Protocollo per la valutazione standardizzata della funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando immagini laser a contrasto speckle

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato e non invasivo per valutare la funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando immagini laser a contrasto speckle combinate con iontoforesi farmacologica e stimoli fisiologici per valutare la reattività microvascolare in contesti di ricerca clinica.

Abstract

L'imaging laser a contrasto speckle (LSCI) è una tecnica ottica ad alta risoluzione e non invasiva che consente la visualizzazione in tempo reale e a campo completo della perfusione sanguigna microvascolare. Questo protocollo presenta una metodologia standardizzata per valutare la funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando LSCI. Poiché le misurazioni ottenute con questa tecnica sono altamente sensibili a confondenti ambientali e fisiologici, il protocollo enfatizza procedure di standardizzazione rigorose per migliorare la riproducibilità e l'affidabilità sperimentale. Il protocollo dettaglia i controlli ambientali essenziali, tra cui la stabilizzazione a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C, il posizionamento dei partecipanti, le procedure di acclimatazione e la minimizzazione delle interferenze esterne durante l'acquisizione dell'immagine. La metodologia integra la LSCI con due manovre provocatorie complementari per valutare la reattività microvascolare cutanea. L'iperemia reattiva post-occlusiva viene utilizzata per valutare la reattività microvascolare integrata, mentre le sfide farmacologiche guidate dall'iontoforesi vengono utilizzate per valutare la funzione endoteliale. In particolare, viene somministrata acetilcolina per valutare la vasodilatazione dipendente dall'endotelio, mentre il nitroprusside di sodio viene somministrato per valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio. Questo protocollo visualizzato passo dopo passo è pensato per facilitare l'adozione di metodologie LSCI standardizzate in contesti di ricerca clinica e traslazionale. L'approccio è stato applicato con successo per identificare le alterazioni microvascolari in diverse condizioni cliniche, tra cui ipertensione resistente, diabete e malattia coronarica. Consentendo una valutazione riproducibile e non invasiva della reattività microvascolare, questa metodologia fornisce uno strumento prezioso per indagare la salute vascolare sistemica, monitorare la progressione della malattia e valutare l'efficacia degli interventi rivolti alla microvascolatura.

Introduzione

L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire una metodologia standardizzata e riproducibile per valutare la funzione microvascolare sistemica e la reattività utilizzando imaging laser a contrasto speckle (LSCI) abbinato a manovre fisiologiche e farmacologiche provocatorie. La microcircolazione, composta da vasi sanguigni terminali — arteriole, capillari e venule — con^{un diametro} 1 inferiore a circa 100 μm, è il principale sito di scambio metabolico e un determinante critico della resistenza vascolare^{periferica 2}. La disfunzione endoteliale in questi piccoli vasi spesso precede le alterazioni macrovascolari e funge da biomarcatore precoce per le malattie cardiovascolari, tra cui ipertensione, diabete e malattia^{coronarica 3}. È importante sottolineare che, sebbene l'alterazione microvascolare contribuisca in modo significativo ai danni agli organi terminali, agisce in concomitanza con l'aterosclerosi macrovascolare e l'infiammazione cronica sistemica all'interno di un processo patologico multifattoriale. Pertanto, la valutazione non invasiva della reattività microvascolare è essenziale sia per la diagnosi precoce sia per il monitoraggio dell'efficacia terapeutica nella ricerca^{traslazionale 4}.

La ragione per cui la microcircolazione cutanea è un surrogato per la salute vascolare sistemica risiede nella sua accessibilità e nel suo ruolo di finestra rappresentativa sulla funzione endoteliale^{globale 5,6}. Tradizionalmente, la fluidometria Doppler laser (LDF) è stata considerata lo standard d'oro per la valutazione cutanea^{non invasiva 7}. Tuttavia, la LDF è limitata dalla scarsa risoluzione spaziale perché fornisce misurazioni puntuali altamente sensibili all'eterogeneità intrinseca della perfusione^{cutanea 8}. Al contrario, la LSCI offre vantaggi significativi offrendo una visualizzazione a campo completo e in tempo reale della perfusione tissutale con alta risoluzione temporale e^{spaziale 9}. Analizzando il pattern di interferenza generato dalla diffusione della luce laser, l'LSCI consente la valutazione simultanea di più regioni vascolari senza richiedere il contatto fisico o coloranti^{esogeni 10,11}.

All'interno della letteratura più ampia, l'integrazione delle LSCI con provocazioni farmacologiche guidate dall'iontoforesi, come l'acetilcolina (ACh) e il nitroprusside di sodio (SNP), è stata validata come un approccio robusto per valutare vie vasodilatatrici dipendenti e indipendenti dall'endotelio^12,13. Inoltre, l'iperemia reattiva post-oclusiva (PORH) fornisce una valutazione integrata della reattività microvascolare che coinvolge mediatori endoteliali, nervi sensoriali neurogeni e funzione muscolare liscia^{vascolare 12}. Nonostante i suoi vantaggi, l'elevata sensibilità delle LSCI alla variabilità ambientale e fisiologica richiede procedure di standardizzazione rigorose. Questo protocollo affronta queste sfide dettagliando controlli ambientali critici, inclusa la stabilizzazione a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C e il posizionamento standardizzato dei partecipanti, per migliorare la riproducibilità intrasoggetto e intersoggetto¹⁰. Questa metodologia è adatta a ricercatori clinici e traslazionali che cercano un approccio metodologico fondato e non invasivo per studiare la fisiopatologia microvascolare in diverse popolazioni di pazienti.

Protocollo

Tutte le procedure che hanno coinvolto partecipanti umani sono state eseguite in conformità con gli standard etici dell'Istituto Nazionale di Cardiologia (Ministero della Salute, Brasile), in conformità con le normative nazionali (Comitato Nazionale di Etica per la Ricerca – INAEP – secondo la Legge n. 14.874, maggio 2024) e la Dichiarazione di Helsinki (revisionata 2024).

1. Preparazione dei partecipanti e controllo ambientale

1. Stabilizzare l'ambiente d'esame
   1. Stabilizzare la temperatura della sala d'esame (RT; 23°C ± 1°C) utilizzando un termostato dedicato per mantenere un ambiente termico stabile.
   2. Monitorare il RT ogni 10 minuti utilizzando un termometro digitale calibrato (precisione di ±0,1°C).
      NOTA: La funzione microvascolare cutanea è altamente sensibile alle fluttuazioni di temperatura.
2. Prepara il partecipante prima della valutazione
   1. Istruisci i partecipanti a non fumare, consumare caffeina o alcol e svolgere esercizi vigorosi per 24 ore prima della valutazione.
   2. Istruire i partecipanti a digiunare per almeno 2 ore prima della valutazione, permettendo l'assunzione di acqua.
      NOTA: L'astinenza dalla caffeina e dall'esercizio fisico vigoroso minimizzano le interferenze esterne con il tono vascolare cutaneo. La caffeina, in quanto antagonista del recettore dell'adenosina, e l'esercizio fisico, attraverso effetti sulla spinta simpatica e sulla termoregolazione, possono indurre alterazioni sostenute della reattività microvascolare che persistono per diverse ore dopo^{l'esposizione 4,14}.
3. Posiziona il partecipante per l'acquisizione dell'immagine
   1. Posiziona il braccio non dominante del partecipante all'altezza del cuore usando cuscinetti corporei per mantenere l'avambraccio in posizione orizzontale e stabile.
   2. Usa la superficie ventrale dell'avambraccio come sito di valutazione.
      NOTA: L'avambraccio non dominante minimizza l'influenza del rimodellamento vascolare lateralizzato associato alle attività quotidiane. L'avambraccio ventrale offre caratteristiche anatomiche favorevoli per l'imaging ottico, tra cui una minore densità di capelli e uno spessore cutaneo ridotti, minimizzando così gli artefatti del segnale e migliorando la riproducibilità della somministrazione di farmaci iontoforetici.
4. Consentire la stabilizzazione cardiovascolare
   1. Mantieni il partecipante a riposo per almeno 20 minuti prima di iniziare le registrazioni microvascolari.
   2. Limitare il partecipante dal parlare, muovere l'arto misurato o usare dispositivi elettronici durante il periodo di riposo.
      NOTA: Il periodo di stabilizzazione minimizza le fluttuazioni autonome e cardiovascolari prima dell'acquisizione basale.
5. Minimizza gli artefatti di movimento
   1. Posizionare l'avambraccio non dominante del partecipante su un sistema a cuscinetto a vuoto.
   2. Regola il cuscino per mantenere la superficie ventrale dell'avambraccio in una posizione orizzontale stabile durante l'acquisizione dell'immagine.
6. Prepara la superficie della pelle
   1. Seleziona i posti della pelle senza peli visibili per tutte le misure.
   2. Rimuovere i peli con un tagliacapelli chirurgico 24 ore prima della valutazione quando necessario.
      ATTENZIONE: Non usare un rasoio per la rimozione dei peli perché l'irritazione della pelle potrebbe interferire con le misurazioni microvascolari.
7. Misura la pressione arteriosa
   1. Seleziona la misura del polsino in base alla circonferenza del braccio del partecipante.
   2. Eseguire tre misurazioni consecutive della pressione sanguigna utilizzando un dispositivo oscillometrico automatico calibrato con un intervallo di 1 minuto tra una misurazione e l'altra.
   3. Scartare la prima misurazione e calcolare la media delle ultime due misurazioni per determinare la pressione arteriosa media (MAP), secondo le linee guida cardiovascolari ESC/ESH e AHA.

2. Configurazione del sistema LSCI e configurazione software

1. Preparare il sistema LSCI
   1. Accendi il sistema LSCI almeno 10 minuti prima dell'acquisizione dell'immagine per permettere la stabilizzazione della sorgente laser.
   2. Verifica la stabilizzazione laser utilizzando l'indicatore di stato software prima di iniziare la registrazione.
2. Posiziona la testa laser
   1. Posiziona la testa laser direttamente sopra l'avambraccio del partecipante.
   2. Regolare la testa laser a una distanza esatta di 15 cm dalla superficie della pelle utilizzando lo strumento di misurazione della distanza fornito dal produttore (Figura 1A)
      NOTA: Mantenere una distanza di acquisizione fissa garantisce una messa a fuoco ottimale dell'immagine e un campo visivo costante tra i partecipanti.
3. Configura il software di acquisizione
   1. Avvia il software di acquisizione immagini e crea un nuovo file di studio.
   2. Inserisci le informazioni demografiche del partecipante e la MAP calcolata in precedenza.
      NOTA: Includere istruzioni dettagliate per il funzionamento del software e screenshot rappresentativi come materiale supplementare, quando applicabile.
4. Configurare i parametri di acquisizione
   1. Imposta la frequenza di campionamento di acquisizione a 1 immagine/s (1 Hz).
   2. Regola la risoluzione spaziale a circa 0,1 mm/pixel per l'area di acquisizione del bersaglio.
      NOTA: Una frequenza di campionamento di 1 Hz fornisce un equilibrio appropriato tra risoluzione temporale e rapporto segnale-rumore, catturando adeguatamente la cinetica iperemica e farmacologica della risposta.
5. Minimizzare le interferenze della luce ambientale
   1. Esegui un controllo del rumore di fondo o una sottrazione di fotogrammi scuri secondo i requisiti del sistema prima dell'acquisizione dell'immagine.
   2. Abbassa le luci della stanza e blocca la luce solare esterna usando tende oscuranti durante tutte le registrazioni quando la sottrazione del fotogramma scuro non è disponibile.
      NOTA: L'illuminazione ambientale standardizzata minimizza le interferenze ottiche e migliora la riproducibilità del segnale.
6. Definire le regioni di interesse (ROI)
   1. Crea almeno tre ROI circolari di circa 80^{mm 2} sullo schermo di anteprima dal vivo all'interno del software di acquisizione.
   2. Posiziona due ROI sui siti degli elettrodi di iontoforesi e un ROI sul sito di valutazione PORH.
   3. Posizionare tutti i ROI sull'avambraccio ventrale a circa 5 cm distale rispetto alla fossa antecubitale, evitando vene superficiali visibili.
      NOTA: La standardizzazione dell'area ROI minimizza l'influenza dell'eterogeneità spaziale nella perfusione cutanea e riduce gli artefatti di bordo associati alle camere di somministrazione dei farmaci.
7. Acquisire la registrazione di base della perfusione
   1. Registrare perfusione di sangue cutaneo a riposo continua per 5 minuti prima della stimolazione vascolare.
   2. Monitorare il segnale di perfusione in tempo reale e confermare l'assenza di picchi indotti dal movimento durante l'acquisizione di base.
   3. Definisci la stabilità di base come una variazione del segnale di perfusione del <10% durante un intervallo continuo di 2 minuti.
8. Abilitare l'analisi della conduttanza vascolare cutanea (CVC)
   1. Inserisci il MAP del partecipante nel software di acquisizione.
   2. Abilita il calcolo automatico del CVC nelle impostazioni del software.
9. Registrare i dati di perfusione e conduttanza
   1. Configura il software per calcolare automaticamente il CVC dividendo i valori di perfusione in tempo reale (APU) per MAP.
   2. Registra simultaneamente sia le unità di perfusione grezza (PU) sia i valori CVC calcolati durante tutto il protocollo.
      
      NOTA: Esprimere la perfusione microvascolare come CVC minimizza l'influenza confondente delle fluttuazioni sistemiche della pressione sanguigna e consente confronti più affidabili tra partecipanti con profili emodinamici diversi.

Figura 1. Configurazione sperimentale per la valutazione della perfusione microvascolare cutanea utilizzando imaging laser a contrasto di speckle (LSCI) combinato con iontoforesi. (A) Configurazione sperimentale rappresentativa utilizzata per la valutazione microvascolare cutanea tramite imaging laser a contrasto di speckle e iontoforesi di agenti vasodilatatori. (B) Risposta rappresentativa di perfusione microvascolare durante la somministrazione iontoforetica transdermica di dosi cumulative di acetilcolina (ACh). (C) Immagine rappresentativa dell'iontoforesi ACh. (D) Immagine rappresentativa di un elettrodo di controllo contenente veicolo. Le etichette indicano i seguenti componenti: (1) testa dell'imager; (2) elettrodi per la somministrazione di farmaco per iontoforesi; e (3) elettrodo dispersivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Iontoforesi e provocazione farmacologica

1. Prepara la pelle all'iontoforesi
   1. Pulisci le zone cutanee ventrali selezionate usando una soluzione salina senza alcol o un detergente delicato per la pelle.
   2. Asciuga delicatamente la pelle prima di posizionare l'elettrodo.
      NOTA: Evitare stimolazioni meccaniche eccessive durante la preparazione della pelle perché la vasodilatazione indotta meccanicamente può interferire con le misurazioni di base.
2. Posizionare gli elettrodi di somministrazione del farmaco
   1. Fissare due elettrodi di somministrazione del farmaco ai siti della pelle preparata utilizzando dischi adesivi a doppia faccia (Figura 1A).
   2. Mantenere una distanza tra elettrodi di circa 5 cm per prevenire interferenze di corrente elettrica.
3. Prepara la soluzione ACh
   1. Riempire la prima camera dell'elettrodo con 200 μL di una soluzione al 2% ACh preparata in soluzione^{salina allo 0,9% 14,15}.
   2. Utilizzare l'elettrodo ACh per valutare la vasodilatazione endotelio-dipendente.
      NOTA: La concentrazione selezionata del farmaco è stata ottimizzata per indurre una risposta microvascolare robusta e doso-dipendente, minimizzando al contempo irritazioni aspecifiche e artefatti galvanici.
4. Preparare la soluzione SNP
   1. Riempire la seconda camera degli elettrodi con 200 μL di una soluzione SNP al 2% preparata in soluzione salina allo 0,9%.
   2. Utilizzare l'elettrodo SNP per valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio.
      ATTENZIONE: SNP è sensibile alla luce. Proteggi la soluzione dall'esposizione alla luce usando carta stagnola e usa la soluzione entro 4 ore dalla preparazione per mantenere la stabilità farmacologica.
      NOTA: La concentrazione SNP selezionata facilita una vasodilatazione stabile al plateau minimizzando gli effetti elettrici aspecifici.
5. Rimuovere le bolle d'aria intrappolate
   1. Ispeziona le camere degli elettrodi per eventuali bolle d'aria intrappolate prima dell'attacco della pelle.
   2. Rimuovere le bolle d'aria visibili toccando delicatamente la camera dell'elettrodo o utilizzando una punta sterile di plastica per una siringa.
      NOTA: Le bolle d'aria possono ostacolare il flusso di corrente e produrre una somministrazione non omogenea del farmaco.
6. Posizionare l'elettrodo di riferimento
   1. Fissare l'elettrodo di riferimento (neutro) a circa 15 cm di distanza agli elettrodi di somministrazione del farmaco utilizzando gel conduttivo o adesivo (Figura 1A).
   2. Confermare il contatto stabile con gli elettrodi prima di iniziare l'iontoforesi.
      NOTA: La separazione spaziale tra le regioni di valutazione farmacologica e quella di valutazione PORH minimizza le interazioni di confondimento e previene la sovrapposizione dell'eruzione del riflesso assonico indotto da ACh con l'area di misura di PORH.
7. Collega il sistema di iontoforesi
   1. Collegare tutti gli elettrodi all'unità di erogazione dell'iontoforesi prima dell'applicazione attuale.
   2. Confermare la polarità dell'elettrodo prima di iniziare il protocollo (anodale per ACh; catodale per SNP).
      ATTENZIONE: Una polarità errata degli elettrodi può compromettere l'efficienza della somministrazione del farmaco e alterare le risposte vascolari.
8. Somministrare il protocollo attuale di iontoforesi
   1. Somministrare sei dosi incrementali di corrente di 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA per entrambi gli agenti farmacologici.
   2. Applica ogni dose attuale per 10 secondi.
      NOTA: Il protocollo incrementale di corrente consente la costruzione di una curva dose-risposta e facilita la valutazione della sensibilità microvascolare e delle risposte al^{plateau 11}. La combinazione di basse ampiezze di corrente e brevi intervalli di stimolazione minimizza la vasodilatazione galvanica non specifica.
9. Mantieni l'intervallo tra una stimolazione e l'altra
   1. Mantenere un intervallo di 60 s tra una corrente consecutiva e l'altra.
   2. Monitorare il segnale di perfusione durante il periodo di stabilizzazione tra le dosi.
      NOTA: L'intervallo selezionato consente la stabilizzazione della risposta microvascolare mantenendo la somministrazione locale del farmaco senza effetti sistemici.
10. Registra la risposta microvascolare
    1. Registra continuamente il segnale di perfusione microvascolare durante tutte le stimolazioni dell'iontoforesi.
    2. Continuare la registrazione per almeno 10 minuti dopo l'ultima applicazione corrente per catturare la risposta massima al plateau. Una risposta rappresentativa dose-dipendente è mostrata nella Figura 2A.

Figura 2. Registrazioni rappresentative della perfusione microvascolare cutanea durante iontoforesi e iperemia reattiva post-occlusua (PORH). (A) Registrazione rappresentativa del flusso sanguigno microvascolare cutaneo ottenuto utilizzando LSCI durante l'iontoforesi del 2% di ACh somministrato utilizzando correnti anodali crescenti di 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA per intervalli di 10 secondi separati da 1 minuto. (B) Registrazione rappresentativa ottenuta durante la valutazione PORH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Iperemia Reattiva Post-Oclusiva (PORH)

1. Posiziona il bracciale di occlusione
   1. Posizionare un bracciale pneumatico standard (largo circa 12 cm) sulla parte superiore del braccio dello stesso arto utilizzato per la registrazione LSCI.
   2. Posizionare la cuffia prossimalmente al sito di valutazione microvascolare selezionato.
2. Definire la regione di valutazione PORH
   1. Creare un terzo ROI sull'avambraccio ventrale adiacente ai siti degli elettrodi per iontoforesi.
   2. Posiziona il ROI all'interno di un'area cutanea priva di trattamenti per evitare interferenze farmacologiche.
      NOTA: Mantenere la separazione spaziale tra i siti di stimolazione farmacologica e la regione di valutazione PORH per preservare risposte vascolari indipendenti.
3. Acquisire la registrazione di base PORH
   1. Registrare perfusione cutanea a riposo continua per 5 minuti prima dell'occlusione arteriosa.
   2. Monitorare il segnale di perfusione di base per confermare la stabilità del segnale prima del gonfiaggio della cuffia.
4. Indotta l'oclusione arteriosa
   1. Gonfia rapidamente il bracciale pneumatico entro < 5 secondi utilizzando un gonfiatore automatico o una lampadina manuale.
   2. Aumentare la pressione sulla cuffia a 50 mmHg sopra la pressione sistolica (SBP) precedentemente misurata dal partecipante.
      ATTENZIONE: Confermare l'occlusione arteriosa completa prima di iniziare il periodo di occlusione perché un'occlusione incompleta può compromettere la risposta iperemica.
5. Mantenere il periodo di occlusione
   1. Mantieni l'occlusione arteriosa in modo continuo per esattamente 3 minuti.
   2. Verifica l'occlusione completa confermando che il segnale LSCI diminuisce fino a un plateau biologico zero (< 10 APU).
      NOTA: Il segnale biologico zero riflette il movimento residuo delle cellule sanguigni indipendentemente dal flusso sanguigno diretto, incluso il moto browniano.
6. Rilascia il bracciale di occlusione
   1. Rilascia istantaneamente la pressione del bracciale utilizzando la valvola di scarico rapido.
   2. Consentire un immediato ripristino del flusso sanguigno per avviare la risposta iperemica reattiva.
7. Registra la risposta iperemica
   1. Continua la registrazione LSCI per almeno 5 minuti dopo il rilascio del bracciale.
   2. Catturare la risposta di picco alla perfusione e il successivo ritorno ai livelli di perfusione di base. Una risposta rappresentativa del PORH è mostrata nella Figura 2B.
8. Quantificare la risposta PORH
   1. Calcola il picco CVC all'interno del software di acquisizione dell'immagine.
   2. Calcola l'area sotto la curva (AUC) del segnale di risposta iperemica utilizzando il software di analisi.

5. Estrazione dei dati e analisi statistica

1. Apri e verifica i dati registrati
   1. Apri i file di acquisizione registrati usando il software di analisi delle immagini.
   2. Verifica che tutti i ROI predefiniti rimangano correttamente posizionati sui corrispondenti siti di misura.
      NOTA: Riposizionare i ROI solo quando artefatti di movimento o deriva di acquisizione compromettono la posizione originale.
2. Definire gli intervalli di analisi
   1. Identificare gli intervalli di analisi specifici sui grafici di perfusione e tendenza CVC.
   2. Seleziona un intervallo basale continuo di 60 s immediatamente prima del primo stimolo vascolare.
   3. Seleziona gli ultimi 30 secondi di ogni intervallo di 60 secondi dopo la stimolazione con iontoforesi per catturare la risposta microvascolare del plateau.
      NOTA: Definire la stabilità di base come un coefficiente di variazione (CV) < il 5% nel segnale di perfusione per minimizzare l'influenza delle oscillazioni vasomotorie e degli artefatti di movimento prima dell'analisi dei dati.
3. Identificare le variabili di risposta PORH
   1. Identificare il segnale biologico zero durante la fase di occlusione arteriosa del protocollo PORH.
   2. Identifica il valore massimo del CVC immediatamente dopo il rilascio della cuffia.
4. Calcola i valori medi degli intervalli
   1. Calcola il valore medio CVC per ogni intervallo di analisi predefinito utilizzando il software di analisi delle immagini.
   2. Verifica l'assenza di artefatti di movimento prima di confermare i valori calcolati finali.
5. Organizza i dati estratti
   1. Esporta o trascrive manualmente i valori medi grezzi di PU e CVC in un foglio di calcolo strutturato.
   2. Organizza il dataset in base ai gruppi di studio e agli stimoli vascolari, inclusi acetilcolina, nitroprusside di sodio e risposte PORH.
      NOTA: Mantieni una denominazione dei file e i codici di identificazione dei partecipanti coerenti durante l'elaborazione dei dati per minimizzare gli errori di trascrizione.
6. Calcolare gli esiti vascolari secondari
   1. Calcolare la percentuale di aumento rispetto ai valori basali di perfusione o CVC per determinare la reattività vascolare.
   2. Calcola l'AUC quando necessario per l'analisi degli endpoint secondari.
7. Eseguire analisi statistiche
   1. Analizza i dati utilizzando un software di analisi statistica.
      NOTA: Includere screenshot rappresentativi o istruzioni di workflow per analisi basate su software come materiale supplementare, quando applicabile.
   2. Valutare la distribuzione dei dati
      1. Valuta la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
      2. Esprime i dati normalmente distribuiti come media ± deviazione standard (SD).
      3. Esprimi dati non normalmente distribuiti come intervallo mediano e interquartile (IQR).
   3. Confronta le risposte microvascolari
      1. Confrontare i dataset a due gruppi utilizzando un t-test indipendente quando le assunzioni di normalità sono soddisfatte.
      2. Confronta più gruppi usando ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey.
   4. Definire criteri di significatività statistica
      1. Definisci la significanza statistica come p < 0,05.
      2. Gestire i dati mancanti causati da artefatti di movimento utilizzando la cancellazione o l'esclusione a coppie dall'analisi interessata.
         NOTA: Applicare la stessa strategia dei dati mancanti in modo coerente in tutti i gruppi di studio per preservare l'integrità analitica.

Risultati

Un'applicazione riuscita di questo protocollo produce una base stabile seguita da risposte microvascolari chiare e distinguibili a ciascun stimolo vascolare. In un esperimento tecnicamente riuscito, la registrazione di base dimostra un segnale di perfusione stabile con fluttuazioni minime, definito come un DS di < 10% del segnale medio. Durante l'iontoforesi di ACh e SNP, si prevede un aumento graduale dell'APU, riflettendo una vasodilatazione dosodependente. Una risposta PORH di success...

Discussione

La LSCI fornisce un approccio standardizzato e non invasivo per la valutazione della funzione microvascolare sistemica con alta risoluzione spaziale e temporale. Rispetto alla LDF, che è limitata a misurazioni a singolo punto ed è altamente sensibile all'eterogeneità spaziale della perfusione cutanea, la LSCI consente l'imaging a campo completo e la valutazione simultanea di più ROI. Questa caratteristica migliora sostanzialmente la riproducibilità delle misurazioni e riduce il coefficie...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura
Monitor BP oscillometrico automatizzato	Omron Healthcare	HEM-7120	Usato per la valutazione della pressione arteriosa media basale (MAP) (3 misurazioni)
Termometro digitale calibrato	Delta OHM	HD2301.0	Precisione ± 0.1°C per il monitoraggio della temperatura ambiente
Elettrodo dispersivo (di riferimento)	Perimed AB	PF 384	Elettrodo neutro a grande superficie
Elettrodi per la somministrazione dei farmaci	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Camere per iontoforesi non invasive (circa 80 mm²)
Controllore di potenza per iontoforesi	Perimed AB	PeriIont Sistema di diagnosi microvascolare	Controller di corrente a doppio canale (fino a 200 µA)
Sistema di imaging a contrasto laser speckle (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Immagini ad alta risoluzione della perfusione sanguigna
Cuscino sottovuoto di grado medico	AB Germa	N/A	Usato per il posizionamento stabile dell'avambraccio a livello del cuore
Pompa sottovuoto a mano singola	AB Germa	N/A	Usato per l'evacuazione dei cuscini sottovuoto
Inflatore rapido del bracciale	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Rapid Cuff Inflator	Usato per l'occlusione arteriosa standardizzata di 3 min
Reagenti e materiali di consumo
Acetilcolina Cloruro (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Vasodilatore endotelial-dipendente preparato al 2%
Dischetti di preparazione con alcool	Becton Dickinson	326895	Fazzoletti di alcol isopropilico al 70% per la preparazione della pelle
Acqua deionizzata	Sigma-Aldrich	38796	Usato per il risciacquo finale degli elettrodi
Cloro di sodio (Salino 0,9%)	Fornitore locale	N/A	Solvente per la preparazione dei farmaci e la pulizia della pelle
Sodio Nitroprussiato (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Vasodilatore endotelial-indipendente preparato al 2%
Garza sterile	Fornitore locale	N/A	Usato per asciugare la superficie della pelle dopo la pulizia
Software
Software di analisi della perfusione	Perimed AB	PIMSoft	Software per l'acquisizione dati LSCI e l'analisi ROI
Software di analisi statistica	GraphPad Software	Prism 10	Usato per l'adattamento della curva dose-risposta e il calcolo dell'area sotto la curva (AUC)