAX nel miocardio di topi C57BL/6J una settimana dopo l'inizio del trattamento con 24 mg/kg di doxorubicina. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il t-test di Welch o il test U di Mann-Whitney, a seconda della distribuzione dei dati. ns, P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Stirpe di topiBalb/cC57Bl/6J
Linea cellulare utilizzata4T1LucPY8119
Quantità di cellule iniettate200 000200 000
Sesso utilizzatoMaschio e femminaMaschio e femmina
Numero di giorni di iniezione46
Dose giornaliera4 mg/kg4 mg/kg
Dose cumulativa di doxorubicina16 mg/kg24 mg/kg
Dose di chetamina40 mg/kg80 mg/kg
Incidenza di cardiotoxicità>90%>90%
Tasso di sopravvivenza19/4516/19

Tabella 1: Parametri chiave del protocollo per ciascun ceppo di topo. Confronto delle principali variabili sperimentali e delle concentrazioni dei reagenti utilizzati nei protocolli per topi Balb/c e C57BL/6J.

Tabella supplementare 1: Parametri di benessere animale. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Panoramica della letteratura sui protocolli sperimentali con 4T1. Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 3: Parametri ecocardiografici misurati con modalità M in 17 topi C57BL/6J con tumore trattati con 24 mg/kg di doxorubicina. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

In questo studio è stato sviluppato un modello di cardiotoxicità indotta da doxorubicina in topi con tumore al seno, ritenuto di notevole rilevanza clinica per futuri studi in cardio-oncologia. L'obiettivo era riprodurre la situazione clinica del percorso di un paziente, dalla sua comparsa in ospedale con una diagnosi di cancro fino al trattamento con una chemioterapia potenzialmente cardiotoxica. Il protocollo segue un disegno pragmatico e utilizza topi immunocompetenti disponibili a livello mondiale, consentendo ad altri gruppi di riprodurlo in altri laboratori. L'elevata percentuale di successo nell'innesto tumorale ne fa un solido candidato per futuri studi tossicologici in cardio-oncologia.

Gli errori più comuni in questo protocollo includono l'esecuzione dell'ecocardiografia su topi con una frequenza cardiaca bassa, che può portare a un accorciamento frazionario (FS) artificialmente ridotto. Consentire ai topi di riprendersi dagli iniziali effetti cronotropi negativi degli anestetici prima della valutazione ecocardiografica aiuta a garantire misurazioni accurate dell'FS. Nei topi Balb/c, potrebbe essere necessaria un'ulteriore riduzione della dose di anestetico se la mortalità rimane elevata. Lo stesso sperimentatore dovrebbe effettuare tutte le valutazioni ecocardiografiche durante l'intero studio, poiché la variabilità tra osservatori può essere significativa43. Per l'impianto tumorale, ritirare lentamente la siringa durante l'iniezione può produrre un tumore di forma lineare, che potrebbe crescere più di un tumore generato mediante iniezione corretta. È inoltre fondamentale iniettare nel capezzolo mammario corretto, poiché un'iniezione nel capezzolo addominale superiore potrebbe interferire con la valutazione ecocardiografica nelle fasi successive dello sviluppo tumorale. Si raccomanda il conteggio manuale delle cellule in sospensione e un'accurata miscelazione prima dell'iniezione, per assicurare che ogni topo riceva un numero comparabile di cellule, riducendo così la variabilità nella dimensione del tumore al termine del protocollo. Quando è richiesto il prelievo settimanale di sangue, il volume raccolto deve essere attentamente controllato, poiché i topi diventano più fragili dopo il trattamento con doxorubicina. Si raccomanda un volume massimo totale di sangue di 50 µL in ogni punto temporale di prelievo, poiché volumi maggiori potrebbero aumentare la mortalità durante il protocollo. La frequenza e il volume dei prelievi ematici devono inoltre rispettare i requisiti etici locali per la sperimentazione animale e le linee guida del servizio veterinario istituzionale. La sostituzione del volume di sangue prelevato con un volume equivalente di soluzione salina somministrata per via sottocutanea può aiutare a compensare la perdita di liquidi dopo il prelievo ematico.

Per confrontare questa procedura con la doxorubicina, una revisione recentemente pubblicata sui modelli animali di cardiomiopatia indotta da antraciclinee ha osservato che la maggior parte dei modelli preclinici (88%) ha utilizzato iniezioni ripetute di Dox e valutazioni degli esiti (spesso mediante ecocardiografia) diverse settimane dopo29. La maggior parte degli articoli ha riportato l'uso del ceppo C57Bl/6J (73,8%), probabilmente a causa della sua robustezza e del basso costo29. Sfortunatamente, un numero significativo di studi ha trascurato l'impatto di un tumore sulla biologia dell'animale prima dell'iniezione delle cellule tumorali17,29. Solo 46 su 736 studi hanno riportato modelli con tumore, di cui 12 hanno utilizzato la linea cellulare 4T1 (carcinoma mammario di tipo triplo negativo) in topi Balb/c, e soltanto uno era un modello di carcinoma mammario in topi C57Bl/6J (più precisamente un carcinoma mammario di tipo positivo per EGFR2)29. Un altro studio ha utilizzato topi C57Bl/6J con un carcinoma mammario di tipo positivo per EGFR-2, ma non ha permesso la crescita tumorale prima dell'inizio della chemioterapia, il che limita l'aspetto traslazionale di questo modello32.

I modelli di xenotrapianto che utilizzano topi immunodeficienti permettono l'uso di linee cellulari tumorali umane, ma mancano di un sistema immunitario funzionante, il che limita lo studio dei meccanismi di cardiotoxicità mediata dall'immunità ed è un limite significativo data l'importanza crescente della cardiotoxicità associata agli inibitori del checkpoint immunitario. I modelli di grandi animali stanno emergendo nel campo della cardio-oncologia, ma avranno sempre gli svantaggi dei costi elevati e della limitata capacità di ingegneria genetica44. I sistemi in vitro e basati su cellule umane in 2D/3D (ad esempio, cardiomiociti derivati da iPSC umane, organoidi cardiaci) consentono schermature meccanicistiche e tossicologiche ad alto rendimento, ma non riescono a riprodurre la fisiologia integrata dell'intero organismo (emodinamica, regolazione neuroormonale, interazione immunitaria) che viene invece catturata dai modelli in vivo. Rispetto a questi approcci, questo modello sinnogenico, immunocompetente e portatore di tumore offre un contesto più clinicamente rilevante per studiare l'interazione tra il carico tumorale e la cardiotoxicità indotta dalla chemioterapia, a costo di una maggiore variabilità biologica, una mortalità più elevata in alcuni ceppi e un rendimento inferiore rispetto ai modelli in vitro più semplici o ai modelli in vivo privi di tumore.

I modelli di cardiotoxicità in assenza di tumore, utilizzati prevalentemente finora, offrono un'elevata riproducibilità, costi ridotti e valutazioni ecocardiografiche e di sopravvivenza più semplici, ma non riescono a riprodurre gli effetti sistemici del carico tumorale, dell'infiammazione associata al cancro e della cachessia sul cuore, fattori riconosciuti sempre più spesso come confondenti rilevanti nella cardiotoxicità dei pazienti17,45. Inoltre, il rimodellamento metabolico del cuore e, di conseguenza, la sua funzione contrattile possono essere alterati da oncometaboliti secreti, come il D-2-idrossiglutarato o il succinato14. Pertanto, se si intende costruire un modello cardio-oncologico per l'analisi biochimica cardiaca mediante diverse tecniche "omiche" (ad esempio proteomica e metabolomica), la presenza del tumore prima della chemioterapia è essenziale. Esistono anche alcune evidenze secondo cui il tumore stesso può indurre una disfunzione cardiaca evidente, sebbene tali risultati non siano costanti in letteratura. Mentre alcuni modelli hanno dimostrato un effetto dannoso dell'inoculazione tumorale sulla frazione di scorrimento (FS) o sui parametri di conduzione elettrica, altri hanno osservato che la presenza del tumore protegge i topi dal rimodellamento indotto da una costrizione aortica trasversa11,13,46. Tuttavia, a seconda dell'ipotesi preliminare, sono necessari anche animali senza tumore. Questi costituiscono l'unico contesto in cui l'effetto cardiotoxico diretto dell'agente chemioterapico può essere isolato dall'influenza confondente del tumore stesso, prerequisito fondamentale per stabilire la causalità e chiarire i meccanismi d'azione specifici del farmaco. Questi animali serviranno da controlli per l'effetto della terapia antitumorale e della sua interazione con il tumore nella cardiotoxicità. Senza questo confronto, sarebbe impossibile distinguere quale componente del fenotipo cardiaco osservato sia attribuibile al farmaco, al tumore o alla loro interazione. Tale distinzione è fondamentale non solo per la comprensione meccanicistica, ma anche per la progettazione razionale di strategie cardioprotettive. È quindi importante riconoscere che ciascuno di questi modelli affronta domande scientifiche distinte e complementari e che nessun modello da solo è sufficiente a riprodurre pienamente la complessità della cardio-oncologia clinica; spesso è necessario un utilizzo combinato o sequenziale di entrambi i modelli per trarre conclusioni meccanicistiche e traslazionali solide.

In questo protocollo, la cardiotoxicità è stata definita secondo le linee guida ESC del 2022 sulla cardio-oncologia, che definiscono la disfunzione cardiaca correlata alla terapia antitumorale moderata e asintomatica come una riduzione della frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) di >10% con un valore di LVEF compreso tra il 40% e il 49%16. Tuttavia, una quantificazione accurata della LVEF richiede un modulo 3D sull'ecografo39. Per evitare una valutazione errata della funzione cardiaca sistolica e mantenere un protocollo semplice applicabile anche nei laboratori dotati di ecografi meno recenti, si è preferito utilizzare la frazione di accorciamento (FS) come marcatore di disfunzione cardiaca, parametro correttamente e facilmente ottenibile mediante analisi in modo M nei topi, con gli stessi criteri stabiliti dall'ESC. Utilizzando questo protocollo, il 90% dei topi sopravvissuti soddisfa i criteri di cardiotoxicità, rendendolo un forte candidato per futuri studi traslazionali. L'effetto cardiotossico della doxorubicina (Dox) è stato confermato mediante valutazione macroscopica (riduzione del peso cardiaco) nei topi Balb/c. In questo studio non è stato incluso un gruppo con solo tumore nei topi C57Bl/6; pertanto, al momento non è disponibile alcun confronto in questo ceppo. Inoltre, in topi C57Bl/6 privi di tumore, la dose di Dox ha indotto alterazioni coerenti con la letteratura precedente sui meccanismi di cardiotoxicità degli antraciclinici: aumento dell'atrofia, dello stress ossidativo e dell'apoptosi19,20.

Tuttavia, variabili più moderne utilizzate nei pazienti, come la deformazione longitudinale globale con tracking dello speckle (GLS), non sono state quantificate in questo caso per motivi tecnici. Se tecnicamente fattibile localmente, sarebbe un valore aggiunto quantificare la GLS, poiché generalmente è considerata più sensibile nel rilevare danni cardiaci precoci23. I biomarcatori cardiaci circolanti, come la troponina, possono essere valutati per migliorare l'affidabilità del rilevamento della cardiotoxicità; tuttavia, la quantità di plasma tradizionalmente richiesta per queste analisi nei topi può rappresentare un fattore limitante a causa del basso volume ematico totale di questi animali. Inoltre, la fragilità di questi animali dopo il trattamento con Dox può aumentare i tassi di mortalità durante o dopo il prelievo di sangue. Un ultimo fattore limitante è la sensibilità di questi saggi per tali biomarcatori, che spesso può ostacolare l'interpretazione.

Sebbene lo stesso sperimentatore esperto abbia effettuato tutte le acquisizioni ecografiche, è stata osservata una notevole variabilità da settimana a settimana negli stessi topi Balb/c, anche in assenza di trattamento. Ciò può essere spiegato dalla sensibilità di questo ceppo all'anestesia con chetamina47. Infatti, inizialmente si sono notati elevati tassi di mortalità durante le procedure con anestesia, con conseguente riduzione del numero di animali che completavano il protocollo, portando a una riduzione della dose di chetamina da 80 mg/kg a 40 mg/kg nei topi Balb/c. Analizzando i grafici di sopravvivenza dei Balb/c trattati con Dox, si osserva che una parte della mortalità si verifica in corrispondenza dell'anestesia (ecocardiografia settimanale), ma la maggior parte dei decessi avviene presso il ricovero animale senza alcuna procedura attiva, evidenziando che la Dox è il fattore principale responsabile della mortalità in questi topi. Tuttavia, è importante tenere presente la mortalità legata all'anestesia quando si interpretano i grafici di sopravvivenza per questo modello, specialmente nel confronto tra due o più ceppi. Per ridurre il rischio di mortalità associata all'anestesia, si potrebbe effettuare l'ecocardiografia su topi coscienti, ma ciò richiede un adeguato addestramento e un periodo di ambientamento prima dell'inclusione degli animali nel protocollo. Per quanto riguarda la Dox, anche a dosi ridotte, quasi la metà dei topi Balb/c non ha completato il protocollo. Si potrebbe tentare l'induzione di cardiotoxicità con dosi ancora più basse di Dox, correndo però il rischio di ridurre il numero di animali che soddisfano i criteri di cardiotoxicità. Un'altra strategia potrebbe essere consentire un periodo di recupero più lungo dopo ogni iniezione di Dox, procedura non adottata in questo studio ma per la quale esistono in letteratura evidenze di migliorata sopravvivenza29.

Le osservazioni effettuate durante la costruzione di questo modello, secondo cui i topi Balb/c sono più sensibili alla Dox rispetto ai topi C57Bl/6J e che le femmine sono più resistenti alla Dox rispetto ai maschi, sono in accordo con la letteratura precedente29. Inoltre, i risultati simili e riproducibili ottenuti in entrambe le linee di topi confermano ulteriormente la robustezza di questo modello proposto. Somministrando dosi cumulative elevate attraverso dosi giornaliere moderatamente alte per un breve periodo di tempo, si sono ottenuti elevati tassi di cardiotoxicità con alta sopravvivenza. La creazione di un modello di cancro al seno (PY8119 è un carcinoma mammario di tipo triplo negativo) in topi C57Bl/6J sarà molto utile per studi futuri, poiché questi topi rappresentano uno dei principali background genetici per modelli transgenici34. L'elevato tasso di successo delle inoculazioni tumorali, che conferma l'efficacia del metodo di iniezione scelto, è un altro aspetto promettente di questo modello. Inoltre, l'elevata tolleranza alla Dox di questi topi apre la possibilità di studi più lunghi con ripetute somministrazioni di Dox, per mimare la comune situazione clinica di cancro secondario o di metastasi. Infine, il protocollo di prelievo degli organi permette la raccolta di tutti gli organi solidi, dei tumori e del loro liquido interstiziale, nonché del midollo osseo e della sua stroma, consentendo un'analisi molto approfondita del modello.

Questo modello presenta alcuni limiti. A causa del suo design pragmatico e per evitare interventi chirurgici invasivi, la posizione precisa del tumore (ovvero la ghiandola mammaria corretta piuttosto che il tessuto adiposo sottocutaneo) non può essere controllata con precisione mediante iniezione sottocutanea, il che può essere di grande importanza a seconda della domanda scientifica in esame48. Se è necessaria un'iniezione nel sito tumorale specifico, un intervento chirurgico più esteso potrebbe essere più adatto per eseguire un'iniezione ortotopica, anche se ciò sembra realmente rilevante soprattutto nel caso in cui si preveda un'analisi biochimica del tumore, poiché volume, latenza e incidenza mostrano risultati simili indipendentemente dal metodo di iniezione48. Si potrebbe inoltre obiettare che l'uso esclusivo di AC non rispecchia perfettamente la situazione clinica, in cui i pazienti spesso ricevono regimi combinati, ad esempio ciclofosfamide o cisplatino. Questo potrebbe effettivamente rappresentare il prossimo passo nella progettazione di questo protocollo; tuttavia, l'adattamento del dosaggio per ciascun chemioterapico utilizzato dovrebbe essere effettuato con attenzione. Inoltre, una mortalità superiore al 50% nei topi Balb/c a tre settimane dall'inizio del trattamento con Dox rimane molto elevata; una riduzione del dosaggio potrebbe migliorare la sopravvivenza, forse al costo di una cardiotoxicità meno pronunciata. Infine, per quanto riguarda i dosaggi impiegati in questo modello, va osservato che sono superiori a quelli comunemente utilizzati negli esseri umani oggi, il che potrebbe limitare il potenziale traslazionale di questo modello.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi relativamente al manoscritto.

Ringraziamenti

Grazie al team della struttura per animali per l'aiuto nel monitoraggio quotidiano del benessere animale. Grazie a Léanne Borges, Elias Ait Assa e Clémence Chabaud per l'assistenza nella stesura del protocollo sugli animali. Per la donazione delle cellule PY8119, un ringraziamento alla dottoressa Julie Helft dell'Unità INSERM 932. Un ringraziamento speciale al dottor Sylvain Provost e alla sua studentessa Mel Gavens per l'aiuto fornito con la bioluminescenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule 4T1LucATCCCRL-2539
Polvere di doxorubicinaCliniscience23214-92-8
EcocardiografoVisual SonicsVEVO LT-200
LuciferinaPerkin Elmer E1605
Rete di nylonMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Cellule PY8119Dono del Dott. Julie Helft

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