Questo protocollo dimostra l'ablazione laser transvesical Ho:YAG per creare un modello riproducibile su ratto della fibrosi del collo vescicale, per studiare il rimodellamento fibrotico indotto da lesioni termiche e interventi terapeutici.
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Articolo metodologico
Induzione assistita da laser Holmium:YAG della contrattura del collo della vescica in un modello ratto
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La contrattura del collo della vescica (BNC) è un restringimento fibrotico dell'uscita vescicale, una complicazione difficile dopo la resezione transuretrale della prostata (TURP). I modelli animali esistenti spesso si basano su legatura extravesicale o cauterizzazione chimica, che non riproducono adeguatamente la fibrosi causata da lesioni termiche che si sviluppa dopo la chirurgia endoscopica e possono mostrare una riproducibilità limitata. Qui descriviamo un modello su ratto di fibrosi del collo vescicale, indotta da ablazione transvesicale con laser Holmium:YAG (laser Ho:YAG) del collo vescicale. Dopo una piccola laparotomia della linea medio-inferiore e una cistotomia, una fibra laser Ho:YAG da 200 μm viene introdotta nel lumen della vescica tramite visualizzazione diretta. L'energia laser viene fornita in modalità contatto a 1,0 J e 10 Hz per 5 secondi per punto nelle posizioni 3 e 9 del collo della vescica, corrispondenti a 50 J per punto e 100 J per animale. Quattro settimane dopo, gli animali trattati sviluppano grossolano ingrossamento della vescica, restringimento del collo, ispessimento della parete vescicale e evidenze istologiche di rimodellamento fibrotico, inclusi un aumento della deposizione di collagene e una maggiore espressione di collagene di tipo I e III. Questo protocollo fornisce un modello pratico che imita cicatrici localizzate indotte da lesioni termiche all'uscita della vescica. Poiché si utilizzano ratti femmine e nel presente studio non sono stati effettuati test urodinamici funzionali, il modello è più adatto allo studio della fibrosi del collo vescicale e al rimodellamento strutturale piuttosto che alla riproduzione completa del BNC maschio dopo l'intervento prostatico. Il modello può essere utile per studiare i meccanismi fibrotici della BNC e per la valutazione preclinica di interventi antifibrotici o ricostruttivi.
Introduzione
La contrattazione del collo della vescica (BNC) è un restringimento fibrotico del collo vescicale, che si verifica comunemente dopo procedure transuretrali, in particolare la TURP 1,2,3. La sua base patologica è la formazione eccessiva di cicatrici e la deposizione di collagene dopo lesioni tissutali e guarigione anomala della ferita 4,5,6. Poiché la BNC può portare a disfunzioni persistenti della miccione, interventi ricorrenti e morbilità sostanziale, è necessario un modello sperimentale riproducibile per indagare la sua patogenesi eil trattamento 7.
Diversi modelli animali sono stati utilizzati per studiare l'ostruzione dell'uscita della vescica o la fibrosi periuretrale, inclusa la legatura extravesicale dell'uretraprossimale 8 e altri approcci chirurgiciaperti 9. Sebbene questi modelli possano indurre ostruzione urinaria e ipertrofia del detrusore, non riproducono specificamente la lesione termica localizzata che si ritiene inizi la BNC postoperatoria dopo un intervento endoscopico. Inoltre, il bersaglio anatomico e il grado di lesione sono spesso difficili da standardizzare, il che può aumentare la variabilità tra animali.
Un modello ideale legato al BNC dovrebbe soddisfare tre criteri: dovrebbe colpire il collo anatomico della vescica, riprodurre lesioni termiche controllate simili a quelle prodotte dai dispositivi energetici endoscopici e generare in modo affidabile un restringimento fibrotico con complessità chirurgica accettabile. Per rispondere a queste esigenze, abbiamo sviluppato un protocollo laser transvesical Ho:YAG su ratti femmine. Sono state selezionate le femmine per facilitare l'esposizione chirurgica e per isolare lesioni termiche specifiche del collo della vescica e rimodellamento fibrotico senza interferenze del tessuto prostatico. Utilizzando la visualizzazione intravesicale diretta, questo metodo consente una consegna accurata dell'energia laser alla mucosa e alla mucosa del collo della vescica, e produce un restringimento fibrotico riproducibile dell'uscita vescicale.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Comitato Etico per il Benessere Animale Sperimentale dell'Istituto di Medicina Tradizionale Cinese di Pechino (Approvazione n. BJTCM-R-2025-03-02). Gli animali venivano ospitati in condizioni standard con accesso ad libitum a cibo e acqua. Nel protocollo attuale sono stati utilizzati un totale di 16 ratti, inclusi 8 ratti nel gruppo di controllo senza intervento chirurgico e 8 ratti nel gruppo trattato con laser Ho:YAG. Due animali del gruppo trattato con laser Ho:YAG sono morti postoperatoriamente. Non sono stati esclusi altri animali a causa di perforazioni, sanguinamenti gravi o induzione del modello fallita.
1. Preparazione preoperatoria
- Preparare meloxicam di grado farmaceutico per analgesia perioperatoria (Figura 1A), il sistema di anestesia per inalazione di piccoli animali (Figura 1B), il sistema laser Ho:YAG con fibra laser da 200 μm (Figura 1C), strumenti microchirurgici sterili (Figura 1D), 8-0 Suture intrecciate assorbibili (acido poliglicolico rivestito, PGA) per la chiusura della cistotomia, suture idroassorbibili di poliglattina 910 intrecciate 4-0 per la chiusura della pelle, soluzione salina sterile, tende sterili, cotton cotton fiancs sterili e lubrificante sterile (Figura 1E).
- Indurre l'anestesia con isoflurano al 3%–4% in ossigeno in una camera di induzione e mantenere l'anestesia con 1,5%–2,5% di isoflurano attraverso un cono nasale durante l'intervento.
- Regolare la concentrazione in base alla frequenza respiratoria e al protocollo istituzionale approvato per animali. Confermare una profondità anestetica adeguata assenza del riflesso di pizzicare prima dell'incisione e rivalutare la profondità anestetica durante tutta la procedura.
- Taglia il pelo ampiamente dalla parte bassa dell'addome in modo che il drappeggio copra il pelo residuo e impedisca il contatto tra strumenti e peli non tagliati.
- Disinfettare il campo chirurgico con scrub alternati povidone-iodio e alcol isopropilico al 70%; esegui tre applicazioni di ciascuna soluzione prima di drappeggiare.
- Posiziona l'animale in posizione supina su una borsa riscaldante impostata a 37 °C e mantieni condizioni sterili per tutta la procedura.
- Se è necessario un riempimento della vescica o l'identificazione intraoperatoria del collo della vescica, lubrificare un piccolo catetere uretrale sterile o una cannula con lubrificante sterile, inserirlo delicatamente attraverso il meato uretrale nella vescica e instillare lentamente soluzione salina sterile. Evita inserimenti forzati o riempimenti eccessivo. Rimuovere o fissare il catetere in base all'esposizione chirurgica prevista.
2. Esposizione della vescica
- Eseguire un'incisione cutanea di 3–4 cm nella linea media inferiore in condizioni sterili (Figura 2A).
- Utilizzando pinze a punta fine e microforbice, si divide il tessuto sottocutaneo e si apre la linea alba per entrare nella cavità peritoneale.
- Esternizzare delicatamente la vescica urinaria con le pinze atraumatiche (Figura 2B).
- Identifica il collo della vescica come la giunzione tra la base della vescica e l'uretra prossimale.
- Posizionare una sonda smussata sotto il collo della vescica per fornire un supporto delicato e stabilizzare l'area bersaglio (Figura 2C).
3. Ablazione laser trasvesicale Ho:YAG
- Dilata la vescica con soluzione salina sterile finché la parete vescica non diventa moderatamente tesa. Evitare la distensione eccessiva, che potrebbe oscurare i punti di riferimento anatomici o aumentare la tensione nel sito della cistotomia.
- Realizzare una cistotomia longitudinale di 0,5 cm sulla cupola anteriore della vescica utilizzando microforbici fini (Figura 2D).
- Introdurre la fibra laser Ho:YAG preparata da 200 μm attraverso la cistotomia nel lumen della vescica.
- Avanza la fibra con visualizzazione diretta verso il collo della vescica.
- Posiziona delicatamente la punta della fibra in contatto diretto con la mucosa del collo della vescica. Mantenere la modalità contatto senza incavazioni visibili del tessuto; Assicurati che la distanza tra la punta e il tessuto sia di circa 0 mm durante tutta la somministrazione dell'energia.
- Fornire energia laser a 1,0 J e 10 Hz per 5 secondi alla posizione delle 9 (Figura 3A) e ripetere alla posizione delle 3 (Figura 3B). Questa impostazione fornisce 50 J per punto e 100 J per animale, con una potenza fissa a 10 W per tutti gli animali.
NOTA: Un'ablazione riuscita è indicata da uno sbiancamento uniforme della mucosa e dalla formazione di un cratere poco profondo da mucosa a submucosa senza carbonizzazione. - Mantieni la fibra stabile durante i 5 secondi di applicazione ed evita di spingere la fibra contro il muro. Evitare la formazione di crateri profondi o perforazioni a spessore completo. Non indirizzare la fibra verso gli orifizi ureterali o l'uretra distale.
- Rimuovere la fibra e irrigare il lumen della vescica con soluzione salina sterile per rimuovere i detriti e confermare l'emostasi.
- Chiudi la cistotomia con 2–3 8-0 interrotte Suture intrecciate assorbibili (rivestito PGA) in modo impermeabile.
- Riempire nuovamente la vescica con 0,5–1,0 mL di soluzione salina sterile per confermare l'assenza di perdite dalla linea di chiusura (Figura 3C).
- Chiudi la parete addominale e la pelle a strati (Figura 3D).
4. Cure post-operatorie
- Tieni il topo su una borsa riscaldante finché non si è completamente ripreso dall'anestesia.
- Somministrare meloxicam a 1 mg/kg per via sottocutanea per analgesia post-operatoria e continuare una volta al giorno per 1–3 giorni, o secondo il protocollo animale approvato.
- Monitorare l'animale quotidianamente per almeno 7 giorni per segni di dolore, disagio, ematuria, ritenzione urinaria, deiscenza della ferita o infezione.
- Fornire supporto all'idratazione e cibo ammorbidito quando necessario durante il primo periodo di recupero.
5. Valutazione della contrattura del collo della vescica
- Lascia che gli animali si riprendano per 4 settimane dopo l'intervento per permettere il rimodellamento fibrotico al collo della vescica.
- Al punto finale sperimentale, si sopporta l'eutanasia degli animali utilizzando un'overdose di pentobarbital sodio (150 mg/kg, intraperitoneale) o un altro metodo approvato dal protocollo istituzionale sugli animali, e confermare la morte prima del prelievo dei tessuti. Preleva la vescica, il collo e l'uretra prossimale in blocco.
- Apri il campione longitudinalmente e fotografa il collo della vescica per documentare il restringimento grossolano.
- Fissare il tessuto con paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore, disidratare tramite etanolo graduato, trasparentare nello xilene, inserire nella paraffina e ottenere sezioni trasversali seriali di 4 μm attraverso la regione del collo della vescica.
- Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina, tricromo di Masson e rosso picrosirius secondo i protocolli istologici standard o le istruzioni del produttore per valutare il restringimento del lume, l'ispessimento della parete del collo della vescica e la deposizione di collagene.
- Per l'immunoistochimica, deparafinizzare sezioni, eseguire il recupero di antigeni, bloccare la perossidasi endogena e il legame aspecifico, incubare sezioni con anticorpi contro il collagene di tipo I e il collagene di tipo III, applicare l'anticorpo secondario appropriato, sviluppare con cromogeno e controcolorare con ematossilina.
NOTA: Gli anticorpi sono diluiti secondo le raccomandazioni del produttore. - Quantificare l'area del lumen e l'area positiva al collagene utilizzando ImageJ/Fiji o software di analisi delle immagini equivalenti.
- Calibra la scala pixel-micrometro usando la barra della scala del microscopio, delinea manualmente la zona di interesse del lumen del collo e del tessuto della vescica e misura l'area del lume.
- Per la colorazione tricroma di Masson, applica una soglia di colore costante per identificare i pixel positivi al collagene blu nella regione di interesse.
- Calcola la frazione dell'area positiva al collagene come area positiva al collagene divisa per l'area totale del tessuto.
- Effettuare misurazioni su sezioni e campi comparabili di ciascun animale e analizzare le immagini in modo cieco.
NOTA: L'induzione del modello di successo è supportata dal restringimento grossolano della bocca urinaria insieme a evidenze istologiche di fibrosi concentrica e aumento della deposizione di collagene nel sito della lesione. Il tasso di successo operativo era di 6/8 nel gruppo trattato con laser Ho:YAG, basato sullo sviluppo del fenotipo macroscopico e istologico atteso.
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Risultati
Quattro settimane dopo l'intervento, i ratti trattati con laser Ho:YAG hanno mostrato cambiamenti macroscopici e istologici riproducibili compatibili con un restringimento fibrotico del collo della vescica. In questo studio, il gruppo di controllo senza intervento chirurgico includeva 8 ratti, mentre il gruppo trattato con laser Ho:YAG includeva 8 ratti. 6 su 8 animali trattati svilupparono il fenotipo atteso; l'attrito è stato costituito da 2 morti postoperatorie nel gruppo trattato con...
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Discussione
In questo studio, abbiamo stabilito un modello di restringimento fibrotico del collo della vescica su ratto utilizzando l'ablazione laser Ho:YAG transvesicale. Il punto di forza principale di questo metodo è che produce una lesione termica controllata al collo anatomico della vescica, seguita da un progressivo rimodellamento fibrotico. Questo differisce dai modelli tradizionali di legatura extravesicale, che generano principalmente ostruzioni tramite compressione esterna piuttosto che fo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 82474255 per l'H.R.) e dal Programma di Ricerca dell'Amministrazione della Provincia dell'Hebei della MTC (B2025018 per l'H.R.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sutura intrecciata assorbibile (rivestita PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, Cina | R831 | |
| Anticorpo anti-collagene I, monoclonale di topo | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Cina | 66761-1-Ig | |
| Anticorpo anti-collagene III, monoclonale di topo | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Cina | 68320-1-Ig | |
| Sutura Vicryl Plus rivestita (poliglactica 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | Aguja de media punta circular SH 26 mm ½; violeta trenzada; absorbible; Lote: RLMCJX |
| Kit di colorazione ematossilina ed eosina (HE) | Servicebio, Wuhan, Cina | 2310005 | |
| Sistema laser Holmium-YAG (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italia | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, fibra da 200 μm |
| Anticorpo secondario anti-IgG di capra coniugato con HRP | Boster, Wuhan, Cina | BA1050 | |
| Isoflurano | RWD | 2025010601 | |
| Kit di colorazione tricromica di Masson | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, Cina | BA4079B | |
| Iniezione di meloxicam | Qilu Animal Health, Shandong, Cina | E135H003 | |
| Paraformaldeide (4%) | Servicebio, Wuhan, Cina | 2510H0070148 | |
| Kit di colorazione Picrosirius red | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, Cina | 20250228 | |
| Catetere intravenoso di sicurezza, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, Cina | AD4-240827 | |
| Sistema di anestesia per inalazione per piccoli animali | RWD Life Science, Shenzhen, Cina | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Indurre con 3%–4% di isoflurano in ossigeno |
Riferimenti
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