Condivisione dell'esperienza sulla sopravvivenza a lungo termine in un modello di trapianto di fegato di ratto non arteriolato

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo presentato è condividere un'esperienza chirurgica ottimizzata per stabilire un modello di trapianto epatico di ratto non arterio, concentrandosi in particolare su perfezionamenti tecnici che garantiscano la sopravvivenza a lungo termine degli animali oltre i 100 giorni.

Abstract

Nel trapianto sperimentale di fegato, il modello del ratto è il punto di riferimento per l'analisi dell'immunologia del trapianto e dei processi metabolici; tuttavia, ricostruire l'arteria epatica estremamente fine (~0,5 mm) rappresenta una sfida tecnica formidabile. Per aggirare questo problema, il modello semplificato di trapianto epatico di ratto non arteriato (NArLT) è ampiamente utilizzato. Purtroppo, gravi complicazioni biliari — come perdite biliari e colangite ischemica — derivanti dalla privazione arteriosa spesso limitano la sopravvivenza a lungo termine dei riceventi. Questo ostacolo limita significativamente la ricerca su argomenti chiave, tra cui l'immunocompatibilità a lungo termine tra ospite e innesto e il rigetto cronico. In questo caso, presentiamo un protocollo ottimizzato per il modello NArLT che incorpora perfezionamenti tecnici critici per superare con successo queste lesioni biliari ischemiche. I miglioramenti chiave includono una fase anepatica significativamente accorciata, una tecnica di dissezione biliare "no-touch", un lavaggio completo delle vie biliari e un metodo ottimizzato di stent biliare interna. Dopo l'implementazione di questa procedura migliorata, il tasso di sopravvivenza dei riceventi ha superato il 94% durante il periodo di osservazione di 100 giorni. In definitiva, questo protocollo ottimizzato fornisce una piattaforma altamente riproducibile e robusta per indagare i meccanismi alla base della tolleranza al trapianto a lungo termine, supportando così lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche nella medicina del trapianto.

Introduzione

Il modello di trapianto di fegato di ratto rappresenta la piattaforma sperimentale più ampiamente utilizzata per la ricerca di base sui trapianti. Tuttavia, la sua applicazione più ampia è spesso ostacolata da una curva di apprendimento notoriamente ripida, che può ostacolare significativamente il progresso degli studi sperimentali a^{valle 1,2}. Inoltre, i modelli convenzionali di trapianto epatico di ratto spesso soffrono di un successo chirurgico subottimale e di bassi tassi di sopravvivenza a lungo termine. Snellendo in modo critico le procedure chirurgiche, affinando meticolosamente i dettagli operatori ed eseguendo ricostruzioni vascolari e biliari sotto visualizzazione diretta, la curva di apprendimento associata a questo complesso modello microchirurgico può essere sostanzialmente^{abbreviata 3,4}. Il trapianto di fegato rimane l'unica terapia curativa per le malattie epatiche in fase terminale, rendendo l'istituzione di modelli di trapianto epatico di ratto profondamente significativa per la ricerca^{scientifica 5,6}.

Il modello di trapianto epatico di ratto non arteriato (NArLT) offre vantaggi significativi nella chirurgia sperimentale: evita la formidabile sfida dell'anastomosi arteriosa microvascolare, accorcia il tempo chirurgico complessivo e riduce la durata dell'anestesia per i ratti. Nonostante la privazione dell'apporto sanguigno arterioso, la risposta biliare risultante in questo modello offre una prospettiva unica per indagare le lesioni biliari ischemiche. Tuttavia, i modelli convenzionali NArLT sono associati a un alto tasso di complicanze biliari postoperatorie fino al 30^{%, il} che compromette gravemente la sopravvivenza a lungo termine. Nel tradizionale modello classico di trapianto di fegato di ratto, il tasso di sopravvivenza a lungo termine del ricevente è inferiore al 70%–85%^8. Per affrontare questo problema, questo studio introduce un protocollo ottimizzato che utilizza uno stent biliare molle trattato con eparina. Utilizzando una tecnica di dissezione biliare "no-touch" per massimizzare la conservazione della rete microvascolare permiziare, insieme a un lavaggio birare completo tramite perfusione fredda, questo approccio mira a mitigare fondamentalmente le complicazioni biliari attraverso supporto fisico e protezione^{ischemica 9,} fornendo infine una base solida e stabile per un monitoraggio immunologico a lungo termine.

Pertanto, massimizzare i tassi di successo procedurali e prolungare la sopravvivenza del ricevente rappresentano gli obiettivi principali di qualsiasi innovazione tecnica nel trapianto di fegato di ratto. Raggiungere questi obiettivi è un prerequisito fondamentale per garantire la progressione tempestiva e ininterrotta della ricerca sperimentale a^{valle 10}.

Protocollo

Tutti gli esperimenti e gli interventi chirurgici sugli animali presenti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico Sperimentale sugli Animali dell'Università di Qingdao (n. 20260301SD5020260401065). Fai tutti i tuoi sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.

1. Preparazione preoperatoria

1. Animali sperimentali
   1. Utilizzare come donatori maschi adulti di Sprague–Dawley (SD), di età compresa tra 8 e 10 settimane e dal peso di 220–250 g. Assicurati che il peso del ricevente sia leggermente superiore a quello del donatore, con una differenza entro 50 g.
   2. Ratti domestici in condizioni specifiche prive di patogeni a una temperatura controllata di 22°C ± 2°C e umidità relativa del 50% ± 10%.
   3. Mantieni un ciclo chiaro/buio di 12 ore con una densità di gabbia di 2–3 ratti per gabbia.
   4. Fornisci una dieta standard da laboratorio per roditori. Permettere ai ratti di acclimatarsi all'ambiente di laboratorio per almeno una settimana prima dell'intervento chirurgico.
   5. Animali rapidi per 12 ore prima dell'intervento. Consentire l'accesso ad libitum all'acqua.
      NOTA: Il digiuno prima dell'intervento aiuta a minimizzare il rischio di aspirazione durante l'anestesia e previene la dilatazione gastrica che può compromettere la funzione respiratoria e ostruire l'esposizione chirurgica.
2. Strumenti e materiali chirurgici
   1. Utilizzare gli strumenti necessari per la chirurgia di trapianto come mostrato nella Figura 1. Elenca i dettagli dei consumabili utilizzati nell'intervento nella Tabella dei Materiali.
   2. Seleziona le guaine epidurali 5F e 6F abbinando il diametro esterno dei cateteri ai diametri fisiologici interni dei vasi target nei ratti SD maschi che pesano 220–250 g.
   3. Usa una guaina 5F (circa 1,67 mm) per la vena porta (PV). Utilizzare una guaina 6F (circa 2,00 mm) per la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC).
      NOTA: Selezionare la dimensione del catetere basandosi su una combinazione di standard anatomici e stima visiva intraoperatoria al microscopio chirurgico. Effettuare un confronto in tempo reale tra il diametro esterno del catetere e il lumen interno del recipiente bersaglio. Si ottiene una corrispondenza adeguata quando il catetere occupa circa il 70%–80% del lumen del vaso, permettendo un inserimento fluido senza allungare troppo la parete del vaso o lasciare un gioco eccessivo. Per i ratti SD entro l'intervallo di peso specificato, possono essere utilizzati diametri anatomici predefiniti dei vasi per la selezione iniziale della dimensione, che dovrebbero essere regolati intraoperatoriamente in base alla variazione individuale. Gli operatori dovrebbero stabilire questa corrispondenza vaso-catetere attraverso una formazione microchirurgica precedente.
   4. Per i ratti SD di età compresa tra 8 e 10 settimane, si selezionano guaine epidurali 5F e 6F come cuffie rispettivamente per PV e IHIVC (Figura 2A).
   5. Preparare polsini con una lunghezza funzionale totale (corpo tubolare) di 2,0–2,5 mm. Mantenere una lunghezza di estensione di 3,0–4,0 mm per la maneggevolezza con la pinza.
   6. Clampare la parete del bracciale con le mascelle delle pinze antizanzara per creare una scanalatura circonferenziale situata a circa 0,5–1,0 mm dal bordo prossimale della manetta (vedi Figura 2A per i dettagli). Mantenere una profondità della scanalatura di circa 0,1–0,2 mm per facilitare un nodo sicuro e la successiva fissazione.
   7. Assicurati che la scanalatura impedisca che la legatura di fissaggio 7-0 scivoli dalla superficie rigida del catetere.
   8. Taglia un catetere endovenoso da 22G per creare uno stent biliare con estremità inclinate o smussate. Assicurati di avere una lunghezza di 5–7 mm.
   9. Preferisco una lunghezza di stent di 7 mm. Regolare la lunghezza in base alla variazione anatomica usando il livello orizzontale della vena gastrica destra come punto di riferimento. Stima la distanza da questo punto di riferimento all'hilo epatico per guidare la selezione della lunghezza dello stent.
   10. Accorciare lo stent (a circa 5–6 mm) se la distanza stimata è limitata o se si riscontra resistenza durante l'inserimento. Assicurati che circa 2–3 mm dello stent possano essere inseriti nel dotto biliare senza piegamenti, pieghe o sporgenza.
   11. Immergi lo stent in soluzione salina eparinizzata (100 IU/mL) a temperatura ambiente (23°C ± 2°C). Mantenere lo stent immerso per almeno 30 minuti prima dell'uso per prevenire la coagulazione biliare intraluminale all'inserimento nel lumen biliare del donatore (Figura 2A).
       NOTA: Prepara la manetta prima dell'intervento e usa le pinze antizanzara per creare scanalature nella parete del manciale, facilitando il nodo e la fissazione dopo una canulazione riuscita. Assicurati che le estremità dello stent biliare tagliato non siano eccessivamente affilate per prevenire la perforazione dei dotti biliari. Al microscopio chirurgico (ingrandimento 10×–16×), confermare che il bordo tagliato sia pulito e privo di bave plastiche frastagliate; Se la punta sembra a forma di ago, smussata leggermente con microforbici. Durante la manipolazione, usa solo micro-pinze fini e non dentite per gestire lo stent. Evitare di applicare una forza esterna eccessiva, come indicato da appiattimento, ovalizzazione o piegatura del lumen dello stent; Scartare e sostituire eventuali stent deformati, poiché il restringimento luminale aumenta il rischio di complicazioni biliari post-operatorie.

Figura 1. Strumenti chirurgici utilizzati nella procedura di trapianto. (A) Bacinella in acciaio inox per reni. (B) Porta-aghi per micro-aghi. (C) Micro-forbici. (D) Micro-pinze (dritte e curve). (E) Clip microvascolari e piccole pinze da bulldog stile zanzara. (F) Portaago standard. (G) Pinze emostatiche dritte (pinze per zanzare). (H) Pinza vascolare. (I) Forbici chirurgiche standard. (J) Elastico (realizzato con il polsino di un guanto chirurgico sterile). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Manette chirurgiche su misura, stent biliare e incisioni addominali pianificate. (A) Preparazione delle cuffie vascolari e dello stent biliare insieme a un righello millimetrico. Da sinistra a destra: una guaina epidurale 6F utilizzata per la cuffia della vena cava inferiore infraepatica (IHIVC), una guaina 5F per la cuffia della vena porta (PV) e uno stent biliare di 5–7 mm ritagliato da un catetere endovenoso 22G. (B) Un'incisione crociata segnata sull'addome del ratto donatore per massimizzare l'esposizione chirurgica. (C) Incisione standard per laparotomia mediana segnata sull'addome del ratto ricevente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Operazione con donatore

1. Primi passi
   1. Anestetizzare il ratto donatore usando isoflurano al 5% con un flusso d'aria di 1 L/min nella camera di induzione. Valuta la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di movimenti spontanei degli arti e riflesso di astinenza.
      NOTA: La profondità dell'anestesia viene valutata osservando l'assenza di movimenti spontanei degli arti, l'assenza di riflesso di astinenza e la frequenza respiratoria. Per garantire il progresso fluido e sicuro dell'intervento, questi parametri vengono rigorosamente rivalutati ogni 20 minuti durante l'intera procedura.
   2. Somministrare il pentobarbital all'1% (40–45 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale nella parte inferiore destra dell'addome, circa 1–2 cm lateralmente alla linea media (linea alba) e 1–2 cm cranico al legamento inguinale destro. Conferma un'anestesia adeguata pizzicando la zampa posteriore e assicurandoti che non ci sia riflesso di astinenza.
   3. Posizionare il ratto donatore in posizione supina su un cuscinetto riscaldante a 37°C per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento.
   4. Radela l'area chirurgica addominale. Disinfetta l'area con povidone-iodio tre volte.
2. Procedure prima della perfusione epatica
   1. Effettuare un'incisione crociata, che si estende fino al processo xifoide, verso la simfisi pubica e lateralmente fino alla linea ascellare mediana per massimizzare l'esposizione del campo chirurgico (Figura 2B).
      NOTA: Esegui la laparotomia in due strati. Prima incisi la pelle e il tessuto sottocutaneo. Poi tenda la linea alba con una pinza e fai una piccola incisione iniziale per permettere l'ingresso dell'aria, facendo cadere le visceri. Estendi l'incisione con forbici mantenendo la lama inferiore parallela alla parete addominale per prevenire lesioni agli organi.
   2. Avvolgi l'intestino con garze imbevbite di soluzione salina. Posizionale sul campo operatorio sterile sul lato sinistro dell'addome per esporre l'area operatoria.
      NOTA: È fondamentale mantenere un'umidità continua dell'intestino eviscerato per tutta la durata della procedura per prevenire la disidratazione ischemica e l'ipotermia. Reidrata periodicamente la garza di copertura applicando gocce di soluzione salina normale calda (37°C) circa ogni 10–15 minuti, o immediatamente quando la garza inizia ad asciugarsi sotto l'illuminazione chirurgica.
   3. Dividere il legamento falciforme. Clampare e retraere il processo xifoide in modo cranico per esporre la VCI supraepatica (SHIVC) e la vena frenica inferiore sinistra.
   4. Dividere il legamento triangolare sinistro. Lega la vena frenica sinistra vicino allo SHIVC usando un 7-0 o 8-0 Sutura (Figura 3A).
      NOTA: Quando si lega la vena frenica inferiore sinistra, posizionare la legatura vicino allo SHIVC. Tieni presente che l'ago per sutura può facilmente perforare il diaframma e causare pneumotorace; Sutura vicino al vaso sanguigno.
   5. Si raccomanda l'elettrocauterizzazione per la divisione dei vasi per raggiungere un'emostasia rapida e ridurre i tempi operatori, migliorando così la consistenza procedurale e la riproducibilità.
      NOTA: L'elettrocauterizzazione standardizza l'emostasi, riduce i tempi operatori e migliora la riproducibilità tra gli operatori.
   6. Mobilitare i lobi caudati e papillari (Figura 3B).
   7. Usa forcette microscopiche per rimuovere il tessuto adiposo e connettivo dalla superficie dell'IHIVC.
      NOTA: Rimuovere il tessuto connettivo finché la parete del vaso non appare liscia e traslucida. Si ottiene un'esposizione adeguata quando le pinze vascolari possono essere applicate senza interferenze e non resta tessuto residuo che possa compromettere il cuffia o la sutura.
   8. Lega la vena surrenale destra a lavaggio con l'IHIVC. Isola la vena renale destra e legala fino a farla infilare con l'IHIVC.
   9. Continuare a dissezionare l'IHIVC caudalmente fino a un livello appena sopra la vena renale sinistra (Figura 3C).
      NOTA: Assicurarsi che l'IHIVC sia completamente scheletizzato (separare i vasi sanguigni il più possibile dal tessuto connettivo adiposo) durante la dissezione. Questo facilita successive procedure di esplantatione epatica e di attacco della manetta.
   10. Solleva delicatamente il fegato usando uno cotton fioc. Dissezionare gli attacchi ligamentari tra il lobo epatico inferiore destro e il retroperitoneo.
       NOTA: Identificare lo SHIVC come un vaso bluastro corto, largo e dalle pareti sottili situato al polo epatico superiore. Fermare la dissezione una volta che la superficie anteriore è stata liberata e le fibre diaframmatiche adiacenti diventano visibili.
   11. Fermare la dissezione al raggiungimento dello SHIVC.
       NOTA: Maneggiare il fegato con estrema attenzione per prevenire lesioni parenchimanti. Esercitare attenzione per proteggere la IVC durante la dissezione retroperitoneale cranica.
   12. Dissezionare il tessuto connettivo tra il PV e il AH corretto. Isola il PV.
   13. Lega la vena gastrica destra (vena pilorica) a lavaggio con la PV. Continuare la dissezione fino alla radice della vena splenica.
   14. Espone la porta epatis. Identifica il tessuto connettivo adiposo simile a un cordone situato a sinistra della PV, che racchiude il dotto biliare comune (CBD) e l'AH.
   15. Effettuare un'incisione a "V" sulla parete anteriore del CBD, 3–5 mm distale rispetto alla biforcazione del dotto epatico.
   16. Usa microforceps per tenere lo stent biliare. Inserire lo stent di circa 3 mm nel tratto biliare mantenendo l'allineamento parallelo con il condotto.
       NOTA: Avanza lo stent in modo fluido senza resistenza. Assicurati di evitare rigonfiamenti laterali, angolazioni o tende sulle pareti dei condotti. Se si verifica resistenza o deformazione, ritirarsi e riallineare prima della reinserzione.
   17. Fissa lo stent con una cravatta di seta 7-0 circonferenziale. Lega l'HA al livello dell'incisione e tranciala prossimalmente (Figura 3D).
       NOTA: Evitare rigorosamente un'eccessiva "scheletizzazione" durante la dissezione del CBD donatore. Preservare il tessuto connettivo peribiliare, i plessi nervosi e le reti microvascolari per favorire la circolazione collaterale precoce e la guarigione biliare post-operatoria. Poiché l'estremità distale del dotto donatore è la regione più ischemica, mantenere il sito anastomotico vicino all'ilo epatico per minimizzare il carico ischemico.
3. Perfusione epatica
   1. Esponi l'aorta addominale. Inserire un ago per vene del cuoio capelluto calibro 23 (23 G) collegato a una siringa da 20 mL riempita con soluzione fredda (4°C) dell'Università del Wisconsin (UW).
      NOTA: Inserire l'ago nell'aorta addominale con un angolo ridotto (15°–20°). Confermare l'ingresso osservando il flashback del sangue arterioso, poi avanzare leggermente e allineare l'ago parallelo al vaso per prevenire la perforazione della parete posteriore.
   2. Rimuovi l'aria dalla siringa prima dell'infusione. Pinza e sistema l'aorta addominale e l'ago usando una pinza vascolare.
      NOTA: Rimuovere tutta l'aria dalla siringa picchiettando per rimuovere le bolle ed espellendo il liquido finché non è visibile una goccia continua alla punta dell'ago. Conferma l'assenza d'aria nel mozzo dell'ago prima della cannulazione.
   3. Iniziare lentamente la perfusione premendo manualmente la siringa a una velocità costante di 3–3,5 mL/min (Figura 3E).
      NOTA: Confermare la corretta posizione intravascolare osservando il ritorno del sangue nel tubo.
   4. Incisi il diaframma. Espone completamente la VCI toracica e l'aorta toracica.
   5. Clampa la VCI toracica alla sua giunzione con l'atrio destro, insieme all'aorta toracica, utilizzando pinze vascolari.
   6. Trasetta la VCI toracica immediatamente sotto la pinza per permettere l'efflusso di perfuso.
      NOTA: Applicare la pinza il più possibile in modo cranico e trasettare sotto di essa per preservare la lunghezza del vaso. Inizia subito la perfusione per prevenire la coagulazione e preservare la qualità dell'innesto.
   7. Continuare la perfusione a un ritmo costante (3–3,5 mL/min) fino a un volume totale di circa 40 mL.
   8. Interrompere la perfusione una volta che il parenchima epatico diventa completamente pallido (marrone-giallastro) (Figura 3F).
      NOTA: Una perfusione adeguata viene confermata quando il fegato diventa uniformemente pallido (marrone-giallastro) e l'effluente dell'IHIVC intersectato è trasparente, senza residui di sangue.
   9. Trasetta l'IHIVC con la vena renale sinistra. Trancetta la PV al livello della vena splenica.
      NOTA: Evitare iniezioni rapide o energiche di perfuso per prevenire lesioni endoteliali e parenchimate.
   10. Ingrandire l'incisione diaframmatica. Preleva l'innesto epatico in blocco con il diaframma attaccato.
   11. Inserire l'innesto in una piastra di Petri sterile contenente una soluzione fredda di conservazione UW.
   12. Mantieni l'innesto in soluzione fredda di UW a 4°C. Trapianto completo entro 2 ore dall'acquisto.

Figura 3. Passaggi chirurgici chiave durante la mobilizzazione del fegato donatore e la perfusione in situ. (A) Esposizione e legatura della vena frenica inferiore sinistra. (B) Isolamento e divisione dei rami comunicanti epato-esofagei. (C) Dissezione dell'IHIVC, dimostrazione della legatura delle vene surrenale destra e renale destra. (D) Inserimento dello stent biliare personalizzato nel dotto biliare comune (CBD) utilizzando la tecnica "no-touch" per preservare il tessuto connettivo peribile. (E) Cannulazione dell'aorta addominale per iniziare una perfusione fredda in situ. (F) Fegato del donatore completamente perfuso che mostra un aspetto uniformemente pallido, indicando un risuccesso di lavaggio del sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione dell'innesto ex vivo

NOTA: Eseguire tutta la preparazione ex vivo dell'innesto su ghiaccio (Figura 4A). Mantieni l'innesto in soluzione UW a 4°C ± 2°C e monitora periodicamente la temperatura per garantire un'adeguata conservazione a freddo.

Figura 4. Preparazione ex vivo dell'innesto di fegato donatore. (A) L'innesto epatico prelevato è posto in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fredda di conservazione UW, posizionato su ghiaccio tritato per mantenere l'ipotermia. (B) Cuffia del donatore PV tramite eversione su un bracciale personalizzato e fissazione con una legatura circonferenziale. (C) Completa preparazione della cuffia per PV e IHIVC, con lo stent biliare in posizione. (D) Preparazione della VCI supraepatica (SHIVC) con suture a sstay posizionate su entrambi gli angoli laterali per facilitare l'anastomosi successiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del braccino PV
   1. Afferra la coda del bracciale PV con le pinze antizanzara e fissala in modo che la coda sia rivolta verso il basso, perpendicolare al fondo della piastra di Petri.
   2. Fai passare la micropinza attraverso il lumen del bracciale. Tira il PV attraverso il bracciale.
   3. Regola la parete anteriore del PV. Evert circa 3 mm della parete del vaso sopra l'estremità svasata della coda a polsetto.
   4. Fissare il vaso evertito alla parete esterna del polsino usando una cravatta di seta circonferenziale 7-0 (Figura 4B).
      NOTA: Assicurarsi che il vaso e il bracciale siano allineati senza torsione o angolazione. Dopo la fissazione, risciacqua il mancino PV con circa 1 mL di soluzione UW e conferma la pervigenza osservando l'efflusso dello SHIVC.
2. Preparazione del bracciale IHIVC
   1. La preparazione e il cuffing dell'IHIVC vengono eseguiti seguendo esattamente gli stessi passaggi descritti per il PV nello Passo 3.1. In breve, questo include la mobilitazione, il trimming e la fissazione dei polsini seguendo lo stesso protocollo standardizzato per garantire coerenza e riproducibilità sperimentale. (Figura 4C).
      NOTA: Confermare la pernocta dell'IHIVC osservando l'afflusso non ostruito dallo SHIVC dopo il lavaggio.
3. Lavaggio delle vie biliari
   1. Lavare delicatamente il dotto biliare attraverso lo stent biliare usando una siringa da 1 mL contenente 0,5 mL di soluzione UW.
   2. Assicurati che non si verifichi perdite di liquido durante lo sciacquo.
      NOTA: L'assenza di perdite di liquido conferma l'integrità del dotto biliare.
4. Preparazione SHIVC
   1. Taglia il SHIVC dell'innesto epatico estraendo il diaframma residuo.
   2. Assicurarsi che lo SHIVC sia completamente scheletroizzato, come definito nel Passaggio 2.2.7.
5. Posizione dei punti di permanenza
   1. Usa 7-0 o 8-0 Suture basate sulla preferenza dell'operatore.
      NOTA: In termini di esiti chirurgici (inclusa la permeabilità anastomica e la sopravvivenza del ricevente), entrambe le dimensioni delle suture sono funzionalmente equivalenti in questo modello. La scelta tra i due può dipendere interamente dalla preferenza personale dell'operatore o dalla disponibilità in laboratorio, senza influire sulla riproducibilità della procedura.
   2. Appiattisci delicatamente il ceppo SHIVC. Posizionare le suture agli angoli laterali sinistro e destro facendo passare l'ago dall'interno verso l'esterno, a circa 1 mm dal bordo (Figura 4D).

4. Operazione destinataria

1. Primi passi
   1. Anestetizzare il ratto ricevente utilizzando lo stesso protocollo descritto per il donatore (Passo 2.1.1).
   2. Posiziona il ratto destinatario su una borsa termica termostatica mantenuta a 37°C.
   3. NOTA: Pesa il ratto ricevente prima dell'anestesia. Assicurarsi che il suo peso corporeo superi di circa 50 g quello del donatore.
2. Mobilitazione del fegato ricevente
   1. Esegui una laparotomia a metà linea.
   2. Retrai lateralmente la parete addominale usando quattro retrattori elastici. Posizionare i due retrattori superiori lateralmente rispetto ai margini costali bilaterali e i due retrattori inferiori lateralmente alle regioni inguinali bilaterali per ottenere un'esposizione ottimale.
      NOTA: Applicare una retrazione sufficiente per esporre il campo operatorio evitando tensioni eccessive che potrebbero causare sbiancamento dei tessuti o compromesso della respirazione.
   3. Legatare la vena frenica inferiore sinistra (LIPV) nello stesso modo descritto per la procedura con donatore (vedi Passo 2.2.1).
   4. Dissezionare i legamenti tra il lobo epatico sinistro e il retroperitoneo. Mobilita i lobi caudati e papillari.
   5. Dividere i legamenti e i rami comunicanti tra l'esofago e il lobo epatico sinistro utilizzando l'elettrocauterizzazione.
      NOTA: Si raccomanda l'elettrocauterizzazione per garantire un'emostasia rapida, ridurre i tempi operatori e migliorare la riproducibilità procedurale.
   6. Dissezionare in modo diretto l'IHIVC fino al livello della vena renale destra.
   7. Isolare e legare con cura la vena surrenale sinistra a circa 2 mm dalla sua confluenza con l'IHIVC.
   8. Gestire il lobo inferiore destro del fegato nello stesso modo descritto per la procedura con donatore (vedi Passo 2.2.4).
   9. Passa un elastico (realizzato con il polsino di un guanto chirurgico sterile, lungo circa 10 cm) trasversalmente dietro lo SHIVC.
      NOTA: Applicare una trazione delicata per esporre lo SHIVC senza limitare il movimento respiratorio.
   10. Lasciare l'elastico in posizione per l'uso durante la successiva transezione dello SHIVC.
   11. Dissezionare e isolare la PV dall'ilo epatico fino al livello del ramo della vena pilorica.
       NOTA: Limitare la dissezione della PV alla regione anastomotica. Preservare gli affluenti circostanti per ridurre i traumi chirurgici.
   12. Isola l'HA all'hilo epatico.
   13. Lega l'HA a filo con l'ilo e trasettalo prossimalmente.
   14. Identifica la confluenza dei dotti epatici sinistro e destro che formano il CBD sotto l'ilo epatico. Lega il CBD in questo sito utilizzando una sutura 7-0 Prolene e trasettalo (Figura 5A).
       NOTA: Minimizzare i traumi chirurgici in questa regione. Preservare la massima lunghezza possibile dell'AH insieme al tessuto connettivo peribiliare, ai plessi nervosi e alla rete microvascolare per facilitare l'instaurazione precoce della circolazione collaterale.
3. Epatectomia ricevente
   1. Applicare pinze microvascolari per occludere immediatamente l'IHIVC cefalade nella vena renale destra.
   2. Applica una pinza microvascolare per occludere la PV appena sopra la sua giunzione con la vena pilorica.
   3. Confermare l'occlusione vascolare efficace osservando un visibile oscuramento del parenchima epatico.
      NOTA: Confermare l'occlusione vascolare tramite un oscuramento uniforme (cianosi) del fegato, perdita del turgore parenchimoso e collasso del PV.
   4. Inserisci un ago per vene per il cuoio capelluto da 23G collegato a una siringa da 5 mL nel PV.
   5. Infondere 2 mL di soluzione di glucosio al 5% per circa 30 secondi per far entrare il sangue intraepatico nella circolazione sistemica.
      NOTA: Iniettare lentamente tramite la PV vicino all'ilo epatico per far entrare il sangue intraepatico nella circolazione sistemica.
   6. Applica trazione verso il basso sull'elastico per esporre lo SHIVC.
   7. Clampa incrociata lo SHIVC usando una pinza vascolare (Figura 5B).
   8. Trasetta l'IHIVC, PV e SHIVC con il parenchima epatico.
   9. Rimuovi completamente il fegato nativo dalla cavità addominale.
      NOTA: Mantieni la fase anepatica entro 26 minuti (non oltre 30 minuti). I vasi trasetti si infilano con il fegato per preservare una lunghezza adeguata e garantire monconi vascolari lisci.
4. Impianto dell'innesto epatico
   1. Ricostruzione dello SHIVC
      1. Posizionare l'innesto epatico nella sua orientazione anatomica ortotopica.
      2. Usa la sutura 7-0 preimpostata all'angolo sinistro per iniziare la sutura continua della parete posteriore verso l'angolo destro.
      3. Fissa la sutura alla sutura a sstay nell'angolo destro.
      4. Continuare la sutura di scorrimento lungo la parete anteriore per completare l'anastomosi (Figura 6A–6C).
      5. Mantenere una distanza di ingresso dell'ago di 0,5–1,0 mm dal bordo del recipiente.
      6. Mantenere un passo di sutura di 1,0–1,5 mm.
         NOTA: Mantieni una distanza costante tra gli aghi e il passo dei punti per garantire un'anastomosi sicura e senza tensione.
      7. Stringi il punto dopo ogni punto per eliminare gli spazi morti e mantenere la tensione adeguata.
         NOTA: Prima di completare la sutura della parete anteriore, risciacqua il SHIVC con soluzione UW utilizzando un ago interno per espellere l'aria residua e prevenire l'embolia atmosferica.
   2. Ricostruzione fotovoltaica
      1. Posizionare suture di sosta 7-0 agli angoli sinistro e destro del moncone PV ricevente.
      2. Applica trazione a tre punti per creare un'apertura triangolare.
      3. Inserisci il PV donatore cuffiato nel lumen.
      4. Fissare usando una legatura 7-0 legata attorno al solco circonferenziale (Figura 6D–6F).
   3. Ricostruzione IHIVC
      1. Ricostruisci l'IHIVC usando la stessa tecnica della ricostruzione PV (vedi Passaggio 4.4.2) (Figura 6G–6I).
   4. Reperfusion
      1. Rilascia sequencialmente le pinze vascolari su SHIVC, PV e IHIVC.
      2. Confermare la riperfusione riuscita osservando un ripristino uniforme del colore dell'innesto senza congestione, emorragia o perdite (Figura 7A).
         NOTA: La produzione attiva di bile dal dotto biliare indica il ripristino della perfusione epatica e della funzione precoce del trapianto.
   5. Ricostruzione biliare
      1. Fai una piccola incisione trasversale (metà del diametro del dotto) sulla parete anteriore del moncone del CBD ricevente.
      2. Inserire lo stent biliare donatore circa 3 mm nel lumen del CBD.
      3. Fissa lo stent con una sutura circonferenziale 7-0 (Figura 7B).
         NOTA: Osservare l'efflusso bile attivo dalla punta distale dello stent donatore prima del completamento della ricostruzione. Questo conferma la permeabilità e la funzione precoce del trapianto.
5. Riscaldamento del destinatario
   1. Irrigare la cavità peritoneale con 150 mL di soluzione salina normale a 37°C prima della chiusura addominale.
      NOTA: Questo passaggio rimuove il sangue residuo, ripristina la temperatura corporea e consente l'ispezione dell'emostasi presso SHIVC, IHIVC e anastomosi PV.
6. Chiusura addominale e cure post-operatorie
   1. Chiudere lo strato musculofasciale usando una sutura continua con filo assorbibile 4-0, facendo morsi da 5 mm a intervalli di 1 cm.
   2. Chiudi la pelle usando una sutura continua con filo di seta 4-0.
   3. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) sottocutaneamente ogni 12 ore per un totale di 2 dosi.
   4. Trasferire il ratto ricevente in una gabbia pulita e a temperatura controllata.
   5. Monitorare continuamente fino al completo recupero dall'anestesia e ripresa del normale movimento spontaneo.

Figura 5. Passaggi chirurgici chiave durante la mobilizzazione epatica e l'epatectomia del ricevente. (A) Identificazione e legatura del CBD ricevente vicino alla biforcazione ilare. (B) Esposizione e incrocio del SHIVC. Un elastico viene posizionato dietro lo SHIVC per fornire trazione e migliorare la visualizzazione durante il clampaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Passaggi chirurgici chiave per la ricostruzione vascolare durante l'impianto di innesto epatico. Ricostruzione dello SHIVC: (A) allineamento utilizzando punti di sosta agli angoli, (B) sutura continua della parete posteriore e (C) completamento della sutura della parete anteriore. Ricostruzione PV usando la tecnica del braccietto: (D) trazione a tre punti, (E) inserimento del donatore PV con cuffia e (F) legatura che fissa la cuffia. Ricostruzione IHIVC usando la stessa tecnica del braccino: esposizione (G), inserimento (H) e legatura (I). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Verifica della funzione dell'innesto, ricostruzione biliare e recupero post-operatorio. (A) Valutazione della funzione precoce dell'innesto dopo la reperfusione, con efflusso biliare visibile dallo stent biliare donatore. Sono visibili ricostruzioni PV e IHIVC. (B) Completamento della ricostruzione biliare con inserimento e fissazione dello stent biliare donatore nel CBD ricevente. (C) Ratto ricevente rappresentativo che dimostra un recupero completo post-operatorio con postura normale e attività spontanea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Per garantire una qualità chirurgica costante e una riproducibilità tra i modelli NArLT, tutte le procedure sono state eseguite dallo stesso microchirurgo esperto. Durante il periodo dello studio sono stati completati in totale 50 trapianti di fegato di ratto. Le durate medie per le procedure chirurgiche sono state le seguenti: la chirurgia con donatore è stata media di 25,3 ± 2,6 minuti, la preparazione ex vivo dell'innesto è stata di 13,1 ± 2,1 minuti, la chirurgia del ricevente è stat...

Discussione

Il modello NArLT è una pietra miliare per la ricerca sperimentale sui trapianti grazie al suo evitamento dell'anastomosi microvascolare¹¹ della arteriosa complessiva. Tuttavia, i metodi convenzionali NArLT sono storicamente afflitti da alti tassi di complicazioni biliari—fino al 30%—che limitano gravemente la sopravvivenza a lungo termine e ostacolano gli studi immunologici^{cronici 2}. L'importanza del metodo proposto risiede nella sua capaci...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sutura assorbibile 4-0	Ethicon	W9109H	Utilizzato per la chiusura dello strato musculofasciale (linea alba)
Sutura di seta 4-0	Ethicon	VCP304H	Utilizzato per la chiusura della pelle
7-0 o 8-0 Sutura / Cravatta di seta	Ethicon	Z1711E	Usata per la legatura di vasi (ad esempio, vena frenica sinistra)
22G catetere endovenoso	B. Braun	4252098B	Tagliato a 5– 7 mm con estremità inclinate per preparare lo stent bilare
Ago per vene al cuoio capelluto 23G	Shandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.	MDLSSVS	Utilizzato per l'inserimento nell'aorta addominale per la perfusione epatica
Buprenorfina	Istituto di Ricerca Farmaceutica di Tianjin Pharmaceutical Co., Ltd.	H12020275	Somministrata come analgesia sottocutanea dopo l'intervento chirurgico
Cotton Swab	Aoocn	216-236	Usato per sollevare delicatamente il fegato durante la dissezione
Ghiaccio tritato	N/A	N/A	Usata per mantenere la temperatura dell'innesto durante la preparazione ex vivo
Trasportatori elastici	N/A	N/A	Usato per ritrarre la parete addominale durante la laparotomia
Guaine per cateteri epidurali	Jiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.	20173084015	Taglie 5F e 6F; usati come manette per PV e IHIVC
Garza	Central Medical Technology Co., Ltd.	CH-1001	Imbevuto di soluzione salina; Usata per coprire e proteggere l'intestino
Soluzione di glucosio (5%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044307	Utilizzato per lavare il sangue intraepatico durante l'epatectomia ricevente
Soluzione fisiologica	Shenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.	H2012003	100 IU/mL; Usato per ammollare il stent bilare
Ago a Permanenza	B. Braun	4254074B	Usato per lavare SHIVC per rimuovere l'aria prima di completare l'anastomosi
Isoflurano	Jinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.	153107015	5% di concentrazione; Utilizzato per l'induzione anestesica
Pinze microvascolari	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	JCZ200	Utilizzato per l'occlusione dei vasi durante l'intervento chirurgico
Pinza per zanzare	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	J31010	Utilizzato per la manipolazione fine e la preparazione dei polsini
Soluzione fisiologica normale (0,9%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044304	Utilizzato per l'irrigazione e la garza (37° C)
Pentobarbital (1%)	Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.	P0500000	40– 45 mg/kg; Utilizzato per l'anestesia chirurgica
Catetere venoso inserito perifericamente (PIVC)	Covidien	8888145015	Usato per lavare la PV cuffata e confermare la permeabilità;
Povidone-Iodio	Shanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.	41836054	Utilizzato per la disinfezione del sito chirurgico
Elastico (da Surgical Glove)	Ansell	N/A	Utilizzato per la trazione SHIVC durante l'intervento chirurgico del ricevente
Sprague– Dawley Rats	Huafukang (Pechino) Biotecnologia Co., Ltd.	22001A	Maschi adulti, 8 e ndash; 10 settimane, 220 e linea; 250 g
Piastra di Petri sterile (10 cm)	Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.	H905001	Utilizzato per trattenere l'innesto in soluzione UW durante la preparazione ex vivo
Siringa (20 mL)	Gruppo Shandong Weigao Medical Polymer Products Co., Ltd.	20163141593	Utilizzato per la perfusione epatica controllata (3– 3,5 mL/min)
Soluzione di conservazione dell'UW	Ponte verso la vita	BTL-UW-1L	Mantenuto a 4° C; Utilizzato per la perfusione epatica e la conservazione dell'innesto da donatore