Protocollo per la valutazione standardizzata della funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando immagini laser a contrasto speckle

Summary

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato e non invasivo per valutare la funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando immagini laser a contrasto speckle combinate con iontoforesi farmacologica e stimoli fisiologici per valutare la reattività microvascolare in contesti di ricerca clinica.

Abstract

L'imaging laser a contrasto speckle (LSCI) è una tecnica ottica ad alta risoluzione e non invasiva che consente la visualizzazione in tempo reale e a campo completo della perfusione sanguigna microvascolare. Questo protocollo presenta una metodologia standardizzata per valutare la funzione microvascolare sistemica nella microcircolazione cutanea umana utilizzando LSCI. Poiché le misurazioni ottenute con questa tecnica sono altamente sensibili a confondenti ambientali e fisiologici, il protocollo enfatizza procedure di standardizzazione rigorose per migliorare la riproducibilità e l'affidabilità sperimentale. Il protocollo dettaglia i controlli ambientali essenziali, tra cui la stabilizzazione a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C, il posizionamento dei partecipanti, le procedure di acclimatazione e la minimizzazione delle interferenze esterne durante l'acquisizione dell'immagine. La metodologia integra la LSCI con due manovre provocatorie complementari per valutare la reattività microvascolare cutanea. L'iperemia reattiva post-occlusiva viene utilizzata per valutare la reattività microvascolare integrata, mentre le sfide farmacologiche guidate dall'iontoforesi vengono utilizzate per valutare la funzione endoteliale. In particolare, viene somministrata acetilcolina per valutare la vasodilatazione dipendente dall'endotelio, mentre il nitroprusside di sodio viene somministrato per valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio. Questo protocollo visualizzato passo dopo passo è pensato per facilitare l'adozione di metodologie LSCI standardizzate in contesti di ricerca clinica e traslazionale. L'approccio è stato applicato con successo per identificare le alterazioni microvascolari in diverse condizioni cliniche, tra cui ipertensione resistente, diabete e malattia coronarica. Consentendo una valutazione riproducibile e non invasiva della reattività microvascolare, questa metodologia fornisce uno strumento prezioso per indagare la salute vascolare sistemica, monitorare la progressione della malattia e valutare l'efficacia degli interventi rivolti alla microvascolatura.

Introduction

L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire una metodologia standardizzata e riproducibile per valutare la funzione microvascolare sistemica e la reattività utilizzando imaging laser a contrasto speckle (LSCI) abbinato a manovre fisiologiche e farmacologiche provocatorie. La microcircolazione, composta da vasi sanguigni terminali — arteriole, capillari e venule — con^{un diametro} 1 inferiore a circa 100 μm, è il principale sito di scambio metabolico e un determinante critico della resistenza vascolare^{periferica 2}. La disfunzione endoteliale in questi piccoli vasi spesso precede le alterazioni macrovascolari e funge da biomarcatore precoce per le malattie cardiovascolari, tra cui ipertensione, diabete e malattia^{coronarica 3}. È importante sottolineare che, sebbene l'alterazione microvascolare contribuisca in modo significativo ai danni agli organi terminali, agisce in concomitanza con l'aterosclerosi macrovascolare e l'infiammazione cronica sistemica all'interno di un processo patologico multifattoriale. Pertanto, la valutazione non invasiva della reattività microvascolare è essenziale sia per la diagnosi precoce sia per il monitoraggio dell'efficacia terapeutica nella ricerca^{traslazionale 4}.

La ragione per cui la microcircolazione cutanea è un surrogato per la salute vascolare sistemica risiede nella sua accessibilità e nel suo ruolo di finestra rappresentativa sulla funzione endoteliale^{globale 5,6}. Tradizionalmente, la fluidometria Doppler laser (LDF) è stata considerata lo standard d'oro per la valutazione cutanea^{non invasiva 7}. Tuttavia, la LDF è limitata dalla scarsa risoluzione spaziale perché fornisce misurazioni puntuali altamente sensibili all'eterogeneità intrinseca della perfusione^{cutanea 8}. Al contrario, la LSCI offre vantaggi significativi offrendo una visualizzazione a campo completo e in tempo reale della perfusione tissutale con alta risoluzione temporale e^{spaziale 9}. Analizzando il pattern di interferenza generato dalla diffusione della luce laser, l'LSCI consente la valutazione simultanea di più regioni vascolari senza richiedere il contatto fisico o coloranti^{esogeni 10,11}.

All'interno della letteratura più ampia, l'integrazione delle LSCI con provocazioni farmacologiche guidate dall'iontoforesi, come l'acetilcolina (ACh) e il nitroprusside di sodio (SNP), è stata validata come un approccio robusto per valutare vie vasodilatatrici dipendenti e indipendenti dall'endotelio^12,13. Inoltre, l'iperemia reattiva post-oclusiva (PORH) fornisce una valutazione integrata della reattività microvascolare che coinvolge mediatori endoteliali, nervi sensoriali neurogeni e funzione muscolare liscia^{vascolare 12}. Nonostante i suoi vantaggi, l'elevata sensibilità delle LSCI alla variabilità ambientale e fisiologica richiede procedure di standardizzazione rigorose. Questo protocollo affronta queste sfide dettagliando controlli ambientali critici, inclusa la stabilizzazione a temperatura ambiente a 23°C ± 1°C e il posizionamento standardizzato dei partecipanti, per migliorare la riproducibilità intrasoggetto e intersoggetto¹⁰. Questa metodologia è adatta a ricercatori clinici e traslazionali che cercano un approccio metodologico fondato e non invasivo per studiare la fisiopatologia microvascolare in diverse popolazioni di pazienti.

Protocol

Tutte le procedure che hanno coinvolto partecipanti umani sono state eseguite in conformità con gli standard etici dell'Istituto Nazionale di Cardiologia (Ministero della Salute, Brasile), in conformità con le normative nazionali (Comitato Nazionale di Etica per la Ricerca – INAEP – secondo la Legge n. 14.874, maggio 2024) e la Dichiarazione di Helsinki (revisionata 2024).

1. Preparazione dei partecipanti e controllo ambientale

1. Stabilizzare l'ambiente d'esame
   1. Stabilizzare la temperatura della sala d'esame (RT; 23°C ± 1°C) utilizzando un termostato dedicato per mantenere un ambiente termico stabile.
   2. Monitorare il RT ogni 10 minuti utilizzando un termometro digitale calibrato (precisione di ±0,1°C).
      NOTA: La funzione microvascolare cutanea è altamente sensibile alle fluttuazioni di temperatura.
2. Prepara il partecipante prima della valutazione
   1. Istruisci i partecipanti a non fumare, consumare caffeina o alcol e svolgere esercizi vigorosi per 24 ore prima della valutazione.
   2. Istruire i partecipanti a digiunare per almeno 2 ore prima della valutazione, permettendo l'assunzione di acqua.
      NOTA: L'astinenza dalla caffeina e dall'esercizio fisico vigoroso minimizzano le interferenze esterne con il tono vascolare cutaneo. La caffeina, in quanto antagonista del recettore dell'adenosina, e l'esercizio fisico, attraverso effetti sulla spinta simpatica e sulla termoregolazione, possono indurre alterazioni sostenute della reattività microvascolare che persistono per diverse ore dopo^{l'esposizione 4,14}.
3. Posiziona il partecipante per l'acquisizione dell'immagine
   1. Posiziona il braccio non dominante del partecipante all'altezza del cuore usando cuscinetti corporei per mantenere l'avambraccio in posizione orizzontale e stabile.
   2. Usa la superficie ventrale dell'avambraccio come sito di valutazione.
      NOTA: L'avambraccio non dominante minimizza l'influenza del rimodellamento vascolare lateralizzato associato alle attività quotidiane. L'avambraccio ventrale offre caratteristiche anatomiche favorevoli per l'imaging ottico, tra cui una minore densità di capelli e uno spessore cutaneo ridotti, minimizzando così gli artefatti del segnale e migliorando la riproducibilità della somministrazione di farmaci iontoforetici.
4. Consentire la stabilizzazione cardiovascolare
   1. Mantieni il partecipante a riposo per almeno 20 minuti prima di iniziare le registrazioni microvascolari.
   2. Limitare il partecipante dal parlare, muovere l'arto misurato o usare dispositivi elettronici durante il periodo di riposo.
      NOTA: Il periodo di stabilizzazione minimizza le fluttuazioni autonome e cardiovascolari prima dell'acquisizione basale.
5. Minimizza gli artefatti di movimento
   1. Posizionare l'avambraccio non dominante del partecipante su un sistema a cuscinetto a vuoto.
   2. Regola il cuscino per mantenere la superficie ventrale dell'avambraccio in una posizione orizzontale stabile durante l'acquisizione dell'immagine.
6. Prepara la superficie della pelle
   1. Seleziona i posti della pelle senza peli visibili per tutte le misure.
   2. Rimuovere i peli con un tagliacapelli chirurgico 24 ore prima della valutazione quando necessario.
      ATTENZIONE: Non usare un rasoio per la rimozione dei peli perché l'irritazione della pelle potrebbe interferire con le misurazioni microvascolari.
7. Misura la pressione arteriosa
   1. Seleziona la misura del polsino in base alla circonferenza del braccio del partecipante.
   2. Eseguire tre misurazioni consecutive della pressione sanguigna utilizzando un dispositivo oscillometrico automatico calibrato con un intervallo di 1 minuto tra una misurazione e l'altra.
   3. Scartare la prima misurazione e calcolare la media delle ultime due misurazioni per determinare la pressione arteriosa media (MAP), secondo le linee guida cardiovascolari ESC/ESH e AHA.

2. Configurazione del sistema LSCI e configurazione software

1. Preparare il sistema LSCI
   1. Accendi il sistema LSCI almeno 10 minuti prima dell'acquisizione dell'immagine per permettere la stabilizzazione della sorgente laser.
   2. Verifica la stabilizzazione laser utilizzando l'indicatore di stato software prima di iniziare la registrazione.
2. Posiziona la testa laser
   1. Posiziona la testa laser direttamente sopra l'avambraccio del partecipante.
   2. Regolare la testa laser a una distanza esatta di 15 cm dalla superficie della pelle utilizzando lo strumento di misurazione della distanza fornito dal produttore (Figura 1A)
      NOTA: Mantenere una distanza di acquisizione fissa garantisce una messa a fuoco ottimale dell'immagine e un campo visivo costante tra i partecipanti.
3. Configura il software di acquisizione
   1. Avvia il software di acquisizione immagini e crea un nuovo file di studio.
   2. Inserisci le informazioni demografiche del partecipante e la MAP calcolata in precedenza.
      NOTA: Includere istruzioni dettagliate per il funzionamento del software e screenshot rappresentativi come materiale supplementare, quando applicabile.
4. Configurare i parametri di acquisizione
   1. Imposta la frequenza di campionamento di acquisizione a 1 immagine/s (1 Hz).
   2. Regola la risoluzione spaziale a circa 0,1 mm/pixel per l'area di acquisizione del bersaglio.
      NOTA: Una frequenza di campionamento di 1 Hz fornisce un equilibrio appropriato tra risoluzione temporale e rapporto segnale-rumore, catturando adeguatamente la cinetica iperemica e farmacologica della risposta.
5. Minimizzare le interferenze della luce ambientale
   1. Esegui un controllo del rumore di fondo o una sottrazione di fotogrammi scuri secondo i requisiti del sistema prima dell'acquisizione dell'immagine.
   2. Abbassa le luci della stanza e blocca la luce solare esterna usando tende oscuranti durante tutte le registrazioni quando la sottrazione del fotogramma scuro non è disponibile.
      NOTA: L'illuminazione ambientale standardizzata minimizza le interferenze ottiche e migliora la riproducibilità del segnale.
6. Definire le regioni di interesse (ROI)
   1. Crea almeno tre ROI circolari di circa 80^{mm 2} sullo schermo di anteprima dal vivo all'interno del software di acquisizione.
   2. Posiziona due ROI sui siti degli elettrodi di iontoforesi e un ROI sul sito di valutazione PORH.
   3. Posizionare tutti i ROI sull'avambraccio ventrale a circa 5 cm distale rispetto alla fossa antecubitale, evitando vene superficiali visibili.
      NOTA: La standardizzazione dell'area ROI minimizza l'influenza dell'eterogeneità spaziale nella perfusione cutanea e riduce gli artefatti di bordo associati alle camere di somministrazione dei farmaci.
7. Acquisire la registrazione di base della perfusione
   1. Registrare perfusione di sangue cutaneo a riposo continua per 5 minuti prima della stimolazione vascolare.
   2. Monitorare il segnale di perfusione in tempo reale e confermare l'assenza di picchi indotti dal movimento durante l'acquisizione di base.
   3. Definisci la stabilità di base come una variazione del segnale di perfusione del <10% durante un intervallo continuo di 2 minuti.
8. Abilitare l'analisi della conduttanza vascolare cutanea (CVC)
   1. Inserisci il MAP del partecipante nel software di acquisizione.
   2. Abilita il calcolo automatico del CVC nelle impostazioni del software.
9. Registrare i dati di perfusione e conduttanza
   1. Configura il software per calcolare automaticamente il CVC dividendo i valori di perfusione in tempo reale (APU) per MAP.
   2. Registra simultaneamente sia le unità di perfusione grezza (PU) sia i valori CVC calcolati durante tutto il protocollo.
      
      NOTA: Esprimere la perfusione microvascolare come CVC minimizza l'influenza confondente delle fluttuazioni sistemiche della pressione sanguigna e consente confronti più affidabili tra partecipanti con profili emodinamici diversi.

Figura 1. Configurazione sperimentale per la valutazione della perfusione microvascolare cutanea utilizzando imaging laser a contrasto di speckle (LSCI) combinato con iontoforesi. (A) Configurazione sperimentale rappresentativa utilizzata per la valutazione microvascolare cutanea tramite imaging laser a contrasto di speckle e iontoforesi di agenti vasodilatatori. (B) Risposta rappresentativa di perfusione microvascolare durante la somministrazione iontoforetica transdermica di dosi cumulative di acetilcolina (ACh). (C) Immagine rappresentativa dell'iontoforesi ACh. (D) Immagine rappresentativa di un elettrodo di controllo contenente veicolo. Le etichette indicano i seguenti componenti: (1) testa dell'imager; (2) elettrodi per la somministrazione di farmaco per iontoforesi; e (3) elettrodo dispersivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Iontoforesi e provocazione farmacologica

1. Prepara la pelle all'iontoforesi
   1. Pulisci le zone cutanee ventrali selezionate usando una soluzione salina senza alcol o un detergente delicato per la pelle.
   2. Asciuga delicatamente la pelle prima di posizionare l'elettrodo.
      NOTA: Evitare stimolazioni meccaniche eccessive durante la preparazione della pelle perché la vasodilatazione indotta meccanicamente può interferire con le misurazioni di base.
2. Posizionare gli elettrodi di somministrazione del farmaco
   1. Fissare due elettrodi di somministrazione del farmaco ai siti della pelle preparata utilizzando dischi adesivi a doppia faccia (Figura 1A).
   2. Mantenere una distanza tra elettrodi di circa 5 cm per prevenire interferenze di corrente elettrica.
3. Prepara la soluzione ACh
   1. Riempire la prima camera dell'elettrodo con 200 μL di una soluzione al 2% ACh preparata in soluzione^{salina allo 0,9% 14,15}.
   2. Utilizzare l'elettrodo ACh per valutare la vasodilatazione endotelio-dipendente.
      NOTA: La concentrazione selezionata del farmaco è stata ottimizzata per indurre una risposta microvascolare robusta e doso-dipendente, minimizzando al contempo irritazioni aspecifiche e artefatti galvanici.
4. Preparare la soluzione SNP
   1. Riempire la seconda camera degli elettrodi con 200 μL di una soluzione SNP al 2% preparata in soluzione salina allo 0,9%.
   2. Utilizzare l'elettrodo SNP per valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio.
      ATTENZIONE: SNP è sensibile alla luce. Proteggi la soluzione dall'esposizione alla luce usando carta stagnola e usa la soluzione entro 4 ore dalla preparazione per mantenere la stabilità farmacologica.
      NOTA: La concentrazione SNP selezionata facilita una vasodilatazione stabile al plateau minimizzando gli effetti elettrici aspecifici.
5. Rimuovere le bolle d'aria intrappolate
   1. Ispeziona le camere degli elettrodi per eventuali bolle d'aria intrappolate prima dell'attacco della pelle.
   2. Rimuovere le bolle d'aria visibili toccando delicatamente la camera dell'elettrodo o utilizzando una punta sterile di plastica per una siringa.
      NOTA: Le bolle d'aria possono ostacolare il flusso di corrente e produrre una somministrazione non omogenea del farmaco.
6. Posizionare l'elettrodo di riferimento
   1. Fissare l'elettrodo di riferimento (neutro) a circa 15 cm di distanza agli elettrodi di somministrazione del farmaco utilizzando gel conduttivo o adesivo (Figura 1A).
   2. Confermare il contatto stabile con gli elettrodi prima di iniziare l'iontoforesi.
      NOTA: La separazione spaziale tra le regioni di valutazione farmacologica e quella di valutazione PORH minimizza le interazioni di confondimento e previene la sovrapposizione dell'eruzione del riflesso assonico indotto da ACh con l'area di misura di PORH.
7. Collega il sistema di iontoforesi
   1. Collegare tutti gli elettrodi all'unità di erogazione dell'iontoforesi prima dell'applicazione attuale.
   2. Confermare la polarità dell'elettrodo prima di iniziare il protocollo (anodale per ACh; catodale per SNP).
      ATTENZIONE: Una polarità errata degli elettrodi può compromettere l'efficienza della somministrazione del farmaco e alterare le risposte vascolari.
8. Somministrare il protocollo attuale di iontoforesi
   1. Somministrare sei dosi incrementali di corrente di 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA per entrambi gli agenti farmacologici.
   2. Applica ogni dose attuale per 10 secondi.
      NOTA: Il protocollo incrementale di corrente consente la costruzione di una curva dose-risposta e facilita la valutazione della sensibilità microvascolare e delle risposte al^{plateau 11}. La combinazione di basse ampiezze di corrente e brevi intervalli di stimolazione minimizza la vasodilatazione galvanica non specifica.
9. Mantieni l'intervallo tra una stimolazione e l'altra
   1. Mantenere un intervallo di 60 s tra una corrente consecutiva e l'altra.
   2. Monitorare il segnale di perfusione durante il periodo di stabilizzazione tra le dosi.
      NOTA: L'intervallo selezionato consente la stabilizzazione della risposta microvascolare mantenendo la somministrazione locale del farmaco senza effetti sistemici.
10. Registra la risposta microvascolare
    1. Registra continuamente il segnale di perfusione microvascolare durante tutte le stimolazioni dell'iontoforesi.
    2. Continuare la registrazione per almeno 10 minuti dopo l'ultima applicazione corrente per catturare la risposta massima al plateau. Una risposta rappresentativa dose-dipendente è mostrata nella Figura 2A.

Figura 2. Registrazioni rappresentative della perfusione microvascolare cutanea durante iontoforesi e iperemia reattiva post-occlusua (PORH). (A) Registrazione rappresentativa del flusso sanguigno microvascolare cutaneo ottenuto utilizzando LSCI durante l'iontoforesi del 2% di ACh somministrato utilizzando correnti anodali crescenti di 30, 60, 90, 120, 150 e 180 μA per intervalli di 10 secondi separati da 1 minuto. (B) Registrazione rappresentativa ottenuta durante la valutazione PORH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Iperemia Reattiva Post-Oclusiva (PORH)

1. Posiziona il bracciale di occlusione
   1. Posizionare un bracciale pneumatico standard (largo circa 12 cm) sulla parte superiore del braccio dello stesso arto utilizzato per la registrazione LSCI.
   2. Posizionare la cuffia prossimalmente al sito di valutazione microvascolare selezionato.
2. Definire la regione di valutazione PORH
   1. Creare un terzo ROI sull'avambraccio ventrale adiacente ai siti degli elettrodi per iontoforesi.
   2. Posiziona il ROI all'interno di un'area cutanea priva di trattamenti per evitare interferenze farmacologiche.
      NOTA: Mantenere la separazione spaziale tra i siti di stimolazione farmacologica e la regione di valutazione PORH per preservare risposte vascolari indipendenti.
3. Acquisire la registrazione di base PORH
   1. Registrare perfusione cutanea a riposo continua per 5 minuti prima dell'occlusione arteriosa.
   2. Monitorare il segnale di perfusione di base per confermare la stabilità del segnale prima del gonfiaggio della cuffia.
4. Indotta l'oclusione arteriosa
   1. Gonfia rapidamente il bracciale pneumatico entro < 5 secondi utilizzando un gonfiatore automatico o una lampadina manuale.
   2. Aumentare la pressione sulla cuffia a 50 mmHg sopra la pressione sistolica (SBP) precedentemente misurata dal partecipante.
      ATTENZIONE: Confermare l'occlusione arteriosa completa prima di iniziare il periodo di occlusione perché un'occlusione incompleta può compromettere la risposta iperemica.
5. Mantenere il periodo di occlusione
   1. Mantieni l'occlusione arteriosa in modo continuo per esattamente 3 minuti.
   2. Verifica l'occlusione completa confermando che il segnale LSCI diminuisce fino a un plateau biologico zero (< 10 APU).
      NOTA: Il segnale biologico zero riflette il movimento residuo delle cellule sanguigni indipendentemente dal flusso sanguigno diretto, incluso il moto browniano.
6. Rilascia il bracciale di occlusione
   1. Rilascia istantaneamente la pressione del bracciale utilizzando la valvola di scarico rapido.
   2. Consentire un immediato ripristino del flusso sanguigno per avviare la risposta iperemica reattiva.
7. Registra la risposta iperemica
   1. Continua la registrazione LSCI per almeno 5 minuti dopo il rilascio del bracciale.
   2. Catturare la risposta di picco alla perfusione e il successivo ritorno ai livelli di perfusione di base. Una risposta rappresentativa del PORH è mostrata nella Figura 2B.
8. Quantificare la risposta PORH
   1. Calcola il picco CVC all'interno del software di acquisizione dell'immagine.
   2. Calcola l'area sotto la curva (AUC) del segnale di risposta iperemica utilizzando il software di analisi.

5. Estrazione dei dati e analisi statistica

1. Apri e verifica i dati registrati
   1. Apri i file di acquisizione registrati usando il software di analisi delle immagini.
   2. Verifica che tutti i ROI predefiniti rimangano correttamente posizionati sui corrispondenti siti di misura.
      NOTA: Riposizionare i ROI solo quando artefatti di movimento o deriva di acquisizione compromettono la posizione originale.
2. Definire gli intervalli di analisi
   1. Identificare gli intervalli di analisi specifici sui grafici di perfusione e tendenza CVC.
   2. Seleziona un intervallo basale continuo di 60 s immediatamente prima del primo stimolo vascolare.
   3. Seleziona gli ultimi 30 secondi di ogni intervallo di 60 secondi dopo la stimolazione con iontoforesi per catturare la risposta microvascolare del plateau.
      NOTA: Definire la stabilità di base come un coefficiente di variazione (CV) < il 5% nel segnale di perfusione per minimizzare l'influenza delle oscillazioni vasomotorie e degli artefatti di movimento prima dell'analisi dei dati.
3. Identificare le variabili di risposta PORH
   1. Identificare il segnale biologico zero durante la fase di occlusione arteriosa del protocollo PORH.
   2. Identifica il valore massimo del CVC immediatamente dopo il rilascio della cuffia.
4. Calcola i valori medi degli intervalli
   1. Calcola il valore medio CVC per ogni intervallo di analisi predefinito utilizzando il software di analisi delle immagini.
   2. Verifica l'assenza di artefatti di movimento prima di confermare i valori calcolati finali.
5. Organizza i dati estratti
   1. Esporta o trascrive manualmente i valori medi grezzi di PU e CVC in un foglio di calcolo strutturato.
   2. Organizza il dataset in base ai gruppi di studio e agli stimoli vascolari, inclusi acetilcolina, nitroprusside di sodio e risposte PORH.
      NOTA: Mantieni una denominazione dei file e i codici di identificazione dei partecipanti coerenti durante l'elaborazione dei dati per minimizzare gli errori di trascrizione.
6. Calcolare gli esiti vascolari secondari
   1. Calcolare la percentuale di aumento rispetto ai valori basali di perfusione o CVC per determinare la reattività vascolare.
   2. Calcola l'AUC quando necessario per l'analisi degli endpoint secondari.
7. Eseguire analisi statistiche
   1. Analizza i dati utilizzando un software di analisi statistica.
      NOTA: Includere screenshot rappresentativi o istruzioni di workflow per analisi basate su software come materiale supplementare, quando applicabile.
   2. Valutare la distribuzione dei dati
      1. Valuta la normalità dei dati utilizzando il test di Shapiro-Wilk.
      2. Esprime i dati normalmente distribuiti come media ± deviazione standard (SD).
      3. Esprimi dati non normalmente distribuiti come intervallo mediano e interquartile (IQR).
   3. Confronta le risposte microvascolari
      1. Confrontare i dataset a due gruppi utilizzando un t-test indipendente quando le assunzioni di normalità sono soddisfatte.
      2. Confronta più gruppi usando ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc di Tukey.
   4. Definire criteri di significatività statistica
      1. Definisci la significanza statistica come p < 0,05.
      2. Gestire i dati mancanti causati da artefatti di movimento utilizzando la cancellazione o l'esclusione a coppie dall'analisi interessata.
         NOTA: Applicare la stessa strategia dei dati mancanti in modo coerente in tutti i gruppi di studio per preservare l'integrità analitica.

Results

Un'applicazione riuscita di questo protocollo produce una base stabile seguita da risposte microvascolari chiare e distinguibili a ciascun stimolo vascolare. In un esperimento tecnicamente riuscito, la registrazione di base dimostra un segnale di perfusione stabile con fluttuazioni minime, definito come un DS di < 10% del segnale medio. Durante l'iontoforesi di ACh e SNP, si prevede un aumento graduale dell'APU, riflettendo una vasodilatazione dosodependente. Una risposta PORH di successo è caratterizzata da una rapida riduzione della perfusione a uno zero biologico stabile durante l'occlusione arteriosa, seguita da un picco iperemico acuto immediatamente dopo il rilascio della cuffia, tipicamente raggiungendo valori diversi volte superiori ai livelli basali nei soggetti sani. La Figura 1A illustra l'allestimento sperimentale utilizzato per la valutazione microvascolare cutanea tramite LSCI e iontoforesi. La Figura 1B–1D mostra risposte rappresentative all'iontoforesi e il posizionamento degli elettrodi. La Figura 2A presenta una risposta microvascolare rappresentativa e dosodependente durante l'iontoforesi ACh, mentre la Figura 2B mostra una risposta rappresentativa del PORH.

Le registrazioni subottimali o tecnicamente inefficaci sono comunemente caratterizzate da instabilità del segnale o artefatti legati al movimento. Picchi ad alta frequenza o fluttuazioni improvvise della linea di base tipicamente indicano movimenti del partecipante o una stabilizzazione insufficiente del sistema di supporto a sottovuoto. Una risposta vasodilatatoria ridotta o assente durante l'iontoforesi in un partecipante altrimenti sano indica comunemente un scarso contatto elettrodo-pelle o bolle d'aria intrappolate all'interno della camera degli elettrodi, causando una compromessa della corrente elettrica. La Figura 3 presenta un esempio rappresentativo di una registrazione inaccettabile caratterizzata da instabilità del segnale legata al movimento.

Figura 3. Esempio rappresentativo di registrazione inaccettabile di perfusione microvascolare durante l'iontoforesi. Registrazione rappresentativa del flusso sanguigno microvascolare cutaneo ottenuto tramite LSCI durante l'iontoforesi ACh che dimostra instabilità del segnale e artefatti legati al movimento inadatti all'analisi quantitativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il mancato raggiungimento di uno zero biologico stabile durante la fase di occlusione PORH indica un'occlusione arteriosa incompleta, comunemente causata da una posizione errata della manetta o da una pressione di gonfiaggio insufficiente. In queste condizioni, la risposta iperemica successiva diventa attenuata e inadatta a un'interpretazione affidabile.

I protocolli eseguiti con successo generano curve di perfusione e CVC riproducibili. Il massimale plateau CVC osservato durante l'iontoforesi SNP riflette la capacità vasodilatatoria totale e l'integrità strutturale vascolare, mentre la risposta mediata da ACh riflette principalmente la funzione microvascolare endoteliale dipendente. Il confronto standardizzato di queste risposte vascolari consente di differenziare tra schemi coerenti con la funzione microvascolare preservata e compromessa. Parametri microvascolari quantitativi rappresentativi ottenuti da giovani soggetti sani e pazienti con ipertensione arteriale resistente sono presentati nella Tabella 1.

Parametro microvascolare	Unità	Controlli giovani sani (n = 25)	Pazienti con ipertensione arteriale resistente (n = 50)	p-valore
CVC di base	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
Picco CVC indotto da ACh	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
Picco CVC indotto dagli SNP	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tabella 1: Parametri rappresentativi della reattività microvascolare in giovani soggetti sani e pazienti con ipertensione arteriosa resistente. I valori sono espressi come media ± deviazione standard (SD). I valori p sono stati calcolati utilizzando un test t indipendente per confronti tra gruppi. Abbreviazioni: ACh, acetilcolina; SNP, nitroprusside di sodio; PORH, iperemia reattiva post-oclusiva; CVC, conduttanza vascolare cutanea; APU, unità di perfusione arbitrarie. I dati rappresentano risultati non pubblicati dal laboratorio degli autori.

Discussion

La LSCI fornisce un approccio standardizzato e non invasivo per la valutazione della funzione microvascolare sistemica con alta risoluzione spaziale e temporale. Rispetto alla LDF, che è limitata a misurazioni a singolo punto ed è altamente sensibile all'eterogeneità spaziale della perfusione cutanea, la LSCI consente l'imaging a campo completo e la valutazione simultanea di più ROI. Questa caratteristica migliora sostanzialmente la riproducibilità delle misurazioni e riduce il coefficiente di variazione negli studi microvascolari clinici. Inoltre, la natura senza contatto della LSCI minimizza artefatti di pressione locale comunemente associati alle tecniche basate su sonde, migliorandone l'idoneità per valutazioni ripetute in contesti di ricerca traslazionale e clinica.

Un componente critico di questo protocollo è la normalizzazione dei dati di perfusione su MAP per calcolare la CVC. Poiché la perfusione sanguigna cutanea è fortemente influenzata dalla pressione sistemica di perfusione, l'interpretazione della sola APU grezze può portare a un significativo confondimento, in particolare nelle popolazioni con profili emodinamici alterati come ipertensione o dislipidemia. Per questo motivo, il protocollo raccomanda di riportare sia i valori di PU grezzo sia quelli normalizzati di CVC per migliorare l'interpretazione della funzione microvascolare in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Un altro aspetto critico del protocollo è la rigida stabilizzazione ambientale e dei partecipanti, inclusi il controllo della temperatura ambiente, la minimizzazione degli artefatti di movimento e la posizione standardizzata dei partecipanti, tutti elementi essenziali per ottenere registrazioni riproducibili.

Devono essere considerate anche diverse limitazioni dell'LSCI. La tecnica valuta principalmente la microcircolazione cutanea superficiale a una profondità di circa 0,5–1 mm e quindi potrebbe non rappresentare completamente letti vascolari più profondi. Inoltre, la pigmentazione della pelle e le interferenze della luce ambientale possono influenzare il rapporto segnale-rumore, rafforzando l'importanza dei controlli ambientali descritti in questo protocollo. Un'altra limitazione è l'uso di una singola misurazione MAP di base per il calcolo del CVC durante tutta la procedura. Sebbene la pressione sanguigna sistemica possa fluttuare durante il periodo di registrazione di circa 40 minuti, l'inflazione ripetuta delle cuffie è stata volutamente evitata perché le misurazioni ricorrenti della pressione sanguigna possono indurre attivazione simpatica e artefatti di movimento che interferiscono con il segnale del laser speckle. Studi futuri che integrano il monitoraggio emodinamico continuo e non invasivo potrebbero ulteriormente migliorare l'interpretazione fisiologica delle misurazioni della conduttanza microvascolare.

I passaggi critici del protocollo includono la stabilizzazione ambientale, il controllo del movimento, il posizionamento degli elettrodi e l'occlusione completa dell'arteria durante la PORH. Le registrazioni di base instabili sono comunemente causate da movimenti dei partecipanti o da periodi di riposo insufficienti e possono essere ridotte alla ristabilizzazione del sistema di cuscinetto a vuoto e dall'allungamento del periodo di acclimatazione. Le risposte iontoforetiche attenuate spesso indicano scarso contatto elettrodo-pelle o bolle d'aria intrappolate all'interno della camera di somministrazione; Il riempimento attento della camera e il riposizionamento degli elettrodi generalmente risolvono questi problemi. Il mancato raggiungimento dello zero biologico durante la fase di occlusione PORH di solito riflette un'occlusione arteriosa incompleta causata da un gonfiamento inadeguato della cuffia o da una posizione errata della manetta. In queste condizioni, la risposta iperemica risultante diventa attenuata e inadatta a un'interpretazione affidabile.

L'integrazione di provocazioni fisiologiche e farmacologiche rappresenta un punto di forza importante di questo protocollo, poiché questi approcci valutano gli aspetti complementari della regolazione microvascolare. Il PORH fornisce una valutazione fisiologica integrata della reattività microvascolare che coinvolge i meccanismi muscolari lisci endoteliali, neurogeni e vascolari scatenati da ischemia transitoria e stress di taglio¹⁶. Al contrario, l'iontoforesi consente la valutazione selettiva delle vie vasodilatatrici dipendenti e indipendenti dall'endotelio¹⁵. L'ACh valuta la vasodilatazione mediata dall'ossido nitrico dipendente da base endoteliale, mentre SNP, un donatore diretto di ossido nitrico, valuta la risposta del muscolo liscio vascolare indipendentemente dalla segnalazione^{endoteliale 15}. L'interpretazione comparativa di queste risposte consente di differenziare tra compromissione endoteliale funzionale e rimodellamento microvascolare strutturale. Questa distinzione è particolarmente rilevante nell'invecchiamento, nell'ipertensione resistente, nel diabete e nelle malattie metaboliche croniche, dove una segnalazione endoteliale compromessa e una rarefazione microvascolare possono^{coesistere 14,17}.

In sintesi, questo protocollo LSCI standardizzato fornisce un metodo riproducibile e traslazionalmente rilevante per la valutazione non invasiva della salute microvascolare umana. La combinazione di iontoforesi farmacologica con test fisiologici di ischemia-reperfusione consente una caratterizzazione dettagliata della funzione endoteliale e vascolare strutturale, minimizzando la variabilità sperimentale attraverso una rigorosa standardizzazione ambientale ed emodinamica. Data la sua sensibilità nel rilevare precocemente disfunzioni microvascolari in diversi disturbi cardiovascolari e metabolici, questo approccio rappresenta uno strumento prezioso per la ricerca clinica, il monitoraggio longitudinale e la valutazione terapeutica nella medicina vascolare traslazionale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipaggiamento
Monitor Oscillometrico Automatico BP	Omron Healthcare	HEM-7120	Utilizzato per la valutazione della pressione arteriale media (MAP) di base (3 misure)
Termometro calibrato digitale	Delta OHM	HD2301.0	Accuratezza & plusmn; 0,1 e deg; C per il monitoraggio della temperatura ambiente
Elettrodo dispersivo (di riferimento)	AB Perimica	PF 384	Elettrodo neutro di grande superficie
Elettrodi per la somministrazione del farmaco	AB Perimica	PF 383 / LI 611	Camere di iontoforesi non invasive (circa 80 mm²)
Controller di potenza per iontoforesi	AB Perimica	Sistema di diagnosi microvascolare PeriIont	Controller di corrente a doppio canale (fino a 200 & micro; A)
Sistema di imaging a contrasto con speckle laser (LSCI)	AB Perimica	PeriCam PSI NR	Imager per perfusione del sangue ad alta risoluzione
Cuscino a vuoto di grado medico	AB Germa	N/A	Utilizzato per una posizione stabile dell'avambraccio al livello del cuore
Pompa a vuoto azionata a mano unica	AB Germa	N/A	Utilizzato per l'evacuazione dei cuscini a vuoto
Gonfiatore rapido per polsini	D.E. Hokanson, Inc.	Gonfiatore rapido per polsini E20	Utilizzato per l'occlusione arteriosa standardizzata di 3 minuti
Reagenti e Consumabili
Cloruro di acetilcolina (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Vasodilatatore dipendente da endotelio preparato al 2%
Assorbenti per la preparazione dell'alcol	Becton Dickinson	326895	Assorbenti al 70% di alcol isopropilico per la preparazione della pelle
Acqua deionizzata	Sigma-Aldrich	38796	Utilizzato per il risciacquo finale degli elettrodi
Cloruro di sodio (0,9% soluzione salina)	Fornitore locale	N/A	Solvente per la preparazione dei farmaci e la pulizia della pelle
Nitroprusside Sodio (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Vasodilatatore endotelio indipendente preparato al 2%
Garza sterile	Fornitore locale	N/A	Usato per asciugare la superficie della pelle dopo la pulizia
Software
Software per l'Analisi della Perfusione	AB Perimica	PIMSoft	Software per l'acquisizione dati LSCI e l'analisi del ROI
Software di Analisi Statistica	GraphPad Software	Prisma 10	Utilizzato per l'adattamento della curva dose-risposta e per il calcolo dell'area sotto la curva (AUC)